UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos
Área de Bromatologia
Enterococos em amostras de alimentos e águas: avaliação da
virulência e do desempenho como indicadores de higiene
Bruna Carrer Gomes
Tese para obtenção do grau de DOUTOR
Orientadora: Profa. Dra. Bernadette D. G. M. Franco
Co-Orientadora: Profa. Dra. Elaine Cristina Pereira De Martinis
São Paulo 2007
Bruna Carrer Gomes
Enterococos em amostras de alimentos e águas: avaliação da
virulência e do desempenho como indicadores de higiene
Tese para obtenção do grau de DOUTOR
Orientadora: Profa. Dra. Bernadette D. G. M. Franco
Co-Orientadora: Profa. Dra. Elaine Cristina Pereira De Martinis
São Paulo 2007
Ficha Catalográfica
Elaborada pela Divisão de Biblioteca e Documentação do Conjunto das Químicas da USP.
Gomes, B r u n a C a r r e r
G633e Enterococos em amostras de alimentos e águas: avaliação da virulência e do desempenho como indicadores de higiene / Bruna Carrer Gomes. -- São Paulo, 2007.
151p.
Tese (doutorado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental
Orientador: Franco, Bernadette Dora Gombossy de Melo Co-orientador: Martinis, Elaine Cristina Pereira de
1. Alimento: Análise : Ciência dos alimentos 2. Microbiologia de alimentos 3. Alimento: Segurança: Saúde pública 4. Bacteriologia I. T. II. Franco, Bernadette Dora Gombossy de Melo, orientador. III. M a r t i n i s , E l a i n e C r i s t i n a P e r e i r a d e , c o - o r i e n t a d o r .
BRUNA CARRER GOMES
Enterococos em amostras de alimentos e águas: avaliação da virulência e do desempenho como indicadores de higiene
Comissão Julgadora da
Tese para obtenção do título de Doutor
________________________________________ Profa. Dra. Bernadette D. G. M. Franco
Orientadora/Presidente ________________________________________ 1º Examinador ________________________________________ 2º Examinador ________________________________________ 3º Examinador ________________________________________ 4º Examinador São Paulo, ________________ de 2007.
Ao meu marido, Iran, pela compreensão e apoio. Muito obrigada por sua cumplicidade, carinho e paciência. Aos meus pais, Elias e Nilvia e minhas irmãs, Carin e Vivian pelo constante apoio e carinho fundamentais na minha vida.
Agradecimentos
À Profa. Dra. Bernadette D. G. M. Franco, pela orientação, incentivo
e sugestões sempre tão oportunas.
À Profa. Dra. Elaine C. P. De Martinis, pela co-orientação, incentivo
e disponibilização do laboratório para realização dos experimentos.
À Profa. Dra. Ana Lúcia da Costa Darini, da FCFRP-USP, pelo
auxílio durante realização de parte dos experimentos.
À Carolina Tonani Esteves, pela ajuda indispensável e pelos
momentos de descontração.
À Izabel Cristina V. Palazzo, especialista em laboratório da
FCFRP-USP, pela disponibilidade e auxílio na identificação dos isolados de
enterococos.
Aos amigos do laboratório de Microbiologia de Alimentos da
FCFRP-USP Rafael, Cláudia, Carlos Eduardo, Regiane, Virgínia,
Maria Aparecida, Lizziane, Fabrício e Natália pelos alegres
momentos de descontração e pela convivência.
À técnica Vanessa Maciel, da FCFRP-USP, pelas dicas de informática
durante a elaboração da tese.
Aos colegas do laboratório de Microbiologia de Alimentos da
FCF-USP Janine e Eb e às técnicas, Kátia e Lúcia, pelas dicas durante
minha permanência em São Paulo.
Aos funcionários da Secretaria do departamento de Alimentos da
FCF-USP, Mônica e Edilson, e da Secretaria de Pós-Graduação,
Elaine e Jorge, por terem sempre colaborado nos momentos que
necessitei.
Ao Prof. Dr. Leonardo Sechi da Università di Sassari que permitiu a
realização do doutorado sanduíche na Itália, pela convivência
agradável e confiança. Grazie mille per la disponibilità e oportunità.
Alle persone che ho conosciuto nel laboratorio dell’ Università di
Sassari: Antonella, Silvia, Giovanna, Donatella, Paola, Sara, Daniela,
Domenico, Signore Manca, Monica, Adriana, Alessandra, Sara, Luca
e Domenico, perché sono stati sempre disponibili. Grazie delle
parole di stimolo, dei tanti fini di settimana con le vostre famiglia
che tante volte me hanno fatto sentire a casa, del cambiamento di
cultura, dell’ amicizia e di tutte belle ricordazione...Un
ringraziamento speciale a Giovanna Felis dell’ aiuto professionale e
della disponibilità. Grazie Mille.
À Università di Sassari - Itália pela oportunidade de estudo.
À Giovanna Felis e Anna Castioni - Laboratorio di Microbiologia
Alimentare, Dipartamento Scientifico e Tecnologico della Università
di Verona que colaboraram com a análise dos dados de RAPD.
Ao Departamento de Água e Esgotos de Ribeirão Preto - DAERP,
especialmente ao Sr. Carlos Farjani Neto, pela colaboração na
obtenção das amostras de água analisadas neste trabalho.
À 3M do Brasil pela doação de placas Petrifilm
®EC utilizadas neste
trabalho.
Ao Centro de Zootecnia - Pólo Regional Leste de Ribeirão Preto, da
Secretaria Estadual de Agricultura e Abastecimento (SAA) do
Estado de São Paulo, pela doação das amostras de leite cru
analisadas neste trabalho.
À Dra. V. Vankerckhoven da Universidade Antwerp na Bélgica pela
doação das cepas de E. faecalis MMH594 e E. faecium C68.
Ao CNPq pela bolsa de doutorado e à CAPES pela bolsa de
doutorado sanduíche.
À FAPESP, pelo financiamento do trabalho (processo n°
2003/11986-2).
À todos que de alguma forma colaboraram durante todos esses anos
para realização do meu trabalho.
GOMES, B. C. Enterococos em amostras de alimentos e águas: avaliação da virulência e do desempenho como indicadores de higiene. 2007. 151f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.
RESUMO
Enterococcus spp. pertencem ao grupo das bactérias láticas e estão presentes
em solos, águas, plantas, microbiota autóctone de vários alimentos e como membros da microbiota intestinal de humanos e animais. Esses microrganismos foram considerados por muito tempo como comensais, mas o aumento da severidade das infecções nosocomiais causadas por enterococos mutirresistentes a antimicrobianos e, a falta de conhecimento sobre seus fatores de virulência geram insegurança na utilização de cepas deste gênero na produção de alimentos como culturas fermentadoras e/ou probióticas. A diferença entre uma cepa de enterococos com potencial patogênico e outra aparentemente segura para uso em processamento de alimentos não é clara, e a probabilidade de que esta última adquira fatores de virulência merece investigação. O objetivo do presente projeto foi determinar características fenotípicas e genotípicas de Enterococcus spp. isolados de amostras de alimentos e águas correlacionando sua presença com indicadores clássicos de higiene e contaminação fecal. De 812 colônias indicativas do gênero enterococos obtidas a partir de 120 amostras de alimentos, 299 isolados (37%) foram presuntivamente caracterizados como Enterococcus spp. Após identificação por PCR, 139 (46,5%) E. faecium, 80 (26,8%) E. faecalis, 36 (12%) E. casseliflavus e 8 (2,7%) E. gallinarum. Produção de gelatinase foi detectada apenas em isolados de E. faecalis (60%). Um isolado de E. faecium (0,7%) e 31 isolados de E. faecalis (38,7%) apresentaram perfil β-hemolítico. Produção de bacteriocina contra Lactobacillus sakei e/ou Listeria
monocytogenes foi observada para 10% dos isolados de E. faecalis e 23% dos
isolados de E. faecium. Hidrólise de sais biliares foi observada para 100% dos isolados de E. gallinarum, 86% E. casseliflavus, 65% E. faecalis e 62,6% de E.
faecium. Alguns isolados de E. faecium apresentaram resistência à
vancomicina, eritromicina e tetraciclina. Entre os isolados de E. faecalis não houve resistência à vancomicina, mas foi observada resistência à tetraciclina, eritromicina e alta concentração de gentamicina. Houve uma maior prevalência dos genes de virulência (esp, gel, ace, as, efaA e cylA) entre os isolados de E.
faecalis quando comparado a E. faecium. Além disso, os isolados de E. faecalis, resistentes a antibióticos, mostraram forte adesão a células Caco-2 e
capacidade de formação de biofilme em superfície abiótica. RAPD-PCR individualizou 14 cepas de E. faecium e 17 cepas de E. faecalis dentre os 52 isolados Enterococcus spp. resistentes a antibióticos. A variabilidade dos resultados impediu o estabelecimento de uma correlação entre a presença ou contagem de coliformes, E. coli e enterococos nas amostras analisadas. Os dados deste trabalho sobre marcadores fenotípicos e genotípicos de virulência, e a presença de cepas resistentes a antibióticos evidenciam a necessidade da avaliação cuidadosa de linhagens de enterococos para aplicações em alimentos.
