DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR PARA O VÍRUS DA DENGUE UTILIZANDO A TECNOLOGIA DE NANOBASTÕES DE OURO

26

DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR PARA O VÍRUS

DA DENGUE UTILIZANDO A TECNOLOGIA DE

NANOBASTÕES DE OURO

A

F

V

,

A

C

J

,

L

O

L

,

F

G

F

Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas – Departamento de Microbiologia1_{. Instituto de Ciências Exatas – Departamento de Física}2_{. Belo Horizonte, Minas Gerais -}

Brasil. E-mail: alicefv_vet@yahoo.com.br3

Abstract. Dengue is the most important arboviral disease in the world, and in the last twenty years

significant increases in the epidemic activity, expansion of the geographical distribution, continuous transmission of several serotypes and emergency of the Dengue Haemorrhagic Fever (DHF) in areas where the disease was not previously prevalent were observed. In terms of epidemiological impact, Dengue (DENV) infections represent the most important infectious disease in Brazil. Consequently, the development of a rapid and efficient diagnostic test is considered a high priority. Nanotechnology is a field of interdisciplinary research involving chemistry, engineering, biology and medicine - with great potential for use in methods of detection, diagnosis and treatment. The Gold Nanorods (AuNR) are of particular interest, especially considering their optical properties and chemistry of the surface. The aim of this work is to develop a biosensor for rapid diagnosis for DENV through serological analysis by UV-visible spectroscopy. In order to build this tool, AuNR were previously functionalized with intermediary reagents to allow interaction with the envelope protein of DENV serotype 3. This interaction was confirmed by UV-visible spectroscopy, transmission electron microscopy and atomic force microscopy. After checking the functionalization, monoclonal antibodies were associated to the tool and interaction demonstrated by UV-visible spectroscopy. The functionalized AuNR were then tested by ELISA, confirming their reactivity to DENV monoclonal antibodies. This biosensor proved to be a rapid alternative for screening positive patients, showing high sensitivity and specificity. Further tests are necessary to adapt the scale experiments for possible commercialization.

Resumo. A Dengue é a arbovirose mais importante no mundo, observando-se que nos últimos 20 anos

houve um aumento significativo na atividade epidêmica, na expansão da distribuição geográfica, na transmissão concomitante de vários sorotipos e na emergência da Febre Hemorrágica do Dengue (FHD) em áreas onde a doença antes não era predominante. Em termos de impacto epidemiológico, a Dengue representa a mais importante doença infecciosa do Brasil. Consequentemente, o desenvolvimento de um teste diagnóstico rápido e eficiente é considerado de grande prioridade. A Nanotecnologia é um campo de pesquisa interdisciplinária que envolve química, engenharia, biologia e medicina – tendo um grande potencial de utilização como métodos de detecção, diagnóstico e tratamento. Os Nanobastões de Ouro (do inglês, AuNR) são particularmente interessantes, principalmente do ponto de vista de suas propriedades ópticas e pela química de sua superfície. O objetivo deste trabalho é desenvolver um biossensor de diagnóstico rápido para DENV através da análise sorológica por espectroscopia de UV-visível. Para o desenvolvimento desta ferramenta, os AuNR foram previamente funcionalizados com reagentes intermediários para permitir sua interação com a proteína do envelope do vírus da Dengue, sorotipo 3. Esta interação foi confirmada por espectroscopia de UV-visível, microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de força atômica. Após a verificação da funcionalização, anticorpos monoclonais foram associados à ferramenta e a interação comprovada por espectroscopia de UV-visível. Os AuNR associados à proteína foram então testados por ELISA, confirmando sua reatividade a anticorpos monoclonais para DENV. Este biosensor provou ser uma alternativa rápida para triagem de pacientes

positivos, apresentando alta sensibilidade e especificidade. Novos testes são necessários para adaptar os experimentos em escala para possível comercialização.

Palavras-chave: Diagnóstico, Dengue vírus, Nanotecnologia, Nanobastões de ouro.

Introdução

Pode-se descrever a Nanotecnologia como a criação, manipulação e exploração de materiais em escala manométrica. A Nanotecnologia é um campo de pesquisa interdisciplinária que envolve química, engenharia, biologia e medicina – tendo um grande potencial de utilização como métodos de detecção, diagnóstico e tratamento. Nanopartículas de ouro oferecem um número de propriedades que as tornam apropriadas para aplicações biológicas. Em particular, apresentam um forte pico óptico que pode ser variado pelo controle da morfologia da partícula, são elétron densas e radiopacas, a química de sua superfície permite uma fácil ligação a moléculas orgânicas adaptadas a necessidades específicas, e elas manifestam um baixo nível de toxicidade quando introduzidas em sistemas biológicos (Pissuwan, 2008).

