Isolamento e Identificação de Legionella spp.

(1)

Isolamento e Identificação de Legionella spp.

Milton Costa

Departamento de Ciências da Vida, Universidade de Coimbra e

(2)

The Story of Legionella

Symptoms

high fever, chills and cough muscle aches and headaches.

Time magazine American Legion Convention

July of 1976

182 ill 29 died

The Bellevue Stratford hotel, Philadelphia.

39 ill 5 died

en.wikipedia.org

•2–10 day incubation period - cases were dispersed across Pennsylvania

•lack of a centralized record of attendance of the convention

•known methods for culture, serology, tissue staining, and toxicology gave negative results

(3)

The Story of Legionella

Symptoms

high fever, chills and cough muscle aches and headaches.

Time magazine

Fraser DW. Lancet Infect Dis. 2005 American Legion Convention

July of 1976

182 ill 29 died

The Bellevue Stratford hotel, Philadelphia.

39 ill 5 died

(4)

The Genesis of Germs (Gillen 2007)

Second, the newly discovered bacterium was isolated in pure culture in the

laboratory. This necessitated

investigating L. pneumophila’s nutritional requirements and designing special growth media that would meet these narrow requirements for bacterial growth.

First, if the etiological agent were biological, then the agent had to be found to be regularly associated with the disease. Tissues from lung biopsies and sputum samples were examined for a recurring microorganism. A Gram-negative rod with a tendency to form long, looping filaments was consistently detected in specimens.

Third, a susceptible animal was needed to demonstrate that L.

pneumophila could produce

disease, particularly a

respiratory disease similar to Legionnaires’ disease in humans. The guinea pig was that animal. L. pneumophila was recovered from infected guinea pigs fulfilling Koch’s fourth postulate.

(5)

Legionella pneumophila strains distribution

Legionela-busters

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Nascentes termais

Primeiros isolamentos de Legionella spp. em tabuleiros de água morna na unidade de prematuros no Hospital Pediátrico de Coimbra.

Veríssimo, A., G. Vesey, M. G. Rocha, G. Marrão, J. Colbourne, P. J. Dennis & M. S. da Costa. (1990) A hot water

supply as the source of Legionella pneumophila in incubators of a neonatology unit. Journal of Hospital Infections, 15:

255-263.

O António Verissimo e eu relacionámos as temperaturas de isolamento de Legionella com temperatura de nascentes termais e decidimos saber se colonizavam nascentes termais.

(7)

As espécies do género Legionella

•L. adelaidensis •L. anisa •L. belardiensis •L. birminghamensis •L. bozemanii •L. brunensis •L. busanensis •L. cherrii •L. cincinnatiensis •L. drancurtii •L. dresdenensis •L. drozanskii •L. dumoffii •L. erythra •L. fairfieldensis •L. fallonii •L. feeleii •L. geestiana •L. gormanii •L. gratiana •L. gresilensis L. hackeliae L. impletisoli L. israelensis L. jamestowniensis L. jordanis L. lansingensis L. londiniensis L. longbeachae L. lytica L. maceachernii L. massiliensis L. micdadei L. moravica L. nagasakiensis L. nautarum L. oakridgensis L. parisiensis L. pneumophila L. quateirensis L. quinlivanii

Cerca de 22 espécies associadas a doença

L. rowbathamii L. rubrilucens L. sainthelensi L. santicrucis L. shakespearei L. spiritensis L. steigerwaltii L. tauriensis L. tucsonensis L. tunisiensis L. wadsworthii L. waltersii L. worsleiensis L. yabuuchiae

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Anticorpos Policlonais

L. pneumophila sg 1 L. micdadei L. pneumophila sg 2 L. santicrucis L. pneumophila sg 3 L. spiritensis L. pneumophila sg 4 L. steigerwaltii L. pneumophila sg 5 L. wadsworthi L. pneumophila sg 6 L. dumofii L. pneumophila sg 7 L. gormanii L. pneumophila sg 8 L. oakridgensis L. pneumophila sg 9 L. londiniensis L. pneumophila sg 10 L. moravica L. pneumophila sg 11 L. nautorum L. pneumophila sg 12 L. pneumophila sg 13 L. pneumophila sg 14 L. pneumophila sg 15 L. bozemanii sg1 L. bozemanii sg2 L. erythra L. feelei sg1 L. feelei sg2 L. israelensis L. jamestowniensis L. jordanis L. longbeachae sg1 L. longbeachae sg2 L. rubrilucensis

