VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica
27 a 30 de julho de 2009 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil
ESTUDO DO SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS EM PROCESSO CONTÍNUO
PA-RA EXTPA-RAÇÃO DO ÁCIDO CLAVULÂNICO
1 Mariana M. M. Mateus, 2Clóvis S. da Silva, 3Marlei B. Pasotto
1
Bolsista de iniciação Científica PIBIC/CNPq/UFSCar, discente do curso de Engenharia Química
2
Aluno da Pós-graduação do Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal de São Carlos/SP
3
Professor do Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal de São Carlos/SP
1,2,3
Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal de São Carlos. Via Washington Luis, Km 235, São Carlos - CEP: 13565-905
e e-mail: marlei@ufscar.br
RESUMO - O uso do Sistema de Duas Fases Aquosas (SDFA) para a extração do antibiótico i-nibidor de beta-lactamase, o ácido clavulânico (AC), é umas das técnicas de separação de bio-moléculas cada vez mais estudadas, principalmente, por ter a facilidade e confiabilidade no aumento de escala, por poder ser desenvolvido em processo contínuo de extração e por um processo econômico em comparação com outras técnicas de separação. O SDFA foi composto por PEG 400, solução tampão de fosfato e soluções de ácido clavulânico produzidas por culti-vos com Streptomyces clavuligerus, pré-tratado por membrana de ultrafiltração de polisulfona de tamanho de poro 3kDa e a partir do produto farmacêutico Clavulin® (500mg de amoxilina e 125mg de AC). O estudo da extração contínua do ácido clavulânico foi feito em diferentes flu-xos: 1,6 mL/min e 6,4 mL/min. Comparando os resultados com o processo em batelada pode-se obpode-servar que o coeficiente de partição e o fator de purificação foram superiores na extração contínua, resultando em um maior rendimento desta. A linearidade do coeficiente de partição e do fator de purificação, bem como a similaridade de comportamento do PEG e Fosfato ao longo do experimento mostram a estabilidade do SDFA e a viabilidade deste processo, industrialmen-te.
Palavras-Chave: ácido clavulânico, processo contínuo, sistema de duas fases aquosas
INTRODUÇÃO
Os estudos sobre o uso do sistema de duas fases aquosas (SDFA) para separação e purificação do antibiótico beta-lactâmico ácido clavulânico (AC), tem demonstrado que está pode ser uma importante técnica na etapa intermediária separação deste antibiótico. O AC é produzido industrialmente em cultura submersa de Streptomyces clavuligerus e possui uma fraca atividade antibacteriana, no entanto, é um potente inibidor da enzima beta-lactamase, enzima esta que oferece resistências às bactérias patogênicas aos antibióticos bet-lactamicos (Buynak, 2003).
Videira & Aires Barros (1994) realizaram a extração do clavulanato de potássio de uma solução pura, em um sistema de duas fases aquosas (SDFA), composto por polietileno glicol e fosfato (PEG/fosfato), variando o pH, peso molecular do PEG e a relação PEG/fosfato. Para as condições estudadas, os autores concluíram que o ácido clavulânico possui uma alta afinidade pela fase rica em PEG, apresentando altos valores de recuperação (90-99%). Os valores obtidos para o coeficiente de partição foram de 1,5 a 114.
Atualmente os parâmetros do SDFA como o coeficiente partição, fator de purificação e rendimento do sistema de duas fases aquosas para separação do ácido clavulânico tem sido otimizado por manipulação das propriedades do sistema (Silva et al. 2008). No entanto, para aumento de escala e implementação industrial é necessário estudos de aspectos fundamentais deste sistema para desenvolvimento de equipamentos apropriados. No que se refere á cinética de separação das fases em processo em batelada tem sido estudado em termos das propriedades físico-químico (densidade, viscosidade, tensão interfacial) medindo a altura da dispersão como uma função do tempo separação (Kaul et al 1995; Solano-Castillo & Rito-Palomares 2000).