Palavras-chave: Probióticos, bacteriocinas, enterococos, fatores de virulência, indicadores de higiene.
GOMES, B. C. Enterococci in samples of food and water: evaluation of their virulence markers and their suitability as hygiene indicators. 2007. 151f. Thesis (Doctoral) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.
ABSTRACT
Enterococcus spp. belong to the group of lactic acid bacteria widely distributed
in soil, plants, foods, animals and humans. In the past, these microorganisms were considered commensals but the increase of antibiotic-resistant enterococci and the lack of knowledge about their virulence markers, had raised concerns regarding the safety of using strains of this genus in the food production as fermentative or probiotic cultures. Besides this, literature data suggests the use of enterococci as sanitary indicator for foods. Differences between enterococci strains with pathogenic potential and an apparently safe ones is unclear and there is a concern about virulence markers transfer. The aim of this work was to determine phenotypic and genotypic characteristics of
Enterococcus spp. isolated from foods and water and also to correlate their
presence with classical indicators of sanitary quality.
Out of 812 presumptive enterococci colonies obtained from 120 food samples, 299 isolates (37%) were presuntively characterized as Enterococcus spp. Isolates were identified by PCR: 139 (46.5%) E. faecium, 80 (26.8%) E.
faecalis, 36 (12.0%) E. casseliflavus and 8 (2.7%) E. gallinarum. Only E. faecalis isolates (60%) produced gelatinase. One E. faecium (0.7%) and 31 E. faecalis (38.7%) were β-haemolytic. Bacteriocin activity against Lactobacillus sakei and/or Listeria monocytogenes was observed for 10% of the E. faecalis
and for 23% of the E. faecium isolates. All E. gallinarum isolates, 86% of the E.
casseliflavus, 65% of the E. faecalis and 62.6% of the E. faecium isolates
showed bile salt hydrolysis activity. Some E. faecium isolates were resistant to vancomycin, erythromycin and tetracycline. Vancomycin resistance was absent among the E. faecalis but, resistance to tetracycline, erythromycin and high-level gentamicin was observed. There was a higher prevalence of virulence genes (esp, gel, ace, as, efaA e cylA) among the E. faecalis isolates when compared to the E. faecium. Antibiotic resistant E. faecalis isolates strongly adhered to Caco-2 cells and formed biofilm on abiotic surface. Using RAPD-PCR 14 E. faecium and 17 E. faecalis strains could be individualized from the 52 antibiotic resistant enterococci. It was not possible to correlate the presence of total coliforms, E. coli and Enterococcus spp. in the samples of food and water analysed due to results variability. Data obtained regarding phenotypic and genotypic virulence markers and the presence of antibiotic resistant enterococci raise the needs of a carefully evaluation of the Enterococcus spp. strains before future applications in foods.
Keywords: Probiotics, enterococci, bacteriocins, virulence factors, hygiene indicators.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Riscos e benefícios associados à presença de Enterococcus spp. em alimentos, amostras ambientais e clínicas... 16 Figura 2- Foto ilustrativa de géis de agarose com os produtos de PCR
para identificação das espécies de Enterococcus obtidos a partir de amostras de alimentos... 52 Figura 3- Perfil de resistência de Enterococcus faecium a antibióticos
de uso clínico isolados a partir de amostras de queijo (a), produtos cárneos (b) e leite (c)... 62 Figura 4- Perfil de resistência de Enterococcus faecalis a antibióticos
de uso clínico isolados a partir de amostras de queijo (a), produtos cárneos (b), leite (c) e vegetais (d)... 63
Figura 5- Gel de agarose contendo produto de PCR dos genes de
virulência de enterococos... 68
Figura 6- Formação de biofilme em superfície abiótica por E. faecalis
e E faecium resistentes a antibióticos (RA) e não resistentes... 74
Figura 7- Fotomicrografia (Olympus BX51) mostrando isolado de E.
faecalis 591 fortemente adesivo (A e B) e isolado 568 (C e
D) com ausência de adesão às células da linhagem Caco-2, coradas com May Grunwald – Giemsa... ... 75
Figura 8- Perfis de RAPD dos isolados de Enterococcus spp. com o
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Sequência dos primers utilizados e tamanho dos
fragmentos obtidos na identificação de E. faecalis, E.
faecium, E. casseliflavus e E. gallinarum... 24
Tabela 2- Sequência dos primers utilizados e tamanho dos
fragmentos obtidos na pesquisa dos genes de virulência de Enterococcus spp... 29
Tabela 3- Caracterização fenotípica e molecular de Enterococcus
spp. obtidos a partir das amostras de alimentos semeadas nos meios KEA e BE... 36
Tabela 4- Resultados presuntivos e finais da população de
Enterococcus spp. nas amostras de carnes, queijos,
vegetais, leite e águas a partir dos meios Bile Esculina
(BE) e Kanamicina Esculina Azida (KEA)... 45
Tabela 5- Número de isolados obtidos nos meios KEA e BE
identificados como Enterococcus spp. por testes fenotípicos e PCR... 50
Tabela 6- Distribuição das espécies dos 263 isolados de
Enterococcus spp. obtidos a partir de amostras de
alimentos e identificados por PCR... 53
Tabela 7- Comparação da identificação de Enterococcus spp. por
PCR e API 20 STREP (Biomérieux, França)... 54
Tabela 8- Perfil de Enterococcus spp. quanto à capacidade de
hidrolisar sais biliares, presença fenotípica dos
marcadores de virulência (β-hemólise e gelatinase) e
atividade inibitória frente a L. sakei ATCC 15521 e/ou L.
monocytogenes ATCC 19115... 57
Tabela 9- Perfil de resistência de E. faecium isolados de amostras
de queijo, produtos cárneos e leite adquiridas no comércio de Ribeirão Preto – SP, Brasil... 60
Tabela 10- Perfil de resistência de E. faecalis isolados de amostras de queijos, produtos cárneos, leite e vegetais adquiridas no comércio de Ribeirão Preto – SP, Brasil... 61 Tabela 11- Perfil de resistência a antibióticos apresentado por E.
faecalis e E. faecium obtidos de amostras de queijos,
produtos cárneos e vegetais adquiridas em Ribeirão Preto – SP, Brasil... 64
Tabela 12- Resultados da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para
isolados de E. faecalis e E. faecium obtidos de amostras de queijo, produtos cárneos, leite e vegetais adquiridas na cidade de Ribeirão Preto – SP, Brasil... 65 Tabela 13- Distribuição dos genes de virulência em E. faecium e E.
