UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE
tf
CENTRO DE TECNOLOGIA E RECURSOS NATURAIS
UNIDADE ACADÉMICA DE ENGENHARIA AGRÍCOLA
(^fRN
COPEAG - COORD. DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENG. AGRÍCOLA
PROGRAMA
EM ENGENHARIA AGRÍCOLA
D i s s e r t a ç ã o de Mestrado
EFEITOS DE EXTRATOS VEGETAIS
"IN VITRO"
NO DESENVOLVIMENTO DE
ASPERGILLUS
FLAVUS E NA QUALIDADE FISIOLÓGICA DE
SEMENTES DE AMENDOIM
CELEIDA QUEIROZ DE LIMA
Biblioteca U F C G SMBC_CDSA CAMPUS D E SUMÉ
U N I V E R S I D A D E F E D E R A L D E CAMPINA G R A N D E ift C E N T R O D E T E C N O L O G I A E R E C U R S O S NATURAIS Ç T R N UNIDADE ACADÉMICA D E E N G E N H A R I A AGRÍCOLA ~ *
PÓS-GRADUAÇÃO E M E N G E N H A R I A AGRÍCOLA
DOAÇÃO
DISSERTAÇÃO
A R E A D E CONCENTRAÇÃO E M PROCESSAMENTO E
ARMAZENAMENTO D E PRODUTOS AGRÍCOLAS
E F E I T O S D E E X T R A T O S V E G E T A I S "IN VITRO" NO D E S E N V O L V I M E N T O D E ASPERGILLUS FLAVUS E NA Q U A L I D A D E FISIOLÓGICA D E
S E M E N T E S D E A M E N D O I M ^ ' 5 , . - u\ < U Es) f— O —3 CQ ca
C E L E I D A Q U E I R O Z D E L I M A
Campina Grande - Paraíba A B R I L - 2009
E F E I T O S D E E X T R A T O S V E G E T A I S "IN VITRO" NO D E S E N V O L V I M E N T O D E ASPERGILLUS FLAVUS E NA Q U A L I D A D E FISIOLÓGICA D E
S E M E N T E S D E AMENDOIM
C E L E I D A Q U E I R O Z D E L I M A
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Engenharia Agrícola do Centro de Tecnologia e Recursos Naturais da Universidade Federal de Campina Grande, Paraíba, como parte dos requisitos necessários para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Agrícola.
Orientadores: Prof. Dr. Francisco de Assis Cardoso Almeida
Prof. Dr. Egberto Araújo
Campina Grande - Paraíba A B R I L - 2009
FICHA CATALOGRÁFICA E L A B O R A D A P E L A B I B L I O T E C A C E N T R A L DA U F C G
L732e Lima, Celeida Queiroz de
Efeitos de extratos vegetais "in vitro" no desenvolvimento de
Aspergillus flavus e na qualidade fisiológica de sementes de
amendoim / Celeida Queiroz de Lima. — Campina Grande, 2009. 49 f. : i l . col.
Dissertação (Mestrado em Engenharia Agrícola) - Universidade Federal de Campina Grande, Centro de Tecnologia e Recursos Naturais.
Referências.
Orientadores: Prof. Dr. Francisco de Assis Cardoso Almeida, Prof. Dr. Egberto Araújo.
1. Amendoim {Arachis hypogea). 2. Tratamento de Sementes. 3. Produtos. I . Título.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE
CENTRO DE TECNOLOGIA E RECURSOS NATURAIS
COORDENAÇÃO D E PÓS-GRADUAÇÃO E M ENGENHARIA AGRÍCOLA
PARECER FINAL DO JULGAMENTO DA DISSERTAÇÃO DA MESTRANDA
CELEIDA QUEIROZ DE LIMA
EFEITO DE EXTRATOS VEGETAIS "In Vitro" NO DESENVOLVIMENTO DE
Aspergillus Flavus
E QUALIDADE FISIOLÓGICA DE SEMENTES DE AMENDOIM.
BANCA E
Dr. Fraflcisco-d© oso Almeida - Orientador
to Ara
Dr. Egbert^ Araújo - Examinador
Dra^Josivanda Palmeira Gomes - Examinadora
Dr. Humberto Silva - Examinador
PARECER
•A
9 U o v.' A O CA B R I L - 2 0 0 9
A Deus
Pelo privilégio de ter nascido e poder compartilhar a emoção de fazer aquilo que gosto, mesmo tendo momentos de dificuldade, pois o que seria de nossos momentos felizes se não existissem os tristes? Eles simplesmente não teriam significado algum, seria como o sol sem chuva, dia sem noite, calor sem frio, alegria sem dor. Uma jamais teria sentido sem a outra; os momentos de dor servem para reconhecermos nossos momentos alegres, nossas virtudes e conquistas e principalmente para agradecer a Deus por eles.
Aos meus pais
João Rodrigues de Lima e Marina Faustino de Queiroz que mesmo distante mantiveram-se sempre ao meu lado me dando exemplo de honestidade, humildade, amor e compreensão.
Aos meus irmãos e sobrinhos
Maria do Socorro, José Sinval, Averlanjo, Silvana, Suelio e sobrinhos, Mazuky, Talita, Marina, Jhulya, Renam, Vitória, Marcela, Mirely, Milena, e o meu pequeno Luiz Emanuel, o qual é meu afilhado; com muito amor e carinho digo-lhes,
vocês fazem parte da minha história de vida.
Ao meu grande amor
A você que mesmo distante me ensinou a lutar pelos meus ideais e acreditar que devemos viver intensamente. "...Sinto que você é ligado a mim..."
A G R A D E C I M E N T O S
A DEUS, pelo seu grande amor, e fidelidade, pelo grande amigo fiel e misericordioso e por ter me dado o dom mais precioso: a vida.
Aos meus pais João Rodrigues e Marina Faustino, que tenho por eles um amor puro, que esse amor foi transformado em forças para o término desse trabalho e pela
dedicação para comigo.
Aos meus orientadores professores Egberto Araújo e Francisco de Assis Cardoso Almeida pelo carinho, amizade, respeito e força nos momentos de fraqueza e seus ensinamentos que serão valiosos na minha profissão. Meus eternos agradecimentos não só pelos ensinamentos académicos, mas principalmente pelos ensinamentos como pessoa, e pelo privilégio de poder chamá-los de meus mestres;
A Banca Examinadora, Josivanda P. Gomes e Humberto Silva, pelas correções e sugestões que muito contribuíram para este trabalho.
A Universidade Federal de Campina Grande por proporcionar minha formação profissional, bem como ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) pela concessão de bolsa.
As secretárias do curso de Pós-Graduação e Engenharia Agrícola D. Rivanilda e D. Aparecida pela paciência e respeito durante esse período.
Aos funcionários do Laboratório de Armazenamento e Processamento de Produtos Agrícolas Silas e Luciene pela alegria e descontração.
Ao Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba por proporcionar a realização dessa pesquisa;
Aos funcionários do Laboratório de Fitopatologia e de Sementes da UFPB/CCA, em nome de Francisca, Tomás, Cosme e Rui, pela ajuda durante o experimento.
A Professora Luciana Cordeiro pelos ensinamentos e apoio com a pesquisa. Ao amigo e irmão em Cristo Macio Moura pela grande ajuda na estatística do trabalho.
A estagiária do Laboratório Alexandra Estrela pela colaboração e amizade; A Thiago Araújo e sua esposa Cristina Araújo, por ter me acolhido em sua casa e pelo imprescindível apoio durante a elaboração da dissertação.
As colegas de curso: Patrícia (Paty), Dyalla, Izabel, Isanna, Leila, Wólia, Day, Karla, Katcylânia (Kaká) e Taylândia pelo companheirismo durante as aulas.
Aos meus grandes amigos do coração Marcos, Zé Carlos, França e Luís Maximino pela força, carinho, respeito e amor durante essa jornada, sem vocês tudo teria sido mais difícil.
A minha grande amiga e irmã de curso, Dayana Medeiros, por tudo que passamos juntas, alegrias e tristezas, pela sua grande fé, pelos ensinamentos, pela
bondade e acima de tudo pela paciência, guardo você em lugar especial no meu coração.
Aos meus colegas e amigos da CONSPLAN: Halanna, Cristina, Isaac, Vanildo, Jandeilson, Antônio, Pedro, Dr. Furtado, Barreto e André pela força e alegrias nos momentos de aflição.
A minha amiga Halanna, pela disponibilidade e afeto, pelo carinho que me fizeram forte e saber e entender o verdadeiro significado de ser amiga. Obrigada por
tudo!
A minha grande e eterna amiga de coração Rosilda Renovato pela paciência e sinceridade, por está do meu lado me ajudando nos momentos difíceis e por me encorajar quando as forças me faltavam.
