Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ UV - VIS

(1)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----

NGUYỄN LẦU HAI

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CEPHALEXIN

TRONG DƯỢC PHẨM

BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-Vis

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH HÓA HỌC

8/2014

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(2)

----

NGUYỄN LẦU HAI

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CEPHALEXIN

TRONG DƯỢC PHẨM

BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV - VIS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH HÓA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS. NGUYỄN THỊ DIỆP CHI

DSCKI: LÊ THỊ CẨM THUÝ 8/2014

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(3)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Năm 2014 – 2015

Đề tài: “Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ UV – Vis”

LỜI CAM ĐOAN

... ... ... ... Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2014

Nguyễn Lầu Hai

Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên ngành: Hóa học

Đã bảo vệ và phê duyệt

Hiệu trưởng: ... Trưởng khoa: ...

Trưởng chuyên ngành Cán bộ hướng dẫn

Nguyễn Thị Diệp Chi

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(4)

BỘ MÔN HÓA HỌC

----

Hội đồng chấm luận văn đã phê duyệt luận văn với đề tài:

“XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CEPHALEXIN TRONG DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV – VIS”

Do sinh viên Nguyễn Lầu Hai, chuyên ngành Hóa học – Khóa 37 thực hiện và báo cáo trước Hội đồng vào ngày…...tháng……năm 2014.

Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2014 Chủ tịch Hội đồng

Xác nhận của khoa Khoa học Tự nhiên

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(5)

BỘ MÔN HÓA HỌC

----

Luận văn tốt nghiệp đại học chuyên ngành Hóa Học – Khóa 37 với đề tài: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CEPHALEXIN TRONG

DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV – VIS” Do sinh viên Nguyễn Lầu Hai thực hiện

Kính chuyển lên Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp.

Cần Thơ, ngày….tháng…. năm 2014 Cán bộ hướng dẫn

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(6)

Trường Đại học Cần thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa học Tự nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Bộ môn Hóa Học ----o0o----

NHÂN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1. Cán bộ hướng dẫn: Nguyễn Thị Diệp Chi

2. Tên đề tài: “Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ UV – Vis”

3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Lầu Hai MSSV: 2111914

Lớp Hóa học Khóa 37

4. Nội dung nhận xét:

a. Nhận xét về hình thức LVTN:

... ... b. Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

... ... c. Những vấn đề còn hạn chế:

... ... d. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có): ... ... e. Kết luận, đề nghị và điểm: ... ... Cần Thơ, ngày….tháng ….2014 Cán bộ hướng dẫn

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(7)

NHÂN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1.. Cán bộ chấm phản biện:……….

2. Tên đề tài: “Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ UV – Vis”

... ... d. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

... ... e. Kết luận, đề nghị và điểm: ... ... Cần Thơ, ngày….tháng ….2014 Cán bộ chấm phản biện

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(8)

NHÂN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1. Cán bộ chấm phản biện: ... 2. Tên đề tài: “Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược

phẩm bằng phương pháp quang phổ UV – Vis”

... ... d. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

... ... e. Kết luận, đề nghị và điểm: ... ... Cần Thơ, ngày….tháng ….2014 Cán bộ chấm phản biện

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(9)

Luận văn Tốt nghiệp Đại học LỜI CẢM ƠN

i Nguyễn Lầu Hai LỜI CẢM ƠN

----

Trong cuộc sống, không có sự thành công nào không gắn liền với hỗ trợ, động viên và giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu vào giảng đường đại học em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất:

Lời đầu tiên, con xin cảm ơn Cha Mẹ đã không quản vất vả để tạo mọi điều kiện thuận lợi, luôn động viên con hoàn thành tốt khóa học cũng như hoàn thành tốt luận văn này.

Xin cảm ơn quý Thầy Cô trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là quý Thầy Cô bộ môn Hóa, khoa Khoa học Tự nhiên đã tận tình truyền dạy cho em bằng tất cả tâm huyết và vốn kiến thức quý báu của mình, để trang bị cho em kiến thức hoàn thành tốt khóa học.

Em xin cảm ơn Cô Nguyễn Thị Diệp Chi đã giúp đỡ, hướng dẫn, tạo cơ hội cho em được tiếp xúc và học hỏi kinh nghiệm ở Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Thành phố Cần Thơ.

Cảm ơn ban Giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Thành phố Cần Thơ cùng với tập thể anh chị phòng Vật lý đo lường, cô Lê Thị Cẩm Thúy đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu của mình cho em hoàn thành tốt luận văn này.

Xin cảm ơn quý Thầy Cô trong hội đồng luận văn đã giành thời gian quý báu của mình để đọc và đưa ra những lời nhận xét quý báu để bài luận văn của em được hoàn thiện hơn.

Cuối cùng cảm ơn Cô Cố vấn lớp Hóa học K37 cùng với tập thể lớp đã quan tâm giúp đỡ em trong suốt khóa học cũng như trong thời gian hoàn thành luận văn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày….tháng….năm 2014

Nguyễn Lầu Hai

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(10)

Luận văn Tốt nghiệp Đại học TÓM TẮT

ii Nguyễn Lầu Hai TÓM TẮT

----

Cephalexin là một loại kháng sinh thế hệ I thuộc nhóm Cephalosporin, ít tan trong nước, tan trong dung dịch đệm có môi trường axit. Có nhiều phương pháp xác định Cephalexin: phương pháp sắc ký lỏng cao áp, phương pháp chuẩn độ thể tích, phương pháp quang phổ UV - Vis…. Tuy nhiên, phương pháp quang phổ UV – Vis có những ưu điểm, có thể áp dụng ở nhiều phòng thí nghiệm như: các thao tác thực hiện đơn giản, ít độc hại, chi phí thấp và thời gian tiến hành nhanh. Đề tài “Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ UV - Vis” nhằm xây dựng, kiểm tra quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến. Đưa ra một quy trình tối ưu về yêu cầu kỹ thuật, kinh tế cũng như về bảo vệ môi trường và bảo vệ sức khoẻ con người.

Tiến hành thẩm định hai quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến với hai hệ dung môi: dung dịch đệm phosphat pH5.5 và nước cất. Cả hai quy trình đều được thực hiện tại bước sóng 261 nm, đều cho độ tuyến tính rất cao trong khoảng 15 ppm – 35 ppm với hệ số tương quan R2_{= 1.0000. Khi sử dụng dung dịch đệm phosphate,}

phương pháp cho độ đúng với tỷ lệ tìm lại 100.6988% và độ lặp lại có RSD = 0.3449%. Khi sử dụng nước, phương pháp cho cho độ đúng với tỷ lệ tìm lại 100.6528% và độ lặp lại có RSD = 0.5329%. Tiến hành định lượng trên một số chế phẩm thì cả hai quy trình đều cho hàm lượng các mẫu đạt yêu cầu chất lượng.

Đề tài đã chứng minh được phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến khi thực hiện bằng hai quy trình trên đều đảm bảo yêu cầu của một quy trình phân tích định lượng. Vì vậy, có thể sử dụng hai quy trình trên để định lượng Cephalexin trong dược phẩm, nhưng sử dụng dung dịch đệm sẽ cho kết quả chính xác hơn vì RSD = 0.3449% < RSD = 0.5329% khi sử dụng nước cất.

