UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E HUMANAS

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CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E HUMANAS

LC-MS & LC-MS/MS

FUNDAMENTOS DA ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Introdução a Espectrometria de Massas

˅ - O espectrômetro de massas é um instrumento que ioniza o analito (transferindo-o para fase gasosa) o analise de acordo com sua m/z. É utilizado para detectar e analisar moléculas orgânicas e inorgânicas.

˅ - Inicialmente era utilizado na determinação de massas atômicas. Atualmente é utilizada na determinação da estrutura molecular de compostos orgânicos, na análise de misturas complexas e determinação isotópica.

C6H5CH2CH3 + e¯ C6H5CH2CH3 + 2 e¯

Reação Típica que Ocorre em MS

.+

Passo a Passo de uma Análise por MS

1 _– Colocar/Transferir a molécula para a fase gasosa

2 - Transformar/converter essas moléculas em fase gasosa para íons _– (fonte de íons)

3 _– Separar os íons de acordo com suas m/z _– (analisador de massas) 4 _– Detectar os íons separados - (fotomultiplicadora)

História da Espectrometria de Massas

- 1897: J.J. Thomson descobre o elétron e determina sua m/z (Prêmio Nobel em 1906)

- 1912: Desenvolvimento do primeiro espectrômetro de massas (J.J. Thomson)

- 1919: Ionização por elétron e desenvolvimento do espectrômetro de massas com setor magnético (A.J. Dempest)

- 1942 : Primeiro instrumento de MS comercial

Primeiro Passo para uma Análise por MS

Ionização

M

+

Formação do Íon molecular

+

+

e¯

CH

CH

+

Formação do Íon Fragmento

+

CH

+

Íon Molecular

- H

- 2H

- 3H

- 4H

CH

+

CH

+

+

+

Resultado Típico de um experimento de MS

M

M+1

Região do íon Molecular

M

M+1

M+2

Por que (M+1) e (M+2)?

Formas Isotópicas dos elementos químicos.

H = 1H 2H 3H

Abundância Isotópica

Elemento Isótopo Abundância Relação

Cloro 35Cl 75,77% 3

37Cl 24,23% 1

Bromo 79 Br 50,5 % 1

81 Br 49,5% 1

Formas de Apresentação dos Resultados em MS

Dados Tabulados do Propionaldeido

m/z RI m/z RI 12 0,30 26 14,56 13 0,50 27 50,76 14 3,58 28 99,94

Contaminantes mais comuns presentes em um espectro de MS

m/z Contaminantes Fonte potencial 18,28,32,40 ar H2O, N2,O2,Ar

18 Solvente de limpeza H2O 31 Solvente CH3OH

77 Solvente Benzeno ou Xileno 91,92 Solvente Tolueno

Porque utilizar o espectrômetro

de massas como detector para

HPLC?

pesticides

polymers

Amino acids

food additives

Padrão Analítico em Solvente

Extraído de uma Matriz Complexa

50 ug/L

HPLC com detecção UV-Vis

Análise de metanólicos de folhas

Picos Coeluidos

Detector de Massas

- É um detector universal e seletivo ao mesmo tempo.

- A identificação positiva do analito em uma amostra é feita observando-se o tempo de retenção do analito + o seu padrão de fragmentação.

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INSTRUMENTAÇÃO PARA LC-MS

Passo a passo de uma análise por MS

1. Colocar/transferir a molécula para a fase gasosa;

2. Transformar/converter essas moléculas em fase gasosa

para íons (fonte de íons);

3. Separar os íons de acordo com sua

m/z

(analisador);

4. Detectar os íons separados

(fotomultiplicadora,

eletromultiplicadora);

Esquema Geral de um Espectrômetro de Massas

Amostra

Fonte de íons

Analisador

de íons Detector

Aquisição de Dados

Introdução direta/via cromatografia

Vácuo

Sistema de Vácuo: Bomba rotativa +Bomba Turbomolecular

Fotografia de uma bomba

rotativa.

- Baixo vácuo

Sistema de alto Vácuo: Bomba do tipo Turbomolecular

Analisador de Massas

- Analisador do tipo quadrupolo

- Analisador do tipo ion trap

- Analisador de tempo-de-voo (ToF)

- Analisador de ICR-FTMS

Analisadores de baixa resolução (resolução unitária

de massa)

Analisadores de alta resolução, chega a 5 casas

dm

m R=m/dm

Resolução de Massa

0,0 100,0 499,95 500,05 RP=m/dm RP=500/(500.05-499.95) RP=500/0.1 RP=5000 Resolução é a habilidade de um analisador em separar íons com valores similares de m/z.