Nanobastões de ouro (AuNR) apresentam propriedades óticas únicas, que estão relacionadas com a interação entre a capacidade condutiva do metal e o campo elétrico formado pela sua radiação eletromagnética que, no caso de alguns metais como o ouro, produz fortes e características bandas de absorção na parte visível do espectro de emissão (Fig. 1). Consequentemente, a formação de nanorods pode ser facilmente utilizando espectroscopia ultravioleta-visível (UV-visível), o que permite sua fácil caracterização (Stone, 2011).

A interação entre nanopartículas e moléculas orgânicas se torna possível após a realização de processos físicos ou químicos, chamados Funcionalização (Salem, 2007). Para promover a funcionalização entre as nanopartículas e uma proteína vários intermediários químicos podem ser utilizados, sendo os mais populares aqueles que realizam uma ligação entre o grupamento amina das lisinas presentes na proteína com o éster formado entre a interação de sulfo-N-hidroxissuccinimida (sulfo-NHS) e 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC), que disponibiliza um grupamento carboxila livre na superfície da AuNP, resultando em uma interação covalente entre as moléculas (Fig. 2).

(a)

(b)

Figura 1. Esquema de oscilação de uma nanopartícula após irradiação de luz. (a) Movimento ondulatório é proveniente da interação entre os elétrons livre da superfície e o campo elétrico gerado pela partícula metálica. (b) Devido à forma anisotrópica dos nanobastões, dois picos de absorção podem ser observados. SHARMA et al., 2009.

A Dengue é, hoje, a principal arbovirose a acometer os seres humanos em todo globo. As estimativas atuais colocam o número de infecções globais anuais em cerca de 50 a 200 milhões de infecções. Destes, 34 milhões de casos seriam de Febre do Dengue e 2 milhões de casos de Dengue grave (antigamente chamados de febre hemorrágica do dengue) (Gubler, 2012). Infecções causadas pelo Dengue virus (DENV) são umas das mais importantes doenças humanas transmitidas por artrópodes no mundo. A transmissão deste vírus é realizada principalmente pelo mosquito Aedes aegypti, que se caracteriza por ser predominantemente urbano e por circular principalmente nas regiões tropicais e subtropicais. Devido a este fator, a distribuição mundial desta doença é caracteristicamente predominante nestas regiões.

A doença é causada pela infecção do indivíduo por um ou mais dentre os quatro sorotipos conhecidos: Dengue1, 2 , 3 ou 4, que são imunológica e geneticamente distintos (De Paula, 2004). As partículas virais são pequenas (aproximadamente 50 nm) e contêm um núcleo elétron-denso com 30 nm, circundado por um envelope lipídico. A superfície viral é composta por duas proteínas, E (envelope) e M (membrana). A glicoproteína E, o principal determinante antigênico das partículas virais, é a responsável pela adsorção e fusão durante a penetração viral. A proteína M é um fragmento formado a partir de uma molécula precursora, prM, e é produzida durante a maturação viral, que ocorre durante a via secretória do vírus. A última proteína estrutural é a proteína C (capsídeo), que interage com o material genético para a montagem do nucleocapsídeo viral (Fig. 3).

O diagnóstico da Dengue é basicamente feito através da sorologia, ou seja, detecção dos anticorpos do tipo IgM contra o vírus que surgem por volta do 7º ao 10º dia de infecção. O surgimento tardio dos anticorpos mensuráveis dificulta o diagnóstico, já que grande parte dos pacientes está em processo de cura quando estes anticorpos podem ser medidos, o que leva a um enorme número de casos não notificados, uma vez que o paciente em processo de cura muitas vezes não faz o teste conclusivo. Adicionalmente, o teste sorológico não é capaz de identificar o sorotipo infectante, processo que depende do isolamento viral, técnica cara, lenta e difícil de implementar.

Materiais e Métodos

Para a síntese dos Nanobastões de ouro, primeiramente uma solução semente (contendo nanoesferas de 4nm) foi produzida. A esta solução, foi acrescido ácido cloroaldríaco 0,2M e CTAB para crescimento dos bastões. A efetividade da produção foi verificada por espectroscopia de UV-visível (UV-3600, Shimadzu Scientific Instruments) e microscopia eletrônica de transmissão.

Para obtenção da proteína (DENV3E), o cDNA correspondente ao gene que codifica a proteína DENV3E foi obtido por RT-PCR a partir da amostra MG-20/2004 (GenBank: EF428572). Esse fragmento foi amplificado e o produto de PCR digerido para clonagem no vetor pGEM-T (Promega, EUA) e depois subclonado no vetor de expressão pQE9 (QIAGEN, EUA) em linhagem M15 de

Escherichia coli. Os clones foram induzidos e crescidos em meio LB rico. Após 24 horas, a suspensão

bacteriana foi centrifugada e lisada, e o clarificado purificado em cromatografia de afinidade por níquel, com o kit HisTrap HP System (GE Healthcare) no aparelho ÄKTAprime plus (GE Healthcare), seguindo as instruções do fabricante.

