BIOQUÍMICA
BIOQUÍMICA
AULA PRÁTICA:
AULA PRÁTICA:
EletroforeseEletroforeseOBJETIVO:
OBJETIVO:
Realizar eletroforese com soro Realizar eletroforese com soro sanguíneo humano (proteína Albuminsanguíneo humano (proteína Albumina)a)INTRODUÇÃO TEÓRICA
INTRODUÇÃO TEÓRICA
Eletroforese em gel
Eletroforese em gel é uma técnica de separação deé uma técnica de separação de moléculasmoléculas que envolve aque envolve a migração de
migração de partículas partículas em um determinado gel durante a em um determinado gel durante a aplicaçãaplicação de umao de uma diferença dediferença de potencial
potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor . As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor massa
massa irão migrar mais rapidamente que as de maior irão migrar mais rapidamente que as de maior massamassa. Em alguns casos, o formato. Em alguns casos, o formato da moléculas também influi, pois algumas terão maior facilidade para migrar pelo gel.A da moléculas também influi, pois algumas terão maior facilidade para migrar pelo gel.A eletroforese normalmente é utilizada para separar
eletroforese normalmente é utilizada para separar proteínas proteínas e moléculas dee moléculas de DNADNA ee RNA
RNA. . Foi introduFoi introduzida cientzida cientificificamenamente em te em 1939 por A.Tis1939 por A.Tiselielius us e A.E. e A.E. KabaKabat t com ocom o objetivo de separar partículas orgânicas.
objetivo de separar partículas orgânicas.
A utilização de eletroforese no uso da rotina laboratorial tem sido importante para A utilização de eletroforese no uso da rotina laboratorial tem sido importante para det
determermininar ar hemhemogloglobiobinopnopatiatias as e e taltalasassemsemiaias, s, auxauxíliílio o diadiagnógnóstistico co parpara a doedoençançass específicas, por ex.: mieloma múltiplo, além de aplicação em lipidogramas, biologia específicas, por ex.: mieloma múltiplo, além de aplicação em lipidogramas, biologia molecular e enzimopatias.
molecular e enzimopatias. Técnicas mais sensíveis
Técnicas mais sensíveis, como é , como é o caso da o caso da focalizaçãfocalização isoelétrica permitem a separaçãoo isoelétrica permitem a separação de frações com
de frações com excelente resolução.excelente resolução.
Eletroforese em gel de agarose Eletroforese em gel de agarose
Nesse caso, a agarose é utilizada como gel para a eletroforese. A agarose é um Nesse caso, a agarose é utilizada como gel para a eletroforese. A agarose é um po
polislissacsacaríarídeodeo, , e e forforma ma uma uma redrede e quque e sesegurgura a as as molmolécuéculalas s durdurantante e a a migmigraçraçãoão.. Dep
Dependendendendo o da da coconcencentrntraçãação o de de agaagarosrose, e, têmtêm-se -se uma uma didiferferençença a no no gragradiedientnte e dede separação. Para preparar um gel de agarose, simplesmente faz-se a mistura entre o pó de separação. Para preparar um gel de agarose, simplesmente faz-se a mistura entre o pó de agarose e solução tampão (TBE). Após fundir, coloca-se brometo de etidio, que fará o agarose e solução tampão (TBE). Após fundir, coloca-se brometo de etidio, que fará o
se a radicais hidrofóbicos das proteínas, causando sua desnaturação. Esta associação, se a radicais hidrofóbicos das proteínas, causando sua desnaturação. Esta associação, com a maioria das proteínas, segue o mesmo padrão: uma molécula de SDS a cada dois com a maioria das proteínas, segue o mesmo padrão: uma molécula de SDS a cada dois resíduos de aminoácidos. Alem disso, cada molécula de detergente ligada atribui uma resíduos de aminoácidos. Alem disso, cada molécula de detergente ligada atribui uma carga negativa a proteína desnaturada, mascarando a carga intrínseca da molécula carga negativa a proteína desnaturada, mascarando a carga intrínseca da molécula nativa. O resultado, qualquer que seja a proteína, é a formação de um complexo com nativa. O resultado, qualquer que seja a proteína, é a formação de um complexo com forma alongada, com a densidade de cargas negativas proporcional ao comprimento da forma alongada, com a densidade de cargas negativas proporcional ao comprimento da cad
cadeia eia polpolipeipeptíptídicdica. a. EstEste e métmétodoodo, , porportatanto nto sepsepara ara proproteíteínas nas segsegundundo o o o seseu u pespesoo mole
moleculacularr. . Se Se a a protproteína apresenteína apresentar ar estrestruturutura a quatquaternáernária, ria, suas subunidsuas subunidades ades serãoserão desnaturadas e dissociadas por SDS e a eletroforese determinara o peso molecular de desnaturadas e dissociadas por SDS e a eletroforese determinara o peso molecular de cada uma delas o emprego da eletroforese em gel, ao longo das diferentes etapas de um cada uma delas o emprego da eletroforese em gel, ao longo das diferentes etapas de um pr
proceocesso sso de de purpurifificaicaçãção o de de proproteíteínasnas, , alealem m de de pepermirmitir tir a a sua sua seseparparaçãação, o, fofornernecece informações adicionais, tais como: o numero de proteínas presentes na preparação, o informações adicionais, tais como: o numero de proteínas presentes na preparação, o seu peso molecular e de quantas subunidades são formadas.