A todos que contribuíram de forma direta e indireta na realização desse trabalho.
Vi ainda debaixo do sol que não é dos ligeiros o prémio, nem dos
valentes, a vitória, nem tampouco dos sábios, o pão, nem ainda dos
prudentes, a riqueza, nem dos inteligentes, o favor, porém tudo depende
do tempo e do acaso.
SUMÁRIO L I S T A DE F I G U R A S Viu L I S T A D E T A B E L A S Ix R E S U M O X A B S T R A C T Xi 1. INTRODUÇÃO 1 2. REVISÃO D E L I T E R A T U R A 3 2.1. Origem, sistemática e características botânicas e agronómicas do amendoim 3
2.2. Importância económica do amendoim 4 2.3. Doenças do amendoim: Campo e armazenamento 6
2.4. Uso de produtos naturais no controle de fitodoenças 7 2.5. Caracterização botânica e composição das plantas utilizadas para formulação de
extratos 10 2.5.1. Neem - Azadirachta indica 10
2.5.2. Canela - Cinnamomum zeilanium 11
2.5.3. Alho - Allium sativum L 11
3. M A T E R I A L E MÉTODOS 13
3.1. Localização dos ensaios e origens das sementes e produtos testados 13 3.2. Análise sanitária de sementes de amendoim e isolamento do fungo 14
3.3. Ensaios experimentais 15 3.3.1. Efeito de extratos vegetais sobre a germinação de esporos e origem de
unidades formadoras de colónias (UFC) 15 3.3.2. Efeito de extratos vegetais sobre o crescimento micelial de A. flavus 17
3.3.3. Efeito do tratamento com extratos vegetais sobre a incidência de A. flavus
e a germinação das sementes 18 3.4. Delineamento experimental e análises estatísticas 19
4. R E S U L T A D O S E DISCUSSÃO 20
4.1. Efeito de extratos vegetais sobre a germinação de esporos, unidades formadoras
de colónias (UFC) e crescimento micelial de A. flavus 20 4.2. Efeito do tratamento com extratos vegetais sobre a incidência de A. flavus e a
4.3. Efeito do tratamento com extratos vegetais sobre a germinação e IVG das
sementes de amendoim 31
5. CONCLUSÕES 36 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 37
LISTA DE FIGURAS
FIGURAS PAGINA
1 Percolador de extração (Foto do autor) 13 2 Placas de Petri contendo sementes distribuídas na câmara de 14
incubação. (Foto do autor)
3 Esquematização dos procedimentos para observação de esporos de 15
A.flavus após imersão em extratos de nim, canela e alho
4 Esquematização dos procedimentos para verificação do desenvolvimento 16 de umidades formadoras de colónias do fungo A.flavus após imersão
dos esporos em extratos de nim. canela e alho
5 Esquematização dos procedimentos de repicagem e de desenvolvimento 17 das colónias do fungo A.flavus em meio de cultura BDA com diferentes
proporções de extratos de nim, canela e alho
LISTA DE T A B E L A S
TABELAS PAGINA
1 Diferenças de germinação de esporos imersos em soluções de 22 extrato vegetais, e de unidades formadoras de colónias em meio
de cultura por A. flavus, com relação ao tratamento testemunha
2 Germinação de conídios de A. flavus previamente imersos em 23 extratos vegetais e números de Unidades Formadoras de Colónias
(UFC) em meio de cultura de BDA
3 Diferenças entre os diâmetros das colónias de A. flavus no oitavo 24 dia de incubação em meio de BDA adicionado de extratos
vegetais com relação ao tratamento testemunha (BDA puro)
4 Diâmetro das colónias de A.flavus no sétimo dia de incubação em 25 meio de BDA adicionado de extratos vegetais
5 Diferenças com relação ao tratamento testemunha, da incidência 28 de A. flavus em sementes de amendoim inoculadas com o fungo
previamente ou após o tratamento com extratos vegetais
6 Efeito do tratamento com extratos vegetais sobre a incidência de 30
A.flavus em sementes de amendoim
7 Diferenças da germinação das sementes de amendoim inoculadas -7 com o fungo A. flavus previamente ou após o tratamento com
extratos vegetais, com relação ao tratamento testemunha
8 Efeitos do tratamento com extratos vegetais sobre a germinação 33 (%) de sementes de amendoim inoculadas com A.flavus
9 Diferenças do IVG das sementes de amendoim inoculadas com o 34 fungo A.flavus previamente ou após o tratamento com extratos
vegetais, com relação ao tratamento testemunha
10 Efeitos do tratamento com extratos vegetais sobre o IVG de 35 sementes de amendoim inoculadas com A. flavus
RESUMO
E premente a necessidade de controle do Aspergillus flavus, fungo importante por deteriorar sementes e grãos armazenados e produzir toxinas prejudiciais a saúde humana e animal. Produtos "naturais" como óleos essenciais ou extratos vegetais, vêm sendo testados e até mesmo utilizados com propósitos de eliminar ou reduzir os efeitos negativos apresentados pelos fungicidas sintéticos. O presente estudo realizou-se com extratos de nim
{Azadirachta indica) - comercial e obtido de folhas-, canela {Cinnamomum zeylanicum) e
alho (Allium sativum L.), aplicados nas proporções 1,10, 25, 50 e 100%, com o objetivo de avaliar "in vitro" os seus efeitos no desenvolvimento de A. flavus e sobre a qualidade fisiológica de sementes de amendoim (Arachis hypogeae L.) tratadas com os referidos extratos. O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Fitopatologia do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba. Os conídios do fungo foram imersos nas soluções de extratos e avaliados quanto a germinação. Também foram plantados em meio de cultura BDA mais extratos, conídios e fragmentos miceliais (2mm de diâmetro) do fungo para se observar, respectivamente, o número de unidades formadoras de colónias (UFC) e o crescimento micelial. As sementes de amendoim, cv. BR-1 , antes ou após a inoculação de A. flavus, foram imersas nas soluções de extratos e, após, avaliadas quanto a incidência do fungo e qualidade fisiológica (Germinação e índice de Velocidade de Germinação - IVG). A análise estatística realizou-se segundo o delineamento inteiramente casualizado em arranjos fatorial, definidos conforme a natureza do ensaio. Os extratos empregados apresentaram atividade fungicida e/ou fungistáticas com relação a germinação de esporos, número de UFC e crescimento micelial, porém de forma diferenciada quanto a planta de onde foram obtidos e a concentração empregada. Os conídios imersos em extrato de canela a 10, 25, 50 e 100% e em extrato de nim comercial a 1 e 10% não germinaram e os menores números de UFC foram nos extratos de canela a 10, 25, 50 e 100%. O crescimento micelial foi nulo nas concentrações 50 e 100% de todos os extratos. Quanto ao tratamento das sementes, os produtos testados em relação à incidência de A. flavus exerceram mais efeito erradicantes, sendo também essas sementes as que apresentaram os maiores valores de germinação e IVG.
ABSTRACT
Effects "/'« vitro" of plant extracts on the development of Aspergillus flavus and physiological quality of peanut seeds
The fungus Aspergillus flavus cause deterioration of seeds and grains in storage and produce toxins that affect the human and animal health. Natural products as essential oils and plant extracts have been tested or applied instead fungicides to eliminate or reduce the negative effects of synthetics fungicides. This work was realized employing extracts of neem (Azadirachta indica) leaves and a commercial product, cinnamon (Cinnamomum
zeylanicum) and apian (Allium sativum), in the proportions of 1, 10, 25. 50 and 100%
aiming to evaluate "'in vitro" effects on the development of A. flavus and physiological quality of treated peanut seeds. The study was carried out in the Laboratory of Phytopathology/Federal University of Paraíba, Areia-Paraiba State-Brazil. The fungi conidia were immersed in the extracts solutions and observed to germination evaluation. Suspensions of conidia and discs of mycelium (2mm diameter) were planted in Potato-Dextrose-Agar (PDA) aditioned of extracts solution to verify respectively the numbers of originated colonies (UFC) and mycelium growth. Peanut seeds cv. before and after inoculated with A. flavus conidia suspensions were treated with extracts solutions and evaluated about fungai incidence. and physiological qualities (germination and index of germination velocity - IVG). The statistical analyses were realized as an entirely randomized factorial design defined according the assays characteristics. The extracts shown fungicides and, or fungistatic effects to spores germination. numbers of UFC and mycelia growth but with variations according the origin (plant) and proportion of extract. Conidia immersed into cinnamon extract at the proportions of 10, 25, 50 and 100% and in neem commercial extract at the proportions of 1 and 10% did not germinate. AIso the cinnamon extract at the proportions of 10, 25, 50 and 100% when eddied to PDA cultural media reduced the numbers of UFC. The mycelia growth do not verified on PDA cultural media with the extracts at the proportions of 50 and 100%. Used in seed treatment the extracts presented more eradication effects than protective effects. The peanut seeds treated after the fungai inoculation presented the higher germination and IVG.
