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(1)ANA CLAUDIA CAMPOS. CARACTERIZAÇÃO DE Mycoplasma agalactiae ISOLADOS NO BRASIL E PRODUÇÃO DE VACINAS CONTRA AGALAXIA CONTAGIOSA. RECIFE 2012.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA VETERINÁRIA. ANA CLAUDIA CAMPOS. CARACTERIZAÇÃO DE Mycoplasma agalactiae ISOLADOS NO BRASIL E PRODUÇÃO DE VACINAS CONTRA AGALAXIA CONTAGIOSA. Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária da Universidade Federal Rural. de. obtenção. Pernambuco, do. título. de. como. requisito. Doutora. em. Ciência. Veterinária.. Orientador: Prof. Dr. Roberto Soares de Castro - UFRPE. Co-Orientador: Prof. Dr. Edisio Oliveira de Azevedo - UFCG. Recife 2012. para.

(3) Ficha catalográfica. C198c. Campos, Ana Claudia Caracterização de Mycoplasma agalactiae isolados no Brasil e produção de vacinas contra agalaxia contagiosa / Ana Claudia Campos. -- Recife, 2012. 75 f. : il. Orientador: Roberto Soares de Castro. Tese (Doutorado em Ciência Veterinária) – Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Medicina Veterinária, Recife, 2012. Referências. 1. Micoplasmose 2. Vacinação 3. Seqüenciamento 4. SDS-PAGE 5. Western Blot 6. Pequenos ruminantes I. Castro, Roberto Soares de, orientador II. Título CDD 636.089.

(4) Aos meus pais Inácio e Ligia, Por toda a nossa história.... DEDICO.

(5) AGRADECIMENTOS. Aos que contribuíram para realização deste trabalho e para o meu equilíbrio emocional, sem eles nada teria sido possível. Correndo o risco de omitir alguém: Aos meus pais Inácio e Ligia, pelo amor, e por AINDA suportarem todo o meu mau humor, comportamento e ausência. A minha querida irmã Andrea Carla, por tentar me ensinar que posso demonstrar meus sentimentos sem que isso me enfraqueça, e a Roberto por aceitar o “pacote” completo. A minha família e amigos pelo apoio em todos os momentos dessa louca vida, e por mesmo sem entenderem, aceitaram minha ausência e chatice. Tia Solange, Tio Adair, Simara e Cecília esse agradecimento é para vocês!!!!! A Deus, por acreditar que vou ser uma pessoa melhor. Será que Ele ainda acredita? Ao Prof. Roberto Castro, por todas as lições, oportunidades e confiança. Continuo sem saber se mereço tanto! Mais uma vez a Oneide e Gabriel por dividirem o Prof. conosco. Muitíssimo obrigada!!!!! Ao Prof. Edisio Oliveira de Azevedo, por todos os ensinamentos e orientações, pela paciência e por ter confiado a mim esse trabalho. A Edisio por me mostrar que a gente pode ser profissional e pessoal ao mesmo tempo. Ainda tenho muito a aprender com você. “Temos coisas bonitas para contar...” As crias de Edisio, Lucas e Camila, por toda ajuda durante o desenvolvimento deste trabalho, pela ótima companhia e ensinamentos, e por aguentarem meu mau humor e chatices. Não sei o que faria sem a ajuda de vocês!!!!! Ao Srº Pedro Azevedo e a Srª Davina Oliveira pela multiplicação do bem em cada um de seus filhos. A família Oliveira de Azevedo e Rocha de Azevedo pela acolhida e por me incluírem entre os seus..

(6) A Belinha, por ser a criatura mais evoluída com quem convivi e por todos os nossos momentos. Espero realmente que a nossa amiga Patricia Brandão tenha razão. A Antônia, Cuíca, Francisca e Tereza, pelo carinho, companhia e amor. Êita! E a Miguel pelas mordidas carinhosas. Anham!!! Aos amigos de Edisio que hoje são meus também: Zanella; Elvira e Carlos; Auxiliadora e Aristarco; Patrícia, Jocelin, Aninha e Mariam; Verônica, Kleber, Rafael, Renata e Raissa; Graça, Clodoaldo e Arthur; Rosângela e Almir, Simone e Pedro, por todos os momentos de descontração. Vocês me mostram a cada contato o quanto os amigos são importantes em nossas vidas. A minha “coleguinha” do inglês, Islânia, pelos momentos de pura descontração e de fiel amizade. Cada momento foi único! A Aderaldo, que reforça a minha confiança que nessa Universidade ainda tem pessoas que realmente se importam com o TODO. Me faz um bem danado te encontrar na Rural! A amiga Rosário Beltrão, que teve toda a paciência do mundo para me inicializar nas práticas laboratoriais. Obrigada pela amizade e pensamento sempre positivo. Aos amigos, Andrea Barretto, Daniella Godoy, David Ferreira, Gustavo Frota, Cynara Parente, Kleber Germano, Andrei Loureiro, César Calzavara, Tânia Rios e Ana Carolina Medeiros, pelas ótimas lembranças. A Sergio Alves, meu AMIGO, por toda a colaboração, lições e conversas!!!!! A Inês, pelas conversas descontraídas e apoio. O que seria de nós pobres desorientados, sem ela! A menina Michele Moreira Martins de Oliveira, a quem sempre agradecerei. Você me ensinou taaaanto!!!!! Ao casal Dalva e a Aderaldo Alcântara por toda a trabalheira que dei e continuo dando a eles, e por me fazerem acreditar que tudo daria certo. A Marcia Almeida, por todas as orientações técnicas neste trabalho, e olha que foram muitas, e por ter me incluído em sua convivência familiar..

(7) A Gedeão, Zé Peão e Oscar, assentados da reforma agrária e criadores de cabras leiteiras em Patos/PB, por toda a colaboração em nosso trabalho. Vocês fizeram esse trabalho acontecer, e me reforçam a cada dia que o caminho do desenvolvimento desse país está na mão dos agricultores familiares. Muito obrigada! A família de Gedeão e Zé Peão, das Neves, Ana Júlia, Geovana, Ilana, Junior e Cassio pela convivência e acolhida. A Xaguinha pelas milhares de carroças de água para as ovelhas e carneiros e pela especial atenção e cuidado com os mesmos. Ao Sr. Cuité - o que seria dos animais e dos experimentos da Veterinária da UFCG sem a ajuda preciosa desse trabalhador? Muito obrigada pela lida com os nossos animais. As meninas e aos meninos do Laboratório de Vacinas e Diagnóstico da Universidade Federal de Campina Grande - Campus de Patos, Dalva Alcântara, Adriana Cunha, Raizza Barros, Daniel Assis, Aline Antas, Aline Mamede e Dêvede Silva pelo trabalho em conjunto nessa tese. Aos colegas da Medicina Veterinária e do Laboratório de Biologia Molecular do Semiárido da UFCG - Patos, Hyago Ramalho, Nerivaldo Wanderley, Aldenir Cavalcanti, Tereza Rotondano, Expedito Camboim e Diego Barreto por todo o apoio durante o experimento. A todo apoio que recebemos dos alunos de graduação da Medicina Veterinária da UFCG- Patos, entre os quais cito: Gizele, Mario, Arlison, Dayvid, Valbério, Arthur, Leonardo Barros, Pedro, Diego Vagner, Herbis Eduardo, Hélio, Thiago, Raissa, Vinícios, Marília e Nozaí. Ao Prof. Carlos Peña UFCG-Patos, pela preciosa orientação, tempo disponibilizado e frases de estímulo e confiança nesse projeto. Ao Prof. Antônio Flavio, UFCG-Patos, pela contribuição no diagnóstico gestacional dos animais. Ao Prof. Eldinê Miranda e a Profa. Sara Vilar HV, UFCG-Patos, pela atenção médica aos nossos animais. A Ana Lisa pela especial atenção as nossas análises..

(8) A Profa Rita Maia pela colaboração e sugestões para esse trabalho, mesmo tão perto do nascimento de sua segunda princesinha. A Dra Josi Veschi pela colaboração na avaliação do nosso trabalho. Ao Prof. Elmiro Nascimento pelas contribuições técnicas e disponibilidade em contribuir com as nossas pesquisas. Aos meus professores da Cultura Inglesa- Patos: Sacha Medcraft, Olaf Bakke, Eripetson Lucena e Deborah Medcraft por entenderem minhas limitações e me estimularem a continuar. Aos mestres de toda uma vida escolar e acadêmica que compartilharam seus conhecimentos comigo. Muito obrigada por tudo! Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária da Universidade Federal Rural de Pernambuco. A Tom Menezes, pela atenção ímpar e por todo profissionalismo que nos faz andar na linha nesse programa. A Tereza e Lana Claudia que passaram um aperto danado nesse período de defesas. Vocês deram conta direitinho!!!! A Universidade Federal de Campina Grande, Centro de Saúde e Tecnologia Rural, Campus de Patos, pelo apoio oferecido durante o experimento. Ao Laboratório Vencofarma pela disponibilização dos adjuvantes. A Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE), pela concessão da bolsa de estudos. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq e Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA pelo financiamento dessa pesquisa através do Edital CNPq/MAPA/SDA 064/2008. Aos caprinos e ovinos, que doaram suas vidas involuntariamente para a execução desse trabalho. Que os resultados beneficiem e aumentem a qualidade de vida de caprinos e ovinos do nosso Nordeste..