seu peso molecular e de quantas subunidades são formadas. Imagem do equipamento utilizado para eletroforese em gel Imagem do equipamento utilizado para eletroforese em gel
MATERIAS MATERIAS
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• Cuba de Cuba de eletroforeseeletroforese
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• Placa de petriPlaca de petri
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• Becker Becker •
• Capilares (com soro sanguíneo humano)Capilares (com soro sanguíneo humano)
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• Papel filtroPapel filtro
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• PinçaPinça •
• Secador de cabeloSecador de cabelo •
• Gel de agaroseGel de agarose
REAGENTES REAGENTES
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• Solução tampão tris (9,5) mantém o pH do Solução tampão tris (9,5) mantém o pH do gel de agarosegel de agarose •
• Ácido acético 5%Ácido acético 5% •
• Negro de amido Negro de amido
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METODOLOGIA METODOLOGIA
1-1- Coloca-se 110 mL de solução tampão na cuba.Coloca-se 110 mL de solução tampão na cuba.
2-2- Separa-se o gel de agarose da placa de acrílico.Separa-se o gel de agarose da placa de acrílico.
3-3- Aplica-se o soro no gel de agarose com microcapilar.Aplica-se o soro no gel de agarose com microcapilar.
4-4- Coloca-se o gel de agColoca-se o gel de agarose na cuba, voltarose na cuba, voltado para baixo, coiado para baixo, coincidindo o ladncidindo o lado o (+) do(+) do gel com (+) da cuba e (-)
gel com (+) da cuba e (-) do gel com (-) da cuba.do gel com (-) da cuba.
5-5- Tampa-se a cuba, liga-se, verifica-se se há formação de bolhas nos cantos (indicamTampa-se a cuba, liga-se, verifica-se se há formação de bolhas nos cantos (indicam passagem da corrente elétrica) e deixar por 30 minutos.
passagem da corrente elétrica) e deixar por 30 minutos.
6-6- Desliga-se a cuba.Desliga-se a cuba.
7-7- Retira-se o gel de agarose da cuba, eliminando o excesso de tampão das bordas comRetira-se o gel de agarose da cuba, eliminando o excesso de tampão das bordas com papel de filtro.
papel de filtro.
8-8- Mergulha-se o gel, voltado para cima, em 100 mL de corante (negro de amido) por Mergulha-se o gel, voltado para cima, em 100 mL de corante (negro de amido) por 15 minutos (sem agitação).
15 minutos (sem agitação).
9-9- Retira-se o gel de agarose do corante e coloca-se, sempre voltado para cima, em 100Retira-se o gel de agarose do corante e coloca-se, sempre voltado para cima, em 100 mL de ácido acético a 5% (descorante) COM AGITAÇÃO por 1 minuto.
mL de ácido acético a 5% (descorante) COM AGITAÇÃO por 1 minuto.
10-10- Retira-se o excesso de descorante do gel de agarose e coloca-se a 60°C (usar estufaRetira-se o excesso de descorante do gel de agarose e coloca-se a 60°C (usar estufa ou jato de ar), até que a mesmo fique completamente SECO.
ou jato de ar), até que a mesmo fique completamente SECO.
111-1- Colocar o gel de agarose em banhos sucessivos de descolorante (ácido acético 5%),Colocar o gel de agarose em banhos sucessivos de descolorante (ácido acético 5%), COM AGITAÇÃO e após secar com o uso de secador de cabelo até o fundo ficar COM AGITAÇÃO e após secar com o uso de secador de cabelo até o fundo ficar transparente novamente.
transparente novamente. 12
12- Proceder à análise qualitativa.- Proceder à análise qualitativa.
RESULTADO RESULTADO
*Imagem
OBSERVAÇÕES OBSERVAÇÕES
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• As proteínas apresentam agrupamentos de cargas positivas e negativas, provenientesAs proteínas apresentam agrupamentos de cargas positivas e negativas, provenientes
dos aminoácidos que as constituem. dos aminoácidos que as constituem.