Capítulo 1
IvxZrodAÂjçãxy
1. INTRODUÇÃO
O amendoim, Arachis hypogeae L., é uma leguminosa cultivada nas mais diversas regiões do mundo, sendo uma cultura de ciclo curto, resistente à seca e de adaptabilidade ampla. Essa planta é cultivada em vários estados do Brasil e, no Nordeste, predominantemente por pequenos e médios produtores, tanto como lavoura de sequeiro, quanto irrigados (EMBRAPA, 2008). No contexto da agricultura mundial o amendoim é a quarta mais importante oleaginosa em termos de produção, inferior apenas a soja, o algodão e a colza (canola). Participa com 10% da produção mundial de óleo comestível, com uma produção mundial de 23,5 milhões de toneladas de grãos por ano, sendo os principais produtores a índia, a Indonésia e o Senegal (EMBRAPA, 2007).
A ocorrência de doenças na cultura do amendoim pode causar a redução de 10% a mais de 50% na produção de vagens e no armazenamento quando medidas de controle não são utilizadas. Em sementes de amendoim, são frequentemente detectados patógenos, principalmente fungos que, transmitidos por essa via, vão originar doenças no campo ou, no armazém causar a deterioração do material em preservação. Em cerca de 150 espécies fúngicas foram assinaladas em sementes de amendoim, porém, um pequeno número de géneros está envolvido com o processo de deterioração. Entre os fungos mais frequentemente assinalados nas sementes encontram-se espécies dos géneros Aspergillus,
Penicillium, Rhizopus, Fusarium (ITO et al., 1992), Alternaria, Nigrospora, Trichoderma, Dothiorella e Pestalotia (MARIOTTO et al., 1982). Entre estes, o Aspergillus spp., Penicillium sp., Fusarium spp. e Rhizopus sp. destaca-se pela frequência
e ação sobre as sementes, prejudicando a germinação ou causando tombamento de plântulas após a germinação (MORAES & MARIOTTO, 1985).
Em sementes ou grãos de amendoim armazenados, a ocorrência do fungo
Aspergillus flavus se reveste de grande importância como agente responsável da
aflatoxina, substância que afeta a saúde de animais e do homem que consumirem produtos derivados de sementes contaminadas. De maneira que as condições climáticas dos países tropicais que apresentam condições de temperatura e umidade elevadas, favorecem a proliferação desses fungos nos produtos agrícolas, determinando altos teores de micotoxinas (MIDIO & MARTINS, 2000), que são metabólitos secundários, sintetizados no final da fase exponencial de crescimento de alguns fungos, podendo
Cccpítuhy-l
IvxtrodAAjção-desenvolver atividade mutagênica, carcinogênica e teratogênica (FARIAS, 2004). Considerando o incremento da cultura do amendoim na região Nordeste, o que também ocorre no estado da Paraíba e, neste contexto agrícola, as limitações no emprego de práticas fitossanitárias, pode se verificar o registro de elevados índices de incidência de A.
flavus.
O controle de patógenos de sementes tem sido feito, predominantemente, por meio do tratamento com fungicidas químicos. Trabalhos realizados no COPEAG/UFCG com sementes de amendoim armazenadas mostraram a eficiência de produtos usados para esse fim (GURJÃO, 1995; MORAES, 1996). Todavia em todo mundo é crescente a procura por alimentos mais nutritivos e sem substâncias tóxicas, como resultado, entre outras coisas, da preocupação com a contaminação ambiental e dos alimentos, pelo uso indiscriminado de agrotóxicos na agricultura. A busca por produtos naturais que sejam eficientes no controle de doenças de plantas têm aumentado nos últimos anos, visando obter alternativas aos fungicidas sintéticos e que não apresentem os efeitos negativos à saúde humana e ao meio ambiente. Diversos estudos foram realizados nesse sentido com relação à patógenos de sementes "in vitro" e no tratamento de sementes, do que se vislumbra a possibilidade de vir a ser uma forma prática de controle.
O presente estudo foi realizado levando em consideração a importância da ocorrência do fungo A.flavus em sementes de amendoim e a posição dessa cultura dentro da conjuntura agrícola do estado da Paraíba, entendendo a necessidade da efetivação do controle fitossanitário por meio do uso de produtos naturais. Os objetivos foram os seguintes:
• Avaliar os efeitos de diferentes proporções de extratos de folhas de nim
(Azadirachta indica), de casca do caule de canela (Cinnamomum zeylanicum) e de bulbos
alho (Allium sativum L ) , e do óleo de nim (produto comercial), sobre o desenvolvimento
in vitro (crescimento micelial e germinação de esporos) de Aspergillus flavus, E ainda,
com relação à patogenicidade de Aspergillus flavus sobre a qualidade fisiológica das sementes de amendoim.
Capítulo-2
ft&vUcUy-
cie L ítzAratura/
2. REVISÃO DE L I T E R A T U R A
2.1 Origem, sistemática e características botânicas e agronómicas do amendoim
O amendoim, provavelmente, é originário da América do Sul, tendo no século X V I , com a chegada dos europeus, sido difundido pelo mundo, assumindo importância na dieta alimentar de alguns povos, como na China e na índia (FREITAS et al., 2003). E uma planta dicotiledônea, da família Leguminosae, subfamília Papilonoideae, do género
Arachis, o qual agrupa mais de 80 espécies silvestres, anuais e perenes, sendo o Brasil o
país que abriga o maior número de espécies. Nesse género as espécies mais importantes são: A. hypogaea L., na qual estão as variedades cultivadas; A. prostrata Benth; e A.
nhambiquarae Hoehne (HAMMONS, 1970; BANKS, 1976).
O amendoim, A. hypogaea é uma espécie autógama, com estruturas reprodutivas envoltas por uma quilha, o que facilita a autofecundação (SANTOS & GODOY, 1999). A frutificação é geocárpica, em que uma flor aérea, após ser fecundada, produz um fruto subterrâneo. Suas flores são amarelas, agrupadas em número variável ao longo do ramo principal ou também dos ramos secundários, conforme a variedade ou o tipo vegetativo. Todas são potencialmente férteis e hermafroditas, autógamas, com baixa porcentagem de cruzamentos naturais. Desenvolvem-se bem nos climas quentes. Os Estados de São Paulo, Goiás, Mato Grosso e Paraná têm climas propícios à cultura, já que possuem calor e umidade suficientes. Para um bom rendimento e boa qualidade o amendoim requer, durante o seu desenvolvimento, temperatura constante, um pouco elevada, e suprimento uniforme de umidade, principalmente no período de frutificação. Na época da secagem é necessário que o tempo esteja seco para evitar a germinação das sementes (EMPRABA, 2007).
As variedades de amendoim são agronomicamente classificadas como pertencente aos grupos Valência, Spanish ou Virgínia, de acordo com caracteres vegetativos e reprodutivos. As cultivares ou acessos de A. hypogaea pertencente aos grupos Valência e Spanish possuem eixo central com flores, habito ereto ou semi-ereto. poucos ramos secundários e às vezes terciários, ciclo curto, vagens com duas (no grupo Spanish), três ou quatro sementes (no grupo Valência), (GODOY et al ., 1999). No Brasil, as plantações comerciais de larga escala utilizam, predominantemente, cultivares do tipo
Capítulo-2
K
eví^õo- cie
L íteratura/
morfológico Valência, de ciclo curto (90 a 110 dias), hábito de crescimento ereto e moderado potencial produtivo. A cultivar Tatu, com essas características, é a mais plantada. Embora suscetível às doenças foliares, a sua precocidade pode ser considerada como um fator de adaptabilidade, propiciando um escape às doenças, principalmente quando a epidemia ocorre a partir dos 60 dias do ciclo (MORAES et al., 1994).
A Embrapa Algodão já sintetizou e distribuiu aos produtores cultivares adaptada a semi-aridez do Nordeste, como a BR-Ide porte ereto, ciclo curto de 89 a 95 dias, floração rápida, iniciando-se aos 22 dias da emergência e pertencente ao grupo Valência. Essa cultivar foi obtida a partir de um bulk formado por três genótipos fenotipicamente similares, oriundos do município de Mogeiro, Itabaiana e Sapé, na Paraíba (EMBRAPA, 2008); têm quatro sementes por vagem de tamanho médio; excelente rendimento de sementes (teor de óleo e de proteínas) e pode produzir mais de 4.000 Kg ha2 (BELTRÃO
et al; 2003), sendo indicada para plantios nas regiões de tabuleiros costeiros do Estado de Sergipe, na Zona da Mata, Agreste e Vales irrigados de Pernambuco, na região do Recôncavo Baiano e no Agreste e Brejo Paraibano.