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(11)

Luận văn Tốt nghiệp Đại học LỜI CAM KẾT

iii Nguyễn Lầu Hai TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN HÓA HỌC

LỜI CAM KẾT

----

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác.

Cần Thơ, ngày…..tháng….năm 2014

Nguyễn Lầu Hai

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(12)

Luận văn Tốt nghiệp Đại học MỤC LỤC

iv Nguyễn Lầu Hai MỤC LỤC

----

1.1 Đặt vấn đề ... 1

1.2 Mục tiêu đề tài ... 1

2.1 Giới thiệu về Cephalexin ... 2

2.1.1 Lịch sử, đặc điểm ... 2

2.1.2 Cấu tạo, danh pháp, tính chất ... 2

2.1.3 Dược động học ... 2 2.1.4 Cơ chế tác động ... 3 2.1.5 Tác dụng ... 3 2.1.6 Chỉ định ... 3 2.1.7 Tương tác thuốc ... 3 2.1.8 Tác dụng phụ ... 3 2.1.9 Một số chế phẩm ... 4

a) Viên nang Hapenxin 500 ... 4

b) Viên nang Cephalexin 500 ... 4

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(13)

v Nguyễn Lầu Hai

c) Viên nang PMS-OPXIL 500 ... 4

d) Viên nang Cephalexin 500 ... 4

e) Cephalexin 250 TB ... 4 2.2 Các phương pháp xác định Cephalexin ... 5 2.2.1 Các phương pháp định tính ... 5 a) Phương pháp sắc ký bản mỏng ... 5 b) Phương pháp quang phổ IR ... 5 c) Phương pháp HPLC ... 5 2.2.2 Các phương pháp định lượng ... 6 a) Phương pháp HPLC ... 6 b) Phương pháp chuẩn độ thể tích ... 7 c) Phương pháp quang phổ UV-Vis ... 8

2.3 Giới thiệu phương pháp quang phổ UV- Vis ... 8

2.3.1 Cấu tạo, sơ đồ máy quang phổ UV –Vis ... 8

2.3.2 Nguyên tắc ... 9

2.3.3 Ưu điểm ... 9

2.3.4 Các sai số trong phép đo ... 10

2.3.5 Yêu cầu của chất phân tích ... 10

2.3.6 Ứng dụng phương pháp quang phổ UV – Vis ... 10

2.4 Thẩm định quy trình định lượng ... 10

2.4.1 Khi nào cần thẩm định ... 11

2.4.2 Tầm quan trọng của việc thẩm định quy trình phân tích ... 11

2.4.3 Các chỉ tiêu thẩm định quy trình định lượng ... 11 a) Độ đặc hiệu ... 11 b) Độ tuyến tính ... 12 c) Giới hạn phát hiện ... 12 d) Giới hạn định lượng ... 13 e) Độ đúng ... 13 f) Độ lặp lại ... 13

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(14)

vi Nguyễn Lầu Hai

3.1 Thời gian, địa điểm... 15

3.2 Hoá chất thiết bị ... 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu ... 15 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu ... 15 3.3.2 Phương pháp phân tích ... 15 3.3.3 Phương pháp xử lý kết quả ... 15 3.4 Hoạch định thí nghiệm ... 15 3.5 Tiến hành thí nghiệm ... 16 3.5.1 Thẩm định quy trình 1 của phương pháp... 16 3.5.2 Khảo sát bước sóng cực đại, và độ ổn định phổ hấp thụ ... 16 3.5.3 Khảo sát độ tuyến tính ... 17 3.5.4 Khảo sát độ đúng ... 17 3.5.5 Khảo sát độ lặp lại ... 18 3.6 Thẩm định quy trình 2 của phương pháp ... 18 3.6.1 Khảo sát bước sóng cực đại, và độ ổn định phổ hấp thụ ... 19 3.6.2 Khảo sát độ tuyến tính ... 19 3.6.3 Khảo sát độ đúng ... 20 3.6.4 Khảo sát độ lặp lại ... 20 3.7 Định lượng mẫu ... 21 4.1 Thẩm định quy trình 1 của phương pháp ... 23 4.1.1 Độ đặc hiệu ... 23 4.1.2 Khảo sát bước sóng cực đại, và độ ổn định phổ hấp thụ ... 24 4.1.3 Khảo sát độ tuyến tính ... 24 4.1.4 Khảo sát độ đúng ... 25 4.1.5 Khảo sát độ lặp lại ... 25

4.1.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ) .... 26

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(15)

vii Nguyễn Lầu Hai

4.2 Thẩm định quy trình 2 của phương pháp ... 26 4.2.1 Độ đặc hiệu ... 26 4.2.2 Khảo sát bước sóng cực đại, và độ ổn định phổ hấp thụ ... 27 4.2.3 Khảo sát độ tuyến tính ... 28 4.2.4 Khảo sát độ đúng ... 28 4.2.5 Khảo sát độ lặp lại ... 29

4.2.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ) .... 30

4.3 Định lượng mẫu bằng hai phương pháp đã thẩm định ... 30 4.4 So sánh phương pháp ... 32 5.1 Kết luận ... 33 5.2 Kiến nghị ... 33

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(16)

Luận văn Tốt nghiệp Đại học DANH MỤC HÌNH

viii Nguyễn Lầu Hai

DANH MỤC HÌNH

----

Hình 2.1 Công thức cấu tạo Cephalexin ... 2

Hình 2.2: Sơ đồ máy quang phổ UV – Vis ... 8

Hình 3.1: Quy trình định lượng ... 22

Hình 4.1: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ QT2 ... 23

Hình 4.2: Phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn Cephalexin ... 24

Hình 4.3: Đường chuẩn QT1 ... 25

Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ QT2 ... 27

Hình 4.5: Phổ hấp thụ của các dung dịch Cephalexin ... 27

Hình 4.6: Đường chuẩn QT2 ... 28

Hình 4.7: Kết quả định lượng bằng hai quy trình. ... 31

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(17)

Luận văn Tốt nghiệp Đại học DANH MỤC BẢNG

ix Nguyễn Lầu Hai DANH MỤC BẢNG

----

Bảng 3.1: Hoá chất và thiết bị ... 15

Bảng 3.2: Dãy dung dịch khảo sát bước sóng cực QT1 ... 16

Bảng 3.3: Dãy dung dịch khảo sát độ tuyến tính QT1 ... 17

Bảng 3.4: Dãy dung dịch khảo sát độ đúng QT1 ... 17

Bảng 3.5: Dãy dung dịch khảo sát bước sóng cực đại QT2 ... 19

Bảng 3.6: Dãy dung dịch khảo sát độ tuyến tính QT2 ... 19

Bảng 3.7: Dãy dung dịch khảo sát độ đúng QT2 ... 20

Bảng 4.1: Độ hấp thụ của các dung dịch Cephalexin ... 24

Bảng 4.2: Tỉ lệ tìm lại Cephalexin của QT1 ... 25

Bảng 4.3: Kết quả khảo sát độ lặp lại QT1 ... 26

Bảng 4.4: Tỉ lệ tìm lại Cephalexin của QT2 ... 29

Bảng 4.5: Kết quả khảo sát độ lặp lại QT2 ... 29

Bảng 4.6: Khối lượng trung bình các mẫu định lượng ... 30

Bảng 4.7: Hàm lượng các mẫu khi định lượng bằng QT1 ... 30 Bảng 4.8: Hàm lượng các mẫu khi định lượng bằng QT2 ... 31 Bảng 4.9: Bảng tổng hợp so sánh hai quy trình ... 32

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(18)

Luận văn Tốt nghiệp Đại học DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

x Nguyễn Lầu Hai DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

----

HPLC: Sắc ký lỏng cao áp.