(9) “Setembro passou/ Outubro e Novembro/ Já tamo em Dezembro/ Meu Deus, que é de nós,/ Meu Deus, meu Deus/ Assim fala o pobre/ Do seco Nordeste/ Com medo da peste/ Da fome feroz// A treze do mês/ Ele fez experiência/ Perdeu sua crença/ Nas pedras de sal,/ Meu Deus, meu Deus/ Mas noutra esperança/ Com gosto se agarra/ Pensando na barra/ Do alegre Natal// Rompeu-se o Natal/ Porém barra não veio/ O sol bem vermeio/ Nasceu muito além/ Meu Deus, meu Deus/ Na copa da mata/ Buzina a cigarra/ Ninguém vê a barra/ Pois a barra não tem// Sem chuva na terra/ Descamba Janeiro,/ Depois fevereiro/ E o mesmo verão/ Meu Deus, meu Deus/ Entonce o nortista/ Pensando consigo/ Diz: "isso é castigo/ não chove mais não"// Apela pra Março/ Que é o mês preferido/ Do santo querido/ Senhor São José/ Meu Deus, meu Deus/ Mas nada de chuva/ Tá tudo sem jeito/ Lhe foge do peito/ O resto da fé// Agora pensando/ Ele segue outra tria/ Chamando a famia/ Começa a dizer/ Meu Deus, meu Deus/ Eu vendo meu burro/ Meu jegue e o cavalo/ Nós vamos a São Paulo/ Viver ou morrer// Nós vamos a São Paulo/ Que a coisa tá feia/ Por terras alheia/ Nós vamos vagar/ Meu Deus, meu Deus/ Se o nosso destino/ Não for tão mesquinho/ Cá e pro mesmo cantinho/ Nós torna a voltar// E vende seu burro/ Jumento e o cavalo/ Inté mesmo o galo/ Venderam também/ Meu Deus, meu Deus/ Pois logo aparece/ Feliz fazendeiro/ Por pouco dinheiro/ Lhe compra o que tem// Em um caminhão/ Ele joga a famia/ Chegou o triste dia/ Já vai viajar/ Meu Deus, meu Deus/ A seca terrível/ Que tudo devora/ Lhe bota pra fora/ Da terra natá// O carro já corre/ No topo da serra/ Oiando pra terra/ Seu berço, seu lar/ Meu Deus, meu Deus/ Aquele nortista/ Partido de pena/ De longe acena/ Adeus meu lugar// No dia seguinte/ Já tudo enfadado/ E o carro embalado/ Veloz a correr/ Meu Deus, meu Deus/ Tão triste, coitado/ Falando saudoso/ Seu filho choroso/ Exclama a dizer// De pena e saudade/ Papai sei que morro/ Meu pobre cachorro/ Quem dá de comer?/ Meu Deus, meu Deus/ Já outro pergunta/ Mãezinha, e meu gato?/ Com fome, sem trato/ Mimi vai morrer// E a linda pequena/ Tremendo de medo/ "Mamãe, meus brinquedo/ Meu pé de fulô?"/ Meu Deus, meu Deus/ Meu pé de roseira/ Coitado, ele seca/ E minha boneca/ Também lá ficou// E assim vão deixando/ Com choro e gemido/ Do berço querido/ Céu lindo azul/ Meu Deus, meu Deus/ O pai, pesaroso/ Nos filho pensando/ E o carro rodando/ Na estrada do Sul// Chegaram em São Paulo/ Sem cobre quebrado/ E o pobre acanhado/ Procura um patrão/ Meu Deus, meu Deus/ Só vê cara estranha/ De estranha gente/ Tudo é diferente/ Do caro torrão// Trabaia dois ano,/ Três ano e mais ano/ E sempre nos prano/ De um dia vortar/ Meu Deus, meu Deus/ Mas nunca ele pode/ Só vive devendo/ E assim vai sofrendo/ É sofrer sem parar// Se arguma notícia/ Das banda do norte/ Tem ele por sorte/ O gosto de ouvir/ Meu Deus, meu Deus/ Lhe bate no peito/ Saudade lhe molho/ E as água nos óio/ Começa a cair// Do mundo afastado/ Ali vive preso/ Sofrendo desprezo/ Devendo ao patrão/ Meu Deus, meu Deus/ O tempo rolando/ Vai dia e vem dia/ E aquela famia/ Não vorta mais não// Distante da terra/ Tão seca mas boa/ Exposto à garoa/ À lama e o pau/ Meu Deus, meu Deus/ Faz pena o nortista/ Tão forte, tão bravo/ Viver como escravo/ No Norte e no Sul/ Ai, ai ai ai...”. Patativa do Assaré - A triste Partida “Que o retorno seja uma grande opção!”.

(10) RESUMO Mycoplasma agalactiae é o principal microrganismo causador da agalaxia contagiosa (AC), doença caracterizada por mastite seguida de agalaxia, poliartrite e ceratoconjuntivite. Em 2001, M. agalactiae foi isolado e identificado no Brasil, determinando grandes prejuízos econômicos. Considerando a necessidade de caracterização de amostras brasileiras de M. agalactiae e da implantação de medidas eficazes de controle, esse trabalho foi realizado em três etapas. O primeiro artigo descreve o perfil bioquímico e protéico de isolados de M. agalactiae de pequenos ruminantes através do cultivo em meio Hayflick modificado, testes bioquímicos. e. imunogenicidade. eletroforese destas. em. proteínas. gel por. de. poliacrilamida. Western. Blot. (SDS-PAGE) (WB).. As. e. a. amostras. apresentaram similaridade no perfil protéico com bandas variando de 30 a 135 kDa no SDS-PAGE, além da presença de uma proteína imunodominante de 48 kDa no WB. Para dar continuidade a identificação do agente envolvido na AC no Brasil, o segundo artigo descreve a análise de dez sequências de M. agalactiae isolados de caprinos e ovinos. Um fragmento de DNA de 360 bp do gene 16S rRNA amplificado por PCR foi sequenciado. A análise revelou alto grau de similaridade, entre as dez sequências e uma similaridade maior que 99% com amostras de referência de M. agalactiae. No terceiro artigo, a eficiência de três vacinas inativadas, preparadas com amostra local de M. agalactiae e adsorvidas com três adjuvantes, foi avaliada em caprinos e ovinos. A resposta sorológica dos animais vacinados foi analisada através de um ELISA indireto. As três vacinas induziram produção de anticorpos, podendo ser utilizadas como uma alternativa para reduzir as perdas econômicas e prevenir a agalaxia contagiosa. Estes resultados confirmam a presença e disseminação do M. agalactiae no país e fortalece a possibilidade de controle da doença pela adoção da vacinação dos rebanhos.. Palavras-chave: caprina, ovina, micoplasmose, vacinação, sequenciamento, SDSPAGE, Western Blot.

(11) ABSTRACT Mycoplasma agalactiae is the main causative organism of contagious agalactia (CA), a disease characterized by mastitis followed by agalactia, polyarthritis, and keratoconjunctivitis. In 2001, M. agalactiae was isolated and identified in Brazil, causing great economic losses. Considering the need for characterization of Brazilian strains of M. agalactiae and implementation of effective control, this work was performed in three steps. The first article describes the biochemical and protein profile of isolates of M. agalactiae in small ruminants through the culture in modified Hayflick medium, biochemical tests, polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunogenicity of these proteins by Western blot (WB). The samples had similar protein in the profile bands ranging from 30-135 kDa in SDS-PAGE, in addition the presence of a protein of 48 kDa immunodominant WB was shown. To continue identifying the agent involved in the AC in Brazil, the second article describes the analysis of ten sequences of M. agalactiae isolated from goats and sheeps. A DNA fragment of 360 bp of the 16S rRNA gene was amplified by PCR and sequenced. The analysis revealed a high degree of similarity among all the sequences. The study revealed greater than 99% similarity with the reference samples of M. agalactiae. In the third article, efficacy of three inactivated vaccines prepared with a local of M. agalactiae sample and adsorbed with three adjuvants was evaluated in goats and sheep. The antibody response in vaccinated animals was analyzed using an indirect ELISA. The three vaccines induced antibody production, and can be an alternative to reduce economic losses and prevent contagious agalactia. These results confirms the presence and spread of M. agalactiae in the country and enhances the possibility of controlling the disease through the adoption of livestock vaccination.. Keywords: goat, sheep, mycoplasmosis, vaccination, sequencing, SDS-PAGE, Western Blot.

(12) LISTA DE ILUSTRAÇÕES Pág. ARTIGO CIENTÍFICO 1 Figura 1. Características dos isolados de M. agalactiae em meio Hayflick. 44. sólido. A: Colônias com aspecto de “ovo frito”. B: Presença de colônias e Filmes. Figura 2. PCR para o gene 16S rRNA dos isolados de M. agalactiae. PM: Peso. 44. Molecular. CN: Controle Negativo. Linhas 3 a 10: identificação das amostras analisadas. Figura 3. Perfil protéico de M. agalactiae obtido por SDS-PAGE e corado com. 45. Coomassie Blue R-250. Linhas 2 a 9: identificação das amostras analisadas. O peso molecular está em kDa. A direita proteínas de M. agalactiae. Figura 4. Resultado do dot-blot utilizando soros positivos e negativos diluídos. 45. de 1/10 até 1/200, antígeno total e diluído 1/2 até 1/32 e conjugado anti-cabra peroxidase 1/100. TL = tampão de lise. Figura 5. Resultado do dot-blot utilizando soros positivos e negativos diluídos. 46. de 1/10 até 1/200, antígeno total e diluído 1/2 até 1/32 e conjugado anti-cabra peroxidase 1/200. TL = tampão de lise. Figura 6. Perfil imunogênico de M. agalactiae através de WB utilizando pool de. 47. soros positivos (CP). BrPB3.03 amostra proveniente da Paraiba e BrRN1.01 do Rio Grande do Norte. O peso molecular está em kDa. A direita proteínas de M. agalactiae. ARTIGO CIENTÍFICO 2 Figura 1. Árvore montada pelo programa MEGA5 após alinhamento da sequência consenso do gene 16S rRNA dos isolados com sequências de M. agalactiae e M. bovis disponíveis no GenBank. O alinhamento foi realizado pela ferramenta ClustalW e agrupamento pelo método de neighbor-joining. O gene 16S rRNA da espécie Candidatus Mycoplasma haemominutum (gi|359801421|) foi usado como outgroup.. 55.