faecalis obtidos de amostras de alimentos... 69
Tabela 14- Genes de virulência, formação de biofilme e adesão a células Caco-2 em E. faecium e E. faecalis resistentes a antibióticos de uso clínico... 72 Tabela 15- Comparação da prevalência de genes de virulência entre
enterococos resistentes a antibióticos (RA) e enterococos não resistentes... 73 Tabela 16- Enumeração de E. coli e coliformes totais (log UFC/g ou
mL) das amostras de carne, leite, queijo, vegetais e águas
em Petrifilm EC (3M) e membrana filtrante... 79 Tabela 17- Contagem de E. coli, coliformes totais e Enterococcus
spp. (log UFC g-1 ou ml-1) nas amostras de alimentos e
águas... 83 Tabela 18- Comparação da população de Enterococcus spp.,
coliformes totais e E. coli nas amostras de alimentos e águas... 84
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 1
1.1 Histórico... 2
1.2 Características fenotípicas, identificação e isolamento ... 3
1.3 Patogenicidade de Enterococcus spp... 6
1.4 Enterococos como indicadores de contaminação fecal ... 10
1.5 Importância de Enterococcus em alimentos ... 12
2. OBJETIVOS... 17
2.1 Objetivo geral... 18
2.2 Objetivos específicos... 18
3. MATERIAS E MÉTODOS... 19
3.1 Coleta das amostras de alimentos e águas ... 20
3.2 Preparo das amostras ... 20
3.3 Isolamento e enumeração de Enterococcus spp ... 21
3.4 Identificação presuntiva de Enterococcus spp... 23
3.5 Identificação das espécies de Enterococcus spp. por testes bioquímicos... 23
3.6 Identificação das espécies de enterococcus empregando-se PCR .... 24
3.7 Caracterização fenotípica das cepas de Enterococcus spp... 24
3.7.1 Hidrólise de gelatina ... 24
3.7.2 Atividade hemolítica ... 25
3.7.3 Determinação da produção de bacteriocina ... 25
3.7.4 Avaliação da hidrólise de sais biliares (BSH) ... 26
3.8 Determinação da resistência a antibióticos... 27
3.9 Detecção de genes de virulência em isolados de E. faecium e E. faecalis... 28
3.10 Formação de biofilme em superfície abiótica... 31
3.11 Adesão em células da linhagem Caco-2... 31
3.12 Análise de fingerprinting por meio de RAPD-PCR... 32
4. RESULTADOS... 34
4.1 Isolamento de Enterococcus spp... 35
4.2 Identificação de espécies de Enterococcus spp ... 51
4.3 Caracterização fenotípica de Enterococcus spp... 55
4.4 Determinação da resistência a antibióticos... 58
4.5 Detecção de genes de virulência em isolados de E. faecium e E. faecalis... 67
4.6 Formação de biofilme em superfície abiótica e adesão em células da linhagem Caco-2... 73
4.7 Análise de fingerprinting por meio de RAPD-PCR... 76
4.8 Enumeração de coliformes totais e E. coli nas amostras de alimentos ... 78
5. DISCUSSÃO... 88
6. CONCLUSÕES... 104
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 107
1.1 Histórico
A classificação taxonômica dos membros do gênero Streptococcus e
Enterococcus passou por alterações significativas nos últimos anos. A partir do
início do século vinte Thiercelin e Jouhaud propuseram, pela primeira vez, a criação do gênero Enterococcus para designar diplococos Gram-positivos de origem intestinal (Morrison et al., 1997). Entretanto, estes microrganismos foram agrupados, por similaridade, no gênero Streptococcus, sendo denominados S. faecalis. Posteriormente, em função das suas características antigênicas foram classificados como Streptococcus do grupo D de Lancefield (Hardie e Whiley, 1997).
Em 1937, Sherman propôs a criação de quatro subgrupos neste gênero: “piogênico”, ”viridans”, ”láctico” e ”enterococos”. Além disso, este autor afirmou que o grupo dos enterococos apresentava características notoriamente distintas em relação aos outros subgrupos (Hardie e Whiley, 1997). Posteriormente, estudos detalhados de caracterização molecular baseados em critérios como, seqüência nucleotídica do DNA ribossômico 16S e hibridização de DNA:DNA e DNA:RNA de diferentes cepas, forneceram bases para reorganização do gênero Streptococcus em três grupos geneticamente distintos: Streptococcus sensu stricto, Enterococcus e Lactococcus (Stiles e Holzapfel, 1997; Facklam et al., 1999).
A criação do gênero Enterococcus para agrupar as espécies de S.
faecalis e S. faecium foi então proposto por Kalina (1970), baseando-se em
diferenças morfológicas, biológicas e sorológicas. Entretanto, essa classificação só foi aceita a partir das evidências genéticas fornecidas por estudos moleculares e quimiotaxonômicos, conduzidos por Schleifer e
Kilpper-Introdução________________________________________________________________________ 3
Bälz (1984). Estes autores confirmaram que as espécies de Streptococcus
faecalis e Streptococcus faecium, agrupadas no grupo D de Lancefield,
deveriam ser transferidas para o gênero Enterococcus por apresentarem características marcadamente distintas dos demais Streptococcus.
Segundo Facklam et al. (1999), o gênero Enterococcus compreende 16 espécies: E. avium, E. malodoratus, E. raffinosus, E. pseudoavium, E.
saccharolyticus, E. faecalis, E. faecium, E. casseliflavus, E. mundtii, E. gallinarum, E. durans, E. hirae, E. dispar, E. sulfureus, E. cecorum e E. columbae. Entretanto, alguns pesquisadores aceitam a existência de até 28
espécies de enterococos (Foulquié-Moreno et al. 2006). Dentre essas espécies, E. faecalis e E. faecium são as mais freqüentemente isoladas de amostras clínicas (Moellering, 1992; Vancanneyt et al., 2002).
1.2 Características fenotípicas, identificação e isolamento
Os enterococos estão amplamente distribuídos na natureza, estando presentes em solos, águas, plantas, vegetais, e microbiota autóctone de vários alimentos (Hardie e Whiley, 1997; Eaton e Gasson, 2001; Giraffa, 2002; Iversen et al., 2002). Este gênero compreende cocos Gram-positivos que ocorrem isolados, aos pares ou em pequenas cadeias. São anaeróbios facultativos, alguns são móveis e a temperatura ótima de crescimento é de 35 a 37°C, sendo que muitas cepas apresentam capacidade de multiplicação entre 10 e 45°C. Estes microrganismos não requerem atmosfera contendo elevada concentração de CO2 para sua multiplicação embora, algumas cepas o façam
lático como produto principal da fermentação da glicose (Hardie e Whiley, 1997; Domig et al., 2003).
Os meios ágar soja tripticase ou ágar infusão cérebro coração adicionados de 5% de sangue de carneiro, ou qualquer ágar base contendo 5% de sangue de outro animal, são suficientes para o crescimento destes microrganismos. Alguns autores utilizam caldo de Man Rogosa, Sharpe (MRS) ou o caldo Todd – Hewitt para o isolamento de enterococos (Ike et al., 1987; Franz et al., 2001a; Franz et al., 2001b; Vancanneyt et al., 2002).
O isolamento seletivo - diferencial de enterococos a partir de amostras clínicas ou de alimentos pode ser realizado em meio contendo como inibidores seletivos, azida sódica, antibióticos (kanamicina ou gentamicina) e sais biliares e, como indicadores, esculina ou tetrazólio (Ike et al., 1987; Devriese et al., 1995; Morrison et al., 1997; Facklam et al., 1999).
Domig et al. (2003) afirmaram que o ágar Bile Esculina (BE) foi muito empregado para a diferenciação e identificação presuntiva de enterococos, já que a tolerância aos sais biliares e hidrólise da esculina é indicativa da presença de membros deste gênero. O ágar Kanamicina Esculina Azida (KEA) é um meio amplamente usado para isolamento e enumeração de enterococos a partir de alimentos (Devriese et al., 1995; Calicioglu et al., 1999; Ingham et al., 2000; Andrighetto et al., 2001; Gelsomino et al., 2001; Gelsomino et al., 2002) e contém azida sódica (inibidor enzimático da cadeia de transporte de elétrons) em combinação com o antibiótico kanamicina. O produto da hidrólise da esculina reage com íons de ferro presente em ambos os meios e leva à formação de halos escuros ao redor das colônias de enterococos (Domig et al., 2003). Embora existam mais de 100 meios seletivos de cultura diferentes para
Introdução________________________________________________________________________ 5
o isolamento de enterococos, Morrison et al. (1997) afirmaram que nenhum é suficientemente seletivo.
Segundo Facklam et al. (1999) e Domig et al. (2003), a identificação presuntiva do gênero Enterococcus, dentre cocos Gram-positivos e catalase negativos, pode ser confirmada com resultados positivos para hidrólise de pirrolidonil –β – naftilamida (PYR), leucina– β – naftilamida (LAP), e crescimento na presença de 6,5% de cloreto de sódio e a 45ºC.
Considerando-se que o gênero Enterococcus não é filogeneticamente homogêneo, é comum o isolamento de linhagens de Enterococcus atípicas (Franz et al., 1999). Sendo assim, para uma identificação adequada é necessária a separação deste gênero em cinco grupos, baseando-se na formação de ácido em caldo manitol e sorbose e, na hidrólise da arginina. Em seguida, as espécies de cada grupo são identificadas por reações mais específicas (Facklam et al., 1999).