UV – Vis: Quang phổ tử ngoại khả kiến.

IR: Quang phổ hồng ngoại.

CTCPDP: Công ty cổ phần dược phẩm. QT1: Quy trình 1. QT2: Quy trình 2. TT: Thuốc thử. CPDP: Cổ phần dược phẩm. USP: Dược điển Mỹ. BP: Dược điển Anh.

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(19)

Luận văn Tốt nghiệp Đại học DANH MỤC PHỤ LỤC

xi Nguyễn Lầu Hai DANH MỤC PHỤ LỤC ---- Phụ lục 1: Xử lý thống kê tuyến tính QT1 ... 35 Phụ lục 2: Xử lý thống kê độ lặp lại QT1 ... 36 Phụ lục 3: Xử lý thống kê tuyến tính QT2 ... 37 Phụ lục 4: Xử lý thống kê độ lặp lại QT2 ... 39

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(20)

Luận văn Tốt nghiệp Đại học Chương 1: PHẦN MỞ ĐẦU

1 Nguyễn Lầu Hai Chương 1:_{PHẦN MỞ ĐẦU}

1.1 Đặt vấn đề

Cephalexin là một loại kháng sinh thế hệ một của nhóm Cephalosporin có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp vỏ tế bào vi khuẩn, là một hợp chất ít tan trong nước, tan trong các dung dịch có môi trường axid. Từ khi xuất hiện, Cephalexin được dùng để điều trị các bệnh tai, mũi, họng, nhiễm khuẩn sản phụ khoa… Hiện nay việc xác định Cephalexin trong dược phẩm chủ yếu dựa theo Dược điển Việt nam, USP, BP với phương pháp sắc ký lỏng cao áp và phương pháp chuẩn độ thể tích. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp tuy có độ chính xác cao nhưng phải sử dụng pha động là các dung môi độc hại và thiết bị đắt tiền, phương pháp chuẩn độ thể tích tuy ít sử dụng hoá chất độc hại nhưng là pháp thủ công dễ sai số, có quy trình phức tạp, có độ chính xác không cao lắm.

Trước thực tế đó, việc xây dựng một phương pháp có độ chính xác cao và ít độc hại, chi phí thấp là một đề tài được quan tâm, phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến là một phương pháp thích hợp để tiến hành nghiên cứu. Do đó, đề tài “Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ UV Vis” được tiến hành để xây dựng, kiểm tra đánh giá phương pháp. Từ đó, tối ưu hoá quy trình phân tích để có thể áp dụng trong công tác kiểm nghiệm dược phẩm, cụ thể là phân tích Cephalexin trong dược phẩm.

1.2 Mục tiêu đề tài

Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp UV-Vis, thẩm định phương pháp với một số chỉ tiêu: độ chọn lọc, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại giới hạn pháp hiện, giới hạn định lượng và định lượng 6 lô thuốc chứa hoạt chất Cephalexin trên thị trường của các công ty CPDP Hậu Giang, CTCPDP Cửu Long và Imexpharm bằng phương pháp đã thẩm định.

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(21)

Luận văn Tốt nghiệp Đại học Chương 2: TỔNG QUAN

2 Nguyễn Lầu Hai Chương 2:_{TỔNG QUAN}

2.1 Giới thiệu về Cephalexin 2.1.1 Lịch sử, đặc điểm

Cephalexin là một kháng sinh thuộc Cephalosporin, một trong hai đại diện cho hầu hết các khánh sinh nhóm Beta – lactam. Các kháng sinh Cephalosporin nói chung và Cephalexin nói riêng có chứa một vòng sáu cạnh, khác với các kháng sinh Penicilin chứa vòng năm cạnh.

Cephalexin là một kháng sinh dạng uống, xuất hiện vào những năm 1970 cùng với hai loại khác được dùng ngoài đường uống là Cephaloridin và Cephalothin.

2.1.2 Cấu tạo, danh pháp, tính chất



Cấu tạo:

Hình 2.1 Công thức cấu tạo Cephalexin



Công thức phân tử: C16H17N3O4S



Phân tử khối: 347.39 g/mol



Danh pháp:

(6R,7R)-7-[(2R)-2-amino-2-phenylacetamido]-3-methyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid



Tính chất: Cephalexin nguyên chất là chất bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Hơi tan trong nước, thực tế không tan trong ethanol 96%, tan trong acid và dung dịch đệm có tính acid [1].

2.1.3 Dược động học [2]

Cephalexin hầu như được hấp thu hoàn toàn, ngay cả khi có sự hiện diện của thức ăn và không bị ảnh hưởng của các bệnh đường tiêu hóa, sau khi cắt một phần dạ dày, chứng thiếu axit clohydric, vàng da hay bệnh có túi thừa (ở tá tràng hay hổng tràng). Thuốc được đào thải với nồng độ cao qua nước tiểu, thời

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(22)

3 Nguyễn Lầu Hai gian bán hủy thường khoảng một giờ, nhưng lâu hơn ở trẻ sơ sinh. Cephalexin có mức độ an toàn cao.

2.1.4 Cơ chế tác động [2]

Cephalexin là thuốc kháng sinh cephalosporin và được sử dụng để chống lại các vi khuẩn trong cơ thể. Nó hoạt động bằng cách ức chế quá trình hình thành vỏ tế bào của vi khuẩn, làm cho nó bị vỡ và giết chết vi khuẩn.

2.1.5 Tác dụng [2]

Cephalexin có phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên vi khuẩn gram dương như tụ cầu, liên cầu, phế cầu.

Cephalexin cũng có tác dụng trên một số vi khuẩn gram âm như E.coli, Klebsiella pneumonia Proterusmirabilis và Shigella.

2.1.6 Chỉ định [2]

Ngày nay, Cephalexin được sử dụng rộng trong những trường hợp nhiễm đường hô hấp (viêm phế quản cấp, mãn tính và giãn phế quản có bội nhiễm), nhiễm tai mũi họng, nhiễm trùng đường tiểu. Ngoài ra, Cephalexin còn được dùng trong dự phòng nhiễm khuẩn đường tiết niệu tái phát, nhiễm khuẩn sản, phụ khoa, da, mô mềm và xương.

2.1.7 Tương tác thuốc [2]

Tránh dùng Cephalexin cho bệnh nhân dị ứng với kháng sinh nhóm Cephalosporin. Vì Cephalexin có quan hệ hóa học với Penicilin nên đôi khi một bệnh nhân có thể có phản ứng dị ứng với cả hai loại thuốc. Tuy nhiên Cephalexin không gây quen thuốc.