Exemplo de espectro de baixa resolução de massa

Exemplo de espectro de alta resolução de massa

Características de alguns analisadores de massas

Quadrupolo ~2000 <2000 10ms

Time of Flight ~4000 unlimited 100µs

Refleton ToF 20,000 unlimited 100µs

Analisador Quadrupolar

Vantagens do analisador quadrupolar

1. Boa reprodutibilidade;

2. Os quadrupolos são pequenos 20cm e de baixo custo;

3. Os tempos de varredura são rápidos;

4. Os íons são acelerados com baixa energia cinética;

5.Facilmente adaptável a sistemas que operam em vácuo relativamente baixo e com técnicas de ionização contínuas LC-MS e LC-MS/MS;

Analisador do tipo

ION TRAP

Vantagens do Analisador do tipo Ion Trap

1. Alta sensibilidade (devido a sua capacidade de estocagem);

2. Tamanho compacto e de baixo custo;

3. Capacidade de realizar vários estágios de MS;

Limitações do analisador do tipo Ion Trap

- Regular para análises quantitativas;

- Baixa resolução de massas;

- Sujeito a efeitos de cargas e reações íon-moléculas;

Analisador de TEMPO DE VOO (ToF)

No analisador do tipo ToF, os íons produzidos por uma fonte pulsada/contínua _“laser”, são acelerados para dentro de um tubo livre de campo _– alto vácuo. Os íons são separados de acordo com seus tamanhos.

10 KV 0V

Vantagens do Analisador (ToF)

1. Alta transmissão de íons (sistema com poucas lentes);

2. Fornece informações MS/MS “post source decay_”;

3. Capaz de analisar simultaneamente todos os íons produzidos;

4. Alta resolução e exatidão de massas;

5. Ideal para análises de amostras complexas

Limitações do analisador do tipo ToF

- Para o máximo desempenho requer ionização pulsada;

- Sistemas de detecção e aquisição muito rápidos - Software;

- Operação/manutenção complexa;

Detectores para LC-MS & LC-MS/MS

A função de um detecto é de transformar os íons que são separados no analisador em um sinal elétrico amplificado, que depois será convertido (por um sistema de aquisição de dados) em um espectro que possa ser interpretado.

Os detectores mais comumente utilizados são:

- Multiplicadores de elétrons;

- Foto multiplicadores;

Multiplicadores de elétrons

- 2 KV

Cascata de elétrons

Para a terra via amplificador Superfície condutiva resistiva

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LC-MS

_–

Modos de ionização e otimização

Acoplamento HPLC-MS: não é direto como em GC-MS

Desafio no acoplamento: HPLC opera a altas vazões

de fase móvel e MS opera em alto vácuo.

Comparativamente,

GC-MS vazão de gás MS _– 0,5 a 2 mL min-1 HPLC-MS _– HPLC operando a 1 mL min-1 gera

INTERFACES DE ELIMINAÇÃO DE SOLVENTES

Particle Beam Interface

... ... ... ... ... ... ... ..._... ... ..._... Ion source Column Flow Nebulizer

To Vaccum Systems

Temporariamente deve-se liberar o gás retido na bomba de vácuo

INTERFACES DE IONIZAÇÃO A PRESSÃO ATM

Liquid from LC

Sample Introduction

Pressão

ATM _{Vácuo 10}Baixo _-1 mBar

Ionização por electrospray (ESI)

ESI _– processo de transferência de íons pré-existentes em solução aquosa para a fase gasosa.

A ESI foi sugerida como possível modo de ionização por Dole em 1968

Processos de Ionização por ESI

Ionização através de separação de cargas: Ocorre em fase líquida, onde os analitos com características básicas formam a espécie [M+H]+ Ionização modo positivo e analitos ácidos formam a espécie [M-H]+ ionização no modo negativo.

+ H+ +

Lidocaína

Ibuprofeno

Processos de Ionização por ESI

Formação do adulto: analitos polares, sem grupos ácidos ou básicos. Adiciona-se na fase móvel cátions ou ânions que se ligam as moléculas do analito e as tornam ionizáveis. [M+Na]+ ou

[M+Cl]-Fase móvel ideal em ESI

Aquela que proporciona a obtenção de um “spray” estável.

Spray estável: solvente orgânico/água 50:50 v/v + aditivo orgânico ácido para auxiliar a ionização do analito.

Aplicações da Técnica de ESI

ESI é uma técnica aplicada na análise desde moléculas neutras pequenas de média polaridade, até moléculas contendo grupos ionizáveis. Fármacos

ESI também é extensivamente aplicada na análise de moléculas grandes (peptídeos e proteínas) devido a produção de íons

multiplamente carregados.

ABS

Vazão

0 _1ml/min

20.000

Ionização Química a Pressão Atmosférica - APCI

-O processo de ionização ocorre em fase gasosa:

-

Vantagem sobre a técnica de ESI

_–

pode ser utilizada com

colunas convencionais de HPLC (altas vazões F.M.)