Na tentativa de reduzir o tempo gasto, o custo e evitar a degradação da biomolécula ocorrida no modo de operação em batelada do SDFA, a forma contínua deste processo de extração vem sendo cada vez mais estudada. Modelos matemáticos para descrever o processo contínuo em estado estacionário e transiente têm sido desenvolvidos para separação de proteínas. Os modelos estão baseados no balanço de
massas dos principais componentes do sistema e dos dados de equilíbrio das fases (Mistry et al. 1996; Cunha et al., 2003; Simon & Guatam 2005). Referente ao antibiótico ácido clavulânico apenas processo em batelada foram desenvolvido, necessitando assim estudos em processos contínuos do sistema de duas fases aquosas para separação e purificação do ácido clavulânico.
Com este trabalho objetivou-se analisar o comportamento dinâmico do processo contínuo de extração do ácido clavulânico, proveniente de produto farmacêutico Clavulin® e produzido por cultivos de S. clavuligerus, a partir dos Sistemas de Duas Fases Aquosas compostos por Polietileno glicol (PEG) e Fosfato.
MATERIAIS E MÉTODOS
MateriaisÁcido clavulânico: As soluções de ácido clavulânico foram produzidas por cultivos com Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, pré-tratado por membrana de ultrafiltração de polisulfona de tamanho de poro 3kDa, cujos meios de cultura são essencialmente constituídos de glicerol, isolado protéico de soja, SUPRO 783, suplementação de ornitina, solução de sais, (NH4)2SO4 e KH2PO4; e a partir do produto
farmacêutico Clavulin® (500mg de amoxilina e 125 mg de AC).
PEG: Foi utilizado PEG de massa molecular 400 Da (Synth).
Métodos Analíticos
Concentração de AC: A concentração de ácido clavulânico foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) segundo o método descrito por Foulstone and Reading (1982).
Concentração de Contaminantes: A concentração de contaminantes nos caldos de cultivo foi determinada por espectrofotometria a 280nm com espectrofotômetro UV/VIS da Pharmacia Biotech, descontando-se a influência da concentração de ácido clavulânico nesse comprimento de onda.
Concentração de PEG e Fosfato: A concentração de PEG foi obtida por um método espectrofotométrico, segundo o descrito por B. Skoog (1979). A concentração de fosfato foi obtida por espectrofotometria, segundo o método azul de molibdênio.
Procedimento Experimental
Os experimentos em processo contínuos foram baseados nos trabalhos realizados por Kaul et al. (1995) e Mistry et al. (1996). A composição do sistema de duas fases aquosas foi baseada nos resultados obtidos por Silva et al. (2008).
Para a realização destes experimentos utilizou-se um reator, sob constante agitação, projetado para que ocorresse uma mistura perfeita. Este foi alimentado por correntes de PEG, Fosfato e Ácido Clavulânico com o auxílio de bombas peristálticas. Em seguida, a mistura foi bombeada continuamente para uma proveta, onde ocorre à separação das fases e continuamente estas fases são retiradas. Foram coletadas amostras das soluções de topo e fundo a cada cinco minutos durante um período de 40 minutos. Pode-se observar na Figura 1, o esquema experimental.
Topo
Fundo Bomba
Tanque de mistura separador AC
PEG Fosfato
Figura 1 – Esquema do processo contínuo para extração do AC
ANÁLISE DOS RESULTADOS
Os resultados foram analisados de acordo com os dados experimentais, considerando-se o coeficiente de partição (K), que caracteriza a dis-tribuição das substâncias entre as fases de topo e de fundo, descrito pela equação 1.f t
C
C
K =
(1)Onde Ct e Cf são as concentrações de AC na fase
de topo e de fundo, respectivamente.
O fator de purificação do sistema foi defi-nido de acordo com a equação 2.
T O To t
C
C
C
C
FP
⋅
⋅
=
(2)Onde C0 e CT0 são as concentrações iniciais da
substância de interesse e contaminantes, respectivamente, Ct e CT são as concentrações
desses produtos na fase de topo.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Extração do AC proveniente de produto far-macêuticoOs resultados da extração do AC em processo contínuo SDFA a partir da solução do produto farmacêutico podem ser observados na Tabela 1, juntamente com os valores obtidos no processo em batelada.