2.2 Importância económica do amendoim
O amendoim é uma oleaginosa cujas sementes são largamente utilizadas como alimento e na industrialização sob as formas "in natura", torradas ou cozidas com sal, em pasta, no fabrico de doces e sorvetes. O óleo extraído de suas sementes é usado como emulsão de substâncias injetáveis, lubrificante, na industrialização de pescado, fabricação de sabões, e o farelo, rico em proteína, são utilizados na alimentação animal. O amendoim é a leguminosa mais difundida e uma das mais importantes do mundo (SICHMAN et al., 1976).
Segundo LEGUMES PROGRAM (1992) o amendoim é uma cultura em expansão, que vem alcançando expressivo valor económico, principalmente por se tratar de um alimento de alto valor calórico, além de seu óleo e proteínas ser considerados de ótima qualidade no aspecto nutricional.. Essa planta é a quarta oleaginosa mais cultivada no mundo, ocupando cerca de 22 milhões de hectares, sendo os principais paises
Capítulo-2
fceví&ão- de/ L íteratura/
produtores a China (12,5 milhões de toneladas), a índia, (17,8 milhões de toneladas) e Estada Unidos (1,7 milhões de toneladas) (SANTOS, 2005). No Brasil, a exploração económica dessa oleaginosa, ocorre em vários estados, porém é o estado de São Paulo o que mais se destaca em termos de área cultivada. No Nordeste, o plantio é incentivado como alternativa de cultivo para pequenos produtores (AMORIM, 1991).
Segundo a CONAB, (2008) o Brasil possui condições naturais (clima e solo) para produzir amendoim de boa qualidade, verificando-se nos últimos anos uma elevação de áreas cultivadas e de produção, após um ciclo de estagnação e de descesse devido a uma série de fatores como a baixa tecnologia usada pelos produtores, e a constante presença do fungo Aspergillus flavus deteriorando os grãos. Atualmente, estão disponíveis tecnologias que permitem a aplicação de boas práticas para o controle das micotoxinas e, em consequência, a retomada do cultivo do amendoim no Brasil (PERES et al., 2005). A produção de amendoim na safra 2007/2008 no Brasil foi de 305 mil toneladas numa área de 115 mil hectares. Desse total, cerca de 228 mil toneladas referem-se à produção do estado de São Paulo, que representa 75% da safra nacional (CONAB, 2008).
No Estado de São Paulo as cultivares IAC Tatu Vermelho, Tatu-ST e IAC-Caiapó tem uma participação no mercado de sementes certificadas de 53%, respectivamente (FAGUNDES, 2009), e os produtores paulistas se compõe na maioria por arrendatários de terras, de porte médio e tecnificados. Os da região Nordeste, são considerados pequenos produtores, com plantio de auto sustentação ou para comercialização do excedente em feiras e as cultivares mais plantadas são Tatu e BR-1.
O amendoim representa uma importante fonte de proteína e óleo ao nível mundial. Seu impacto económico se deve principalmente a sua grande diversidade de formas de consumo (SANTOS et al., 1996). Além disso, contem carboidratos, sais minerais e vitaminas, constituindo-se num alimento altamente energético (585 calorias g /sementes). O sabor agradável torna-o um produto destinado também ao consumo "in natura", podendo ser utilizados para extração de óleo, empregado diretamente na alimentação humana, indústria de conservas (enlatados) e em produtos medicinais (AGROBYTE, 2007). Os grãos possuem teores de óleo em tomo de 20 a 45% respectivamente (GODOY et al., 1999). Em termos nutricionais, por se tratar de um produto altamente energético e proteico, ele poderia contribuir para alimentação na região nordeste,
Capítulo-2
K evC&cLo- de/ L tâeratura/
diminuindo a carência nutricional, principalmente em locais onde a aquisição de produtos de origem animal é impossibilitada, devido ao seu alto custo (SANTOS et al.,1993).
2.3 Doenças do amendoim: Campo e armazenamento
A cultura do amendoim é afetada por microrganismos que causam doenças parasitárias, sendo estas micoses, bacterioses, viroses e nematoses. Vários desses agentes patogênicos causam doenças nas plantas em desenvolvimento, podendo, ou não, serem transmitidos via sementes; outros se constituem problemas por deteriorar as sementes armazenadas (MORAES, 1987).
Os fungos presentes nas sementes armazenadas são tradicionalmente divididos em dois grupos: de campo e de armazenamento. Os primeiros invadem as sementes ainda no campo, requerendo para seu crescimento, umidade relativa em torno de 90 a 95%. O tempo de sobrevivência desses fungos nas sementes está diretamente relacionado com as condições de ambiente de armazenamento. Os fungos de armazenamento, por sua vez, estão presentes nas sementes recém-colhidas, geralmente em percentagens muito baixas. Mas eles são capazes de sobreviver em ambientes com baixa umidade, proliferando em sucessão aos fungos de campo e causando a deterioração das sementes e grãos armazenados (BERJAK, 1987; MERONUCK, 1987).
No armazenamento, os fungos são os principais microorganismos responsáveis pela destruição das sementes, ou quando isso não ocorre, provocam grande perda de vigor. O problema com microorganismos é maior no caso das sementes com baixa qualidade física. Os principais danos causados pelos insetos às sementes são as perdas de peso, de pureza física e da qualidade fisiológica, enquanto que a ação de microorganismos, desde que haja condições de umidade e temperatura satisfatórias, é no sentido de acelerar a taxa de deterioração das sementes durante o armazenamento (DINIZ, 2000).
O amendoim (Arachis hypogaea L.) está sujeito a contaminação por fungos. A invasão por microorganismos pode ocorrer no solo, durante o processo de formação das sementes (ROSSETO et al, 2003), na colheita (PITT et al., 1991), como também as fases de secagem, benefíciamento e armazenamento, (FERNANDEZ & KRAPOVICKAS, 1994; ALMEIDA et al., 1998; BRUNO et al., 2000). URBEN et al. (1983) relatam que
Capítulo 2
Reví&âLo d& L ít&ratura/
os fungos mais constantes de amendoim são: Aspergillus flavus, A. niger, Rhizopus sp.,
Penicillum sp., Chaetomium sp., Macrophomina phaseolina, Dothiorelkla sp., Fusarium oxyporum, Fusarium sp., Pestaloíia sp., Alternaria sp., Phomopis sp., Nigrospora sp., Rhisoctonia solani, Trichoderma sp. Entre estes, o Aspergillus spp., Penicillium sp., Fusarium spp. e Rhizopus sp. destacam-se pela frequência e ação sobre as sementes,
prejudicando a germinação ou causando tombamento de plântulas após a germinação (MORAES & MORIOTTO, 1985).
As espécies dos géneros Aspepergillus e Penicillium, têm sua atividade regulada pelas condições ambientais vigentes durante o período de armazenamento e pelas condições dos lotes especialmente de seus estados físicos, teor de umidade e inoculo inicial, sendo os principais fungos responsáveis por perdas das sementes ou grão (LUCCA FILHO, 2003). A princípio, considerava-se como única fonte de inoculo o armazém; porém as sementes podem chegar a esses locais, já infectadas (DFIINGRA & COELHO NETO, 1998). As sementes de amendoim são substrato favorável ao crescimento de Aspergillus flavus Link e A. parasiticus Speare e, subsequente, produção de aflatoxinas por algumas estirpes desses fungos (DHINGRA & COELHO NETO,
1998), substâncias essas que são altamente prejudiciais à saúde humana e animal. Outra espécie assinalada com frequência é A. ninger, que sobrevivendo ao armazenamento pode apodrecer as sementes durante a germinação ou causar podridão no colo das plântulas ( L I M A & ARAÚJO, 1999).
2.4 Uso de produtos naturais no controle de fitodoenças
Os produtos químicos têm sido o principal meio de controle de problemas fitossanitários, no campo e no armazenamento. No entanto, devido ao alto risco de intoxicação e ao custo-econômico, tem-se buscado alternativas de controle, como o uso de substâncias de origem vegetal (BOFF & ALMEIDA, 1996), procedimento que remota aos primórdios da agricultura, como o emprego de folhas de ciprestes no tratamento de sementes (NEERGAARD, 1979; DHINGRA et al., 1980).