Imunofluorescência indirecta

Anticorpos Monoclonais para L. pneumophila

MAB 1 MAB 2 MAB 3 W32 33G2 32A12 144C2 W29 P4C3 P9C3 P 13-15 W36 W32 4032 W39 JR5 K1 G6 Um flagelante

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Amostra de água

Filtração

Concentrado

Directo

Tratamento

calor

Tratamento

_ácido

Espalhamento em GVPC

Incubação a 37ºC, 3 a 10 dias

Processar amostras

Norma ISO 11731

BCYE BCYE INC

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Visualização das colónias suspeitas

Identificação presumptiva de Legionella spp.

BCYE

BCYE sem cisteína

Purificação

Preservação

Identificação

Identificação presumptiva

Norma ISO 11731

Latex Ser1, Ser2-14, Ser2-15

Ácidos gordos ou 16s rRNA

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Identificação de Legionella pelos ácidos gordos

6790 amostras examinadas entre 1997 e 2013 para legionelas.

Cerca de 1600 estirpes de Legionella identificadas pela análise dos ácidos gordos.

Este banco de dados, foi adoptado pela MIDI e estamos agora acreditados dentro da Norma ISO 11731 e prNP4422. Em casos de dúvida podemos pesquisar o gene dotA for PCR para confirmar L. pneumophila. Mais vulgarmente usamos sequenciação do gene 16S rRNA-

Temos conservadas um número muito grande de estirpes de espécies de Legionella. As não-pneumophila mais

isoladas pertencem a L. oakridgensis, L. londiniensis, L.

(13)

Aquicella lusitana

e Aquicella siphonis

“Algumas coisas não são aquilo que parecem”

Santos, P., I. Pinhal, F. A. Rainey, N. Empadinhas, J. Costa, B. Fields, R. Benson, A. Veríssimo & M. S. da Costa

(2003). The Gamma-Proteobacteria, Aquicella lusitana gen. nov., sp. nov. and Aquicella siphonis, sp. nov., infect protozoa

(14)

Parentes mais próximos são Rickettsiella (doença em insectos).

Rickettsiella

spp., parasitas intracelulares, nunca foram cultivadas.

Legionella

spp. e Aquicella spp. são cultiváveis.

Aquicella

spp.

Crescem só em meios com carvão, extracto de levedura e

a

_{-cetoglutarato ou piruvato.}

Crescimento aeróbio ou microaeróbio.

Não cresce em anaerobiose.

Aquicella lusitana

e Aquicella siphonis

(15)

Meio de cutura

líquido

Espaçamento de

agar

Carvão Activado

Este processo permitiu-nos examinar várias

condições de crescimento de Legionella e Aquicella

que não seria possível com meios sólidos contendo

carvão.

Gama de temperatura de crescimento,

Gama de pH de crescimento,

Substratos assimilados,

Aquicella lusitana

e Aquicella siphonis

(16)

Aquicella lusitana

Aquicella siphonis

Hartmannella vermiformis

Infecção crónica (10

3

_/cell),

não é aguda (10

5

_-10

6

_{/cell) como Legionella spp.}

Aquicella

spp. infectam Hartmanella vermiformis

Células humans infectadas

com Legionella

Aquicella

spp. não infectam macrófagos humanos

Aquicella lusitana

e Aquicella siphonis

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AS PESSOAS E AS ORGANIZAÇÔES FINANCIADORAS

António Verissímo Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Fernanda Nobre

Sociedade das Águas de Luso, SA

Joana Costa

Cinágua

Graça Rocha

Gina Marrão

Alexandra Diogo

Filipa d’ Avó

Paula Morais

Richard Bowker

Barry Fields

(18)

Instituto Superior de Engenharia do Porto| 24 outubro 2013 Workshop "Prevenção e Controlo de Legionella nos Sistemas de Água"

Legionella pneumophila em ambientes aquáticos

(19)

Transmissão de Legionella (Fraser, 1984)

Ambientes naturais

Factores de amplificação

Disseminação Ambientes intervenção humana

Exposição por uma população susceptível Inoculação

LEGIONELOSE

(20)

Água de profundidade Lagos

Natural spring

Rios

Nascentes quentes Biofilmes

Nascentes

Ambientes aquáticos naturais Ambientes aquáticos artificiais ou de intervenção humana

Fontes Piscinas Torres de arrefecimento Sistemas de distribuição Chuveiros Solo jardinagem

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Legionela – de organismo ambiental a agente patogénico acidental

Fleirmans e colegas em 1981 analisaram centenas de amostras de inúmeros lagos e rios dos Estados Unidos. O estudo detectou legionelas na maioria das amostras, mas apenas 15% provocaram doença em porquinhos da índia.