2.1.8 Tác dụng phụ [2]

Một số ít bệnh nhân có thể bị rối loạn tiêu hóa như buồn nôn, nôn mữa và tiêu chảy khi dùng Cephalexin. Ngoài ra, do có phổ kháng khuẩn rộng nên Cephalexin có thể gây tăng trưởng các vi khuẩn cộng sinh. Một số trường hợp có thể xảy ra giảm bạch cầu trung tính nhưng có hồi phục.

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(23)

4 Nguyễn Lầu Hai 2.1.9 Một số chế phẩm

a) Viên nang Hapenxin 500

Công ty Cổ phần Dược phẩm Hậu Giang Thành phần: Cephalexin…………500 mg

Tá dược vừa đủ……1 viên

b) Viên nang Cephalexin 500

Công ty Cổ phần Dược phẩm Cửu Long Thành phần: Cephalexin…………500 mg

c) Viên nang PMS-OPXIL 500

Công ty Cổ phần Dược phẩm Imexpharm Thành phần: Cephalexin…………500 mg

d) Viên nang Cephalexin 500

Công ty Vidiphar Thành phần: Cephalexin…………250 mg Tá dược vừa đủ……1 viên e) Cephalexin 250 TB Công ty Cophavina Thành phần: Cephalexin…………250 mg Tá dược vừa đủ……1 gói

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(24)

5 Nguyễn Lầu Hai 2.2 Các phương pháp xác định Cephalexin

2.2.1 Các phương pháp định tính

a) Phương pháp sắc ký bản mỏng [1]

Bản mỏng: Silicagel, không có chất kết dính, được chuẩn bị như sau: Đặt

bản mỏng trong bình sắc ký có chứa hỗn hợp dung môi n-hexan (C6H14) và

tetradecan (C14H30) (95 : 5) ngập khoảng 1 cm, để dung môi di chuyển theo

chiều dài của bản mỏng, sau đó lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký và để dung môi bay hơi.

Dung môi khai triển: Dung dịch acid citric 0.1M - dung dịch dinatri

hydrophosphat 0.1M - dung dịch ninhydrin trong aceton có nồng độ 1 g trong 15 ml (60 : 40 : 1.5).

Dung dịch thử: Lấy một lượng bột viên tương ứng với khoảng 30 mg

cephalexin, hòa tan trong 10 ml nước, lọc.

Dung dịch đối chiếu: Dung dịch cephalexin chuẩn 0.3% trong nước. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 l mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 3/4 chiều dài bản mỏng. Lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, đánh dấu mức dung môi và để bản mỏng khô ngoài không khí, sấy bản mỏng ở 110o_{C trong 10 phút và quan sát dưới ánh sáng}

thường.

Yêu cầu: Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử và của dung dịch đối chiếu phải giống nhau về vị trí, màu sắc và kích thước.

b) Phương pháp quang phổ IR [3]

Hoà tan một lượng bột thuốc tương đương với 0.5 g Cephalexin trong 1 ml nước và 1.4 ml dung dịch HCl 1M, lọc và rửa bằng 1 ml nước, thêm từ từ dung dịch CH3COONa bão hoà cho đến khi xuất hiện kết tủa, thêm 5 ml

CH3OH, lọc và rửa kết tủa hai lần mỗi lần bằng 1 ml CH3OH và làm khan ở

áp suất không quá 0.7 kPa. Đo phổ IR của phần kết tủa vừa làm khan và so sánh với phổ chuẩn của Cephalexin chuẩn.

Yêu cầu: Phổ IR của chế phẩm phải phù hợp với phổ chuẩn của Cephalexin chuẩn.

c) Phương pháp HPLC [1]

Trong phép thử định lượng, pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(25)

6 Nguyễn Lầu Hai 2.2.2 Các phương pháp định lượng

a) Phương pháp HPLC [1]

Pha động: Hòa tan 1.0 g natri pentansulfonat trong 1015 ml hỗn hợp nước,

CH3CN, CH3OH và (CH3)3N (850 : 100 : 50: 15), điều chỉnh tới pH=3.0±0.1

bằng acid phosphoric.

Dung dịch chuẩn nội: Cân chính xác khoảng 300 mg 1-hydroxy

benzotriazol (C6H5N3O) vào bình định mức 1000 ml, hòa tan trong 10 ml

CH3OH (TT) và loãng bằng pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng

lọc 0.45 m.

Dung dịch chuẩn: Hoà tan một lượng cephalexin chuẩn trong nước để thu

được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1,0 mg/ml. Hút chính xác 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình nón nút mài, thêm chính xác 15,0 ml dung dịch chuẩn nội và trộn đều. Lọc qua màng lọc 0.45 m.

Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng

100 mg cephalexin vào bình định mức 100 ml, thêm 75 ml nước và lắc siêu âm 15 phút, pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc và bỏ 20 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 10 ml dịch lọc vào bình nón nút mài, thêm chính xác 15,0 ml dung dịch chuẩn nội và trộn đều. Lọc qua màng lọc 0.45 m.

Điều kiện sắc ký: Cột nhồi pha tĩnh C18 (5 m hoặc 10 m) Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm. Tốc độ dòng: 1.5 ml/phút.

Thể tích tiêm: 20 l.

Cách tiến hành:

Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký đối với dung dịch chuẩn: trên sắc ký đồ thu được, độ phân giải giữa pic chuẩn nội và pic cephalexin không nhỏ hơn 5; độ lệch chuẩn tương đối của tỷ số diện tích pic cephalexin và chuẩn nội không được lớn hơn 2.0%.

Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng cephalexin (C16H17N3O4S), từ tỷ số diện tích pic

cephalexin và chuẩn nội trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C16H17N3O4S trong cephalexin chuẩn.

Nhận xét: Phương pháp đòi hỏi hoá chất, thiết bị đắt tiền, thời phân tích trên máy lâu, sử dụng dung môi độc hại. Tuy nhiên cũng có nhiều thuận lợi như độ chọn lọc cao, sử dụng ít hoá chất, quy trình đơn giản.

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(26)

7 Nguyễn Lầu Hai b) Phương pháp chuẩn độ thể tích [4]

Vòng  – Lactam của Cephalexin không bền trong môi trường kiềm, khi gặp môi trường kiềm thì vòng  – Lactam bị phá vỡ và tạo thành hợp chất có tính khử. Hàm lượng Cephalexin được xác định bằng cách phá vỡ vòng  – Lactam trong môi trường kiềm sau đó cho phản ứng với một lượng xác định dung dịch I2 dư. Lượng I2 thừa sau phản ứng sẽ được xác định bằng cách chuẩn

độ với Na2S2O3 với chất chỉ thị hồ tinh bột.

Mẫu thử: cân khối lượng 20 viên thuốc, tính khối lượng trung bình bột

thuốc của viên. Lấy bột thuốc 20 viên trộn đều, cân lượng bột thuốc tương đương 250 mg cephalexin khan cho vào bình định mức 250 ml. Thêm 100 ml nước cất, lắc kỹ trong 30 phút. Định mức tới vạch bằng nước cất, lắc đều, lọc bỏ 20 ml dụng dịch lọc đầu và lọc lấy dung dịch.

Lấy chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình nón có nút mài, thêm 5 ml dung dịch NaOH 1N, lắc đều và để yên 30 phút. Sau đó thêm 20 ml dung dịch đệm acetate (5.44% CH3COONa.3H2O và 2.4% CH3COOH), 5 ml HCl

1N và 25 ml dung dịch I2 0.02N. Đậy kín bằng nút mài đã thấm ướt và để trong

tối 20 phút. Định lượng I2 thừa bằng Na2S2O3 0.02N với chất chỉ thị hồ tinh

bột.