Embora, atualmente, venha se tornando comum o uso de métodos moleculares para a identificação de espécies de Enterococcus, ainda é comum o emprego de características fenotípicas e de testes bioquímicos para a classificação das espécies deste gênero (Facklam e Collins, 1989; Devriese et al., 1993; Devriese et al., 1995; Franz et al., 2001b; Chingwaru et al., 2003).
Existem alguns testes rápidos, comercialmente disponíveis, para a identificação de enterococos. Contudo, segundo Facklam et al. (1999) esses testes devem ser utilizados com ressalvas, já que muitos identificam corretamente apenas E. faecalis. Dentre os sistemas de identificação rápida destacam-se: ID 32 STREP, API 20 STREP, API 50CH, Api zym (BioMérieux, França) e Phene Plate PhP Plate System (PhPlate Microplate Techniques,
Suécia) (Ike et al., 1987; Devriese et al., 1995; Borgen et al., 2001; Franz et al., 2001b; Vancanneyt et al., 2002).
1.3 Patogenicidade de Enterococcus spp.
Por muito tempo as espécies do gênero Enterococcus foram consideradas comensais. Entretanto, nos últimos anos, estes microrganismos vêm se destacando como importantes patógenos nosocomiais, sendo reconhecidos hoje como a segunda causa de infecções do trato urinário e a terceira nos casos de bacteremia nosocomial (Aguirre e Collins, 1993; Franz et al., 2001a). Foulquié-Moreno et al. (2006) afirmaram que dentre as bactérias láticas, o gênero Enterococcus é o que causa mais controvérsia.
O aumento da severidade das infecções causadas por enterococos pode estar relacionado ao uso irracional de antimicrobianos, permitindo sua sobrevivência e disseminação no ambiente hospitalar. Além disso, bactérias desse gênero apresentam uma alta capacidade de adquirir e transferir genes de resistência a antibióticos de uso clínico (Vancanneyt et al., 2002).
Enterococcus spp. apresentam resistência intrínseca a vários agentes
antimicrobianos como penicilinas, cefalosporinas, sulfonamidas e um perfil de baixa resistência a aminoglicosídeos e lincosamidas. A resistência adquirida baseada na aquisição de plasmídeos e transposons é relevante para cloranfenicol, eritromicina e para altas concentrações de clindamicina, aminoglicosídeos, tetraciclinas, β-lactâmicos, fluoroquinolonas e glicopeptídeos (Moellering, 1992; Facklam et al., 1999; Franz et al., 1999). Outro fato relevante é a emergência de vários perfis fenotípicos de E. faecalis e E. faecium resistentes à vancomicina (em inglês, VRE – “vancomycin resistant
Introdução________________________________________________________________________ 7
enterococci”). Palazzo et al. (2006) analisaram 51 cepas de enterococos resistentes à vancomicina, que continham o elemento de inserção Tn1546, isoladas de diferentes hospitais no Brasil. Estes autores observaram que na maior parte das cepas analisadas os genes responsáveis pela resistência à vancomicina estavam localizados em plasmídeos conjugativos de 70Kb, facilitando a transferência de resistência.
Todas essas características vêm contribuindo para que estes microrganismos se destaquem dentre os patógenos causadores de infecções em humanos. Entretanto, a patogenicidade dos enterococos não pode ser explicada apenas pelo seu perfil de resistência aos antimicrobianos, devendo-se levar em consideração também, outros fatores de virulência (Franz et al., 1999).
Atualmente, procura-se relacionar os fatores de virulência apresentados por Enterococcus spp. com a severidade das infecções por eles causadas, bem como sua origem (Ike et al., 1987; Morrison et al., 1997; Franz et al., 1999; Eaton e Gasson, 2001; Franz et al., 2001a; Vancanneyt et al., 2002; Duprè et al., 2003; Franz et al., 2003).
A hemolisina, um dos marcadores fenotípicos que possivelmente atua como um fator de virulência para algumas cepas de E. faecalis, é capaz de lisar eritrócitos humanos, de cavalos e de coelhos. Cepas de enterococos que
apresentam perfil β-hemolítico também podem produzir um peptídeo
antimicrobiano (bacteriocina) codificado por plasmídeos conjugativos com atividade inibitória contra muitas bactérias Gram-positivas (Coque et al., 1995; Hickey et al., 2003). Para alguns membros do gênero, quando hemolisina e
bacteriocina são expressas pelo mesmo determinante genético, recebem a denominação genérica de citolisina (Booth et al., 1996).
A citolisina está presente em cerca de 60% dos E. faecalis envolvidos
em infecções e causa reação do tipo β-hemólise em ágar contendo sangue
humano ou de cavalo, mas não é capaz de hemolisar sangue de carneiro, que é rotineiramente empregado em laboratórios clínicos (Mundy et al., 2000). Além disso, especula-se que essa proteína confira às cepas que a produzem um mecanismo de auto-proteção.
Ike et al. (1987) procuraram relacionar a produção de hemolisina por cepas de E. faecalis isolados de amostras de pacientes com infecções e fezes de pacientes sadios. Aproximadamente 60% das cepas de E. faecalis isoladas de pacientes com infecção apresentavam perfil hemolítico, enquanto que a análise de material fecal de indivíduos saudáveis revelou uma prevalência de 17% deste tipo de enterococos. Estes autores também observaram que o perfil hemolítico poderia ser transferido a alta freqüência por meio de plasmídeos conjugativos.
A produção de uma adesina denominada substância de agregação (AS) é considerada outro fator de virulência de enterococos e, contribui para a formação de agregados celulares, facilitando a troca de material genético entre as células bacterianas (Franz et al., 2001a). A proteína AS é codificada por plasmídeos que são incorporados pelas células receptoras por meio de conjugação bacteriana mediada por substâncias quimioatraentes (feromônios). Estas substâncias induzem a expressão de AS na superfície de células doadoras, facilitando a formação de agregados celulares e conseqüente troca de material genético (Wells et al., 2000).
Introdução________________________________________________________________________ 9
A proteína de superfície “Esp” (do inglês, "Enterococcus surface protein") também se relaciona à patogenicidade de algumas cepas de enterococos, e parece estar envolvida no processo de adesão célula-célula. Esta proteína apresenta várias regiões, características de proteínas de superfície, reconhecidamente envolvidas no processo de adesão às células eucarióticas e evasão da resposta imune (Franz et al., 1999; Shankar et al., 1999; Duprè et al., 2003).
Toledo-Arana et al. (2001) analisaram 93 cepas de E. faecalis que possuíam o gene esp, e mostraram que destas cepas, 87 foram capazes de formar biofilmes. Todas as 59 cepas deficientes de esp não apresentaram essa mesma capacidade. Estes autores sugeriram que a formação de biofilmes aumentaria a resistência inata de alguns microrganismos frente a antibióticos e, conseqüentemente, sua patogenicidade.
Um outro fator de virulência que vem sendo amplamente pesquisado para Enterococcus spp. é a gelatinase (Gel), uma protease responsável pela hidrólise de gelatina, colágeno, hemoglobina e outros peptídeos bioativos. Alguns pesquisadores relacionam a produção de gelatinase com a indução de processos inflamatórios (Coque et al., 1995; Hickey et al., 2003).
Hialuronidase (Hyl) é um outro fator de virulência descrito para E.
faecium que apresenta um certo grau de similaridade à hialuronidase
previamente descrita para Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus e
Streptococcus pneumoniae. Embora ainda não esteja completamente
estabelecido, acredita-se que esta enzima seja responsável por injúria tecidual, aumento do poder invasivo do microrganismo e até mesmo pela progressão da pneumonia pneumocócica (Rice et al., 2003; Kayaoglu e Orstavik, 2004;
Vankerckhoven et al., 2004).
De acordo com Kayaoglu e Orstavik (2004) a proteína EfaA, antígeno A de E. faecalis, possui cerca de 55 a 60% de homologia com um grupo de proteínas de estreptococos conhecidas como adesinas e em enterococos parece funcionar como uma adesina de endocardite. A presença do gene efaA que codifica esta proteína foi relatada em vários isolados clínicos de E. faecalis e também em vários isolados obtidos a partir de amostras de alimentos (Eaton e Gasson, 2001).
Uma outra proteína que também parece estar relacionada com o aumento de patogenicidade de E. faecalis é a adesina de colágeno, codificada pelo gene ace. Esta proteína é capaz de aderir aos colágenos tipo I e IV, similar à proteína Cna de Staphylococcus aureus (Nallapareddy et al., 2000; Mannu et al., 2003).