Verificaram ainda um efeito sazonal na detecção de legionelas, aumentando a sua concentração nos meses de verão.

Tison e colegas em 1983 realizaram um estudo nos lagos e rios do Monte de St. Helena e detectaram elevadas concentrações de legionelas nas águas termais aquecidas.

Estudos realizados em Portugal Continental e no Açores por Veríssimo e colegas também identificaram múltiplas espécies de legionelas em águas com temperaturas entre os 22ºC e os 67.5°C.

Apesar das legionelas serem facilmente recuperadas em águas superficiais, só recentemente Costa e colegas conseguiram isolá-las de águas de profundidade, onde se pensa que existam em muito baixas concentrações.

L. longbeach representa uma notável excepção, uma vez que é predominantemente isolada de solo. Esta espécie é responsável pela maioria dos casos de Legionelose na Austrália, que ocorrem entre jardineiros.

(22)

Os ambientes naturais são raramente associados a casos de legionelose.

As legionelas multiplicam-se muito lentamente a baixas temperaturas, o que resulta num equilíbrio natural entre a concentração das bactérias e dos seus hospedeiros. Concentração esta abaixo do limite mínimo necessário para causar infecção em humanos.

A maioria dos casos de doença está associada a ambientes sujeitos a intervenção humana onde temperatura da água é superior, alterando a concentração quer das bactérias quer dos seus hospedeiros naturais.

Assim, variações na temperatura da água podem alterar o equilíbrio entre as legionelas e os protozoários, resultando num aumento rápido da concentração das bactérias, podendo causar doença.

Legionela – de organismo ambiental a agente patogénico acidental

Ambientes naturais _{Ambientes intervenção humana}

103_{a 10}6_leg/L

<1% população

> 106 _leg/L

50% população Concentração bacteriana como factor determinante para a ocorrência de doença

(23)

temperaturas entre 6ºC e 63ºC – óptimo 37ºC

valores de pH entre 5.5 e 8.1

oxigénio dissolvido entre 0.3 e 9.6 mg/ml

Carácter ubíquo em ambientes aquáticos não salinos

Factores que favorecem o aumento da sua concentração

presença de outros organismos

zonas de reduzida circulação de água

presença de sedimentos

(24)

Legionela – de organismo ambiental a agente patogénico acidental

Legionellae multiplica-se no ambiente em:

14 espécies de amoebae 2 espécies de ciliados 1 espécie de Myxomycota

Os protozoários são ubíquos em diversos ambientes naturais, como água doce e salgada, água salobra, solos húmidos e em areias secas.

As legionelas não são bactérias de vida livre, multiplicam-se intracelularmente em vários

tipos de protozoa sendo esta relação crucial para a ecologia do organismo.

(25)

ciriscience.org

http://www.q-net.net.au

Amoeba aprisionando L. pneumophila

Macrófago preenchido com ~100 Legionella

Berk et al., 2008 Appl. Environ. Microbiol.

Berk et al., 1998 Appl. Environ. Microbiol.

Acanthamoeba spp. produz vesículas

respiráveis contendo legionelas

Ciliados expelem vesículas contendo legionelas

Hilbi et al., 2010 Mol. Microbiol.

C. elegans é um hospedeiro

metazoário de legionelas

Brassinga et al., 2010 Mol. Microbiol.

A infecção de Humanos por legionelas é um desvio ao seu ciclo de vida natural em amoebae

(26)

Legionela – de organismo ambiental a agente patogénico acidental

O relacionamento entre as legionelas e amebas propicia de facto uma forma de protecção capaz de potenciar a capacidade de sobrevivência destas bactérias a ambientes hostis.

Provavelmente esta protecção será a explicação mais plausível para o facto das legionelas conseguiram transitar de ambientes naturais para ambientes de intervenção humana, suportando os vários tratamentos a que a água é sujeita.

stress térmico e osmótico. biocidas

(27)

Biofilmes

A maior parte da actividade bacteriana na natureza ocorre, não com as células individualizadas, mas com as bactérias organizadas em comunidades sob a forma de um biofilme. Esses biofilmes são constituídos por uma comunidade estruturada de células aderentes a uma superfície inerte (abiótica) ou viva (biótica), embebidas numa matriz de exopolissacárido.