Figura 3. Estrutura da partícula viral de Dengue virus. Fonte: adaptado de http://virologyness.wordpress.com.

A funcionalização ocorreu pela reação de amidação ativada por diimida. Primeiramente os AuNR foram ligados à extremidade tiol do ácido lipóico (C8H14O2S2). Através da extremidade carboxila livre, o agente acoplante EDAC e o agente estabilizante NHS são utilizados para formar um éster ativo que, que em seguida, reagem com os grupos amina presentes nas proteínas. A ocorrência da ligação foi verificada por UV-Vis, TEM e AFM

Os testes de eficácia da ferramenta como diagnóstico se deu por duas plataformas. Primeiramente, soluções seriadas de anticorpo monoclonal foram adicionadas à suspensão coloidal da ferramenta AuNR-DENV3E e testadas por UV-Vis. Posteriormente, esta ferramenta foi sensibilizada em uma microplaca para um teste similar ao ELISA. Da mesma forma, anticorpos monoclonais foram utilizados como soro primário.

Resultados e Discussão

Primeiramente, os Nanobastões foram produzidos e caracterizados (Fig. 4a-c). A solução se encontra homogênea e livre de contaminantes, como nanopartículas mal formadas e excesso de CTAB. Similarmente, a proteína foi produzida e purificada (Fig 4d).

Posteriormente, foram realizadas as reações químicas de funcionalização. A evolução do processo foi acompanhada por espectroscopia de UV-vis, sendo que a cada adsorção na superfície da nanopartícula, apresentava um deslocamento do espectro (Fig. 5). As amostras foram, ainda, submetidas a uma avaliação comparativa por TEM (Fig. 6a-b) e AFM (Fig. 6c-d). Todos estes métodos comprovam a interação entre nanopartícula e proteína.

(a) (b) (c) (d)

Figura 4. Verificação da produção dos insumos, AuNR e DENV3E. (a)(b) Microscopia eletrônica de transmissão, comprovando a homogeneidade e pureza da amostra. (c) Espectroscopia UV-visível, apresentando os dois picos

fortes de emissão que comprovando a forma de bastão da nanopartícula. (d) SDS-PAGE da proteína DENV3E.

(a) (b) (c)

Figura 5. Acompanhamento da funcionalização por espectroscopia de UV-visível. (a) Interação AuNR e ácido lipóico. (b) Interação AuNR e EDAC/NHS. (c) Interação AuNR e DENV3E. Em detalhe, curva de concentração

Por fim, foram realizados os testes de avaliação da antigenicidade da ferramenta. Na plataforma em suspensão, através de diluições seriadas do anticorpo monoclonal, foi determinado o limite de detecção da técnica de 1:300.000 – muito superior a testes comerciais existentes (Fig 7a). No teste de ELISA, a detecção do anticorpo pela ferramenta também foi superior à proteína pura (Fig 7b).

Conclusão

A ferramenta AuNR-DENV3E foi efetivamente construída e caracterizada. A antigenicidade da mesma foi comprovada e, segundo os dados obtidos, apresenta maior sensibilidade e especificidade do que a proteína pura, caracterizando um insumo para testes de diagnósticos significativamente superiores aos existentes no mercado. Novos testes, agora com soro de pacientes, devem ser realizados para melhor caracterização da resposta.

Referências Bibliográficas

Pissuwan D, Valenzuela S, Cortie MB. Prospects for gold nanorod particles in diagnostic and therapeutic applications. Biotechnol Genet Eng Rev. 2008;25:93-112.

Stone J, Jackson S, Wright D. Biological applications of gold nanorods. Wiley Interd Rev Nanomed. 2011 Jan-Feb;3(1):100-9. Salem, A. K.; Pearce, M. E.; Melanko, J. B. Multifunctional Nanorods for Biomedical Applications. Pharmac. Res., 2007.

De Paula SO, Fonseca BAL Dengue: a review of the laboratory tests a clinican must know to achieve a correct diagnosis. Braz Jour of Infec Dis, 8: 390-398. 2004.

Gubler, DJ. The Economic Burden of Dengue. Am. J. Trop. Med. Hyg., v. 86, n. 5, p. 743–744, 2012.

(a) (b)

(c)

(d)

Figura 6. Microscopias comparativas. [TEM] Imagens mostram AuNRs puros (a) e funcionalizados (b), evidenciando uma substância amorfa na superfície das nanopartículas. [AFM] Comparativo topográfico entre AuNR

puro (c) e funcionalizado (d), onde o acréscimo de diâmetro e a superfície macia caracterizam a ligação.

Figura 7. Avaliação da antigenicidade de AuNR-DENV3E. (a) Plataforma em suspensão. Deslocamento evidencia ligação do anticorpo. Detalhe abaixo demonstra não reatividade a um soro negativo. (b) ELISA, mostrando q