Os coeficientes de partição no processo contínuo são superiores ao processo em batelada (Tabela 1), indicando que a cinética de separação das fases ocorre rapidamente. No entanto, para o fluxo de 1,6 mL/min, a composição das fases do sistema contínuo se aproxima do processo em batelada como pode se observar na Tabela 1. Este fato mostra que pode não haver uma mistura instantânea dentro do reator, ocasionando uma variação na composição SDFA.
Tabela 1. – Análise dos dados experimentais dos SDFA em processos Clavulin
Solução Fluxo (mL/min) K Ct (mg/L) Cf (mg/L) Clavulin 1,6 8,6 123,2 14,1 6,4 17,6 117,5 7,1 Batelada 5,7 141,5 22,1 Na Figura 2 pode ser observado o comportamento do K ao longo do tempo para o processo contínuo de SDFA. Inicialmente o processo contínuo de SDFA para extração do AC apresenta instabilidade, devido a não uniformidade das vazões de alimentação do reator no início do processo contínuo. No entanto, pode-se observar a similaridade de comportamento no restante do tempo (Figura 2). Vale ressaltar, que a estabilidade do sistema manteve-se para um fluxo quatro vezes maior, mostrando a necessidade de um baixo controle do processo. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 15 30 45 60 75 90 105 K tempo (min) F=1,6 mL/min F=6,4 mL/min
Figura 2 – Variação dos coeficientes de parti-ção para o processo contínuo com Clavulin de fluxo 1,6 mL/min e 6,4 mL/min em relação ao tempo
A variação da composição de PEG e Fosfato na fase de topo e fundo durante a etapa experimental do processo contínuo pode ser observada nas Figuras 3 e 4, respectivamente. O aumento de 4 vezes na vazão de 1,6 mL/ min para 6,4 mL/min não influenciou na estabilidade da composição do sistema ao longo do tempo. No
entanto, é possível notar-se que as concentrações de PEG e Fosfato foram alteradas, esta alteração deve estar relacionada ao fato de que, apesar da cinética de separação para formação das fases ser rápida, o sistema ainda não atingiu o equilíbrio químico das fases (Figuras 3 e 4). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 CP E G ,T (m o l/ L ) tempo (min) F=1,6 mL/min F=6,4 mL/min
Figura 3 – Variação da concentração de PEG na fase de topo para o processo contínuo com Clavulin de fluxo 1,6 mL/min e 6,4 mL/min em relação ao tempo 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 CF o sf ,F ( g /L ) tempo (min) F=1,61 mL/min F=6,44 mL/min
Figura 4 – Variação da concentração de Fosfato na fase de fundo para o processo de fluxo 1,6 mL/min e 6,4 mL/min com Clavulin em relação ao tempo
Extração do AC proveniente de cultivo
Os resultados do processo de extração contínua do AC proveniente de cultivo também foram avaliados de acordo com os valores obtidos experimentalmente, considerando-se, além do coeficiente de partição, o desempenho do processo avaliado pelo fator de purificação.
Na Tabela 2, observam-se os valores de K e FP, juntamente com os valores obtidos das
concentrações de AC nas fases de topo e de fun-do. Os resultados obtidos demonstram que o coe-ficiente de partição e o de fator de purificação são superiores no processo de extração contínua do AC em comparação com os resultados do pro-cesso em batelada.