Mẫu trắng: Hút chính 10 ml dung dịch lọc cho vào một bình nón khác,

thêm 20 ml dung dịch đệm acetate và 25 ml dung dịch I2 0.02N. Đậy kín bằng

nút mài thấm ướt, để trong tối 20 phút. Chuẩn độ với Na2S2O3 0.02N với chất

chỉ thị hồ tinh bột.

Mẫu chuẩn: Cân chính xác 250 mg cephalexin chuẩn khan cho vào bình

định mức 250 ml. Thêm 100 ml nước cất, lắc kỹ trong 30 phút. Định mức tới vạch bằng nước cất, lắc đều (dung dịch chuẩn).

Hút chính xác 10 ml dung dịch chuẩn cho vào một bình nón khác, thêm 20 ml dung dịch đệm acetate và 25 ml dung dịch I2 0.02N. Đậy kín bằng nút

mài thấm ướt, để trong tối 20 phút. Chuẩn độ với Na2S2O3 0.02N với chất chỉ

thị hồ tinh bột.

Hàm lượng được tính dựa vào hàm lượng chuẩn.

Nhận xét: Quy trình tốn nhiều thời gian, nếu nguyên liệu hay chế phẩm có lẫn các chất khử sẽ bị I2 oxi hoá làm cho kết quả phân tích bị sai lệch do đó

độ chọn lọc không cao. Tuy nhiên, phương pháp này dễ dàng thực hiện ở các phòng thí nghiệm với quy mô nhỏ.

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(27)

8 Nguyễn Lầu Hai c) Phương pháp quang phổ UV-Vis [5]

Dựng đường chuẩn với dãy dung dịch chuẩn Cephalexin ứng với các nồng độ 15 ppm – 20 ppm – 25 ppm – 30 ppm – 35 ppm.

Dung dịch thử: Cân 20 viên thuốc, tính giá trị trung bình bột thuốc trong

mỗi viên, trộn đều. Cân lượng bột thuốc tương đương 50 mg Cephalexin khan theo hàm lượng ghi trên nhãn, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml dung môi dung dịch đệm phosphat pH5.5, siêu âm 15 phút, định mức tới vạch bằng dung dịch đệm, lắc đều. Lọc bỏ 20 ml đầu, lọc thu lấy dịch lọc. Hút chính xác 5 ml dịch lọc cho vào bình định mức 100 ml, định mức tới vạch bằng dung dịch đệm, lắc đều.

Tiến hành đo độ hấp thụ dãy dung dịch chuẩn và dung dịch thử với mẫu trắng là dung dịch đệm ở bước sóng 261 nm.

Hàm lượng Cephalexin được tính dựa vào đường chuẩn

Nhận xét: Quy trình đơn giản, ít sử dụng hoá chất độc hại, ít tốn thời gian, thiết bị không đắt lắm.

2.3 Giới thiệu phương pháp quang phổ UV- Vis

Phương pháp phân tích quang phổ là phương pháp phân tích quang học dựa trên việc nghiên cứu sự tương tác của bức xạ ánh sáng trên chất khảo sát hoặc sự hấp thụ các bức xạ dưới một tác động hóa lý nào đó.

2.3.1 Cấu tạo, sơ đồ máy quang phổ UV –Vis [6]

Hình 2.2: Sơ đồ máy quang phổ UV – Vis

Trong đó: 1: Nguồn đèn UV 12 và 13: Chùm tia sáng 2: Nguồn đèn Vis 14: Cuvet mẫu trắng 3, 8, 10 và 11: Gương 15: Cuvet mẫu thử

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(28)

9 Nguyễn Lầu Hai 4 và 6: Khe 16 và 17: Thấu kính

5: Lưới nhiễu xạ 18 và 19: Detector

7: Lọc 9: Bán gương

2.3.2 Nguyên tắc

Một chùm sáng từ nguồn sáng tử ngoại hoặc khả kiến được tách thành các tia sáng đơn sắc với các bước sóng khác nhau bằng một lăng kính hoặc lưới nhiễu xạ. Mỗi tia sáng đó được tách thành hai tia sáng có cường độ bằng nhau bằng một bán gương. Một tia sáng (chùm sáng mẫu) sẽ đi xuyên qua một vật chứa trong suốt (cuvet) có chứa hỗn hợp chất nghiên cứu được hoà tan trong dung môi trong suốt (dung dịch thử). Tia sáng còn lại (tia sáng tham chiếu) sẽ đi xuyên qua một cuvet khác (giống với cuvet chứa dung thử) chỉ chứa dung môi hoà tan (mẫu trắng). Cường độ của hai tia sáng sẽ được đo bằng đầu dò điện tử và được so sánh. Tia sáng tham chiếu sẽ hấp thụ ít hoặc không hấp thụ, được xác định là I0. Cường độ của tia sáng mẫu được xác định là I. Trong một thời

gian ngắn, quang phổ kế sẽ quét tất cả các bước sóng. Vùng UV thường được quét trong khoảng 200 nm – 400 nm, vùng Vis từ 400 nm – 800 nm.

Bộ phận đầu dò (detector) sẽ so sánh cường độ chùm ánh sáng đi qua dung dịch (I) và đi qua dung môi (I0). Tín hiệu quang được chuyển thành tín

hiệu điện, sau khi được phóng đại, tín hiệu sẽ chuyển sang bộ phận ghi để vẽ đường cong sự phụ thuộc của log (I0/I) vào bước sóng. Nhờ sử dụng máy tính,

bộ tự ghi còn có thể ghi ra cho ta những số liệu cần thiết như giá trị λmax cùng

với giá trị độ hấp thụ A. Tất cả các cường độ hấp thụ ứng với mỗi bước sóng sẽ được thể hiện trên phổ đồ.

Cường độ tia sáng trước và sau khi qua cuvette được liên hệ với nhau bởi

biểu thức Lambert – Beer: C

I I T A            _log( ₎ _log 0   Trong đó: A: Độ hấp thụ C: Nồng độ (mol/L) l: Chiều dài lớp dung dịch : Hệ số hấp thụ phân tử gam 2.3.3 Ưu điểm

Phương pháp quang phổ khả kiến có các ưu điểm:

- Phương pháp có độ nhạy cao, cho phép xác định nồng độ trong khoảng 10-2_{đến 10}-6_{mol/L (1-10 %).}

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(29)

10 Nguyễn Lầu Hai - Phân tích thuận tiện: không đòi hỏi thiết bị, hóa chất quá đắt tiền, có thể phân tích nhiều đối tượng mẫu khác nhau.

- Dễ tự động hóa: các thao tác từ đưa mẫu phân tích vào, đưa các hóa chất cần thiết, vẽ phổ, xử lý phổ, xử lý kết quả, xử lý thống kê đều được thực hiện một cách tự động hóa trên các máy móc, thiết bị hiện đại.