(13) ARTIGO CIENTÍFICO 3 Figura 1. Níveis de anticorpos anti-M. agalactiae analisados pelo ELISA-Gs em. 65. caprinos vacinados contra agalaxia contagiosa. Gc1 = caprinos imunizados com a vacina 1; Gc2 = caprinos imunizados com a vacina 2; Gc3 = caprinos imunizados com a vacina 3; Gc4 = caprinos não imunizados (controle). 0 = dia da 1ª dose; 15 = 15 dias após 1ª dose; 21 = dia da 2ª vacinação, 21 dias após 1ª dose; 51 a 171 = dias após a 1ª dose. Figura 2. Níveis de anticorpos anti-M. agalactiae analisados pelo ELISA-Gs em. 65. ovinos vacinados contra agalaxia contagiosa. Gov1 = ovinos imunizados com a vacina 1; Gov2 = ovinos imunizados com a vacina 2; Gov3 = ovinos imunizados com a vacina 3; Gov4 = ovinos não imunizados (controle). 0 = dia da 1ª dose; 15 = 15 dias após 1ª dose; 21 = dia da 2ª vacinação (21 dias após 1ª dose); 51 a 171 = dias após a 1ª dose. Figura 3. Comparação da resposta imune através do ELISA-Gs dos grupos de. 69. caprinos desafiados. Gc1 = caprinos imunizados com a vacina 1; Gc2 = caprinos imunizados com a vacina 2; Gc3 = caprinos imunizados com a vacina 3; Gc4 = caprinos não imunizados (controle). D0= dia do desafio (75 dias após a segunda dose da vacina); D1 a D8 = data das coletas (em dias) após o desafio, realizadas com intervalo de 7 dias. Figura 4. Comparação da resposta imune através do ELISA-Gs dos grupos de ovinos desafiados. Gov1 = ovinos imunizados com a vacina 1; Gov2 = ovinos imunizados com a vacina 2; Gov3 = ovinos imunizados com a vacina 3; Gov4 = ovinos não imunizados (controle). D0= dia do desafio (75 dias após a segunda dose da vacina); D1 a D8 = datas das coletas (em dias) após o desafio, realizadas com intervalo de 7 dias.. 69.

(14) LISTA DE TABELAS Pág. ARTIGO CIENTÍFICO 1 Tabela 1. Lista de isolados brasileiros de Mycoplasma agalactiae analisados.. 40. ARTIGO CIENTÍFICO 3 Tabela 1. Tamanho da reação local (em mm) e persistência do nódulo (em dias). 64. no local de inoculação de acordo com a vacina utilizada em caprinos (Gc) e ovinos (Gov). Tabela 2. Percentual de densidade óptica (DO) analisado através do ELISA-Gs. 66. dos caprinos vacinados (Gc1, Gc2, Gc3) e não vacinados (Gc4). Tabela 3. Percentual de densidade óptica (% DO) analisado através do ELISA-. 67. Gs dos ovinos vacinados (Gov1, Gov2, Gov3) e não vacinados (Gov4). Tabela 4. Resultados do ELISA-Gs em percentual de densidade óptica (% DO). 70. após desafio dos caprinos. Grupos vacinados (Gc1, Gc2, Gc3) e não vacinado (Gc4). Tabela 5. Resultados do ELISA-Gs em percentual de densidade óptica (% DO) após desafio dos ovinos. Grupos vacinados (Gov1, Gov2, Gov3) e não vacinado (Gov4).. 70.

(15) SUMÁRIO Pág. Introdução. 16. 2 Objetivos. 18. 2.1 Geral. 18. 2.2 Específicos. 18. 3 Revisão de Literatura. 19. 3.1 Agalaxia Contagiosa. 19. 3.2 Identificação e caracterização do Mycoplasma agalactiae. 21. 3.3 Medidas de controle e prevenção. 23. 3.4 Situação no Brasil. 27. Referências Bibliográficas. 30. 4 Artigo Científico 1. 37. Caracterização bioquímica e protéica de Mycoplasma agalactiae do Brasil. 5 Artigo Científico 2 Sequenciamento. 52 parcial. do. gene. 16S. rRNA. confirma. homogeinidade de Mycoplasma agalactiae no Brasil. 6 Artigo Científico 3 Desenvolvimento e avaliação da eficácia de vacinas inativadas contra agalaxia contagiosa no Brasil.. 57.

(16) INTRODUÇÃO. 17. Introdução O desenvolvimento da ovinocaprinocultura na região Nordeste do Brasil tem recebido constantes incentivos do setor público nos últimos anos, tanto em termos de destinação de recursos para financiamento como por meio de políticas de compra direta do leite, carne e derivados. A crescente oferta de matéria-prima desencadeou a instalação de usinas de processamento e matadouros, constituindo-se numa das alternativas para o beneficiamento do leite e da carne, facilitando a comercialização do produto, inclusive dos agricultores familiares. Em que pese o bom momento do setor, alguns entraves no processo produtivo podem ser observados. Falta assistência técnica qualificada, o manejo alimentar é precário, o armazenamento de forragens é insuficiente, o processo de organização dos produtores e da produção é incipiente e os cuidados higiênicosanitários dos rebanhos continuam sendo negligenciados. A circulação de animais entre os rebanhos se dá de forma indiscriminada e sem controle do serviço de defesa sanitária animal. Do ponto de vista sanitário, uma das principais preocupações atuais têm sido a ocorrência e disseminação da Agalaxia Contagiosa (AC) em ovinos e caprinos causada por Mycoplasma agalactiae. A doença se caracteriza por mastite, agalaxia, poliartrite e ceratoconjuntivite causando sérios prejuízos aos caprinocultores da região desde 2001, quando pesquisadores da Universidade Federal de Campina Grande – UFCG, Universidade Federal Rural de Pernambuco – UFRPE, Empresa de Pesquisa Agropecuária da Paraíba – EMEPA e Universidade Federal Fluminense – UFF fizeram o diagnóstico clínico-patológico e microbiológico da enfermidade em um rebanho leiteiro pertencente à Estação Experimental de Pendência, do governo do estado da Paraíba (NASCIMENTO et al., 2002; AZEVEDO et al., 2002; TABOSA et al., 2002). Por tratar-se de uma doença até então exótica no país, e não haver, naquele momento, métodos diagnósticos rápidos, a infecção rapidamente se disseminou entre os rebanhos dos Estados de Pernambuco, Paraíba e Rio Grande do Norte, favorecida pela intensa comercialização de animais entre estes Estados (AZEVEDO et al., 2006)..

(17) INTRODUÇÃO. 18. No início dos primeiros casos no estado da Paraiba, o sacrifício dos animais dos rebanhos acometidos foi indicado. Entretanto, muitos criadores não conheciam a doença e comercializaram seus animais, disseminando a infecção e impossibilitando seu controle. Diferentes medidas podem ser adotadas para o controle da doença, sendo que nenhuma delas isolada é suficiente para manter os rebanhos totalmente protegidos da infecção. Portanto, a associação de diferentes procedimentos é a melhor estratégia. A administração de antibióticos por longos períodos reduz a apresentação dos casos clínicos, em contrapartida, mantém um grande número de animais portadores que transmitem a bactéria para outros animais. A indução de partos com separação imediata das crias pode auxiliar a formação de rebanhos livres da bactéria, mesmo quando nascidos de animais infectados, e a vacinação dos animais jovens contribui para redução do número de casos clínicos e tem sido amplamente adotada em regiões endêmicas. Diversos estudos que demonstram a eficiência das vacinas contra Mycoplasma agalactiae têm sido realizados na Europa. No Brasil, apesar da doença ter sido notificada há 10 anos, não há vacinas disponíveis para comercialização. A preparação de vacinas requer o conhecimento do microrganismo causador, em particular sua constituição antigênica. Para tanto, diversas técnicas podem ser empregadas, sendo que a SDS-PAGE é a mais comumente utilizada. Por outro lado, a qualidade de uma vacina está diretamente relacionada com o processo de produção do antígeno ou sua inativação, bem como os adjuvantes empregados na formulação. Neste sentido, este trabalho está dividido em três artigos. No primeiro artigo, é feita a caracterização protéica e imunogênica de isolados de M. agalactiae utilizando SDS-PAGE e Western Blot. No segundo artigo, são apresentados os resultados da utilização de vacinas inativadas adsorvidas com diferentes adjuvantes na indução de anticorpos em caprinos e em ovinos e, no terceiro artigo, é apresentado o sequenciamento de um fragmento de DNA do gene 16S rRNA amplificado por PCR e a análise filogenética destes isolados, comparando-os às sequências depositadas no GenBank. Desta forma, este trabalho teve como objetivo dar continuidade ao entendimento da epidemiologia da agalaxia contagiosa no Brasil e disponibilizar uma alternativa para a redução de casos da doença..