A associação dos organismos em biofilmes constitui uma forma de protecção ao seu desenvolvimento, fomentando relações simbióticas e permitindo a sobrevivência em ambientes hostis.

Em ecossistemas aquáticos, mais de 99,9% das bactérias crescem em biofilmes associadas a uma grande variedade de superfícies.

Os biofilmes mais comuns na natureza são heterogéneos, compostos por duas ou mais espécies, podendo os produtos do metabolismo de uma espécie auxiliar o crescimento das outras e a adesão de uma dada espécie fornecer ligandos que promovem a ligação de outras.

Inversamente, a competição pelos nutrientes e a acumulação de metabolitos tóxicos produzidos pelas espécies colonizadoras poderão limitar a diversidade de espécies num biofilme.

(28)

Biofilmes

Protecção contra: • Radiações UV • Fagocitose • Desidratação • Predadores • Antimicrobianos

Os principais componentes estruturais de biofilmes são: • Microrganismos

• Matriz de exopolímeros

• Componentes de origem não-biológica

Cooperação metabólica e disponibilidade de nutrientes

as legionelas atingem sistemas de distribuição de água potável, e

através deles, mesmo após

tratamento da água, permanecem viáveis até ao fim da linha de distribuição de água de hotéis, hospitais e outros edifícios, incluindo torres de arrefecimento de sistemas de ar condicionado, cilindros de aquecimento, torneiras e chuveiros

(29)

(30)

Um estudo de genómica comparada demonstrou que bactérias e vida livre possuem, em regra, genomas maiores do que bactérias intracelulares.

Contudo este paradigma não se aplica a bactérias que reside em amibas.

(31)

Moliner et al., 2009 FEMS Microbiol Rev

O paradigma de Legionella pneumophila

(32)

guinea pig alveolar macrophages infected in vitro with L. pneumophila

http://news.bbc.co.uk/2/hi/science/nature/3677756.stm

A capacidade inata das legionelas conseguirem replicar-se em diferentes protozoa equipou estas

bactérias com a capacidade de se replicarem em macrófagos alveolares humanos.

(33)

Residem na via endocítica

Interagem com a via secretora

Reside nos lisossomas

Bactérias que foram internalizadas por células eucarióticas necessitam de evitar a fusão

com o lisossoma ou desenvolver estratégias para sobreviver neste organelo. Bactérias que reside em

vacúolos que mantêm as características de endossomas

Bactérias alteram a via endocítica e estabelecem vacúolos com características únicas

Interagem com a via secretora

Replicação de legionelas em células eucariotas: estratégia essencial de virulência

(34)

Adaptado de Garduno, RA. 2008. In: Legionella pneumophila: pathogenesis and immunity and Molmeret et al., 2004 Microbes Infect.

Nucleus

Forma Replicativa

Forma Virulenta Intermediário Vesícula

Adesão e entrada Saída Maturação Diferenciação Estabelecimento Replicação Protozoa Transmissão a humanos através de aerossóis contaminados

Fase replicativa Fase transmissiva Macrófago

(35)

Bruggemannet al., 2006 Cell Microbiol Jules and Buchrieser 2007 FEBS Letters

Forma replicativa Forma virulenta Transição rigorosamente regulada Expressão de factores relacionados com a virulência

(36)

Yang et al., 2008 IJSEM

53 espécies de Legionella,

todas capazes de infectar protozoários

24 espécies foram associadas a casos de doença

(37)

Yang et al., 2008 IJSEM

L. pneumophila sg. 1

90% dos casos de Legionelose

(38)

Há um bias entre a prevalência de L. pneumophila como principal responsável por

casos de doença e a sua distribuição ambiental

Prevalência de Legionella sp. – doença vs ambiente

L. pneumophila sg.1; 84% L. pneumophila sg. 2-14; 6% Legionella bozemanae, L. micdadei, and L. longbeachae; 7% Other Legionella sp.; 3% L. pneumophila sg 1; 29,1% L. pneumophila sg 2-14; 46,5% Total non-pneumophila legionellae; 24,4%

L. pneumophila sg.1 corresponde a 30% dos isolados ambientais e a 84% dos isolados clínicos

Distribuição ambiental

(39)

Estirpes clínicas são

menos diversas que

estirpes de

ambientes artificiais

Ambientes artificiais

Estirpes clínicas

L. pneumophila sg1 associada a doença pode não ser devido à sua prevalência no ambiente, mas sim a uma maior

capacidade infecciosa. Assim, isolados de ambientes artificiais e clínicos podem constituir um sub-grupo de todos os genótipos existentes especialmente adaptados.