Os elevados custos ambientais e económicos, derivados do uso de agrotóxicos na agricultura, resultaram num maior esforço de pesquisas direcionadas ao desenvolvimento
Capitulo-2
RevtiôLo- de/ Literatura/
de sistemas de controle de doenças de plantas através de agentes naturais. Em respostas a esta problemática têm-se usado métodos alternativas mais compatíveis com o ecossistema, ainda com a vantagem de serem mais baratos. As vantagens mais propagadas desses sistemas são o menor impacto ambiental e a maior segurança ao homem, tanto para aquele que aplica o produto quanto para o consumidor final dos alimentos. Esta vertente na pesquisa de novos compostos se dá pelo aspecto ecologicamente correio de produzir substancias que sejam menos agressivas ao meio ambiente, contribuindo para uma melhor qualidade de vida, conforme estabelece a Carta Europeia do Ambiente e da Saúde (DEOUX & DEOUX, 1998).
Segundo PRATES (2000) defensivos alternativos são produtos preparados a partir de substâncias não prejudiciais à saúde humana e ao meio ambiente, destinados a auxiliar no controle de pragas e doenças da agricultura, tendo como vantagem propiciar a redução do uso de agrotóxicos nos cultivos convencionais e favorecer a obtenção de produtos com menos ou nenhum resíduo químico, mais saudável para o consumidor final. Estão incluídos nesta categoria os agentes de biocontrole, os diversos biofertilizantes líquidos, os feromônios, os extratos de plantas, óleos essenciais, entre outros, cuja atividade influencia positivamente na resistência das plantas ao ataque de pragas e de agentes de doenças, pois esses defensivos têm potencial para controle direto de alguns fitoparasitas através da presença de substâncias fungicidas, bactericidas e inseticidas em sua composição, regulando e tonificando o metabolismo vegetal.
O tratamento de sementes com produtos químicos tem sido eficiente no controle de patógeno (MACHADO, 1988). No entanto, a utilização de substâncias extraída de vegetais que podem atuar na inibição de fungos associados a sementes e ou no solo associada a outras práticas agrícolas pode constituir numa opção potencial para controle de fitopatógenos residentes do solo e do equilíbrio biológico (VALARINI et al., 2003). Muitas espécies de plantas medicinais, contém fenóis, quinonas, saponinas, flavanóides e terpenóides em quantidade apreciáveis para repeli insetos, além de prevenir a ocorrência de doenças de plantas (SILVA JÚNIOR & VLZZOTO, 1996). Os compostos fenólicos desempenham importância fundamental na resistência das plantas ao ataque de fungos (AGRIOS, 1998). Dentre os compostos fenólicos importantes nas resistências das plantas ao ataque de patógenos destacam-se os flavonóides e os taninos (ZUANAZZI, 2002).
Capítulo-2
evCaão- cie- Literatura/
As substâncias encontradas em produtos naturais são geralmente classificadas como compostos secundários, sendo que a maioria se origina de acetato ou aminoácidos da via bioquímica, havendo, entretanto, considerável diversidade química entre esses compostos, podendo ser ácidos fenólicos, cumarina, terpenoides, flavonóides, etileno e varias outras substâncias (CASTRO et al., 1983).
De acordo com JACOBSON (1989), dentre as espécies botânicas mais utilizadas atualmente como fonte de aleloquimicos, encontra-se as famílias Meliaceae, Rutaceae, Lamiaceaea, Annonaceae e Canellaceae. A família Meliaceae vem se destacando como fonte de plantas inseticidas dentre as diversas famílias botânicas, tanto pelo número de espécies vegetais com atividade inseticida, como pela eficiência de seus extratos, onde a espécie Azadiracta indica conhecida por nim indiano (SCHMUTTERER, 1988; KOUL et al., 1990; MORDUE (Luntz), BLACKWELL, 1993; VENDRAMIM, 1997), é caracterizado por sua ação tóxica, inibidora da alimentação e do crescimento e redução da fecundidade nos insetos (MORDUE (Luntz) BLACKWELL, 1993).
Alguns produtos têm demonstrado a eficiência de extratos vegetais no tratamento de sementes. Em trigo {Triticum aestivum L.), sementes tratadas com extratos de fumo
{Nicotina ríistica L.) (KHAN, 1992) e de lírio-da-índia {Azadiracta indica Juss) (KHAN
& KUMAR, 1990) tiveram redução da microflora e aumento do poder germinativo. O tratamento de sementes de arroz (Oryza sativa L.) com um extrato aquoso obtido de nó-vômica {Strychnos mux-vomica L.) foi mais efetivo que o fungicida mancozeb 0,5% no controle do fungo Trichoniella padwickii (Ganduly) (JAIN SHETTY et al., 1989). Em outros estudos, o tratamento de sementes de arroz com extrato aquoso de Cycas revoluta Thunb. e Thuja orientalis L ; mantidas sob diferentes métodos de armazenamento, permitiu o controle de alguns fungos; porém, as concentrações maiores dos extratos reduziram a germinação das sementes ( K U M A R 1990). Produtos extraídos de cascas de aroeira {Astronium urundeuva Engl.) e cajueiro {Anacardium occidentale L.) são utilizados pela medicina popular no tratamento de diversas enfermidades. O chã de casca de cajueiro, segundo ALBUQUERQUE (1989), é utilizado para diarreia, inflamações na garganta e como anti-hemorrágico. De acordo com BRAGA (1986), as cascas balsâmicas e hemostáticas de aroeira são utilizadas contra afecções das vias respiratórias, do aparelho urinário, nas hemoptises e metrorragias. Extratos de aroeira e cajueiro foram testados no CCA/UFPB, Areia-PB (CARVALHO et al; 1999; COUTINHO et al; 1999;
Capítulo-2
Ke^dão de/ Literatura/
FELISMINO et al, 1999), obtendo-se resultados que permitem vislumbrar a utilização desses produtos no tratamento de sementes visando o controle de patógenos.
Diferentes produtos do Nim {Azadiracta indica A. Juss) - torta, extrato de folha, óleo - tem sido testado para o controle de doenças do sistema radicular, parte aérea e pós-colheita, com resultados positivos em vários casos (CARNEIRO, 2003).
2.5 Caracterização botânica e composição das plantas utilizadas para formulação de extratos
2.5.1 Neem - Azadirachta indica
O nim é uma planta da família Meliaceae, sendo uma árvore muito resistente e de crescimento rápido, que alcança, normalmente, de 10 a 15 metros de altura e, dependendo do tipo de solo e das condições climáticas favoráveis ao desenvolvimento das plantas, pode atingir até 25m de altura. Seus frutos, sementes, óleo, folhas, cascas e raízes têm grande utilidade medicinal como anticépticos, antimicrobianos, antimalárica, contra vermes intestinais e no uso contraceptivo (espermaticida) (EMBRAPA, 2007).
Produtos tem sido obtidos a partir do nim com grande atividade biopesticida (KOUL et al., 1990; SCHMUTTERER 1990), e com efeitos inseticida, repelente e inibidora de crescimento, (MORDUE (Luntz) BLACKWELL., 1993), fungicida e nematicida (BURG & MAYER, 2006). O principio ativo, o azadirachitin, se concentra nas sementes, mas está presente em toda a planta Segundo MARTINEZ (2002), esse composto é uma mistura de isômeros com estrutura química muito semelhante e atividade biológica variável, sendo a azadiractina a mais encontrada. A molécula da azaractina é muito complexa e até o momento, não foi sintetizada. Assim, todos os produtos disponíveis no mercado são preparados pela extração dos compostos a partir da planta.
Os extratos de nim apresentam mais de 40 ingredientes ativos e, assim como outras Meliáceas, possuem compostos limonóides com reconhecida ação sobre os insetos, sendo azadiractina, salanina, melantriol e nimbina os limonóides mais conhecidos (GARCIA, 2000; EPAMIG, 2002).
Capítulo 2
RevticUy-
cie L íteratura/
2.5.2 Canela - Cinnamomum zeylanium
A canela é uma árvore perene, alcançando altura de 8-17 m , suas folhas são perfumadas de cor verde-escuro sendo a parte inferior , transformando posteriormente em bagas de cor púrpuro-escuro. O clima e as condições do solo afetam a planta profundamente de modo que uma mesma espécie ou variedade, cultivada em outro país, pode produzir uma casca de qualidade muito diferente daquela obtida nas regiões da índia (KOKETSU & GONÇALVES, 1991).
A espécie C. zeylanicum é uma planta aromática e medicinal pertencente à família Lauraceae, originária de algumas regiões da índia e do Ceilão. É encontrada e conhecida no Brasil como canela-da-índia e canela-do-ceilão. O Brasil importa regularmente de diferentes países quantidades significativas tanto de cascas quanto do óleo essencial, dada a ausência de cultivo comercial dessa especiaria no País. É uma das mais antigas especiarias conhecidas. Seu uso é relatado os tempos bíblicos e o controle de seu comércio foi um dos motivos das grandes explorações marítimas (FREIRE et al, 2005).