(18) OBJETIVOS. 18. 2 Objetivos 2.1 Geral. Caracterizar Mycoplasma agalactiae isolados no Brasil e produzir uma vacina para o controle da Agalaxia Contagiosa utilizando amostra brasileira de M. agalactiae.. 2.2 Específicos. 2.2.1 Caracterizar amostras brasileiras de M. agalactiae, através da análise do perfil protéico e bioquímico. 2.2.2 Sequenciar fragmento de DNA do gene 16S rRNA de isolados brasileiros de M. agalactiae. 2.2.3 Testar a imunogenicidade das vacinas produzidas através da avaliação dos níveis de anticorpos anti-M. agalactiae dos animais vacinados utilizando um ELISA indireto. 2.2.4 Avaliar a eficácia das vacinas através do desafio de animais vacinados..

(19) REVISÃO DE LITERATURA. 20. 3 Revisão de Literatura 3.1 Agalaxia Contagiosa. A agalaxia contagiosa (AC) causada por Mycoplasma agalactiae tem sido relatada em caprinos e ovinos de forma endêmica em países da Europa, África e região central e oeste da Ásia e como uma doença emergente em países do continente americano e no Japão (DOUTRE et al., 1981; REAL et al., 1994; EGWU et al., 2001; GIL et al., 2003; AZEVEDO et al., 2006; OIE, 2011). Outras espécies podem estar envolvidas, como M. capricolum subesp. capricolum, M. mycoides subesp. mycoides LC (Large Colony), M. putrefaciens e M. arginini (CORRALES et al., 2007). Os sinais clínicos característicos são mastite seguida de agalaxia, poliartrite e ceratoconjuntivite. A infecção dissemina-se rapidamente no rebanho, podendo atingir 30-85% dos animais em curto intervalo de tempo determinando perdas consideráveis, sobretudo pela redução acentuada na produção de leite e morte dos animais (DOUTRE et al., 1981; REAL et al., 1994; EGWU et al., 2001; GIL et al., 2003). M. agalactiae infecta o hospedeiro principalmente por via oral e intramamária, e, menos frequentemente, respiratória, subcutânea, genital e ocular. Uma vez ocorrida a infecção, os microrganismos aderem-se ao tecido epitelial, utilizando adesinas localizadas na superfície (RAZIN, 1999). Em seguida os animais desenvolvem bacteremia com febre e distribuição do agente nos órgãos alvos, (glândula mamária, olhos, órgãos internos, linfonodos, articulações, tendões, etc), onde ocorre o processo inflamatório. A enfermidade é transmitida rapidamente através do contato com animais infectados, com ou sem sinais clínicos, ou através da ingestão de água e alimentos contaminados com exsudatos e leite. As fêmeas em lactação adquirem a infecção através das mãos do ordenhador, ordenhadeira mecânica através do contato com materiais contaminados, ou por inalação. A venda de animais portadores e o contato entre os animais durante a transferência constituem os principais meios de transmissão entre rebanhos. Nos rebanhos de áreas endêmicas a doença.

(20) REVISÃO DE LITERATURA. 21. frequentemente ocorre próximo ou durante a lactação, por vários anos seguidos (BERGONIER et al., 1997; MADANAT et al., 2001). A doença persiste no rebanho, em virtude do agente ser excretado por longos períodos quando já não há sinais clínicos. O isolamento de M. agalactiae foi possível a partir do leite de cabras por um período de 12 meses, podendo persistir por até oito anos (MADANAT et al., 2001). A presença de portadores assintomáticos em um rebanho representa um sério risco à manutenção da infecção. Outra condição de risco de transmissão é a presença de M. agalactiae no conduto auditivo externo (DaMASSA, 1983; RIBEIRO et al., 1997), local onde pode evitar a ação da resposta imunológica do hospedeiro. A morbidade pode alcançar 100% e a mortalidade pode atingir 10-80% (AZEVEDO et al., 2002; NICHOLAS, 2002), dependendo do perfil imunológico do rebanho. Vários surtos importantes têm sido descritos, e medidas radicais, às vezes são indicadas, na perspectiva de controlar/erradicar a infecção (AZEVEDO, 2005). Em países onde cabras e ovelhas desempenham um importante papel como alimento e mercadoria, a agalaxia contagiosa é um dos mais sérios problemas sanitários (DaMASSA, 1992; MADANAT et al., 2001; MARENDA et al., 2004). Os casos clínicos ocorrem com maior freqüência no início da lactação e quando as condições higiênicas dos estábulos, salas de ordenhas e ordenhadores não são satisfatórias (KINDE et al., 1994). O período de incubação da AC varia de uma a oito semanas, dependendo da quantidade de microrganismos, virulência da amostra e resistência do hospedeiro. Normalmente, os primeiros casos apresentam evolução aguda com febre passageira, redução abrupta da produção de leite, agalaxia e mastite uni ou bilateral. A coloração do leite pode variar desde claro (aquoso) a amarronzado com grumos ou apresentar aspecto purulento. Quando deixado em repouso, os grumos se depositam no fundo do recipiente. O odor não é alterado, porém quando há presença de M. putrefaciens, ou de outras bactérias produtoras de gases, observa-se um odor pútrido (TULLY et al., 1974). Na fase clínica da agalaxia contagiosa em pequenos ruminantes há aumento da contagem de células somáticas (CCS) no leite (CORRALES et al., 2004). Não há predisposição por idade e o quadro de poliartrite é mais comum nas articulações do carpo e tarso, que apresentam-se doloridas, com líquido de aspecto fibrino-purulento, podendo variar de transparente a amarelado (DaMASSA et al., 1984). A poliartrite causa perda de peso acentuada, podendo levar o animal à morte.

(21) REVISÃO DE LITERATURA. 22. por inanição, devido à incapacidade de locomoção (AZEVEDO, 2005). Nos casos crônicos os animais podem desenvolver anquilose, podendo o animal ficar sem disposição e evitando ficar em estação (DaMASSA et al., 1992; MADANAT et al., 2001). Os. sintomas. oculares. variam. de. conjuntivite,. ceratite. a. severa. ceratoconjuntivite. Quando isto ocorre há lacrimejamento, fotofobia, congestão da mucosa conjuntiva e, nos casos avançados, vascularização da superfície da córnea, podendo ocorrer perda da visão uni ou bilateral (CORRALES et al., 2007).. 3.2 Identificação e caracterização do Mycoplasma agalactiae. Os métodos de diagnóstico utilizados para identificação de micoplasmas estão bastante desenvolvidos. O aparecimento de colônias com aspecto de “ovo frito” ou mamilar e a presença de filmes e manchas associados ao perfil bioquímico, como não degradar arginina nem fermentar glicose, são úteis para identificação de M. agalactiae, sendo, portanto, o método padrão para diagnóstico laboratorial. Os meios mais utilizados são seletivos (PPLO e Hayflick caldo e agar) contendo penicilina e acetato de tálio e enriquecidos com soro equino ou suíno, que suprem a necessidade de colesterol dos micoplasmas, são os mais utilizados. A diferenciação das espécies através de técnicas sorológicas é rotineiramente utilizada, no entanto, em alguns casos, há necessidade de comprovação por técnicas mais específicas, em virtude de reações cruzadas entre amostras estreitamente relacionadas ou mesmo por variações no tamanho e expressão antigênica das proteínas de superfície da amostra (ROSENGARTEN & YOGEV, 1996). Estruturalmente, a membrana celular dos micoplasmas é constituída por 2/3 de proteínas e 1/3 de lipídeos. As lipoproteínas de membrana são mais abundantes nesse grupo que nas demais bactérias e constituem a maioria dos antígenos de superfície dos micoplasmas. Sistemas baseados em mutação são freqüentemente desenvolvidos como estratégia de sobrevivência dos micoplasmas no interior dos hospedeiros (RAZIN et al., 1998). Diferentes proteínas estão associadas com a aderência do micoplasma às células hospedeiras. Uma proteína de 40 kDa, associada à aderência de M. agalactiae, foi identificada por Fleury et al. (2002) que confirmaram sua participação.

(22) REVISÃO DE LITERATURA. 23. como mediadora desse evento, pois anticorpos anti-P40 inibiram significativamente a aderência in vitro de M. agalactiae às células sinoviais de ovinos. A P40 é específica de M. agalactiae, pois espécies de Mycoplasma estreitamente relacionadas não apresentaram resposta quando analisadas por southern blotting. Soro monoclonal anti-P40 produzido em coelho reagiu com uma proteína com peso molecular de 37 kDa da amostra de referência PG2 e de outras 22 amostras de M. agalactiae isoladas em diferentes países da Europa (FLEURY et al., 2002). Tola et al. (2001) caracterizaram e seqüenciaram uma lipoproteína de membrana com 80 kDa (P80) de M. agalactiae isolado de leite caprino com agalaxia contagiosa. Anticorpos anti-P80 foram detectados na fase inicial da infecção, mas a função desta proteína ainda deve ser esclarecida. Estudos conduzidos por Fleury et al. (2001) revelaram uma proteína com 30 kDa associada à membrana de M. agalactiae. Das 27 amostras pesquisadas, 20 apresentaram P30. A P30 induziu uma resposta imune que permaneceu crescente até 21 e 61 dias quando analisadas por ELISA e Imunobloting, respectivamente. Santona et al. (2002) identificaram epítopos imunodominantes de uma lipoproteína de M. agalactiae e sugeriram que esses sítios podem ser utilizados como vacinas sintéticas contra agalaxia contagiosa. Proteínas com 40, 55, 70, 80 e 110 kDa foram detectadas em amostras isoladas de ovinos com AC, destacando-se uma de 55 kDa que foi imunodominante quando testada com os 96 soros de ovinos infectados. Esta proteína parece ser menos representativa na amostra de referência PG2. Chávez-González et al. (1995) desenvolveram dois PCR’s baseados na seqüencia do gene 16S rRNA de M. agalactiae e M. bovis. Os primers iniciadores foram idênticos nos dois sistemas e complementares para a região variável V2, enquanto os primers reversos tinham dois nucleotídeos diferentes, complementares para a região variável V6. O resultado de ambos os sistemas foi um produto amplificado com 360 pb. Mattsson et al. (1991) analisaram a sequência parcial do gene 16S rRNA de M. agalactiae e M. bovis e constataram, pela utilização de sondas de hibridação, que não houve hibridazação entre as amostras de bovinos, caprinos e ovinos para a seqüência da região V8,. podendo ser usada para detectar M. agalactiae em. amostras de caprinos e ovinos..