(40)

Como as infecções têm origem

ambiental e não ocorre

transmissão entre pessoas, o estudo da diversidade genética

subjacente a variações na

capacidade infecciosa de estirpes isoladas de ambientes naturais, bem como de ambientes artificiais e clinicas, é fundamental na

determinação de quais os

mecanismos críticos no processo infeccioso.

Apesar do seu carácter ubíquo em ambientes aquáticos, a maioria dos estudos em legionelas focam estirpes isoladas de ambientes sujeitos a intervenção humana na tentativa de estabelecer a ligação epidemiológica entre o ambiente e casos clínicos.

Ambientes

Natural

Ambientes artificiais

Estirpes clínicas

(41)

Roy and Isberg, 1997 Infect. Immun.

Wild-type L.

pneumophila

Defective for all icm/dot-mediated virulence

activities

dotA

Wild-type L.

pneumophila

Defective for all icm/dot-mediated virulence activities dotA Effector protein Invasion and

trafficking pore L. pneumophila Lysossm_e

maior ilha de patogeneicidade, o complexo “intracellular multiplication (icm)/defective organelle trafficking (dot)” é absolutamente necessário para a multiplicação em amibas e macrófagos

(42)

80 estirpes naturais

74 estirpes de ambientes de intervenção humana

21 estirpes de referências e tipo (Bumgbaugh et al., 2002; Ko et al., 2002; Costa et al., 2005) 119 estirpes de ambientes de intervenção humana e clínicas não relacionadas (Ko et al., 2006) Estirpes Paris, Lens and Corby (Cazalet et al., 2004; Glöckner et al., 2007)

(43)

Estrutura da população inferida pelo

gene dotA

IZ47 IZ88 NM19 IZ41 IZ58 Al f1 Fel g1 4 JLP 10 09 IS 27 AT CC331 53IZ7 K01 35 K01 40 SG T50 SG3 ma29 SGT2 74 K01 25 Alf30 K01 39 SGT2 95 Aco1 3 Felg1 5 ATCC331 54 IS12 ATCC331 55 IZ19 JLP10 59 JLP10 62 Alf31 ACO 28 ATCC432 83 K01Alf38 9 JLP1012 JLP1016 JLPK011018 61 IZ4 NCTC114 04 K0134 Felg20 SGT2K0137K0124K0131K0141K0142IZ7584 JLP1013K0136K0129K0130K0132K0133 strainSF9ATCC33823NCTC1191JLP1060JLP1038EDT-3ED13ED7

JLP1003ACO9HUC2HUC4MUCan40K0151R1 JLP 1004 MU R4 MU R7 ATCC437 36 SG13 JLP10K01K01K01K01Paris₃₀43714567 JLP 10 61 JLP 10 05 K01 68 K01 54 ARN24 JLP 10 24 K01 69 Por19 JLP 10 55 AT_CC352 89 JLP 10 45 JLP 10 42 JLP 10 39 JLP 10 46 JLP 10 27 AT_CC431 10 JLP 10 29 JLP 10 5659K01 AT CC431 1348K01 str ai nO LDA K01 46 K01 7072 K01 JLP 10 40 JLP 10 10 ARN23 JLP 10 43 JLP 10 31 JLP 10 44 AT CC431 07 po r9 AT CC331 52 53 K01 JLP 10 22 63 K01 JLP10 53 FELG 84 JLP10 34 JLP10 21 JLP10 58 JLP10 33 ED10 FELG 75 JLP10 15 JLP1032 ATCC350 96 FELG78 CAN45 CAN44 AQ70 CAATN43CC431 06 ATCC438 01 HRD2 Can30 K0155 AQ71 Le61 ARN25 AQ69 HRD1JLP1011Can26_JLP1001_JLP1020Can10Can5JLP1002_ATCC431

30 AGK01N2 64 GER8 AGN8 GER81 GER3 Corby JLP 1063 K01 49 JLP 1025 Por3 JLP10 23 FELG 172 SGT1 50 AGN3 FELG 183 AGN9 Alf22 ALF18 JLP1028 JLP1026 NM1 NM6