A canela é uma planta condimentar, é definido como produtos aromáticos de origem vegetal, utilizados com a finalidade principal de temperar alimentos. Os condimentos também possuem propriedades antimicrobianas, antioxidantes e medicinais. De acordo com SHELEF (1983), existem aproximadamente 70 tipos de condimentos cultivados no mundo. Esses exercem maior atração para o consumo na alimentação humana, por reunir características como sabor, aroma e aspectos capazes de estimular poderosamente os sentidos do corpo e influenciar o apetite (SALGADO, 2005).
2.5.3 Alho - Allium sativum L.
O alho é uma planta herbácea e bulbosa. É plantada em todo o mundo como hortaliça aromática, condimentar e medicinal. As folhas são lineares e longas. Partindo do bulbo, o alho é composto de bulbilhos (conhecidos como dentes), envolvidos por
CapCtulo-2
K
evCaão- de/ L Ctercutura/
películas esbranquiçada ou cor-de-rosa. As flores, dispostas em umbelas, apresentam cores esbranquiçadas ou avermelhadas. E indicado como fungicida, antibacteriano, e antiviral, devido à alicina ( L I M A et al., 1994).
A alicina possui propriedades bacteriostáticas, bactericidas, amebicidas, antelmíntica, nematicida, anti-inflamátoria, antioxidante, antisséptico, antiviral, candidicida, fungicida, inseticida, larvicida, micobactericida, vibriocida. O dialil dissulfeto, presente em 60% do óleo do alho, é uma das mais importantes substâncias da planta e foi descoberta em 1892 pelo cientista alemão W. Semmler. Trabalha em conjunto com o ajoeno, substância também presente no óleo essencial do alho é usada atualmente como bactericida, fungicida, vermífugo, antiviral e antiprotozoário (CARRICONDE & MORES, 1992; TESKE & TRENTINI, 1995; ALONSO, 1998; DANTAS, 2003).
O alho é utilizado principalmente como hortaliça aromática e condimento alimentar, porém seus constituintes ativos conferem-lhe propriedades medicinais favoráveis à saúde humana e animal, ainda apresentando atividade contra fitopatógeno, sendo empregado em muitos países como defensivo natural. Sua ação contra pragas e doenças amplamente exploradas e aproveitadas. Através do emprego de seus óleos se controla insetos nocivos, como lagartas e pulgões (NICOMEDES JÚNIOR e SOUSA,
Capítulo-3
Material/ e> hAétodoy
3. M A T E R I A L E MÉTODOS
3.1 Localização dos ensaios e origem das sementes e produtos testados
Os ensaios experimentais foram conduzidos no laboratório de Processamento e Armazenamento de Produtos Agrícolas em conjunto com os Laboratórios de Fitopatologia e de Análise de Sementes do CCA/UFPB, Areia, Paraíba.
Foram utilizadas sementes de amendoim, variedade BR-1, adquiridas na Embrapa Algodão, Campina Grande e mantidas em câmara frias de armazenamento no Laboratório de Armazenamento de Produtos Agrícolas da Unidade Académica de Engenharia Agrícola do Centro de Tecnologia e Recursos Naturais (CTRN) da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG).
Os produtos naturais (extratos vegetais) foram obtidos a partir de folhas de nim
-(Azadirachta indica) oriundas de uma plantação (bosque) e os bubilhos de alho {Allium sativum) e raspas de casca de canela {Cinnamomum zeylanicum) adquiridas em feira
livre, todos na cidade de Boqueirão, PB. Para produção dos extratos foram utilizados 500 g de matéria-prima e 1000 ml de álcool etílico. Para a preparação dos extratos foi seguida a metodologia descrita por ALMEIDA et al. (2003). As folhas de Neem, após um período de 24 horas em estufa a 40 ± 2 °C, e as cascas de canela foram trituradas em moinho de martelo da Marca Tecnal e os bulbilhos passados em um espremedor de alho. Todo o material obtido foi pesado em balança da Marca Marte, Modelo AS 5500C em seguida umedecido com uma pequena quantidade de álcool etílico a 70 % v v " , e finalmente colocadas em percolador (Figura 1) para extração. Também foi utilizado extrato do Nim comercial adquirido na Embrapa algodão de Campina Grande, PB.
Capítulo-3
Material/ e/ Métodoy
3.2. Análise sanitária de sementes de amendoim e isolamento do fungo
Para isolamento do Aspergillus flavus foi tomada uma amostra de 200 sementes de amendoim, variedade BR-1, que estavam armazenadas no período de 10 dias no LAPPA, que foi submetida à incubação pelo emprego de método de papel de filtro umedecido (NEERGARD, 1979), em placas de Petri ( 0 = 9,5 cm), dentro de cada uma delas, as sementes em número de 10, foram distribuídas, igualmente espaçadas, sobre uma camada constituída por três folhas sobrepostas de papel de filtro umedecidas com água destilada esterilizada (ADE). O ambiente de incubação (Figura 2) foi em uma câmara com temperatura de 22 ± 2 °C e iluminação (fotoperíodo de 12 h) proporcionada por lâmpadas N.U.V (próximo ao ultravioleta) de 40 w, Marca Phillips, situadas 40 cm acima da superfície onde as placas foram distribuídas. No oitavo dia de incubação, as sementes foram observadas em microscópio estereoscópico para identificação e contagem das colónias fúngicas. Considerando as características das colónias e visualização das estruturas vegetativas e reprodutivas, fez-se, a partir de um fragmento micelial, o isolamento do fungo objeto do trabalho, o qual foi inoculado em meio de cultura BDA (Batata, 200 g; Dextrose, 20 g; Agar-Agar, 17 g; e água destilada, 1000 mL) esterilizado em autoclave a 121°C por 30 min, contido em placas de Petri. A partir do isolado do fungo foram feitos 20 subcultivos em mais placas de Petri e em tubos de ensaio contendo meio de cultura de BDA, para a produção de inóculos que foram utilizados nos experimentos.
Figura 2 Placas de Petri contendo sementes distribuídas na câmara de incubação (Foto
Capítulo-3
Materíat e> MétocLoy
3.3. Ensaios experimentais
3.3.1 Efeito de extratos vegetais sobre a germinação de esporos e origem de unidades formadoras de colónias (UFC).
Os extratos vegetais brutos foram utilizados brutos (100%) e diluídos em água destilada esterilizada (ADE), nas proporções de 1, 10, 25, 50%, sendo, de cada uma dessas soluções, vertidos 5 mL em tubos de ensaio onde o A. flavus se desenvolvia (Figura 3), efetuando-se a agitação dos tubos para se obter a suspensão dos esporos. Decorrido um período de 24 h foram retiradas de cada tubo de ensaio, com auxilio de uma pipeta (calibrada para 100 uL), cinco gotas de suspensão de esporos que foram postas em hemacitômetro (câmara de Neubauer) e observadas sob microscópio composto, Marca microscópios Olympus, Modelo U-MDOV3, para a contagem de esporos germinados e não germinados.
Contagem de esporos germinados
Figura 3 Esquematização dos procedimentos para observação de esporos de A. flavus
Capítulo-3
Material' e/ Métodoy
Para o ensaio referente às UFC foram vertidos 5 mL das soluções dos extratos em tubos de ensaios onde as colónias de A.flavus se desenvolveram, sendo os tubos agitados manualmente para se obter as suspensões de esporos. Decorridos 12 h, foi feita uma diluição em série, conforme se esquematiza na Figura 4: tomou-se 1,0 mL da suspensão (solução de extratos + esporos) que foi adicionado em um outro tubo de ensaio contendo 9 mL de ADE (1:10); deste tubo foi também retirado 1 mL da suspensão e adicionado em outro tubo com 9 mL de ADE (1:100); e, da mesma forma que o anterior, uma nova diluição (1:1000). Desta nova diluição, cinco alíquotas de 0,5 mL foram retiradas e colocadas, individualmente, sobre meio de cultura de BDA contido em placas de Petri e espalhadas por meio de alça de Dgradsky para a cobertura uniforme da superfície. Decorridas 24 e 48 h essas placas foram observadas sob aparelho contador de colónias para a contagem de UFC.