1.4 Enterococos como indicadores de contaminação fecal
O interesse do uso de Enterococcus spp. como indicador de higiene e contaminação fecal pode ser justificado pelo fato que este gênero é geralmente mais tolerante à refrigeração quando comparado com E. coli e outros coliformes e, parece sobreviver por mais tempo durante a estocagem refrigerada de carcaças de carnes (Ingham e Schmidt, 2000).
Entretanto, embora os enterococos façam parte da microbiota intestinal de humanos e de diferentes espécies animais, o uso deste gênero como indicador de contaminação fecal pode ser limitado devido ao fato destes microrganismos apresentarem uma alta resistência ao calor, serem capazes de sobreviver no ambiente extra-enteral, e poderem sobrepujar facilmente a
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microbiota de um alimento termicamente processado (Smoot e Pierson, 1997; Borgen et al., 2001). Ao contrário do grupo de coliformes totais e fecais, não há um nível estabelecido para relacionar a presença de Enterococcus spp. e a qualidade higiênica de um determinado produto (Giraffa et al., 1997).
Atualmente, as populações de coliformes totais, coliformes fecais e
Escherichia coli são freqüentemente pesquisadas em amostras de água e em
alimentos como indicadores da presença de patógenos humanos associados à contaminação fecal (BAM, 2001; Vail et al., 2003).
Segundo o "Health Products and Food Branch" (Canadá, 2001) dentre as metodologias disponíveis para a enumeração de microrganismos do grupo dos coliformes e de E. coli em amostras de água e alimentos, destaca-se o uso de placas PetrifilmTM (3M). Estas placas são formadas por filmes de papel
quadriculado revestidos com polietileno, nutrientes desidratados e gel hidrossolúvel a frio. São comercializadas prontas para o uso, permitindo a análise de um grande número de amostras em pouco tempo.
A viabilidade de se utilizar coliformes totais, fecais e enterococos como microrganismos indicadores também foi avaliada por Noble et al. (2003). Estes autores monitoraram a qualidade higiênica de amostras de água provenientes da costa da Califórnia (EUA) e os resultados obtidos não permitiram concluir quais os microrganismos indicadores mais adequados para o monitoramento da qualidade de água naquela região.
Calicioglu et al. (1999) compararam a recuperação de Enterococcus spp. e E. coli a partir de carcaças bovinas artificialmente inoculadas com material fecal. Utilizando o Ágar Kanamicina Esculina Azida e placas de PetrifilmTM (3M)
concluíram que a contagem de enterococos poderia ser útil como indicador de contaminação fecal de carcaças bovinas.
Quando comparados aos coliformes fecais, os enterococos são capazes de sobreviver por mais tempo no ambiente marinho e são mais resistentes aos processos de tratamento de efluentes, havendo boa correlação deste microrganismo com a presença de patógenos de interesse. Por este motivo, o estado da Califórnia (EUA) incorporou a enumeração de enterococos aos métodos tradicionais para determinação da qualidade de água recreacional (Choi et al., 2003).
Existem, contudo, algumas limitações para o uso de enterococos como indicadores de contaminação fecal recente: (i) são microrganismos encontrados não apenas no trato intestinal de humanos mas também de outros animais de sangue quente e não apresentam, dessa forma, especificidade de hospedeiro; (ii) não é bem conhecida a distribuição das espécies de enterococos em águas residuais e, (iii) a presença de enterococos é desejável em muitos alimentos. Sendo assim, a interpretação da presença de bactérias desse gênero, deve ser feita com cautela (Giraffa, 2002; Blanch et al., 2003; Choi et al., 2003).
1.5 Importância de Enterococcus em alimentos
A natureza ubíqua dos enterococos faz com que seja comum o seu isolamento de uma ampla variedade de alimentos (Klein et al., 1998; Robredo et al., 2000; Chingwaru et al., 2003). Em vegetais, E. casseliflavus é a espécie mais comum (Devriese et al., 1995; Gelsomino, 2002). Além disso, processamentos tecnológicos de alguns alimentos como, salga e defumação,
Introdução________________________________________________________________________ 13
expõem os microrganismos a extremos de temperatura, pH e salinidade. Nestas condições, os enterococos, que são altamente resistentes, podem se multiplicar e até provocar a deterioração do produto (Giraffa, 2002; Foulquié-Moreno et al., 2006).
Enterococcus spp. também podem contaminar produtos acabados
durante o próprio processamento. De acordo com Gelsomino et al. (2002) os enterococos podem sobreviver e até se multiplicar em equipamentos e tanques de estocagem de laticínios, favorecendo assim, a contaminação direta dos produtos. Entretanto, enquanto alguns estudos revelam a relação entre enterococos e a deterioração de alguns produtos, outros defendem o papel deste microrganismo no desenvolvimento de características sensoriais em queijos e produtos fermentados (Foulquié-Moreno et al., 2006).
A presença de enterococos no trato gastrintestinal de animais pode levar à contaminação da carne durante o abate. E. faecalis e E. faecium são as espécies predominantes em diversos tipos de produtos cárneos fermentados ou não (Franz et al., 2003; Foulquié-Moreno et al., 2006). A alta resistência térmica apresentada por enterococos também favorece a persistência destes microrganismos em produtos cárneos processados (Franz et al., 1999; Foulquié-Moreno et al., 2006) e pode contribuir para o desenvolvimento de aromas pela ação glicolítica, proteolítica e lipolítica (Hugas et al., 2003).
Algumas propriedades bioquímicas dos enterococos como, alta
tolerância a sal e ácido, são desejáveis no processamento de alguns queijos (Andrighetto et al., 2001; Giraffa, 2002; Jurkovič et al., 2006). Em particular, E.
faecium, é freqüentemente utilizado na fermentação de vários queijos de
enterococos em diversos queijos pode variar de 104 UFC g-1 a 107 UFC g-1
dependendo do tipo de queijo, da fase da maturação e da contaminação inicial do leite utilizado no processamento (Franz et al., 1999).
A avaliação da microbiota de queijos da região mediterrânea, produzidos a partir de leite cru de ovelha e cabra, revelou que o metabolismo de Enterococcus spp. é importante na maturação e no desenvolvimento de características sensoriais desses queijos, quer seja por proteólise, lipólise ou até mesmo metabolismo do citrato (Foulquié-Moreno et al., 2006). Os enterococos, ao contrário de outras bactérias láticas, são capazes de metabolizar o citrato com conseqüente produção de diacetil, acetaldeído, acetoína, 2-3-butanodiol e dióxido de carbono, que conferem características e textura particulares em queijos e outros produtos lácteos (Foulquié-Moreno et al., 2006).
Além do emprego tecnológico, a utilização de Enterococcus spp. como probióticos na diminuição dos riscos de doenças intestinais, em humanos e animais também é possível (Stiles e Holzapfel, 1997). Zeyner e Boldt (2005) demonstraram que a administração oral diária de E. faecium CF68 foi eficaz na redução de casos de diarréia em porcos. Adicionalmente, E. faecium CF68 pareceu estar envolvido no aumento da concentração sérica de IgG contra
Giardia e IgA específica e total, em fezes de ratos (Benyacoub et al., 2005).
De acordo com Klingberg et al. (2005) para que um microrganismo seja considerado probiótico, deve-se garantir que cerca de 108 células cheguem
viáveis ao trato gastrintestinal e que estes microrganismos resistam a baixo pH e sais biliares, garantindo a sobrevivência à passagem gastrintestinal. Além disso, é fundamental garantir que as cepas probióticas sejam seguras para utilização na produção de alimentos (Saavedra et al., 2003; De Vuyst et al.,
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2003). De acordo com Salminen et al. (1996) algumas características devem ser verificadas para que um microrganismo seja classificado como probiótico: capacidade de aderir e de multiplicar na mucosa intestinal, impedir ou reduzir a adesão de patógenos, ser seguro, não invasivo, não carcinogênico, produzir ácidos, peróxido de hidrogênio e bacteriocinas.
De acordo com Strompfova et al. (2006) as bacteriocinas de enterococos, conhecidas como enterocinas, pertencem ao grupo IIa que são peptídeos pequenos, catiônicos, hidrofóbicos, termicamente estáveis e com atividade contra uma ampla variedade de microrganismos. Estas bacteriocinas vêm despertando muito interesse para o uso na indústria de alimentos como antimicrobianos naturais (Cleveland et al., 2001; Drider et al. 2006)
Essas bacteriocinas podem apresentar atividade inibitória frente a alguns patógenos. Particularmente, E. faecalis e E. faecium foram capazes de controlar a multiplicação de Listeria sp. durante o processamento de alguns queijos (Sulzer e Busse, 1991; Giraffa et al., 1997).