- Phương pháp này rất thuận lợi cho việc nghiên cứu các cơ chế tạo phức, xác định các dạng tồn tại của ion trung tâm, các ligand nằm trong phức đơn và đa ligand trong pha nước cũng như pha hữu cơ

2.3.4 Các sai số trong phép đo

Phương pháp phân tích quang phổ cũng như các phương pháp phân tích khác, sai số được chia làm hai loại: sai số do tiến hành phản ứng hóa học (hóa chất, thao tác, dụng cụ….), sai số của tín hiệu đo độ hấp thụ của dung dịch (sai số hệ thống). Trong phương pháp quang phổ thì sai số quan trọng nhất là sai số của tín hiệu trong quá trình đo độ hấp thụ.

2.3.5 Yêu cầu của chất phân tích

Các hợp chất cần xác định phải bền, ít phân ly, ổn định, không thay đổi thành phần trong khoảng thời gian nhất định để thực hiện phép đo (10 – 20 phút). Hệ số  càng lớn càng tốt, nồng độ các chất xác định phải tuân theo định luật Lambert – Beer.

Các hợp chất là phức cần đo phải có bước sóng cực đại khác xa bước sóng cực đại của thuốc thử trong cùng điều kiện, tức là khoảng 80 – 100 nm.

2.3.6 Ứng dụng phương pháp quang phổ UV – Vis

Phương pháp phổ UV – Vis có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực phân tích định tính, phân tích cấu trúc phân tử và phân tích định lượng. Nguyên tắt của phương pháp phân tích định lượng là dựa vào mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch của định luật Lambert – Beer, phương pháp định tính là dựa vào hình dáng của phổ và bước sóng cực đại.

2.4 Thẩm định quy trình định lượng [7]

Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra, cung cấp bằng chứng khách quan để chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra (fitness for the urpose). Kết quả của thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Thẩm định phương pháp phân tích là một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy.

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(30)

11 Nguyễn Lầu Hai 2.4.1 Khi nào cần thẩm định [8]

- Sử dụng một phương pháp mới vào công việc phân tích hằng ngày. - Thay đổi mục đích sử dụng của phương pháp.

- Giới hạn thu được sau khi phân tích nằm ngoài giới hạn quy định. - Thay đổi quy trình: thành phần tá dược trong thuốc, trang thiết bị, thông số kỹ thuật, thay đổi nhà cung cấp hoá chất.

2.4.2 Tầm quan trọng của việc thẩm định quy trình phân tích [9]

Thẩm định quy trình phân tích là một quá trình tiến hành thiết lập bảng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Nói cách khác, việc thẩm định một quy trình phân tích yêu cầu chúng ta phải chứng minh một cách hoá học rằng khi tiến hành thí nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận được.

Trong các tiêu chuẩn chúng ta phải xây dựng phương pháp phân tích hay cũng gọi là quy trình thử nghiệm để giúp cho việc thực hiện kiểm tra chất lượng cũng như các tiêu chí đề ra cho các tiêu chuẩn đó.

Mục tiêu của việc thẩm định các phương pháp phân tích là để chứng tỏ rằng quy trình đáp ứng với yêu cầu dự kiến.

2.4.3 Các chỉ tiêu thẩm định quy trình định lượng a) Độ đặc hiệu [8]

Độ đặc hiệu: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các

tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất.... Cụ thể, trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích. Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác.

Cách tiến hành: Ta đánh giá độ đặc hiệu dựa vào cách so sánh hệ số góc

của đường chuẩn thu được từ mục độ tuyến tính và hệ số góc biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ dung dịch và độ hấp thụ thu được khi xác định độ đúng.

Đánh giá: Sự sai khác giữa hai hệ số góc không quá 5%, chứng tỏ quy

trình có tính chọn lọc với chất phân tích.

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(31)

12 Nguyễn Lầu Hai b) Độ tuyến tính [10]

Tính tuyến tính của một phương pháp phân tích là khả năng luận ra các kết quả thử của phương pháp hoặc bằng phép biến đổi toán học hay trực tiếp dựa vào tương quan tỉ lệ giữa đại lượng đo được và nồng độ. Tính tuyến tính trong một miền giá trị được xác định bằng hệ số tương quan R.

Cách tiến hành:

Tiến hành thực nghiệm để xác định ứng với các nồng độ x biết trước, các giá trị định lượng được y. Như ta đã biết nếu y phụ thuộc tuyến tính vào x có nghĩa là trong khoảng nồng độ cần khảo sát đường biểu diễn của y theo x là một đường thẳng (đoạn thẳng) theo phương trình sau: yaxb hayAaCb.

Dựa vào kết quả thu được từ thực nghiệm của x và y tương ứng ta tính hệ số tương quan R. Dựa vào kết quả thu được từ thực nghiệm của x và y tương ứng ta tính hệ số tương quan R. ) ( ) ( ) )( ( 1 1 1 1



        n i i n i n i i i y y x x y y x x R

Trong đó: 𝑥_𝑖: Giá trị Abs đo được 𝑦_𝑖: Giá trị nồng độ 𝑥̅: Giá trị Abs trung bình 𝑦̅: Giá trị nồng độ trung bình

Đánh giá: Tùy theo hoạch định mà chọn giá trị R. Thông thường chọn 0,99 ≤ R ≤ 1 thì có sự tương quan tuyến tính.

c) Giới hạn phát hiện [7]

Giới hạn phát hiện: Nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp định lượng).

Có thể xác định giới hạn phát hiện dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc suy ra được từ phương trình hồi quy tuyến tính.

Giới hạn phát hiện (LOD) được tính theo công thức:

a S LOD3.3

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(32)

13 Nguyễn Lầu Hai Trong đó: S: độ lệch chuẩn

a: Hệ số gốc d) Giới hạn định lượng [10]

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát.

Có thể xác định giới hạn định lượng dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc suy ra được từ phương trình hồi quy tuyến tính.

Giới hạn định lượng (LOQ) được tính theo công thức:

LOD LOQ3.3

e) Độ đúng [10]

Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy với giá trị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã được làm đồng nhất trong cùng điều kiện xác định. Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất chuẩn tìm thấy so với lượng chất chuẩn thêm vào.

Cách tiến hành

Xác định hàm lượng hoạt chất cần đem thử bằng phương pháp đề xuất. Thêm một lượng chất chuẩn của hoạt chất cần thử với hàm lượng bằng với hàm lượng trung bình ±20% của chất đó trong mẫu đem thử. Tiến hành định lượng bằng phương pháp đề xuất để tìm hàm lượng của phần thêm vào chất cần thử, từ kết quả thu được xác định tỷ lệ % tìm lại của chất đem thử:

100 3 2 1    M M M Đ Trong đó: M1: Tổng lượng tìm thấy M2: Lượng sẵn có M3: Lượng thêm vào

Đánh giá: Phương pháp thử nghiệm được chấp nhận khi độ đúng trung

bình có giá trị thuộc khoảng 98% ≤ Σ ĐTB ≤ 102%. f) Độ lặp lại [10]

Độ lặp lại (hay độ chính xác): Mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng

lẻ với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định. Độ lặp lại bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên.

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(33)

14 Nguyễn Lầu Hai Độ lặp lại thường được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (SD) hay độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của một loạt các lần thử ngiệm.