Plantio de esporos e desenvolvimento de colónias
Figura 4 Esquematização dos procedimentos para verificação do desenvolvimento de
umidades formadoras de colónias do fungo A. flavus após imersão dos esporos em extratos de nim, canela e alho
Capítulo-3
Material'
e Métodoy
3.3.2. Efeito de extratos vegetais sobre crescimento micelial de A. flavus
Para a realização desse ensaio os componentes do meio de cultura BDA foram colocados em erlemayers com capacidade de 500 mL, sendo adicionados a cada recipiente quantidades de extrato de modo a constituir as diferentes proporções dos produtos testados. Em seguida o meio de cultura foi esterilizado em autoclave a 121 °C durante 30 min e, após, durante o esfriamento, próximo ao ponto de fusão, foi distribuído (20 mL) dentro de placas de Petri. Após o esfriamento e solidificação do meio de cultura efetuou-se a repicagem, transferindo-se um disco micelial (0,2 cm de diâmetro) da margem de uma colónia de A. flavus plantando-o no centro da superfície do meio de cultura com as diferentes concentrações dos produtos (Figura 5). As placas de Petri foram mantidas em ambiente de incubação (câmara) e, a cada 24 h efetuava-se com auxilio de uma régua milimetrada, a medição, em dois sentidos, do diâmetro das colónias do fungo. Para efeito de comparação de tratamentos, foram consideradas duas variáveis: o diâmetro das colónias no oitavo dia.
Figura 5 Esquematização dos procedimentos de repicagem e de desenvolvimento das
colónias do fungo A. flavus em meio de cultura BDA com diferentes proporções de extratos de nim, canela e alho
BDA + Extrato Vegetal Plantio e m
Cultura do fungo
Capitulo 3
Material/ e/ Métodoy
3.3.3 Efeito do tratamento com extratos vegetais sobre a incidência de A.
flavus e a germinação das sementes
Efetuou-se o tratamento na razão de 5 mL de extrato, em diferentes proporções, para 500 g de sementes que foram colocadas dentro de "beckeres" . Com auxilio de um bastão de vidro efetuou-se a agitação das sementes para que ocorresse uma cobertura uniforme dos produtos. Uma parte (metade) das sementes tratadas foi pulverizada com uma suspensão de esporos de A. flavus, concentração IO6 conídios por mL.
As sementes inoculadas e as não inoculadas com esse fungo foram submetidas à análise sanitária (micoflora) e teste de germinação. A micoflora foi determinada empregando-se na incubação o método de papel de fdtro umedecido (NEERGARD, 1979), conforme descrito no item 3.2. Para cada tratamento (proporções) foram utilizadas 200 sementes, divididas em quatro grupos (repetições) de 50 unidades. Em placas de Petri ( 0 = 9,5 cm), dentro de cada uma delas, as sementes em número de 10, foram distribuídas, igualmente espaçadas, sobre uma camada constituída por três folhas sobrepostas de papel de fdtro umedecidas com água destilada esterilizada (ADE). As placas de Petri contendo as sementes foram mantidas em ambiente de incubação (câmara com temperatura de 22 ± 2 °C e iluminação (fotoperíodo de 12 h) proporcionada por lâmpadas N.U.V (próximo ao ultravioleta) de 40 w, marca Phillips, situadas 40 cm acima da superfície onde as placas foram distribuídas (Figura 2). No oitavo dia de incubação, as sementes foram observadas sob microscópio estereoscópico para identificação e determinação da incidência (percentagem de sementes afetadas) de A. flavus.
Em outro ensaio, as sementes foram imersas em uma suspensão de esporos do fungo (conidios/mL) e postas a secar sobre folhas de papel toalha. Após um período de 2 h uma parte das sementes (metade) foi submetida ao tratamento com os produtos testados, conforme descrito no parágrafo anterior. Sementes tratadas e não tratadas foram postas em incubação pelo método do papel de filtro umedecido (NEERGAARD, 1979) e avaliadas quanto à incidência de A. flavus.
Sementes inoculadas, pré e pós- tratamento, foram submetidas ao teste de germinação seguindo-se os procedimentos prescritos nas "Regras para Análise de Sementes" (BRASIL, 1992). Para cada tratamento/repetição foi utilizado 200 sementes
Capítula- 3
Material/ e/ Métodoy
(quatro repetições de 50 unidades) distribuídas sobre duas folhas de papel Germitest, e cobertas com uma outra folha, todas previamente umedecidas com água destilada. Para a incubação formaram-se rolos de papel que foram postos em um germinador mantido à temperatura constante de 25 °C, durante dez dias. As variáveis analisadas foram primeira contagem de germinação realizada no quinto dia de incubação e germinação (final) no décimo dia.
3.4 Delineamento experimental e análises estatísticas
Os resultados foram analisados através do programa SAEG 5.0 (1997) utilizando o delineamento inteiramente casualizado (DIC) com 4 repetições em esquema fatorial como segue:
Experimento 1: [(2x4x5)+1] representado por: sementes inoculadas e sementes
não inoculadas com esporos, tratamento com extratos vegetais, proporções dos extratos, respectivamente.
Experimento 2: [(2x4x5)+1] representado por: sementes inoculadas e sementes
não inoculadas com fungos, tratamento com extratos vegetais, proporções dos extratos, respectivamente.
As médias de cada tratamento foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Capítulo-4-
Ketuttadoy &QÍAOUM&O-4. R E S U L T A D O S E DISCUSSÃO
4.1. Efeito de extratos vegetais sobre a germinação de esporos, unidades formadoras de colónias (UFC) e crescimento micelial de A.flavus.
Foram avaliados os efeitos de extratos vegetais em diferentes proporções sobre conídios (germinação) e micélio (crescimento) de A. flavus por serem estas as estruturas de disseminação quando o fungo se estabelece infectando ou contaminando sementes, grãos e outros produtos vegetais armazenados.
Os resultados referentes à germinação dos esporos de A. flavus imersos nos extratos de canela a 1% e no de alho a 25% diferiram positiva e significativamente da testemunha e, da mesma forma, os referentes ao número de unidades formadoras de colónias (UFC) em BDA adicionado dos extratos de alho a 25 e 100%, de nim folha a 1 e
10%, e de nim comercial a 1, 10, 25 e 100% (Tabela 1).
Nestes tratamentos que se diferenciaram significativamente da testemunha registraram-se os maiores valores de germinação de esporos e dos números de UFC (Tabela 2), também significativamente diferentes dos demais tratamentos.
Os conídios imersos em extrato de canela a 10, 25, 50 e 100% e em extrato de nim comercial a 1 e 10 não germinaram e os menores números de UFC foram nos extratos de canela a 10. 25. 50 e 100%
Quanto ao diâmetro das colónias de A. flavus no oitavo dia de desenvolvimento as concentrações de 25, 50 e 100% de todos os extratos e as proporções de nim folha a 10% e de nim comercial a 1% diferiram significativamente da testemunha (Tabela 3). Comparando-se os extratos para cada concentração (Tabela 4), os efeitos foram iguais entre si, exceto na proporção 10% na qual o diâmetro em extrato de canela diferiu significativamente dos demais produtos. Na Tabela 4 pode ser constatado ainda que nas concentrações 50 e 100% de todos os extratos as colónias apresentaram diâmetro igual a 0,20 cm, não tendo havido, portanto, o crescimento micelial, pois este foi o valor do diâmetro do fragmento micelial plantado no meio de cultura quando da instalação do experimento.
Capítulo-^
Sobre os extratos empregados no presente trabalho, são encontrados na literatura relatos de efeitos dos mesmos inibindo a germinação de esporos e o crescimento micelial de fungos fitopatogênicos (TANSEY & APPLETON, 1975; CHALFOUN & CARVALHO, 1987; BOLKHAN & RIBEIRO, 1981; BASTOS, 1992; BARROS et al., 1995; VIEGAS et al., 2005; RIBEIRO, 2008).
Tendo sido observados efeitos distintos das concentrações dos extratos sobre a germinação e crescimento micelial do A. flavus, pode entender-se que a forma como se estabelece o contato das estruturas fúngicas com as substâncias potencialmente fungistáticas ou fungitóxicas encontradas nos extratos são determinantes da atividade antifúngica. Na imersão dos conídios nas soluções com diferentes proporções de extratos, dar-se o contato direto desta estrutura fúngica com as substâncias de potenciais fungistáticas ou fungitóxicas existentes nos extratos, o que pode causar a inibição da germinação ou a morte dos esporos.