Dentre as características probióticas de Enterococcus spp. cabe-se destacar a capacidade de redução de colesterol sérico pela atividade de hidrólise de sais biliares (BSH). De acordo com Franz et al. (2001b) a desconjugação de sais biliares no lúmen intestinal contribui para a redução de nivéis séricos de colesterol, pois os ácidos biliares livres são mais facilmente excretados pelo trato gastrointestinal.
Por outro lado, o aumento da severidade das infecções nosocomiais causadas por cepas de Enterococcus mutirresistentes a antimicrobianos e a falta de conhecimento sobre seus fatores de virulência geram insegurança na utilização de cepas deste gênero na produção de alimentos, como culturas fermentadoras e
probióticas (Giraffa et al., 1997; Franz et al., 1999; Giraffa 2002; Franz et al., 2003). As várias aplicações de Enterococcus spp. em alimentos, bem como os riscos associados com sua presença, estão ilustrados na Figura 1 .
Figura 1: Riscos e benefícios associados à presença de Enterococcus spp. em alimentos, amostras ambientais e clínicas. Adaptado de Domig et al. (2003).
Eaton e Gasson (2001) afirmaram que a diferença entre uma cepa de enterococos com potencial patogênico e outra aparentemente segura para uso em processamento de alimentos não é clara, e a probabilidade de que esta última adquira fatores de virulência merece maior investigação.
Diante do exposto e, considerando-se a escassez de dados sobre enterococos em alimentos consumidos no Brasil, este trabalho foi realizado para investigar isolados obtidos a partir de amostras de águas e alimentos, bem como para determinar perfis de resistência a antibióticos e fatores de virulência de Enterococcus spp. Ainda, foi estudada a viabilidade de sua utilização como indicador de contaminação fecal.
2.1 Objetivo geral
Determinar características fenotípicas e moleculares de Enterococcus spp. isolados de amostras de alimentos e águas e correlacionar a presença destes microrganismos com indicadores clássicos de higiene e contaminação fecal.
2.2 Objetivos específicos
• Fornecer dados da ocorrência de Enterococcus spp. em alimentos comercializados na cidade de Ribeirão Preto-SP;
• Avaliar a eficácia do sistema API20 Strep na identificação das espécies dos isolados obtidos;
• Caracterizar os isolados obtidos quanto à produção de hemolisina, bacteriocina, gelatinase e capacidade de hidrólise de sais biliares (BSH); • Verificar a presença de marcadores de virulência (as, ace, efaA, gelE,
esp, cyl e hyl) nos isolados de E. faecium e E. faecalis;
• Determinar o perfil de resistência de E. faecalis e E. faecium aos antibióticos de uso clínico: ampicilina, tetraciclina, vancomicina, eritromicina e gentamicina;
• Analisar os isolados de E. faecalis e E. faecium quanto à capacidade de formação de biofilme em superfície abiótica;
• Analisar os isolados de E. faecalis e E. faecium, resistentes a antibióticos, quanto à capacidade de adesão em células da linhagem Caco-2;
• Avaliar a similaridade dos isolados de E. faecalis e E. faecium, resistentes a antibióticos, aplicando-se a técnica de RAPD-PCR;
• Correlacionar a presença de Enterococcus spp. com indicadores clássicos de higiene e contaminação fecal, E. coli e coliformes totais.
3.1 Coleta das amostras de alimentos e águas
Foram analisadas 120 amostras de alimentos, sendo: 30 de queijo (mussarela, queijo Minas, ricota, gouda, cheddar, parmesão, provolone, chancliche e gorgonzola), 30 de produtos cárneos (carne bovina e suína crua, embutidos, miúdos, carne de frango e de peixe), 30 de vegetais (verduras e vegetais frescos e minimamente processados, grãos cozidos, conservas e ervas) e 11 amostras de leite pasteurizado adquiridas no comércio varejista de Ribeirão Preto – SP e 19 de leite cru coletadas na fazenda de Zootecnia do Pólo Regional Leste de Ribeirão Preto-SP. Também foram analisadas 30 amostras de água destinada ao consumo humano, sendo 25 amostras representativas do sistema de distribuição municipal de Ribeirão Preto, cedidas pelo Departamento de água e Esgotos de Ribeirão Preto – DAERP e 5 amostras de água mineral comercializadas em Ribeirão Preto – SP. As amostras foram transportadas para o laboratório em caixas isotérmicas com gelo reciclável e mantidas sob refrigeração até o momento da análise.
3.2 Preparo das amostras
As amostras de produtos cárneos, queijos, e vegetais foram fracionadas assepticamente em porções de 25 g, acondicionadas em embalagens plásticas esterilizadas e adicionadas de 225 mL de peptona bacteriológica (Oxoid – Reino Unido) a 0,1% (p/v). Alíquotas de 10 mL de leite foram diluídas em 90 mL de peptona a 0,1% (p/v). Essas amostras foram homogeneizadas por um minuto em homogeneizador de amostras para microbiologia (“Bag Mixer”, Interscience, França). As amostras de água foram homogeneizadas no próprio recipiente da coleta. A partir destas suspensões foram preparadas diluições
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decimais seriadas (10-2, 10-3 , 10-4 ,10-5) para enumeração de enterococos,
coliformes totais e E. coli.
3.3 Isolamento e enumeração de Enterococcus spp.
Para o isolamento de Enterococcus spp. a partir de amostras de alimentos foram utilizados os ágares "Bile Esculina" (BE) e "Kanamicina Esculina Azida" base suplementado com 20mg/L kanamicina (KEA), ambos da Oxoid, Reino Unido. Estes meios foram escolhidos devido a relatos de bons resultados para o isolamento de enterococos a partir de amostras contendo uma densa população microbiana (Ike et al., 1987; Devriese et al., 1995; Morrison et al., 1997; Facklam et al., 1999; Andrighetto et al., 2001).
Alíquotas de 0,1 mL das diluições das amostras (10-1,10-2,10-3, 10-4,10-5)
foram semeadas em superfície nos meios BE e KEA. Os meios inoculados foram incubados por 24 horas a 37°C. Para a enumeração de Enterococcus spp. foram selecionadas as placas contendo entre 25 e 250 UFC (Unidade Formadora de Colônia), representativas de cada amostra. Utilizou-se a raiz quadrada do número de UFC para definir o número de colônias a serem submetidas aos testes posteriores de identificação presuntiva de Enterococcus spp. Para as amostras sólidas e líquidas o resultado foi expresso, respectivamente, em UFC/ g da amostra e UFC/ mL da amostra.
A enumeração de Enterococcus spp. em amostras de água foi feita empregando-se a técnica da membrana filtrante. Alíquotas de 100 mL foram filtradas utilizando filtros com poro de 0,45 µm (Millipore, EUA). A membrana foi transferida para a superfície de ágar m-Enterococcus (Becton Dickinson, EUA) e incubada a 37°C por 24-48 horas. A presença de colônias com coloração
roxa, devido a redução do indicador trifenil tetrazólio (TTC) era considerada indicativa de Enterococcus spp.
3.4 Identificação presuntiva de Enterococcus spp.
Após o período de incubação, as colônias características do gênero
Enterococcus foram purificadas por inoculação em ágar soja tripticase (TSA,
Oxoid) suplementado com 0,6% de extrato de levedura (Oxoid) e incubadas por 24 horas a 37°C. Em seguida, uma colônia isolada foi transferida para um tubo inclinado contendo TSA suplementado com 0,6% de extrato de levedura e incubada por 24 horas a 37°C. A partir desta cultura foi realizado o teste de catalase. As colônias catalase negativa foram submetidas à coloração de Gram e os isolados que se apresentaram como cocos Gram-positivos aos pares ou isolados foram mantidos para testes posteriores.