(23) REVISÃO DE LITERATURA. 24. O grau de variabilidade intra-específica do gene 16S rRNA de M. agalactiae e M. bovis isoladas na Europa foi investigado por Königsson et al. (2002) utilizando o seqüenciamento do produto amplificado por PCR. O número de nucleotídeos diferentes em isolados de M. agalactiae variou de 0 a 14 e de 0 a 10 em M. bovis, enquanto que o número de polimorfismos variou de 0 a 7 e de 0 a 6, respectivamente. Das 17 amostras de M. agalactiae, nove posições polimórficas foram identificadas, enquanto que M. bovis apresentou seis posições em oito amostras estudadas. Os autores confirmaram a estreita relação entre as duas espécies, embora tenham detectado 14 nucleotídeos diferentes nas seqüências do gene 16S rRNA, mas 10 deles estão localizados em posições polimórficas, ou seja, a diferença entre as duas amostras envolvendo o gene 16S rRNA é de apenas quatro nucleotídeos.. 3.3 Diagnóstico, prevenção e controle. Para o estabelecimento de estratégias de controle e classificação de um rebanho em relação a AC é necessário a implantação de uma rotina de avaliações, como a realização de exame bacteriológico do leite para isolamento do M. agalactiae, exames clínicos, análise epidemiológica, além de acompanhamento sorológico semestral ou anual para fins de monitoramento (PÉPIN et al., 2003). O diagnóstico presuntivo da AC é estabelecido com base nos achados epidemiológicos e na presença de sinais clínicos. Entretanto, se somente um sinal da doença está presente, torna-se mais difícil o diagnóstico clínico, devendo ser confirmado através de exames laboratoriais. O isolamento e identificação do agente infeccioso é realizado através do cultivo em meios específicos, contendo soro equídeo ou suíno, como fonte de colesterol. Diversos amostras clínicas podem ser utilizadas, porém o leite tem apresentado melhores resultados. Suabe ocular, nasal, vaginal, líquido articular, sangue, urina, lavado do conduto auditivo externo, entre outros, também podem ser cultivados (MADANAT et al., 2001; AZEVEDO et al., 2006). Técnicas mais precisas, sensíveis e específicas têm sido padronizadas na perspectiva de reduzir o período necessário para o diagnóstico final. A crescente utilização da biologia molecular, como ferramenta diagnóstica, tem permitido a identificação de antígenos de superfície, segmentos do DNA cromossomal ou RNA.

(24) REVISÃO DE LITERATURA. 25. ribossomal (rRNA), com alta sensibilidade e especificidade, sendo a reação em cadeia da polimerase (PCR) a técnica mais comumente empregada (CHAVEZGONZALEZ et al., 1995; TOLA et al., 1996; GRECO et al., 2001; AZEVEDO et al., 2006; ). No entanto, estas técnicas são de difícil aplicação na rotina laboratorial por exigir reagentes de alto custo, equipamentos sofisticados e mão-de-obra qualificada. O diagnóstico também pode ser feito mediante a utilização de técnicas sorológicas para a detecção de anticorpos, como Western Blot (DE LA FE et al., 2007), teste de fixação de complemento (KITTELBERGER et al., 2006) e os ensaios imunoenzimáticos (LAMBERT et. al., 1998; MADANAT et al., 2002; AZEVEDO et al., 2006). Uma das primeiras providências para o controle de surtos de agalaxia contagiosa é o isolamento dos animais infectados e a rápida administração de antibióticos. com. intuito. de. reduzir. a. carga. infectante.. Muitos. agentes. antimicrobianos, tais como macrolídeos e lincosamideos, tetraciclina, tiamulin e fluoroquinolonas, são eficazes contra os micoplasmas, embora já se tenha relatos de resistência aos antibióticos mais constantemente utilizados (LORIA et al., 2002; ASSUNÇÃO et al., 2006; ANTUNES et al., 2008). Embora haja a possibilidade de combater esta infecção com o uso de antibióticos, a administração por períodos curtos (cinco a sete dias), com redução ou desaparecimento dos sinais clínicos, não elimina totalmente a bactéria, propiciando que os animais tornem-se permanentemente infectados. Por outro lado, o alto custo com tratamentos prolongados faz com que os criadores abandonem o tratamento e comercializem os animais assim que os sintomas desaparecem, favorecendo ainda mais a disseminação da infecção. Quando a infecção entra em um território livre da agalaxia contagiosa, a medida mais efetiva parece ser o sacrifício dos animais. Entretanto, por causa do impacto econômico e social desta intervenção, torna-se difícil sua aplicação, particularmente em países com baixo desenvolvimento econômico (MADANAT et al., 2001; AZEVEDO, 2005; CORRALES et al., 2007). A busca de alternativas para controlar a doença tem sido constante. Uma das possibilidades é a separação das crias no momento do parto com oferecimento de colostro e leite tratado termicamente ou de animais negativos (ALCÂNTARA et al., 2003)..

(25) REVISÃO DE LITERATURA. 26. Em áreas endêmicas, o controle objetiva reduzir a disseminação da infecção intra e inter-rebanhos pela redução da movimentação de animais, higienização das instalações, antibioticoterapia e vacinação (BERGONIER et al., 1997). Desde a década de 1970, a Europa tem adotado a vacinação como medida profilática para AC em ovinos e caprinos utilizando vacinas vivas atenuadas (FOGGIE et al., 1970; 1971). No entanto, é a partir da década de 1990 que esta prática foi mais intensamente empregada com diferentes formulações. A maioria das vacinas é preparada apenas com M. agalactiae, mas outras são formuladas a partir da associação de M. agalactiae com M. mycoides subsp. mycoides LC (Large Colony), M. putrefaciens, M. capricolum subsp. capricolum (LEÓN VIZCAÍNO et al., 1995; TOLA et al., 1999; GRECO et al., 2002; DE LA FE et al., 2007; BUONAVOGLIA et al., 2008; BUONAVOGLIA et al., 2010). Vacinações são consideradas apropriadas particularmente em regiões de baixo poder econômico e social. Nestes locais a imunização é desejável, até porque medidas mais radicais (sacrifício de animais, restrição de comércio e trânsito de pessoas e animais) são praticamente impossíveis de serem adotadas. Entre as vacinas desenvolvidas poucas modificações foram realizadas nos protocolos utilizados. Vacinas vivas atenuadas contra M. agalactiae induzem títulos mais altos e mais duradouros, mas o microrganismo pode ser eliminado no leite por vários meses (MADANAT et al., 2001). Esses inconvenientes fazem com que muitos países não autorizem o uso de vacinação contra agalaxia contagiosa. Por outro lado, vacinas inativadas estimulam títulos mais baixos e menos persistentes, e devem ser repetidas em períodos mais curtos, de preferência antes e após o parto (LEON VIZCAINO et al., 1995), sendo consideradas uma alternativa mais segura de controle da AC. Na maioria das vezes, as vacinas são inativadas com formaldeído. No entanto, outras substâncias podem ser empregadas, como o fenol, o etilenoamino binário, a saponina, o tratamento térmico entre outros (BUONAVOGLIA et al., 1998; DE LA FE et al., 2004). Tola et al. (1999) ao utilizarem diversos tipos de inativantes em vacinas contra agalaxia contagiosa demonstraram que a saponina apresentou ótima capacidade de manutenção das proteínas imunogênicas do antígeno e manutenção de níveis de anticorpos por um período superior a seis meses. Nesse mesmo caminho, De La Fe et al. (2004) demonstraram que o formaldeido, fenol e etilenoamino binário foram eficientes para inativação de M..