Tabela 2 – Análise dos dados experi-mentais dos SDFA em processos contínuos e em batelada realizados com caldo
solução Fluxo (mL/min) K (-) FP (-) Ct (mg/L) Cf (mg/L) Caldo 1,6 13,2 0,74 95,7 7,3 Batelada 4,2 0,45 132,5 29,3 Na Figura 5 observa-se que o comporta-mento foi de forma linear e estável tanto para coe-ficiente de partição como para o fator de purifica-ção durante o processo contínuo de SDFA com caldo ao longo do tempo. Comportamento este também observado para a concentração de PEG e Fosfato (Figuras 6 e 7, respectivamente), em relação ao tempo
.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 3 6 9 12 15 18 0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 K tempo (min) K F P FPFigura 5 – Variação do K e FP para o processo contínuo caldo de AC emrelação ao temp
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3,0 C P E G ,T ( m o l/ L ) tempo (min)
Figura 6 – Variação da concentração de PEG na fase de topo para o processo contínuo cal-do de AC em relação ao tempo 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 tempo (min) CF o sf ,F ( g /L )
Figura 7 – Variação da concentração de Fosfa-to na fase de fundo para o processo contínuo caldo de AC relação ao tempo
CONCLUSÃO
Os sistemas de duas fases aquosas ope-rando em processos contínuos para a extração do ácido clavulânico apresentaram coeficientes de partição superiores aos processos em batelada e melhor desempenho, com um fator de purificação também superior, ao utilizar o AC proveniente do cultivo.
Os experimentos mostraram-se estáveis durante os 40 minutos de observação, sem apre-sentar altas variações do K, FP e das concentra-ções analisadas.
Estes experimentos mostraram a viabili-dade do processo contínuo para extração de AC industrialmente, perante o melhor desempenho deste em comparação com o processo em bate-lada.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BARBOZA, M.; ARAUJO, M. L. G. C.; HOKKA, C.O. Kinetic studies on clavulanic acid degrada-tion. Biochemical Engineering Journal, v.23, p.31-36, 2005. v. 22, p.225- 235, 1984.
BUYNAK, J. D., Understanding the longevity of the β-lactam antibiotics and of antibiot-ic/β-lactamase inhibitor combinations. Bi-ochemical Pharmacology, v.71, p.930–940, 2003.
CUNHA, M. T.; COSTA, M. J. L.; CALADO, C. R. C., FONSECA, L. P.; AIRES-BARROS; M. R.; CABRAL, J. M. S. Integration of produc-tion and aqueous two-phase systems extrac-tion of extracellular Fusarium solani pisi cuta-nise fusion proteins. Journal of Biotechnolo-gy, v.100, p.55-64, 2003.
FOULSTONE, M.; READING, C., Assay of amox-icillin and clavulanic acid, the Components of Augmentin, in Biological Fluids with High, 1982.
KAUL, A.; PEREIRA, R. A. M., ASENJO, J. A., MERCHUK, J. C. Kinetics separation for polyethylene glycol-phosphate two-phases systems. Biotechnology and
bioengineering, v. 48, p.246-256, 1995. MISTRY, S.L.; KAUL, A.; MERCHUK, J.C.;
ASENJO, J.A. Mathematical modelling and computer simulation of aqueous two-phase continuous protein extraction. Journal of Chromatography A, v.741, p.151-163, 1996.
SILVA, C. S.; BOVAROTTI, E; RODRIGUES, M. I.; HOKKA, C. O.; BARBOZA M. Avaliação de efeitos de parâmetros envolvidos na purificação do acido clavulânico através do sistema de duas fases aquosas. In: XVII Congresso Brasileiro de Engenharia Química (COBEQ) 2008, Recife-Pe. Anais (CD-ROM).
SOLANO-CASTILLO, C.; RITO-PALOMARES, M. Kinetics of phase separation under different process and design parameters in aqueous two-phase systems. Journal of Chromatography B, v.743, p.195–201, 2000.
SKOOG, B. Determination of polyethylene glycols 4000 and 6000 in plasma protein prepara-tions. Vox Sang, v.37, p.345-349, 1979. VIDEIRA, M.; AIRES-BARROS, M. R.
Liquidi-liquid extraction of clavulânico acid using an aqueous two-phase system of polyethyleneglycol and potassium phosphate. Jounal of chromatography A, v.668, p. 237-240, 1994.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem pelo financiamento da FAPESP (05/55079-4) e a CNPq pela bolsa IC para Mariana M.M. Mateus e a bolsa de doutora-do para Clóvis S. da Silva.