NM44 IMC5_IMC15IMC1Le66IMC9Le52IMC1IMC2IMC12Le73IMC273 JLP1048 SG46 IS65 IS60 IS13 ma19 JLP1050 ma36 IS30 IS22 EDT -10 EDT -1 ma₃₄ AG_N4 AG_N7 FELG 21₅ FE_LG 24 4 SG T54 SG₁₅ 0 Ger12 SG_T ED8 SG T5₁ SG T3₂₇ Le78 SG T5₃ SG T2₅₆ G ER10 SG 1 SG T1₂₉ SG T7₉ SG 82 SG T2 80 Ac o6 0 ACO 5 SG 64SG T3 02 ACO 33 ACO 15 ACO 41 SG T6 7 SG 69 Le171 JLP 10 66 9 ATCC437 Aco2 03 SG T286 JLP1068 JLP10₅₄ JLP 1070 JLP 10₆₉ JLP 10 64 ma31 Aco22 ATCC43290 ma18 ACO48 Faco3 Aco8 JLP10₄₁ Aco 20 JLP 1007 K01₆₂ K01JLP₅₂ 10₅₇ FRO 6 ALF15 IS₁ JLP 10 71 m a28 m a32 m a1 FRO 5 JLP 10 49 JLP 10 52 JLP 10 67 K01 26 K01 47 AT_CC332 15 K01 27 JLP 10 06 JLP 10 37 Fac o1Fac o5 Lens AT CC431 12 JLP 10 08 m a16 JLP 10 36 K01 28 JLP 10 35 ACO 12 Aco6 7 10 JLP 47 10 JLP 65 JLP 10 51 NM18 NM49 NM22 NM53 Le58 Le49 K01 57 K01 56 K01 65 ATCC332 16 K01 66 K01 58 ATCC337 35 ATCC337 36 ATCC337 37 ATCC331 56 1017 1014 ATCC352 JLPJLP 51 JLP 1019 0.02 dotA-A dotA-B dotA-C dotA-D dotA-E IZ47 IZ88 NM19 IZ41 IZ58 Al f1 Fel g1 4 JLP 10 09 IS 27 AT CC331 53IZ7 K01 35 K01 40 SG T50 SG3 ma29 SGT2 74 K01 25 Alf30 K01 39 SGT2 95 Aco1 3 Felg1 5 ATCC331 54 IS12 ATCC331 55 IZ19 JLP10 59 JLP10 62 Alf31 ACO 28 ATCC432 83 K01Alf38 9 JLP1012 JLP1016 JLPK011018 61 IZ4 NCTC114 04 K0134 Felg20 SGT2K0137K0124K0131K0141K0142IZ7584 JLP1013K0136K0129K0130K0132K0133 strainSF9ATCC33823NCTC1191JLP1060JLP1038EDT-3ED13ED7

JLP1003ACO9HUC2HUC4MUCan40K0151R1 JLP 1004 IZ47 IZ88 NM19 IZ41 IZ58 Al f1 Fel g1 4 JLP 10 09 IS 27 AT CC331 53IZ7 K01 35 K01 40 SG T50 SG3 ma29 SGT2 74 K01 25 Alf30 K01 39 SGT2 95 Aco1 3 Felg1 5 ATCC331 54 IS12 ATCC331 55 IZ19 JLP10 59 JLP10 62 Alf31 ACO 28 ATCC432 83 K01Alf38 9 JLP1012 JLP1016 JLPK011018 61 IZ4 NCTC114 04 K0134 Felg20 SGT2K0137K0124K0131K0141K0142IZ7584 JLP1013K0136K0129K0130K0132K0133 strainSF9ATCC33823NCTC1191JLP1060JLP1038EDT-3ED13ED7