(26) REVISÃO DE LITERATURA. 27. agalactiae, M. mycoides subsp. mycoides LC, M. capricolum subsp. capricolum e M. putrefaciens mantendo a capacidade imunogênica das amostras, podendo ser utilizados na preparação de vacinas contra AC. Leon-Vizcaíno et al. (1995) produziram uma vacina inativada e estabeleceram diferentes protocolos vacinais em um rebanho de 400 caprinos e observaram que houve redução dos sinais clínicos e que os animais que receberam três doses de vacina apresentaram maior resistência à infecção experimental que os vacinados com duas doses. A eficiência das vacinas está diretamente relacionada com a qualidade do antígeno, o tipo de adjuvante e as condições de saúde dos animais imunizados. Adjuvantes como o hidróxido de alumínio e o óleo mineral são constantemente utilizados. Buonavoglia et al. (1998) e Greco et al. (2002) observaram que vacina inativada adsorvida com adjuvante oleoso induziu títulos mais altos e mais duradouros do que a vacina com hidróxido de alumínio como adjuvante. Contudo, vale salientar que adjuvantes oleosos produzem maior reação no local de administração que os adjuvantes aquosos, podendo interferir no diagnóstico de lesões causadas por Corynebacterium pseudotuberculosis, infecção comum entre os rebanhos do Nordeste brasileiro. Recentemente, De La Fe et al. (2007) detectaram anticorpos anti-M. agalactiae durante seis meses após vacinação quando hidróxido de alumínio foi utilizado como adjuvante. Os autores relatam que vacina contendo hidróxido de alumínio associado à saponina conferiu uma maior proteção dos animais quando submetidos a desafio experimental. Como em outros países, a vacinação das matrizes antes e após o parto e aos seis meses de idade pode ser uma medida auxiliar na redução da expressão clínica da enfermidade (LEON VIZCAINO et al., 1995). Seguindo a linha de vacinas tradicionais Buonavoglia et al. (2008) analisaram uma vacina inativada contendo três tipos de adjuvantes em diferentes concentrações e observaram que a vacina constituída por Montanide ISA-563, Marcol-52 e Montane-80 na proporção de 30:63:7, respectivamente, apresentou os melhores resultados em termos de produção de anticorpos. A desvantagem da vacina com tripla emulsão oleosa foi uma maior reação no local da inoculação. Em relação a persistência de anticorpos, em outro estudo utilizando a mesma vacina, Buonavoglia et al. (2010) constataram que os ovinos vacinados e desafiados aos 5 e 8 meses.

(27) REVISÃO DE LITERATURA. 28. após o reforço vacinal não desenvolveram sinais clínicos de AC. No entanto, apresentaram declínio dos títulos de anticorpos mesmo após o desafio, ao contrário do grupo controle, que tiveram sinais clínicos e aumentaram os níveis de anticorpos. Vacina de DNA contra AC preparada a partir do gene p48 de M. agalactiae, foi capaz de induzir resposta celular e humoral quando testada em camundongos representando uma possibilidade de aplicação em pequenos ruminantes (CHESSA et al., 2009).. 3.4 Situação no Brasil. No Brasil não havia relatos ou confirmação da AC até 2001, entretanto a ocorrência de sinais clínicos de AC simultaneamente em caprinos de um mesmo rebanho no Estado da Paraíba resultou na suspeita de agalaxia contagiosa causada por Mycoplasma agalactiae, microrganismo até então exótico no país. A confirmação se deu por isolamento e pelo teste de imunoperoxidase indireta (NASCIMENTO et al., 2002). Posteriormente, Azevedo et al. (2006) diagnosticaram a doença também em Pernambuco e no Rio Grande do Norte. Os autores relataram a morte de 14 (14,73%) das 89 cabras em lactação e de sete (6,4%) dos 109 cabritos de um rebanho constituído por animais de raças leiteiras de alto valor zootécnico. Em um segundo surto, as taxas de mortalidade foram de 36,5% entre os cabritos, 22,9% entre os cordeiros e 3,3% entre as cabras em lactação. Os rebanhos que apresentaram estes casos tinham em comum a participação em exposições de animais, embora os surtos tenham ocorrido com intervalo de 3-4 meses. Os animais desses rebanhos foram medicados com tilosina e tetraciclina, obtendo resultados clínicos favoráveis, mas com manutenção de portadores. Levantamento por amostragem revelou que 20% dos criatórios das microrregiões do Cariri (oriental e ocidental), maior bacia produtora de leite caprino do estado da Paraíba, foram positivos para AC, demonstrando a ampla distribuição da doença (BANDEIRA et al., 2007). Dos Animais testados 7,5% apresentaram resultado positivo para M. agalactiae. A doença tem se disseminado entre os rebanhos leiteiros pela falta de conhecimento das medidas preventivas por parte dos produtores, pela incapacidade de fiscalização dos órgãos de defesa sanitária dos estados e municípios e pelo.

(28) REVISÃO DE LITERATURA. 29. intenso comércio de animais vivos, destinados ao abate e para a reprodução. A enfermidade constitui-se em uma das maiores preocupações de pesquisadores e produtores desta região nos últimos anos, sobretudo pelo elevado custo para o controle da doença nos rebanhos. Em estudo recente, Campos et al. (2009) padronizaram um ELISA Indireto para diagnóstico da enfermidade utilizando antígeno sonicado de M. agalactiae e como conjugado proteína G-peroxidase (ELISA-Gs), o que tem permitido a rápida identificação de caprinos infectados na região Nordeste do Brasil. Utilizando o ELISA-Gs, Alcântara (2010), em levantamento realizado em 20 rebanhos caprinos leiteiros distribuídos em municípios da microrregião do Cariri ocidental paraibano, detectou a presença de anticorpos anti-M. agalactiae em 307 (56,43%) das 544 amostras analisadas. A taxa de animais positivos variou de 10,0% a 100% por propriedade. Nos rebanhos acometidos o controle tem se fundamentado no sacrifício de animais infectados, antibioticoterapia e segregação de animais, de acordo com as condições econômicas e sociais dos produtores (AZEVEDO, 2005). Alcântara et al. (2003) obtiveram crias livres da infecção a partir da indução do parto e separação das crias no momento do parto, alcançando bons resultados com este procedimento. Considerando que o uso da antibioticoterapia, apesar de reduzir os sintomas, não induz à cura total (CORRALES et al., 2007) e que este tipo de tratamento requer longo período, o que resulta em resistência bacteriana, permanência do agente no meio ambiente, bem como a presença de resíduos no leite, têm sido pesquisadas alternativas terapêuticas. Marinho. (2008). avaliou. um. medicamento. homeopático. (bioterápico),. produzido com M. agalactiae isolado de uma cabra com AC, para o tratamento da doença em caprinos de surtos ocorridos na Paraíba. Este tratamento resultou no desaparecimento dos sintomas em todos os animais, bem como na melhora no desempenho produtivo e ausência de novos surtos nos rebanhos monitorados durante 12 meses. O tratamento para AC através da bioterapia mostrou-se viável, por ser compatível com o manejo da pecuária orgânica, não oferecendo risco para a saúde humana e animal, bem como da redução dos custos com o medicamento. Diante da realidade há necessidade de associação destas ações, com ênfase no diagnóstico e no desenvolvimento de vacinas com amostras brasileiras, como.

(29) REVISÃO DE LITERATURA. 30. medidas estratégicas de controle da doença, contribuindo para a sustentabilidade da atividade na região semiárida. Neste sentido, Campos (2012) testou a eficiência de três vacinas inativadas produzidas com amostra brasileira de M. agalactiae e adsorvidas com diferentes adjuvantes em caprinos e ovinos, obtendo boa resposta em termos de produção de anticorpos anti-M. agalactiae e proteção contra a infecção experimental. Acompanhamento. de. surtos. em. diferentes. áreas. dos. Estados. de. Pernambuco, Paraiba e Rio Grande do Norte têm sido realizados com o objetivo de estabelecer medidas de controle e tratamento eficazes e para melhor entender a dinâmica da infecção em nossa região (comunicação pessoal)..

(30) REVISÃO DE LITERATURA. 31. Referências Bibliográficas ALCÂNTARA, M.D.B.; AZEVEDO, E.O.; FARIAS, A.A.; TABOSA, I.M.; ARAÚJO, M.D.; SANTOS, F.A.; NASCIMENTO, E.R.; CASTRO, R.S. Indução de parto e separação das crias para controle da agalaxia contagiosa em caprinos. In: Cong. Latinamer. Buiatria, XI, 2003, Salvador. p. 71. ALCÂNTARA, M.D.B. Soroprevalência da agalaxia contagiosa e vacinação experimental em caprinos. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária), Centro de Saúde e Tecnologia Rural, Universidade Federal de Campina Grande, Patos, PB. 2010. 44p. ANTUNES, N.T.; TÁVIO, M.M.; ASSUNÇÃO, P.; ROSALES, R.S.; POVEDA, C.; DE LA FE, C.; GIL, M.C.; POVEDA, J.B. In vitro susceptibilities of field isolates of Mycoplasma agalactiae. Vet. J., v. 177, p. 436-438, 2008. ASSUNÇÃO, P.; ANTUNES, N.T.; ROSALES, R.S.; DE LA FE, C.; POVEDA, C.; POVEDA, J.B.; DAVEY, H.M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytometry A., v. 69, n. 10, p. 1071-1076, 2006. AZEVEDO, E.O. Aspectos clínicos, microbiológicos, anátomo-patológicos e epidemiológicos da agalaxia contagiosa dos ovinos e caprinos (ACOC) no Brasil. Tese (Doutorado em Ciência Veterinária), Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE. 2005. 135p. AZEVEDO, E.O.; ALCÂNTARA, M.D.B.; TABOSA, I.M.; NASCIMENTO, E.R.; FARIAS, A.A.; CASTRO, R.S.; CAMPOS, C.A.M. Contagious agalactia by Mycoplasma agalactiae in dairy goats in Brazil. Epidemiologic findings. In: Intern. Cong. Intern. Organiz. Mycoplasmol. (IOM). XIV, Vienna, p. 48, 2002. AZEVEDO, E.O; ALCÂNTARA, M.D.B.; NASCIMENTO, E.R.; TABOSA, I.M.; BARRETO, M.L.; ALMEIDA, J.F.; ARAÚJO, M.D.; RODRIGUES, A.R.O.; RIETCORREA, F.; CASTRO, R.S. Contagious agalactia by Mycoplasma agalactiae in small ruminants in Brazil: first report. Braz. J. Microbiol., v. 37, p. 576-581, 2006..