Cách thực hiện

Với cùng một mẫu được làm đồng nhất, tiến hành định lượng bằng phương pháp đề xuất n lần (n = 6 –10 hay nhiều hơn). Sau đó áp dụng công thức tính SD và RSD của phương pháp: 1 ) (    n x x SD i ; x SD RSD Đánh giá: RSD càng nhỏ thì phương pháp càng chính xác, thường giá trị RSD < 2%.

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(34)

Luận văn Tốt nghiệp Đại học Chương 3: THỰC NGHIỆM

15 Nguyễn Lầu Hai Chương 3:_{THỰC NGHIỆM}

3.1 Thời gian, địa điểm

Đề tài được thực hiện tại phòng Vật lý đo lường, Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm thành phố Cần Thơ. Thời gian thực hiện từ 15/07/2014 – 15/10/2014 3.2 Hoá chất thiết bị Bảng 3.1: Hoá chất và thiết bị Hoá chất Thiết bị Kali dihydrophosphat Dinatri hydrophosphat

Chuẩn nguyên liệu Cephalexin 94.8% Nước cất

Máy quang phỏ UV-Vis Hitachi 2900 Máy siêu âm hoà tan

Máy pH Cân phân tích

Bình định mức, pipet, bình tam giác, phiễu lọc

3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu

Trung tâm tiến hành lấy mẫu ngẫu nhiên ở một số nhà thuốc tây trên địa bàn thành phố Cần Thơ, mỗi mẫu lấy 2 lô, ứng với mỗi lô thuốc sẽ lấy 60 viên bất kì.

Đề tài tiến hành lấy và nghiên cứu trên các mẫu viên nang sau: Hapenxin (CTCPDP Hậu Giang), Cephalexin (CTCPDP Cửu Long), PMS OPXIL (CTCPDP Imexpharm).

3.3.2 Phương pháp phân tích

Đề tài tiến hành nghiên cứu bằng phương pháp quang phổ UV-Vis. 3.3.3 Phương pháp xử lý kết quả

Các kết quả nghiên cứu sẽ được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel. 3.4 Hoạch định thí nghiệm

Thẩm định hai quy trình định lượng Cephalexin bằng phương pháp quang phổ UV-Vis: Quy trình 1 với dung môi đệm phosphat pH5.5 và quy trình 2 với dung môi nước nhằm khảo sát: độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng.

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(35)

16 Nguyễn Lầu Hai Định lượng mẫu sau: Hapenxin (CTCPDP Hậu Giang), Cephalexin (CTCPDP Cửu Long), PMS OPXIL (CTCPDP Imexpharm) bằng hai quy trình trên.

3.5 Tiến hành thí nghiệm

3.5.1 Thẩm định quy trình 1 của phương pháp Pha các dung dịch:

Dung dịch đệm phosphate pH5.5: Là hỗn hợp gồm 96.4 ml dung dịch

KH2PO4 1.36% và 3.6 ml dung dịch Na2HPO4 3.58%.

Dung dịch chuẩn gốc: Cân 53.7 mg chuẩn Cephalexin (hàm lượng 94.8%)

cho vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml dung dịch đệm, siêu âm 15 phút, định mức tới vạch bằng dung dịch đệm phosphat.

Dung dịch thử gốc: Cân 20 viên thuốc Hapenxin 500 mg (số lô 150114 –

050116), lau sạch nang và cân khối lượng 20 nang rỗng, tính giá trị trung bình bột thuốc trong mỗi viên, trộn đều. Cân 57.6 mg cho vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml dung dịch đệm phosphate, siêu âm 15 phút, định mức tới vạch bằng dung dịch đệm, lắc đều. Lọc bỏ 20 ml đầu, lọc lấy dịch lọc.

3.5.2 Khảo sát bước sóng cực đại, và độ ổn định phổ hấp thụ

Mục đích: Xác định bước sóng cực đại và kiểm tra sự ổn định phổ hấp thụ

của dung dịch Cephalexin ở các nồng độ khác nhau.

Tiến hành thí nghiệm:

Pha các dung dịch chuẩn Cephalexin ứng với các nồng độ như bảng sau: Bảng 3.2: Dãy dung dịch khảo sát bước sóng cực đại của QT1

Dung dịch Thể tích dung dịch chuẩn gốc (ml) Dung dịch đệm phosphate pH5.5 Nồng độ C (ppm) 1 3 Định mức tới vạch 100 ml 15.2723 2 4 20.3630 3 5 25.4538 4 6 30.5446 5 7 35.6353

Tiến hành quét phổ các dung dịch trên trong vùng từ 200 nm – 350 nm với mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat pH5.5

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(36)

17 Nguyễn Lầu Hai 3.5.3 Khảo sát độ tuyến tính

Mục đích: Xác định phương trình hồi quy y = ax + b hay A = aC + b và hệ

số tương quan tuyến tính (R) của nồng độ và độ hấp thụ

Pha các dung dịch Cephalexin ứng với các nồng độ như bảng sau: Bảng 3.3: Dãy dung dịch khảo sát độ tuyến tính QT1

Dung dịch Thể tích dung dịch chuẩn gốc (ml) Dung dịch đệm phosphate pH = 5.5 Nồng độ C (ppm) 1 3 Định mức tới vạch 100 ml 15.2723 2 4 20.3630 3 5 25.4538 4 6 30.5446 5 7 35.6353

Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch trên tại bước sóng 261 nm với mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat pH5.5

3.5.4 Khảo sát độ đúng

Mục đích: Xác định độ chính xác của phương pháp thông qua việc so sánh

lượng tìm thấy so với lượng thực thêm vào ban đầu và được tính dựa trên tỉ lệ phần trăm tìm lại (%).

Pha các dung dịch Cephalexin theo các tỉ lệ trong bảng sau: Bảng 3.4: Dãy dung dịch khảo sát độ đúng QT1

Dung dịch Thể tích dung dịch chuẩn gốc (ml) Thể tích dung dịch thử gốc (ml) Dung dịch đệm phosphate pH5.5 1 0 3 Định mức tới vạch 100 ml 2 1 3 3 2 3 4 3 3

Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch trên tại bước sóng 261 nm với mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat pH5.5

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(37)

18 Nguyễn Lầu Hai 3.5.5 Khảo sát độ lặp lại

Tiến hành định lượng lặp lại 6 lần mẫu Hapenxin 500 của CTCPDP Hậu Giang, số lô 150114 theo quy trình:

Cân 20 viên thuốc, lau sạch nang và cân lại khối lượng 20 nang từ đó tính khối lượng trung bình bột thuốc trong mỗi viên, trộn đều bột thuốc. Cân lặp lại 6 lần bột thuốc vừa trộn, mỗi lần tương đương 50 mg Cephalexin cho vào 6 bình định mức 100 ml đã đánh số từ 1 – 6, ghi lại khối lượng bột thuốc trong mỗi bình. Cho thêm và mỗi bình khoảng 75 ml dung dịch đệm phosphate pH5.5, siêu âm 15 phút. Sau đó, lấy ra định mức tới vạch bằng dung dịch đệm, lắc đều và lọc qua giấy lọc bỏ 20 ml đầu. Ứng với mỗi bình định mức được lọc vào 1 bình nón, các bình nón cũng được đánh số từ 1 – 6.