JLP1003ACO9HUC2HUC4MUCan40K0151R1 JLP 1004 MU R4 MU R7 ATCC437 36 SG13 JLP10K01K01K01K01Paris₃₀43714567 JLP 10 61 JLP 10 05 K01 68 K01 54 ARN24 JLP 10 24 K01 69 Por19 JLP 10 55 AT_CC352 89 JLP 10 45 JLP 10 42 JLP 10 39 JLP 10 46 JLP 10 27 AT_CC431 10 JLP 10 29 JLP 10 5659K01 AT CC431 1348K01 str ai nO LDA K01 46 K01 7072 K01 JLP 10 40 JLP 10 10 ARN23 JLP 10 43 JLP 10 31 JLP 10 44 AT CC431 07 po r9 AT CC331 52 53 K01 JLP 10 22 63 K01 JLP10 53 FELG 84 JLP10 34 JLP10 21 JLP10 58 JLP10 33 ED10 FELG 75 JLP10 15 JLP1032 ATCC350 96 FELG78 CAN45 CAN44 AQ70 CAATN43CC431 06 ATCC438 01 MU R4 MU R7 ATCC437 36 SG13 JLP10K01K01K01K01Paris₃₀43714567 JLP 10 61 JLP 10 05 K01 68 K01 54 ARN24 JLP 10 24 K01 69 Por19 JLP 10 55 AT_CC352 89 JLP 10 45 JLP 10 42 JLP 10 39 JLP 10 46 JLP 10 27 AT_CC431 10 JLP 10 29 JLP 10 5659K01 AT CC431 1348K01 str ai nO LDA K01 46 K01 7072 K01 JLP 10 40 JLP 10 10 ARN23 JLP 10 43 JLP 10 31 JLP 10 44 AT CC431 07 po r9 AT CC331 52 53 K01 JLP 10 22 63 K01 JLP10 53 FELG 84 JLP10 34 JLP10 21 JLP10 58 JLP10 33 ED10 FELG 75 JLP10 15 JLP1032 ATCC350 96 FELG78 CAN45 CAN44 AQ70 CAATN43CC431 06 ATCC438 01 HRD2 Can30 K0155 AQ71 Le61 ARN25 AQ69 HRD1JLP1011Can26_JLP1001_JLP1020Can10Can5JLP1002_ATCC431

NM44 IMC5_IMC15IMC1Le66IMC9Le52IMC1IMC2IMC12Le73IMC273 JLP1048 SG46 IS65 IS60 IS13 ma19 JLP1050 ma36 IS30 IS22 EDT -10 EDT -1 ma₃₄ AG_N4 AG_N7 HRD2 Can30 K0155 AQ71 Le61 ARN25 AQ69 HRD1JLP1011Can26_JLP1001_JLP1020Can10Can5JLP1002_ATCC431

NM44 IMC5_IMC15IMC1Le66IMC9Le52IMC1IMC2IMC12Le73IMC273 JLP1048 SG46 IS65 IS60 IS13 ma19 JLP1050 ma36 IS30 IS22 EDT -10 EDT -1 ma₃₄ AG_N4 AG_N7 FELG 21₅ FE_LG 24 4 SG T54 SG₁₅ 0 Ger12 SG_T ED8 SG T5₁ SG T3₂₇ Le78 SG T5₃ SG T2₅₆ G ER10 SG 1 SG T1₂₉ SG T7₉ SG 82 SG T2 80 Ac o6 0 ACO 5 SG 64SG T3 02 ACO 33 ACO 15 ACO 41 SG T6 7 SG 69 Le171 JLP 10 66 9 ATCC437 Aco2 03 SG T286 JLP1068 JLP10₅₄ JLP 1070 JLP 10₆₉ JLP 10 64 ma31 Aco22 ATCC43290 ma18 ACO48 Faco3 Aco8 JLP10₄₁ Aco 20 JLP 1007 K01₆₂ K01JLP₅₂ 10₅₇ FRO 6 ALF15 IS₁ JLP 10 71 m a28 m a32 m a1 FRO 5 JLP 10 49 JLP 10 52 JLP 10 67 K01 26 K01 47 AT_CC332 15 K01 27 JLP 10 06 JLP 10 37 Fac o1Fac o5 Lens AT CC431 12 JLP 10 08 m a16 JLP 10 36 K01 28 JLP 10 35 ACO 12 Aco6 7 10 JLP 47 10 JLP 65 JLP 10 51 NM18 NM49 NM22 NM53 Le58 Le49 K01 57 K01 56 K01 65 ATCC332 16 K01 66 K01 58 ATCC337 35 ATCC337 36 ATCC337 37 ATCC331 56 1017 1014 ATCC352 JLPJLP 51 JLP 1019 0.02 dotA-A dotA-B dotA-C dotA-D dotA-E dotA-A dotA-B dotA-E dotA-D dotA-C

Neighbor-joining method

(MEGA4)

Costa et al., 2010 Environ. Microbiol.