(31) REVISÃO DE LITERATURA. 32. BANDEIRA, D.A.; CASTRO, R.S.; AZEVEDO, E.O.; MELO, L.S.S.; MELO, C.B. Perfil sanitário e zootécnico de rebanhos caprinos nas microrregiões do Cariri paraibano. Arq. Bras. Med. Vet. Zoot., v. 59 p.1597-1600, 2007. BERGONIER, D.; BERTHELOT, X.; POUMARAT, F. Contagious agalactia of small ruminants: current knowledge concerning epidemiology, diagnosis and control. Rev. Sci. Tech. OIE, v. 16, p. 848-873, 1997. BUONAVOGLIA, D.; GRECO, G.; CORRENTE, M.; GRECO, M.F.; D’ABRAMO, M.; LATRONICO, F.; FASANELLA, A.; DECARO, N. Long-term immunogenicity and protection against Mycoplasma agalactiae induced by an oil adjuvant vaccine in sheep. Res. Vet. Sci., v. 88, n. 1, p. 16-19, 2010. BUONAVOGLIA, D.; GRECO, G.; QUARANTA, V.; CORRENTE, M.; MARTELLA, V.; DECARO, N. An oil-emulsion vaccine induces full-protection against Mycoplasma agalactiae infection in sheep. New Microbiol., v. 31, p. 117-123, 2008. BUONAVOGLIA, D.; FASANELLA, A.; SAGAZIO, P.; TEMPESTA, M.; IOVANE, G.; BUONAVOGLIA, C. Persistence of antibodies to Mycoplasma agalactiae in vaccinated sheep. New Microbiol., v. 21, n. 2, p. 209-212, 1998. CAMPOS A.C.; TELES J.A.A.; AZEVEDO E.O.; NASCIMENTO E.R.; OLIVEIRA, M.M.M.; NASCIMENTO S.A.; CASTRO R.S. ELISA protein G for the diagnosis of contagious agalactia in small ruminants. Small Rumin. Res., v. 84, p. 70-75, 2009. CAMPOS, A.C. Produção e avaliação de vacina contra agalaxia contagiosa. Tese (Doutorado em Ciência Veterinária), Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE. 2012. 75p. CHÁVEZ-GONZÁLEZ, Y.; BASCUNANA, C.R.; BOLSKE, J.G.; MATTSON, J.B.; MOLINA, C.F.; JOHANSSON, K.-E. In vitro amplification of the 16S rRNA genes from Mycoplasma bovis and Mycoplasma agalactiae by PCR. Vet. Microbiol., v. 47, p. 183-190, 1995. CHESSA, B.; PITTAU, M.; PURICELLI, M.; ZOBBA, R.; CORADDUZZA, E.; DALL’ARA, P.; ROSATI, S.; POLI, G.; ALBERTI, A. Genetic immunization with the.

(32) REVISÃO DE LITERATURA. 33. immunodominant antigen P48 of Mycoplasma agalactiae stimulates a mixed adaptive immune response in BALBc mice. Vet. Sci., v. 86, n. 3, p. 414-420, 2009. CORRALES, J.C.; ESNAL, A.; DE LA FE, C.; SANCHEZ, A.; ASSUNÇÃO, P.; POVEDA, J.B.; CONTRERAS, A. Contagious agalactia in small ruminants. Small Rum. Res., v. 68, p.154–166, 2007. CORRALES, J.C.; SANCHEZ, A.; LUENGO, C.; POVEDA, J.B.; CONTRERAS, A. Effect of clinical contagious agalactia on the bulk tank milk somatic cell count in Murciano–Granadina goat herds. J. Dairy Sci., v. 87, n. 10, p. 3165-3171, 2004. DaMASSA, A.J. Prevalence of Mycoplasmas and mites in the external auditory meatus of goats. Calif. Vet., v. 37, n. 10, p. 13-17, 1983. DaMASSA, A.J.; BROOKS, D.L.; HOLMBERG, C.A. Pathogenicity of Mycoplasma capricolum and Mycoplasma putrefaciens. Isr. J. Med. Sci., v. 20, p. 975-978, 1984. DaMASSA, A.J.; WAKENELL, P.S.; BROOKS, D.L. Review Article. Mycoplasmas of goats and sheep. J. Vet. Diagn. Invest., v. 4, p. 101-113, 1992. DE LA FE, C.; ASSUNCÃO, P.; RAMÍREZ, A.S.; POVEDA, J.B. Inactivation of Mycoplasma species involved in contagious agalactia. Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr., v. 117, n. 1-2, p. 1-5, 2004. DE LA FE, C.; ASSUNCÃO, P.; SAAVEDRA, P.; TOLA, S.; POVEDA C.; POVEDA, J.B. Field trial of two dual vaccines against Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (large colony type) in goats. Vaccine, v. 25, n. 12, p. 2340-2345, 2007. DOUTRE, M.; PERREAU, P.; NDIAYE, A.M. Un foyer d’agalaxie contagieuse de la chèvre à Mycoplasma agalactiae au Sénégal. Rev. Elev. Méd. Vét. Pays Trop., v. 34, n. 1, p. 11-14, 1981. EGWU, G.O.; AMEH, J.A.; ALIYU, M.M.; MOHAMMED, F.D. Caprine mycoplasmal mastitis in Nigeria. Small Rum. Res., n. 39, p. 87-91, 2001..

(33) REVISÃO DE LITERATURA. 34. FLEURY, B., BERGONIER, D.; BERTHELOT, X.; PETERHANS, E.; FREY, J.; VILEI, E.M. Characterization of. P40, a cytadhesin of Mycoplasma agalactiae. Infect.. Immun., v. 70, n. 10, p. 5612–5621, 2002. FLEURY, B.; BERGONIER, D.; BERTHELOT, X.; SCHLATTER, Y.; FREY, J.; VILEI, E.M. Characterization and analysis of a stable serotype-associated membrane protein (P30) of Mycoplasma agalactiae. J. Clin. Microbiol., v. 39, n. 8, p. 28142822, 2001. FOGGIE, A.; ETHERIDGE, J. R.; ERDAB, 0.; ARISOY, F. Contagious agalactia of sheep and goats preliminary studies on vaccines. J. Comp. Path., v. 80, p. 345-359, 1970. FOGGIE, A.; ETHERIDGE, J. R.; ERDAB, 0.; ARISOY, F. Contagious agalactia of sheep and goats immunity of lactating ewes vaccinated before mating with live or dead vaccines. J.Comp. Path., v. 81, p. 393-400, 1971. GIL, M.C.; PEÑA, F.J.; MENDOZA, J.H.; GOMEZ, L. Genital Lesions in an Outbreak of. Caprine Contagious Agalactia Caused by. Mycoplasma. agalactiae. and. Mycoplasma putrefaciens. J. Vet. Med. Series B., v. 50, n.10, p. 484, 2003. GRECO, G.; CORRENTE, M.; BUONAVOGLIA, D.; ALIBERTI, A.; FASANELLA, A. Inactivated vaccine induces protection against Mycoplasma agalactiae infection in sheep. New Microbiol., v. 25, n. 1, p. 17-20, 2002. GRECO, G.; CORRENTE, M.; MARTELLA, V.; PRATELLI, A.; BUONAVOGLIA, D.D. A multiplex-PCR for the diagnosis of contagious agalactia of sheep and goats. Mol. and Cel. Probes., v. 15, p. 21-25, 2001. KINDE, H.; DAMASSA, AL J.; WAKENELL, P. S.; PETTY, R. Mycoplasma infection in a commercial goat dairy caused by Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (caprine biotype). J. Vet. Diagn. Invest., v. 6, p. 423-427, 1994. KITTELLBERGER, R.; O’KEEFE, J.S.; MEYNELL, R.; SEWELL, M.; ROSATI, S.; LAMBERT, M.; DUFOUR, P.; PÉPIN, M. Comparison of four diagnostic tests for the.

(34) REVISÃO DE LITERATURA. 35. identification of serum antibodies in small ruminants infected with Mycoplasma agalactiae. N. Z .Vet. J., v. 54, n.1, p. 10-15, 2006. KÖNIGSSON, M. H.; BOLSKE, G.; JOHANSSON. K. E. Intraspecific variation in the 16S rRNA gene sequences of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis strains. Vet. Microbiol., v. 85, n. 3, p. 209-220, 2002. LAMBERT, M.; CALAMEL, M.; DUFOUR, P.; CABASSE, E.; VITU, C.; PÉPIN, M. Detection of false-positive sera in contagious agalactia with a multiantigen ELISA and their elimination with a protein G conjugate. J. Vet. Diagn. Invest., v. 10, p. 326-330, 1998. LEON VIZCAINO L.; GARRIDO ABELLAN, F.; CUBERO PABLO, M.J.; PERALES, A. Immunoprophylaxis of caprine contagious agalactia due to Mycoplasma agalactiae with an inactivated vaccine. Vet. Rec., v. 137, n. 11, p. 266-269, 1995. LORIA, G.R.; SAMMARTINO, C.; TAMBURELLO, A.; EMANUELE, M.C.; AYLING, R.D.; NICHOLS, R.A.J. Antibiotic susceptibility of Mycoplasma agalactiae strains isolated from sheep in Sicily. In: Intern. Cong. Intern. Organiz. Mycoplasmol. (IOM). XIV, Vienna, p. 60, 2002. MADANAT A., D. ZENDULKOVÁ, P. LÁNY, Z. POSPÍŠIL, P. ČÍHAL. Prevalence of Mycoplasma agalactiae Antibodies in Czech and Jordanian Herds of Small Ruminants. Acta Vet. Brno., v. 71, p. 37-44, 2002. MADANAT A., ZENDULKOVÁ, D.; POSPÍŠIL, Z. Contagious agalactiae of sheep and goats. A review. Acta Vet. Brno., v. 70, p. 403-412, 2001. MARENDA, M.S.; VILEI, E.M.; POUMARAT, F.; FREY, J.; BERTHELOT, X. Validation of the suppressive subtractive hybridization method in Mycoplasma agalactiae species by the comparison of a field strain with the type strain PG2. Vet. Res., v. 35, n. 2, p. 199-212, 2004. MARINHO, M.L. Ação terapêutica do bioterápico de Mycoplasma agalactiae em caprinos com agalaxia contagiosa dos ovinos e caprinos. (Doutorado em Ciência Veterinária) – Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife. 2008. 118 p..