Hút chính xác 5 ml dịch lọc của 6 bình nón cho vào 6 bình định mức 100 ml khác cũng được đánh số 1’ – 6’, định mức tới vạch bằng dung dịch đệm và lắc đều. Tiến hành đo độ hấp thụ của 6 bình, mỗi bình lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình.

Hàm lượng Cephalexin được tính như sau:

Từ độ hấp thụ A của các dung dịch mỗi bình, dựa vào đường chuẩn ta tìm được nồng độ C. Sau đó áp dụng công thức sau để tính hàm lượng Cephalexin:

𝐻(%) = 𝐶 × 2000 × 𝑚𝑡𝑏

1000 × 𝑚 × 𝑃 × 100 Trong đó:

C: Nồng độ tính được bằng cách thế A vào phương trình hồi quy. mtb: Khối lương trong bình bột thuốc trong mỗi viên (mg).

m: Khối lượng bột thuốc cho vào bình định mức (mg). P: Hàm lượng Cephalexin ghi trên nhãn (mg).

2000: Độ pha loãng. 1000: Hệ số chuyển đổi.

3.6 Thẩm định quy trình 2 của phương pháp Pha các dung dịch sau:

Dung dịch chuẩn gốc: Cân 53.5 mg chuẩn Cephalexin (hàm lượng 94.8%)

cho vào bình định mức, thêm 70 ml nước, siêu âm 15 phút, định mức tới vạch bằng nước.

Dung dịch thử gốc: Cân 20 viên thuốc Hapenxin 500 mg (số lô 150114 –

050116), tính giá trị trung bình bột thuốc trong mỗi viên, trộn đều. Cân 57.4 mg

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(38)

19 Nguyễn Lầu Hai cho vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml nước, siêu âm 15 phút, định mức tới vạch bằng nước, lắc đều. Lọc bỏ 20 ml đầu, lọc lấy dịch lọc.

3.6.1 Khảo sát bước sóng cực đại, và độ ổn định phổ hấp thụ

Mục đích: Xác định bước sóng cực đại và kiểm tra sự ổn định phổ hấp thụ

của dung dịch Cephalexin ở các nồng độ khác nhau.

Pha các dung dịch Cephalexin ứng với các nồng độ như bảng sau: Bảng 3.5: Dãy dung dịch khảo sát bước sóng cực đại QT2

Dung dịch Thể tích dung dịch chuẩn gốc

(ml) Nước Nồng độ C (ppm) 1 3 Định mức tới vạch 100 ml 15.2154 2 4 20.2872 3 5 25.3590 4 6 30.4308 5 7 35.5026

Tiến hành quét phổ các dung dịch trên trong vùng từ 200 nm – 350 nm với mẫu trắng là nước.

3.6.2 Khảo sát độ tuyến tính

Mục đích: Xác định phương trình hồi quy y = ax + b hay A = aC + b và hệ

số tương quan tuyến tính (R) của nồng độ và độ hấp thụ.

Pha các dung dịch Cephalexin ứng với các nồng độ như bảng sau: Bảng 3.6: Dãy dung dịch khảo sát độ tuyến tính QT2

Dung dịch Thể tích dung dịch chuẩn gốc

(ml) Nước Nồng độ C (ppm) 1 3 Định mức tới vạch 100 ml 15.2154 2 4 20.2872 3 5 25.3590 4 6 30.4308 5 7 35.5026

Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch trên tại bước sóng 261 nm với mẫu trắng là nước.

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(39)

20 Nguyễn Lầu Hai 3.6.3 Khảo sát độ đúng

Mục đích: Xác định độ chính xác của phương pháp thông qua việc so sánh

lượng tìm thấy so với lượng thực thêm vào ban đầu và được tính dựa trên tỉ lệ phần trăm tìm lại (%).

Tiến hành pha các dung dịch Cephalexin theo các tỉ lệ trong bảng sau: Bảng 3.7: Dãy dung dịch khảo sát độ đúng QT2

Dung dịch Thể tích dung dịch chuẩn gốc (ml) Thể tích dung dịch thử gốc (ml) Nước 1 0 3 Định mức tới vạch 100 ml 2 1 3 3 2 3 4 3 3

Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch trên tại bước sóng 261 nm với mẫu trắng là nước.

3.6.4 Khảo sát độ lặp lại

Tiến hành định lượng lặp lại 6 lần mẫu Hapenxin 500 của CTCPDP Hậu Giang, số lô 150114 theo quy trình:

Cân 20 viên thuốc, lau sạch nang và cân lại khối lượng 20 nang từ đó tính khối lượng trung bình bột thuốc trong mỗi viên, trộn đều bột thuốc. Cân lặp lại 6 lần bột thuốc vừa trộn, mỗi lần tương đương 50 mg Cephalexin cho vào 6 bình định mức 100 ml đã đánh số từ 1 – 6, ghi lại khối bột thuốc trong mỗi bình. Cho thêm và mỗi bình khoảng 75 ml nước, siêu âm 15 phút. Sau đó, lấy ra định mức tới vạch bằng dung dịch đệm, lắc đều và lọc qua giấy lọc bỏ 20 ml đầu. Ứng với mỗi bình định mức được lọc vào 1 bình nón, các bình nón cũng được đánh số từ 1 – 6.

Hút chính xác 5 ml dịch lọc của 6 bình nón cho vào 6 bình định mức 100 ml khác cũng được đánh số 1’ – 6’, định mức tới vạch bằng nước và lắc đều. Tiến hành đo độ hấp thụ của 6 bình mỗi bình lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình.

Hàm lượng Cephalexin được tính như sau:

Từ độ hấp thụ A của các dung dịch mỗi bình, dựa vào đường chuẩn ta tìm được nồng độ C. Sau đó áp dụng công thức sau để tính hàm lượng Cephalexin:

DI

ỄN

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

ĐẠ

O TP.QUY

NH

ƠN

(40)

21 Nguyễn Lầu Hai 𝐻(%) = 𝐶 × 2000 × 𝑚𝑡𝑏

1000 × 𝑚 × 𝑃 × 100 Trong đó:

C: Nồng độ tính được bằng cách thế A vào phương trình hồi quy. mtb: Khối lương trong bình bột thuốc trong mỗi viên (mg).

m: Khối lượng bột thuốc cho vào bình định mức (mg). P: Hàm lượng Cephalexin ghi trên nhãn (mg).

2000: Độ pha loãng. 1000: Hệ số chuyển đổi. 3.7 Định lượng mẫu

Bảng 3.8: Các mẫu định lượng

Mẫu Tên thuốc Số lô & hạn dùng Nhà sản xuất

1 PMS OPXIL 500 01013 – 291216 CTCPDP Imexpharm 2 PMS OPXIL 500 00913 - 251216 CTCPDP Imexpharm 3 Hapenxin 500 100114 - 050116 CTCPDP Hậu Giang 4 Hapenxin 500 150114 - 050116 CTCPDP Hậu Giang 5 Cephalexin 500 27020414 - 020417 CTCPDP Cửu Long 6 Cephalexin 500 27020527 - 020417 CTCPDP Cửu Long

Đồng nhất mẫu: Mỗi mẫu cân 20 viên, lấy bột thuốc ra lau sạch nang và

cân khối lượng 20 nang. Từ đó tính khối lượng trung bình bột thuốc trong viên, trộn đều bột thuốc.