A identificação presuntiva foi feita baseando-se na capacidade de multiplicação dos enterocos em caldo de Man Rogosa Sharpe – MRS (Oxoid)Q
contendo (i) 6,5% (p=-21/v) de cloreto de sódio, (ii) caldo MRS ajustado para pH 9,6 com solução de hidróxido de sódio (10N), (iii) multiplicação em
caldo MRS a 10 e 45°C e (iv) teste do L-pirrolidonil-β-naftilamida - PYR
(DrySlide PYR Kit - Becton, Dickinson and Company, EUA) de acordo com a metodologia proposta por Schillinger e Lücke (1987), Franz et al. (1999) e Andrighetto et al. (2001). Para a realização destes testes, alíquotas de 100 µL das culturas provenientes do crescimento de 24 horas em caldo MRS foram inoculadas nos respectivos meios de cultura. A turvação dos meios, após incubação por 24 horas, era indicativa de teste positivo. Para o teste do PYR, eram utilizadas colônias isoladas de enterococos provenientes do crescimento
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de 24 horas em TSA adicionado de 5% de sangue de cavalo. Estas colônias eram transferidas para a área de reação do kit, impregnadas com uma solução de revelação e o desenvolvimento de coloração rosa/roxa, devido à reação entre β-naftilamina e p-dimetilaminocinamaldeído, era indicativo de teste positivo, conforme instruções do fabricante.
3.5 Identificação das espécies de Enterococcus spp. por testes
bioquímicos
Isolados que apresentaram resultados presuntivos para o gênero enterococos foram identificados pelo teste API 20 STREP (BioMérieux, França), conforme especificações do fabricante.
3.6 Identificação das espécies de Enterococcus empregando-se PCR
Os isolados indicativos do gênero enterococos foram cultivados em placas de TSA suplementado com 0,6% de extrato de levedura por 24 horas. As culturas de E. faecalis NCTC 775, E. faecium NCTC 7171, E. gallinarum NCTC 12359 e E. casseliflavus NCTC 12361 foram utilizadas como controles positivos. As colônias foram raspadas com auxílio de uma alça esterilizada e
transferidas para um tubo Eppendorf contendo 100 µL de água para PCR
(w-3500, Sigma). Esta suspensão foi homogeneizada e em seguida centrifugada por aproximadamente 15 segundos. O sobrenadante obtido foi utilizado na PCR para identificação dos genes específicos das espécies de E. faecium, E.
faecalis, E. casseliflavus e E. gallinarum (Dutka-Malen et al., 1995). Os primers
utilizados bem como o tamanho dos fragmentos obtidos estão descritos na Tabela 1.
Tabela 1: Seqüência dos primers utilizados e tamanho dos fragmentos obtidos na identificação de E. faecalis, E. faecium, E. casseliflavus e E. gallinarum
Espécie Gene amplificado Seqüência (5 ’- 3’) Tamanho produto (pb)
E. faecalis ddlE. faecalis + ATCAAGTACAGTTAGTCT
- ACGATTCAAAGCTAACTG 941 E. faecium ddlE. faecium + GCAAGGCTTCTTAGAGA
- CATCGTGTAAGCTAACTTC 550
E. gallinarum vanC-1 + GGTATCAAGGAAACCTC
- CTTCCGCCATCATAGCT 822 E. casseliflavus vanC-2, vanC-3 + CTCCTACGATTCTCTTG
- CGAGCAAGACCTTTAAG 439
Fonte: Dutka-Malen et al.(1995)
A PCR foi feita em termociclador (Mastercycler – Eppendorf) com volume final de 25 µL que consistiu de 60 ng de DNA, 25 pmol de cada primer,
0,2 mM de dATP, dCTP, dTTP, e dGTP, 2 mM de tampão contendo MgCl2 e
0,625 U de Taq DNA polimerase. Foi utilizado um ciclo de 94°C por dois minutos seguido de 30 ciclos de 94°C por um minuto, 54°C por um minuto, 72°C por um minuto e um ciclo final de 72°C por dez minutos. Os produtos da PCR foram submetidos a eletroforese em um gel de 1% (p/v) de agarose em tampão Tris-borato-EDTA e corados com brometo de etídeo (Dutka-Malen et al., 1995).
3.7 Caracterização fenotípica das cepas de Enterococcus spp.
3.7.1 Hidrólise de gelatina
A produção de gelatinase foi avaliada no ágar Todd – Hewitt suplementado com 30 g/L de gelatina bacteriológica, ambos da Oxoid. A cultura proveniente do crescimento de 24 horas a 37°C no caldo MRS foi transferida para a superfície deste meio com auxílio de uma alça esterilizada e
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a placa foi incubada a 37°C por 18 horas e em seguida resfriada a 4°C por 5 horas. A hidrólise da gelatina foi visualizada pela formação de um halo turvo ao redor da colônia (Ike et al., 1987; Eaton e Gasson, 2001).
3.7.2 Atividade hemolítica
Para investigação da produção de hemolisina foi utilizado o ágar tripticase de soja (TSA) suplementado com 5% de sangue de cavalo pois
segundo Domig et al. (2003), para este gênero bacteriano a reação
β-hemolítica baseada na atividade da citolisina é favorecida neste meio.
Culturas puras provenientes do crescimento de 24 horas em caldo MRS foram semeadas nas placas contendo este meio e incubadas a 37°C por 24-48 horas. A formação de zonas claras ao redor da colônia foi indicativa da produção de β-hemólise (Eaton e Gasson, 2001).
3.7.3 Determinação da produção de bacteriocina
Para avaliação da atividade inibitória, culturas puras de Enterococcus spp. foram submetidas ao teste “spot-on-the-lawn” com Lactobacillus sakei ATCC 15221 e Listeria monocytogenes ATCC 19115 como microrganismos indicadores. Resumidamente, alíquotas de 2µL das culturas de Enterococcus spp. reativadas em caldo MRS a 37°C durante 24 horas foram inoculadas em placas de Petri contendo ágar TSA adicionado de 0,6% de extrato de levedura (TSAYE) e incubadas a 37°C por 24 horas em jarras contendo envelopes geradores de anaerobiose (Anaerogen, Oxoid). Em seguida, adicionou-se nestas placas uma sobrecamada de caldo infusão cérebro-coração (BHI) semi-sólido contendo 1% do microrganismo indicador. As placas foram incubadas
mais uma vez em anaerobiose a 37°C por 24 horas e, após esse tempo, a presença de um halo de inibição ao redor das colônias de Enterococcus spp. foi indicativa da presença de substância inibitória (Lewus et al., 1991)
Empregando a metodologia descrita por Lewus et al. (1991) foi excluída a possibilidade de inibição devido à produção de ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio e atividade de bacteriófagos líticos. Além disso, para a caracterização da substância inibitória como bacteriocina foi avaliada sua natureza protéica utilizando as enzimas Proteinase K 8044) e Protease (P-5147) de Streptomyces griseus (ambas da Sigma, Alemanha) de acordo com a metodologia proposta por Lewus et al. (1991).
3.7.4 Avaliação da hidrólise de sais biliares
Os isolados de enterococos foram avaliados quanto à capacidade de hidrolisar sais biliares (BSH). Para isso, alíquotas de 10 µL das culturas proveniente do crescimento de 24 horas em caldo Man, Rogosa, and Sharpe – MRS (Oxoid) foram transferidas para placas de ágar MRS suplementado com 0,5% (p/v) de sal sódico do ácido taurodeoxicólico e 0,37 g/L de cloreto de
cálcio (CaCl2). As placas foram incubadas a 37°C por 72 horas em jarras
contendo envelopes geradores de anaerobiose (Anaerogen, Oxoid). Baseando-se no diâmetro da zona de precipitação ao redor das colônias, após o período de incubação, a atividade de hidrólise de sais biliares foi classificada como: ausente (ausência de zona de precipitação), baixa (zona de precipitação de até 10mm), média (zona de precipitação entre 10 e 15mm) e alta (zona de precipitação > 15mm) (Franz et al., 2001 b).
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Experimentos realizados durante estágio de doutorado no exterior
Esta parte do trabalho (itens 3.8 a 3.12) foi realizada durante Estágio de Doutorando no Exterior com bolsa da CAPES, desenvolvido no período de 05/2005 a 05/2006 com a colaboração do Prof. Dr. Leonardo A. Sechi, da Università degli Studi di Sassari – Dipartamento di Scienze Biomediche, Itália.
3.8 Determinação da resistência a antibióticos
A presença de enterococos resistentes a cinco antibióticos de uso clínico foi avaliada através de uma triagem em ágar BHI com as seguintes concentrações de antibióticos: 32 µg/mL vancomicina, 16 µg/mL tetraciclina, 8 µg/mL eritromicina, 16 µg/mL ampicilina e 500 µg/mL gentamicina (Willey et al., 1992, CLSI, 2005). Para tanto, os isolados de E. faecium e E. faecalis provenientes do crescimento de 24 horas em TSA foram transferidas para tubo contendo solução salina esterilizada, para obtenção de uma suspensão correspondente à turbidez 0,5 da escala de MacFarland. Dois microlitros desta suspensão foram transferidos para as placas contendo ágar BHI com as concentrações adequadas de antibióticos. Os meios inoculados foram incubados a 37°C e a leitura foi realizada após 24 e 48 horas de incubação.