C a p í t u l o 4
-Tabela 1. Diferenças de germinação de esporos imersos em soluções de extrato vegetais,
e de unidades formadoras de colónias em meio de cultura por A. flavus. com relação ao tratamento testemunha
Tratamentos (Testemunha) Germinação de esporos (%) Unidades Formadoras de Colónias (UFC) Canela 1% 13,07* 12,00 N S Canela 10% -0,58N 5 i -91,25 N S Canela 25% -0,58N S -90,50 N S Canela 50% -0,58N 5 ) -85,75 N S Canela 100% -0,58N S -95,50 N S Alho 1% 2,47N S -38,25 N S Alho 10% 0,67N S -22,50 N S Alho 25% 21,31* 165,75* Alho 50% 1,02NS -73,50 N S Alho 100% 0,14N S 133,25* Nim folha 1% -0,03N S 237,25* Nim folha 10% 1,35NS 319,25* Nim folha 25% 2,14N S 15,75 N S N i m folha 50% 0,25N S -46,25 Ní> Nim folha 100% -0,25N5> -74,50 N S N i m comercial 1% - 0 , 2 1N S 222,75* Nim comercial 10% -0,20N S 249,50* Nim comercial 25% 0,85N S 241,75* N i m comercial 50% 5,01NÍ> 58,25 N S N i m comercial 100% 0,13N S 188,00* DMS 9,64
185,85
CV 165,90 56,87ns e * = não significativo e significativo a 5% de probabilidade, respectivamente pelo teste de Dunnett DMS = diferença mínima significativa; C V = coeficiente de variação
Tabela 2. Germinação de conídios de A. flavus previamente imersos em extratos vegetais
e números de Unidades Formadoras de Colónias (UFC) em meio de cultura de BDA.
Proporções Extratos
dos extratos Canela Alho Nim folha Nim comercial
<%) Germinação de esporos (%)
1,0
14,0 A 3,0 B 1,0 B 0,0 B 10,0 0,0 A 1,0A 2,0 A 0,0A 25,0 0,0 B 22,0A 3,0 B 1,0 B 50,0 0;0A 2,0 A 1,0 A 6,0A100,0 0,0A 1.0A 0.0A 1.0A
DMS 10,95 CV 165,90 Números de U F C 1.0 106 B 72 B 358 A 349 A 10,0 4 B 102 B 428 A 372 A 25,0 7 C 287 A 134 B 350 A 50,0 13 B 38 B 81 A B 175 A 100,0 1 C 115B 31 BC 262 A DMS 113,30 CV 50,07
Médias seguidas de mesma letra maiúscula nas linhas não diferem entre si ao nível de probabilidade de 5% pelo teste de Tukey. Os dados obtidos em função da aplicação das proporções não ajustaram a modelos de regressão polinomial
DMS = diferença mínima significativa; CV = coeficiente de variação.
Capitulo-^
Tabela 4. Diâmetro das colónias de A. flavus no oitavo dia de incubação em meio de
BDA adicionado de extratos vegetais.
Proporções Extratos
dos extratos (%)
Canela Alho Nim folha Nim comercial
Diâmetro das colónias (Cm)
1,0 2,68 A 3,88 A 2,73 A 2,73 A 10,0 7,03 A 5,20 B 4,90 B 4,90 B 25,0 1,73 A 2,75 A 2,80 A 2,80 A 50,0 0,20 A 0,20 A 0,20 A 0,20 A 100,0 0,20 A 0,20 A 0,20 A 0,20 A DMS 2,13 CV 48,15
Médias seguidas de mesma letra maiúscula nas linhas não diferem entre si ao nível de probabilidade de 5% pelo teste de Tukey. Os dados obtidos em função da aplicação das proporções não ajustaram a modelos de regressão polinomial.
DMS = diferença mínima significativa; C V = coeficiente de variação.
No ensaio referente às UFC. os esporos foram plantados em um meio apropriado para promover o desenvolvimento de fungos, podendo o efeito dos produtos diluídos no meio de cultura ter se verificado mais sobre os tubos germinativos do que inibindo a germinação, afetando, dessa forma, o surgimento e desenvolvimento de colónias. No ensaio referente ao crescimento micelial, as hifas ao serem plantadas em BDA + extratos, estando em pleno desenvolvimento vegetativo, ao alimentarem-se do substrato absorvem as substâncias de possíveis efeitos fungistáticos ou fungitóxicos dos extratos vegetais adicionados previamente ao meio de cultura.
Considerações também devem ser feitas sobre os efeitos da composição dos
extratos. uma vez que nos vegetais são encontradas tanto substâncias que estimulam a
CccpítuUrQ-atividade de fungos, sendo determinantes da patogênese, quanto substâncias com atividades antifúngicas. Considerando a primeira classe dessas substâncias, infusões e extratos vegetais têm sido adicionados meio de cultura para promoverem o desenvolvimento de fitopatógenos (DHINGRA & SINCLAIR, 1995). Porém, devido à segunda classe dessas substâncias extratos e óleos essenciais, principalmente os de plantas medicinais, têm sido avaliados quanto as suas atividades sobre organismos fitopatogênicos. Os extratos de nim apresentam mais de 40 ingredientes ativos com reconhecida ação biocida como a azadiractina, salanina, melantriol e nimbina os limonóides mais conhecidos (GARCIA, 2000; EPAMIG, 2002). Extratos e óleos essenciais de alho têm comprovada ação fungicida, antibacteriano, e antiviral, devido a compostos como a alicina, o dialil dissulfeto e o ajoeno (CARRICONDE & MORAIS,
1992; TESKE & TRENTINI, 1995; ALONSO, 1998; DANTAS, 2003); L I M A et al. 2006). A canela também possuem ingredientes benéficos a saúde humana e ação antimicrobiana (KOTETSU et al., 1991), sendo constatada efeitos de seus extratos com relação ao A. flavus ( VIEGAS et al., 2005).
Nos extratos vegetais brutos, como no caso dos utilizados no presente trabalho, as proporções dessas classes de substâncias são variáveis quantitativamente. Então os valores mais elevados de germinação de esporos, número de UFC e de diâmetro de colónias verificados com o emprego de concentrações menores desses extratos podem ser devido à quantidade insuficiente, nestas concentrações, das substancias que exerçam atividade antifúngica. Por outro lado, quando os valores mais elevados de germinação de esporos e número de UFC foram registrados em concentrações maiores de extratos, pode ter se verificado nessas concentrações quantidade suficiente de substâncias estimuladoras da atividade fúngica diminuindo ou anulando a atividade das substâncias antifúngica. Nos tratamentos em que os extratos foram adicionados ao meio de cultura com concentrações de 50 e 100%, não se verificou o crescimento micelial de A. flavus (Tabela 4), o que pode significar que em meio de cultura houve o favorecimento das atividades das substâncias antifúngicas.
Capitulo-^
4.2 Efeitos do tratamento com extratos vegetais sobre a incidência de A. flavus e a germinação das sementes de amendoim
Nas sementes de amendoim inoculadas com conídios de A. flavus previamente ao tratamento com as diferentes concentrações dos extratos testados, e nas inoculadas após o tratamento.
As diferenças de incidência com relação ao tratamento testemunha, das concentrações de extratos aplicadas antes e depois da inoculação do fungo são apresentadas na Tabela 5. Nas sementes tratadas antes da inoculação foram negativas e significativas as diferenças com relação à testemunha, dos tratamentos extratos de canela e de alho a 50 e 100%, e de extratos de nim comercial a 1, 25, 50 e 100%. Nas sementes tratadas depois da inoculação do A. flavus, foram negativas e significativas as diferenças com relação a testemunha, dos tratamentos extratos de canela e de alho a 100%, extrato de nim folha 1% e, positivas e significativas do extrato de nim folha a 10% e de nim comercial a 10 e 25 %.
Capitulo-4-Tabela 5. Diferenças com relação ao tratamento testemunha, da incidência de A. flavus
em sementes de amendoim inoculadas com o fungo previamente ou após o tratamento com extratos vegetais.
Tratamentos (Testemunha) Modos de inoculação do fungo
Pré-tratamento Pós-tratamento Canela 1% -9.0 N S 12.3 N S Canela 10% -10,0 N S 7,3 N S Canela 25% -10,5 N S -10,5 N S Canela 50% -17,5* -9,0 N S Canela 100% -32,5* -20,5* Alho 1% -4,0 N S 9,0 N S Alho 10% -4,5 N S 13,0 N S Alho 25% -3,5 N S -9,8 N S Alho 50% -16,3* -13,3 N S Alho 100% -21,3* -22,5* Nim folha 1% -2,8 N S -18,8* Nim folha 10% -0,5 N S 15,0* Nim folha 25% -2,0 N S -6,3 N* Nim folha 50% -2,8 N S 5,0 N S Nim folha 100% -2,5 N S -0,8 N S Nim comercial 1% -20,5* 4,8 N S Nim comercial 10% -10,3 N* 16,0* Nim comercial 25% -28,0* 18,8* Nim comercial 50% -32,0* 8,8 N S Nim comercial 100% -21,8* 4,0 N S DMS 14,05 CV 18,86
ns e * = não significativo e significativo a 5% de probabilidade, respectivamente pelo teste de Dunnett. DMS = diferença mínima significativa; CV = coeficiente de variação