-Não há restrições quanto ao tipo de solvente utilizado no

sistema de HPLC (mais utilizada em HPLC de fase normal):

Ionização Química a Pressão Atmosférica - APCI

Aplicações da Técnica de APCI

APCI é uma técnica aplicada na análise de moléculas neutras pequenas de baixa até média polaridade.

Moléculas típicas analisadas: drogas, esteróides, PAHs.

As técnicas de ESI e APCI podem ser

consideradas complementares em relação ás

suas aplicações, apesar da superposição das

Otimização das condições experimentais em ESI

-Técnica de seleção de variáveis (NEVES, C.F.C et. al. Química Nova, v.25, n2. p. 327-329, 2002.)

-Variáveis envolvidas na técnica de ESI estudades:

-Voltagem do capilar:

-Voltagem do cone:

-Temperatura da fase de íons: -Vazão do gás secante:

Otimização das condições experimentais em

APCI

-Variáveis envolvidas na técnica de APCI estudades:

-Voltagem da descarga corona:

-Voltagem do cone:

-Temperatura da fase de íons:

-Temperatura do vaporizador:

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

(MALDI)

-Técnica de ionização branda, aplicada na ionização de biomoléculas (proteínas, peptídeos e açucares)

-A ionização é realizada por meio de um pulso de laser (geralmente laser de nitrogênio) aplicado a amostra que está cristalizada em uma placa apropriada.

Formas de obtenção de dados em MS

Modos de operação em MS

SCAN _– Modo de varredura de massas

DR/RF é modificada durante a análise, permitindo fazer uma faixa grande de varredura de m/z em uma única análise.

A sensibilidade é reduzida, porque um grande número de íons são monitorados simultaneamente.

OBS: esse modo de operação é realizado para determinar quais os íons presentes na amostra (análise qualitativa). Fragmentação total.

O modo SCAN é realizado em equipamentos com analisadores Quadrupolo e íon trap.

Modos de operação do quadrupolo

SCAN

Modo SCAN - DC/RF é modificada durante a análise

Modos de operação em MS

SIM _– Select íon Monitoring

DR/RF é mantida constante durante toda a análise, permitindo a detecção de um único íon de interesse (ou até um número máximo de 20 íons). A sensibilidade é maior, porque um número pequeno de íons é monitorado durante o tempo de passagem pelo quadrupolo.

OBS: esse modo de operação é realizado para fins de confirmação/quantificação de determinado(s) analito(s) em uma amostra

O modo SIM é realizado em equipamentos com analisadores Quadrupolo e íon trap.

Importante: Para uma análise completa de um analito, geralmente são escolhidos 3 íons mais intensos no espectro de massas (modo SCAN), os quais são então monitorados no modo SIM _– 1 íon para quantificação

Modos de operação do quadrupolo

SIM

Modo SIM - DC/RF permanece constante durante a análise para determinação do analito de certa m/z

Quadrupolo no modo SIM

T

(Rf

1

/dc

1

):

T

(Rf

1

/dc

1

):

T

(Rf

1

/dc

1

):

Sensibilidade SIM x SCAN

Full SCAN

m/z 30-400

SIM

Cromatograma do íon extraído

O cromatograma obtido na tela do software de aquisição de dados é denominado de cromatograma de íon total. Ele nos oferece informação a respeito de todos os analitos eluídos e detectados pelo sistema de MS.

A partir desse cromatograma, podemos obter informações específicas sobre determinados íons presentes, através do modo conhecido como cromatograma do íon extraído.

Cromatograma do íon total (TIC)

... para se obter somente o pico referente ao analito do m/z _{425,9 basta “pedir” ao software,}

através de um comando, que ele apresenta o sinal do íon extraído na m/z desejada.

EIC do íon de

m/z 425,9

Espectro de massas referente

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LR

MS x

HR

MS

RESOLUÇÃO EM ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Resolução em MS

LR

MS x

HR

MS

TANDEM (MS)

n

R

R

= m/

Δ

m

Exatidão em MS

Habilidade com o qual um analisador de massas pode fornecer com exatidão a informação sobre m/z, sendo uma função da estabilidade e resolução do equipamento.

Portanto, exatidão e resolução estão intimamente ligadas

A exatidão varia dramaticamente de analisador para analisador, dependendo do tipo e resolução destes.

Uma alternativa para descrever a exatidão é usar a terminologia part per million (ppm) na qual um peptídeo pode ser descrito como 1000,00 Da ± 100

Resolução em MS

...se um espectrômetro separa a massa 100 de 101:

R = m/_Δm _Δm = 101 _– 100 = 1 R = 100/1 =100 Ex 1: R>20.000 ?