Em seguida, os isolados que apresentaram resistência aos antibióticos testados foram submetidos à determinação da concentração inibitória mínima (CIM). A determinação da CIM foi realizada pelo método de diluição em ágar (Yousif et al., 2005; CLSI, 2005) com concentrações de vancomicina, tetraciclina e eritromicina variando de 1 µg/mL a 256 µg/mL enquanto que a concentração de gentamicina variou de de 1 µg/mL a 500 µg/mL.
3.9 Detecção de genes de virulência em isolados de E. faecium e E.
faecalis
O DNA genômico dos isolados foi extraído conforme descrito por Sechi et al. (1998 a, b) com algumas modificações e usado para detecção dos seguintes genes de virulência: esp, as, ace, efaA, gelE, cylA e hyl.
Em todas as reações as seguintes cepas foram usadas como controle positivo: E. faecalis JH2-2 para ace e gelE, E. faecalis ATCC 47077 para efaA,
E. faecalis 740 (nossa coleção)para o gene as, E. faecalis MMH594 para cylA
e E. faecium C68 para hyl (Vankerckhoven et al., 2004) e E. faecium 18 R320 para esp (Mannu et al., 2003). As seqüências dos primers utilizados para amplificação dos genes de interesse estão apresentadas na Tabela 2.
29 M at eriais e M ét od os__ ___ ____ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___
Tabela 2: Sequência dos primers utilizados e tamanho dos fragmentos obtidos na pesquisa dos genes de virulência de
Enterococcus spp.
Gene Marcador de virulência Primers Seqüência (5’ - 3’) Tamanho
produto (pb) Referência
as substância de agregação AS 1 CCAGTAATCAGTCCAGAAACAACC 406 Mannu et al. 2003
AS 2 TAGCTTTTTTCATTCTTGTGTTTGTT
ace adesina de colágeno de E. faecalis ACE 1 AAAGTAGAATTAGATCCACAC 320 Mannu et al. 2003
ACE 2 TCTATCACATTCGGTTGCG
gelE Gelatinase gel E1 AGTTCATGTCTATTTTCTTCAC 402 Mannu et al. 2003
gel E2 CTTCATTATTTACACGTTTG
efaA antígeno A de E. faecalis efaA1 CGTGAGAAAGAAATGGAGGA 499 Mannu et al. 2003
efaA2 CTACTAACACGTCACGAATG
esp proteína de superfície ESP46 TTACCAAGATGGTTCTGTAGGCAC 913 Shankar et al. 1999
ESP47 CCAAGTATACTTAGCATCTTTTGG
cylA Citolisina CYT I ACTCGGGGATTGATAGGC 688 Vankerckhoven et al. 2004
CYT IIb GCTGCTAAAGCTGCGCTT
hyl Hialuronidase HYL n1 ACAGAAGAGCTGCAGGAAATG 276 Vankerckhoven et al. 2004
Para os genes esp, as, ace, efaA e gelE as reações foram feitas em um total de 30 µl, usando 5 µl de DNA como molde, 0,5 µM de cada primer, 1x de
tampão PCR, 4,0 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTPs, 1U de Taq platinum
DNA polymerase (Invitrogen Life Technologies, EUA). As reações de PCR consistiam de uma etapa inicial de 94°C por 3 minutos, seguida de 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 56°C por 1 minuto, extensão a 72°C por 1 minuto e uma etapa final de 72°C por 5 minutos, para os genes
ace, efaA and gelE.
O gene as foi amplificado utilizando-se 30 ciclos de PCR com desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 54°C por 1 minuto, extensão a 72°C por 1 minuto, enquanto que para o gene esp a desnaturação foi feita a 94°C for 1 minuto, anelamento a 58°C por 1 minuto, extensão a 72°C por 1 minuto, por 30 ciclos (Mannu et al., 2003).
Os genes cylA e hyl foram amplificados por meio de uma multiplex PCR,
de acordo com a metodologia proposta por Vankerckhoven et al. (2004) com algumas modificações. Resumidamente, as reações foram feitas utilizando-se um volume final de 30 µl com 5 µl de DNA molde, 0,1 µM de cada primer de hyl
e 0,2 µM de cada primer de cylA, 1x de tampão PCR, 2,5 mM de MgCl2, 200
µM de cada dNTP, 1U of Taq platinum DNA polymerase (Invitrogen Life Technologies). As reações de PCR foram feitas com uma etapa inicial de 94°C por 3 minutos, seguida de 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 56°C por 1 minuto, extensão a 72°C por 1 minuto e uma etapa final de 72°C por 10 minutos.
Os produtos de PCR foram separados por eletroforese utilizando-se gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídeo e visualizado sob luz UV.
Materiais e Métodos_________________________________________________________________ 31
3.10 Formação de biofilme em superfície abiótica
A formação de biofilme em superfície abiótica foi quantificada de acordo com a metodologia descrita por Toledo-Arana et al. (2001) com algumas modificações. Resumidamente, os 80 isolados de E. faecalis e 139 de E.
faecium foram reativados em BHI a 37°C por 24 horas. As culturas foram
diluídas 1:20 em BHI e 200 µl desta suspensão foram transferidas para placas de microtitulação de 96 poços (Becton Dickinson, EUA). As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas, e então os poços foram lavados com solução de tampão fosfato (PBS), secos na posição invertida e corados com solução de 1% de cristal violeta por 15 minutos. Os poços foram enxagüados mais uma vez e o corante remanescente foi solubilizado com 200 µl de uma solução de etanol-acetona (80:20, v/v). A densidade ótica foi determinada a 595 nm (A595)
usando um leitor de microplacas (Versa max - Molecular Devices, EUA). Cada teste foi feito em triplicata e os valores obtidos classificados como a seguir: A595
≤ 1 não formador de biofilme (-); 1 <A595 ≤ 2 fraco (+); 2 < A595 ≤ 3 moderado
(++); A595 > 3 forte (+++), conforme descrito por Duprè et al. (2003).
3.11 Adesão em células da linhagem Caco-2
Células da linhagem Caco-2 foram obtidas da American Type Culture
Collection - ATCC (Manassas, EUA), cultivadas em RPMI 1640 - Glutamax I
(Gibco, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 100 unidades/mL de estreptomicina e penicilina. As células foram incubadas a 37°C em 5% CO2 e quando apresentavam crescimento confluente foram transferidas
para placas de 24 poços e incubadas por mais 24 horas a 37°C em 5% de CO2.
cultivadas em caldo BHI e diluídas no próprio meio de preparo das células sem adição de antibióticos. Dez microlitros desta suspensão contendo cerca de 106
bactérias, foram transferidos para cada poço contendo as células Caco-2 e a placa foi incubada a 37°C por 3 horas em 5% CO2. Após fixação e coloração
com May–Grunwald–Giemsa a adesão foi estimada pela contagem em microscópio (aumento 1.000 vezes) do número de células de enterococos aderidas às células Caco-2 (Duprè et al., 2003).
3.12 Análise de fingerprinting por meio de RAPD-PCR
A similaridade dos isolados de E. faecalis e E. faecium, resistentes a antibióticos, foi analisada empregando-se a técnica de RAPD-PCR (do inglês,
Random Amplified Polymorphic DNA – Polymerase Chain Reaction)
utilizando-se o primer aleatório M13: 5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’ (Huey e Hall 1989; Andrighetto et al. 2001; Vancanneyt et al., 2002; Cosentino et al., 2004; Rossetti e Giraffa, 2005; Yousif et al., 2005).
Os produtos de PCR foram separados por eletroforese utilizando-se gel de agarose a 1,5% (p/v), corados com brometo de etídeo e visualizados sob luz UV. A imagem foi transferida para o computador e a análise dos padrões obtidos foi feita utilizando-se o software Gelcompar e o algoritmo UPGMA (Applied Maths, Bélgica).
3.13 Enumeração de coliformes totais e E. coli
Para as amostras de produtos cárneos, queijos, vegetais e leite a enumeração dos coliformes totais e E. coli foi realizada pela semeadura em placas PetrifilmTM EC (3M, EUA). Para isso, alíquotas de 1 mL das suspensões