(35) REVISÃO DE LITERATURA. MATTSSON,. J.G.;. GERSDORF,. H.;. GOBEL,. U.B.;. JOHANSSON,. 36. K.E.. Detection of Mycoplasma bovis and Mycoplasma agalactiae by oligonucleotide probes complementary to 16S rRNA. Mol. Cell. Probes., v. 5, n. 1, p. 27-35, 1991. NASCIMENTO, E.R.; BARRETO, M.L.; PLATENIK, M.O.; AZEVEDO, E.O.; TABOSA, I.M.; ALCÂNTARA, M.D.B.; ALMEIDA, J.F.; NASCIMENTO, M.G.F. Contagious agalactia by Mycoplasma agalactiae in goats in Brazil. Etiologic study. In: Intern. Cong. Intern. Organiz. Mycoplasmol. (IOM). XIV, Vienna, p. 45-46, 2002. NICHOLAS, R.A.J. Improvements in the diagnosis and control of diseases of small ruminants caused by mycoplasmas. Small Rum. Res., v. 45, p. 145–149, 2002. OIE.. Organização. Mundial. de. Saúde. Animal,. 2011.. Disponível. em:. http://web.oie.int/wahis/public.php. Acesso em 05 de fevereiro de 2012. PÉPIN, M.; DUFOUR, P.; LAMBERT, M..; AUBERT, M.; VALOGNES, A.; ROTIS, T.; VAN de WIELE, A.; BERGONIER, D. Comparison of three enzyme-immunosorbent assays for serologic diagnosis of contagious agalactia in sheep. J. Vet. Diagn. Invest., v. 15, p. 281-285, 2003. RAZIN, S. Adherence of pathogenic mycoplasmas to host cells. Biosci. Rep., v. 19, n. 5, 1999. RAZIN, S.; YOGEV, D.; NAOT, Y. Molecular biology and pathogenicity of Mycoplasmas. Microbiol. Molecul. Biol. Reviews, v. 62, n.4, p. 1094-1156, 1998. REAL, F.; DÉNIZ, S.; ACOSTA, B.; FERRER, O.; POVEDA, J.B. Caprine contagious agalactia caused by Mycoplasma agalactiae in the Canary Islands. Vet. Rec., v. 135, p. 15-16, 1994. RIBEIRO, V.R.; NASCIMENTO, E.R.; FACCINI, J.L.H.; NASCIMENTO, M.G.F.; LIGNON, G.B. An improved method for the recovery of Mycoplasmas from the external ear canal of goats. J. Vet. Diag. Invest., v. 9, n. 2, p.156-158, 1997. ROSENGARTEN, R.; YOGEV, D. Variant colony surface antigenic phenotypes within Mycoplasma strain populations: Implications for species identification and strain standardization. J. Clin. Microbiol., v. 34, n. 1, p. 149-158, 1996..

(36) REVISÃO DE LITERATURA. 37. SANTONA, A.; CARTA, F.; FRAGHI, P.; TURRINI, F. Mapping antigenic sites of an immunodominant surface lipoprotein of Mycoplasma agalactiae, AvgC, with the use of synthetic peptides. Infect. Immun., v. 70, n. 1, p. 171-1716, 2002. TABOSA, I.M.; ALCÂNTARA, M.D.B.; AZEVEDO, E.O.; NASCIMENTO, E.R.; GONZALEZ, C.I.M.; RIET-CORREA, F. Contagious agalactia by Mycoplasma agalactiae in dairy goats in Brazil. Clinic and pathological findings. In: Intern. Cong. Intern. Organiz Mycoplasmol. (IOM), XIV, Vienna, p. 49, 2002. TOLA, S.; CROSBEDU, S.; CHESSA, G.; UZZAU, S.; IDINI, G.; IBBA, B.; ROCCA, S. Sequence, cloning, expression and characterisation of the 81-kDa surface membrane protein (P80) of Mycoplasma agalactiae. FEMS Microbiol. Lett., v. 202, p. 45-50, 2001. TOLA, S.; IDINI, G.; MANUNTA, D.; GALLERI, G.; ANGIOI, P.P.; ROCCHIGIANI, A.M.; LEORI, G. Rapid and specific detection of Mycoplasma agalactiae by polymerase chain reaction. Vet. Microbiol. v. 51, p. 77-84, 1996. TOLA, S.; MANUNTA, D.; ROCCA, S.; ROCCHIGIANI, A. M.; IDINI, G.; ANGIOI, P. P.; LEORI, G. Experimental vaccination against Mycoplasma agalactiae using different inactivated vaccines. Vaccine, v. 17, n. 22, p. 2764-2768, 1999. TULLY, J.G.; BARILE, M.F.; EDWARD, D.G.; THEODORE, T.S.; ERNO, H. Characterization of some caprine mycoplasmas, with proposals for new species, Mycoplasma capricolum and Mycoplasma putrefaciens. J. Gen. Microbiol., v. 85, p. 102-120, 1974..

(37) ARTIGO CIENTÍFICO. 38. 4 Artigo Científico 1. Caracterização bioquímica e protéica de Mycoplasma agalactiae do Brasil. Biochemical and protein characterization of Mycoplasma agalactiae in Brazil.. RESUMO. O Mycoplasma agalactiae é o principal agente responsável pela agalaxia contagiosa (AC) em pequenos ruminantes, caracterizada clinicamente por mastite seguida de agalaxia, poliartrite e ceratoconjuntivite. A infecção dissemina-se rapidamente e tem determinado perdas econômicas consideráveis em rebanhos leiteiros do Nordeste brasileiro. Com o objetivo de caracterizar M. agalactiae, isolados de leite caprino obtidos de animais de rebanhos infectados foram cultivados em meio Hayflick modificado e submetidos a testes bioquímicos, reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando primers para o gene 16S rRNA, eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western Blot (WB). Em meio de cultura, os isolados formaram colônias com aspecto de ovo frito, produziram filmes e manchas, não degradaram arginina nem fermentaram glicose. Na PCR um fragmento de 360pb foi amplificado caracterizando-os como M. agalactiae. As amostras apresentaram similaridade no perfil protéico com bandas variando de 30 a 135 kDa no SDS-PAGE. Uma proteína de aproximadamente 48 kDA (P48) apresentou maior antigenicidade no Western Blot. A baixa variabilidade antigênica detectada e a imunogenicidade da P48 são benéficas para a utilização das amostras em testes diagnósticos e para produção de vacinas.. Palavras-chave: Agalaxia Contagiosa, PCR, SDS-PAGE, Western Blot, diagnóstico.

(38) ARTIGO CIENTÍFICO. 39. ABSTRACT. Mycoplasma agalactiae is the main agent of contagious agalactia (CA) in small ruminants, a disease characterized clinically by mastitis, agalactia, polyarthritis and keratoconjunctivitis. The infection spreads rapidly and has given considerable economic losses in dairy herds in northeastern Brazil. To characterization of M. agalactiae isolates of goat milk obtained from infected animals herds were cultured in Hayflick modified medium and were submitted to biochemical tests, polymerase chain reaction (PCR) using primers for 16S rRNA, polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western Blot (WB). In culture medium, the isolates formed colonies with fried egg appearance, produced films and spots, not degraded arginine or ferment glucose. By PCR, fragment of 360pb was amplified characterizing them as M. agalactiae. The samples showed similarity in the protein profile with bands ranging from 30 to 135 kDa in SDS-PAGE. A protein of approximately 48 kDa (P48) showed higher reactivity in Western Blot. The low variability and immunogenicity of the antigen detected P48 are beneficial for use in diagnostic and vaccine production.. Keywords: Contagious Agalactia, SDS-PAGE, Western Blot, diagnostic. 1 Introdução. A agalaxia contagiosa (AC) dos ovinos e caprinos causada por Mycoplasma agalactiae está mundialmente disseminada, ocorrendo endemicamente na maioria dos países mediterrâneos, oeste da Ásia, África e EUA (DaMASSA, 1983; EGWU et al., 2001). Os sinais clínicos característicos são mastite seguida de agalaxia, poliartrite e ceratoconjuntivite. A infecção dissemina-se rapidamente no rebanho determinando perdas consideráveis, sobretudo pela redução acentuada na produção de leite e morte dos animais (DOUTRE et al., 1981; REAL et al., 1994; EGWU et al., 2001; GIL et al., 2003). No Brasil, a ocorrência destes sinais clínicos simultaneamente em caprinos de um mesmo rebanho no Estado da Paraiba em 2001, resultou no diagnóstico de AC causada por M. agalactiae, microrganismo até então exótico no país (NASCIMENTO et al., 2002; OIE, 2011). Posteriormente, a doença foi diagnosticada também em.