(44)

Influência da recombinação na

evolução do gene dotA

RDP3

(Recombination detection program)

Philadelphia Lansing 3 Paris Lansing 3 82A3105 Alf18 Concord 3 Chicago 8 Leiden 1 Bloomington 2 IN-23G1-C2 797-PA-H LE58 AGN2

LE58 Bloomington 2 797-PA-H

Corby Lens 713 Alf18 Unknown Dallas 1E IMC23 Unknown Felg244 Unknown IS30 Unknown 1169-MN-H Leiden 1 Unknown Bloomington 2 NM1 Leiden 1 Unknown U7W Corby Unknown MICU B Corby Unknown U8W Corby Unknown Lansing 3 Unknown Los Angeles 1 Unknown Dallas 1E U8W Unknown LE58 713 Unknown Chicago 2 LE58 Dallas 1E Togus 1 LE58 Dallas 1E 570-CO-H LE58 Dallas 1E LE58 Dallas 1E 713 Lens Lansing 3 Lansing 3 Lansing 3 Lansing 3 Lansing 3 Lansing 3 Lansing 3 17 LE58 AGN2 17 17 17 17 17 17 17 17 4 19 19 19 16 7 10 18 3 15 15 15 15 15 15 5 6 2 13 13 13 12 12 12 12 12 12 8 9 12 14 14 14 14 1 11 11 11 11 dotA-A dotA-B dotA-C dotA-D Philadelphia Lansing 3 Paris Lansing 3 82A3105 Alf18 Concord 3 Chicago 8 Leiden 1 Bloomington 2 IN-23G1-C2 797-PA-H LE58 AGN2

LE58 Bloomington 2 797-PA-H

Corby Lens 713 Alf18 Unknown Dallas 1E IMC23 Unknown Felg244 Unknown IS30 Unknown 1169-MN-H Leiden 1 Unknown Bloomington 2 NM1 Leiden 1 Unknown U7W Corby Unknown MICU B Corby Unknown U8W Corby Unknown Lansing 3 Unknown Los Angeles 1 Unknown Dallas 1E U8W Unknown LE58 713 Unknown Chicago 2 LE58 Dallas 1E Togus 1 LE58 Dallas 1E 570-CO-H LE58 Dallas 1E LE58 Dallas 1E 713 Lens Lansing 3 Lansing 3 Lansing 3 Lansing 3 Lansing 3 Lansing 3 Lansing 3 17 LE58 AGN2 17 17 17 17 17 17 17 17 4 19 19 19 16 7 10 18 3 15 15 15 15 15 15 5 6 2 13 13 13 12 12 12 12 12 12 8 9 12 14 14 14 14 1 11 11 11 11 dotA-A dotA-B dotA-C dotA-D

(45)

dotA-A dotA-B dotA-C dotA-D Philadelphia 1 Paris 82A3105 Concord 3 Chicago 8 Leiden 1 Bloomington 2 IN-23-G1-C2 797-PA-H AGN2 Corby Alf18 IMC23 Felg244 IS30 1169-MN-H NM1 U7W U8W MICU B Lansing 3 Los Angeles 1 Dallas 1E LE58 Chicago 2 Togus 1 570-CO-H Lens 713 F₂₆ S₁₀₄₁ dotA-A dotA-B dotA-C dotA-D Philadelphia 1 Paris 82A3105 Concord 3 Chicago 8 Leiden 1 Bloomington 2 IN-23-G1-C2 797-PA-H AGN2 Corby Alf18 IMC23 Felg244 IS30 1169-MN-H NM1 U7W U8W MICU B Lansing 3 Los Angeles 1 Dallas 1E LE58 Chicago 2 Togus 1 570-CO-H Lens 713 F₂₆ S₁₀₄₁

Substituição de aminoácidos

HAPPLOT

(46)

Estirpes de L. pneumophila isoladas de ambientes naturais (i.e. rios, lagos), possuem maior diversidade alélica e são distintas da maioria das linhagens contendo estirpes relacionadas com casos de doença.

os alelos do gene dotA de estirpes isoladas de ambientes artificiais e relacionadas com casos clínicos estão sob pressão selectiva purificadora, antevendo que essas estirpes pertencem a um sub-grupo de todos os clones que foi selecionado pela sua capacidade de sobreviver e proliferar em ambientes artificiais e infectar com sucessos humanos.

A preservação da diversidade alélica do gene dotA nas estirpes ambientais antevê adaptações a diversos nichos.