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• As cargas são resultadas da ligação ou perda de prótonsAs cargas são resultadas da ligação ou perda de prótons •
• Os prótons (HOs prótons (H++) são íons com carga positiva. Alguns grupos são neutros e ao) são íons com carga positiva. Alguns grupos são neutros e ao
receberem um próton, tornam-se positivos (é o caso do grupo -NH
receberem um próton, tornam-se positivos (é o caso do grupo -NH22, que, ligando-se, que, ligando-se
a prótons, é convertido a -NH
a prótons, é convertido a -NH33++). Outros grupos são neutros, mas, ao perderem um). Outros grupos são neutros, mas, ao perderem um
próton, tornam-se negativ
próton, tornam-se negativos (é o os (é o caso do grupo-COOH, que se converte em -COOcaso do grupo-COOH, que se converte em -COO--).).
Estas perdas e adições dependem do pH do meio em que a proteína se encontra. Estas perdas e adições dependem do pH do meio em que a proteína se encontra.
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• Uma propriedade das cargas elétricas em solução é que quando uma diferença deUma propriedade das cargas elétricas em solução é que quando uma diferença de
potencial é aplicada à solução - ou seja, quando os pólos de uma bateria são potencial é aplicada à solução - ou seja, quando os pólos de uma bateria são conectados à solução – as cargas positivas são atraídas pelo pólo negativo e as conectados à solução – as cargas positivas são atraídas pelo pólo negativo e as cargas negativas, pelo pólo positivo, deslocando-se em direção a eles.
cargas negativas, pelo pólo positivo, deslocando-se em direção a eles.
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• A principal motriz para o movimento das cargas em solução é a diferença deA principal motriz para o movimento das cargas em solução é a diferença de
potencial. Conseqüentemente, quanto maior a intensidade da voltagem aplicada, potencial. Conseqüentemente, quanto maior a intensidade da voltagem aplicada,
maior será a velocidade com que as cargas se dirigem ao pólo de sinal oposto. maior será a velocidade com que as cargas se dirigem ao pólo de sinal oposto.
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• DeDessssa a foformarma, , ququananto to mamaioior r fofor r a a cacargrga a da da mamacrcromomololécéculula, a, mamaioior r seserá rá a a susuaa
velocidade de migração eletroforética. velocidade de migração eletroforética.
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• O tamanho da macromolécula também influi decisivamente na sua velocidade deO tamanho da macromolécula também influi decisivamente na sua velocidade de
migração. Isso porque existe um componente friccional entre a macromolécula, o migração. Isso porque existe um componente friccional entre a macromolécula, o solvente, o suporte e os demais íons em solução que faz com que quanto maior a solvente, o suporte e os demais íons em solução que faz com que quanto maior a macromolécula, menor a sua velocidade de migração em direção ao pólo de sinal macromolécula, menor a sua velocidade de migração em direção ao pólo de sinal oposto.
oposto.
CONCLUSÃO CONCLUSÃO
A aula foi satisfatória, pois conseguimos realizar a atividade proposta e conclui-se A aula foi satisfatória, pois conseguimos realizar a atividade proposta e conclui-se que:
que:
Os métodos de eletroforese convencionais são baseados na habilidade de um gel Os métodos de eletroforese convencionais são baseados na habilidade de um gel separar moléculas, com base no tamanho, sob a influência de um campo elétrico separar moléculas, com base no tamanho, sob a influência de um campo elétrico unidirecional. Em contraste, utilizam-se sucessivos campos elétricos alternados que unidirecional. Em contraste, utilizam-se sucessivos campos elétricos alternados que forçam as moléculas a
forçam as moléculas a mudarem continuamenmudarem continuamente a te a direção de migração.direção de migração.
A separação é baseada, provavelmente no fato que as moléculas maiores mudam de A separação é baseada, provavelmente no fato que as moléculas maiores mudam de direção mais lentamente que as
direção mais lentamente que as menores. Entretanto, o mecanismo preciso da separaçãomenores. Entretanto, o mecanismo preciso da separação ainda não é totalmente conhecido, embora seja objeto de numerosos estudos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• • http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gelhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel • • http://www.ciencianews.com.br/eletroforeses.htmhttp://www.ciencianews.com.br/eletroforeses.htm •• Marzzoco, Anita e Torres, Bayardo Baptista, Bioquímica Básica, 2ª edição, RioMarzzoco, Anita e Torres, Bayardo Baptista, Bioquímica Básica, 2ª edição, Rio
de Janeiro, 1999, Editora Guanabara Koogan S.A. de Janeiro, 1999, Editora Guanabara Koogan S.A.
• • http://www.unitau.br/scripts/prppg/biocienc/downloads/comparatecmolec-N2- http://www.unitau.br/scripts/prppg/biocienc/downloads/comparatecmolec-N2-2002.pdf 2002.pdf 10 10