Qual a massa pode ser separada com R>20.000

R = m/_Δm 20.000= m/_Δm _Δm = m/20.000

Δm = 100/20.000 = 0,005

Resolução em MS

Valley Definition “international Union of pure and applieded chemistry–Resolution in

mass spectrometer

CUIDADO!!!

Definições alternativas de Resolução

Resolving Power

IUPAC

Mass Accuracy

Exatidão de massas

FWHM

Full Width at Half Maximum

0,1 Da ½ Hmax

Hmax

FWHM

500m/z

Resolução em MS _– íon especificado (m/z 500) Massa 500

Largura do pico 0,1

Resolução FWHM = 500/0,1 = 5.000 LRMS

Massas Exatas e possíveis fórmulas

de íon com

m/z = 180

180.0000 18 0.1 87 9 18 0.0 08 5 18 0.0 09 3 180.2000 C 1 5 C 9 N 4 O C 13 H 24 18 0. 00 73 C 14 H1 2 180.1000

High resolution and high mass accuracy enables

LC-

MS em

TANDEM (MS)n

LC-MS/MS ou LC-MS em TANDEM

- _{Espectrometria de massas em “tandem” ou MS/MS envolve dois ou} mais estágios de análise de massas separados por uma reação.

- Principal vantagem em MS/MS: redução do ruído químico devido a alta especificidade.

- Existem duas configurações para TANDEM:

TANDEM-IN-SPACE

Esses instrumentos possuem os analisadores de massas em diferentes localizações físicas do equipamento.

Exemplo: instrumentos de triplo quadrupolo (QqQ) e Instrumentos do tipo quadrupolo/tempo-de-voo (QqToF)

TANDEM-IN-TIME

Nesses instrumentos , os vários estágios MS são realizados dentro do mesmo espaço físico, porém a diferentes tempos de experimentos.

TANDEM-IN-SPACE

_–

triplo quadrupolo (

QqQ

)

Modos de operação

_–

triplo quadrupolo (

QqQ

)

Espectros dos “íons fragmentos”

Ex: Determinação dos fragmentos obtidos a partir do íon de m/z 609 da reserpina (íon percursor).

MS1

static at m/z 609 mass aparent

Collision Cell

pass all masses scanning fromMS2

Modos de operação

_–

triplo quadrupolo (

QqQ

)

Espectros do “íons percursor”

Ex: Determinação dos íons percursores que originaram um determinado íon fragmento.

MS1

scanning from

m/z 50 to 650

Collision Cell

Modos de operação

_–

quadrupolo (

QqQ

)

“Perda neutra constante”

MS1

scanning

Collision Cell

RF only

MS2

QqQ:

Vantagens

Alta especificidade, precisão e exatidão;

Torna possível a análise de misturas complexas;

QqToF:

Vantagens

QqToF-

nessa configuração, o último quadrupolo de um

instrumento QqQ é substituído por um analisador de massas

do tipo ToF.

QqToF-

emprega uma geometria ortogonal para injeção dos

íons na região do ToF (desacoplando a velocidade do íon do

feixe original do eixo do ToF.

QqToF-

une a vantagem de alta especificidade do quadrupolo

oprando no modo SIM com alta resolução e exatidão de

massas do analisador ToF.

QqToF:

Vantagens

Alta resolução de massas (alcançando valores

maiores do que 20.000).

Boa exatidão de massas < 5 ppm.

Alta sensibilidade S/N aumentada.

TANDEM-IN-TIME

_–

(

Íon Trap

)

Íons de diferentes massas são “aprisionados” em um compartimento do

espectrômetro e, através de uma varredura de potencial, os íons são ejetados e direcionados ao detector.

Vantagens do

Íon Trap

A energia e distribuição espacial dos íons produzidos pela fonte não são críticos.

Melhor do que sistemas QqQ na análise qualitativa. Os instrumentos são de pequeno porte (compactos).

Comparação entre diferentes modos de MS-MS

Triple Quadrupole medium high low high Ion Trap MS/MS high high low medium LC/ToF/MS high low high low LC/Q-ToF/MS medium high high medium

Table 1. Relative comparasion of LC/MS systems

Sensitivity in Seletivity Accuracy Dynamic

full scan range

Quadrupolo x Ion Trap x ToF

Analisador do tipo quadrupolo _– melhor escolha para quem pretende realizar análises quantitativas de compostos presentes em quantidades de traços.

Analisador do tipo Íon trap _– melhor escolha para quem pretende realizar análises qualitativas e estudos de reações íon-molécula (operado em modo MS-MS ).

Analisador do tipo ToF _– melhor escolha para quem pretende realizar análises qualitativas em amostras complexas nas quais alta resolução e exatidão de massas são necessárias.