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Microencapsulação de extratos metanólicos de amora-preta (rubus fruticosus) e ácido gálico.

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Academic year: 2021

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel

Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial

Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Agroindustrial

Dissertação

MICROENCAPSULAÇÃO DE EXTRATOS METANÓLICOS DE AMORA-PRETA (Rubus Fruticosus) E ÁCIDO GÁLICO

Cleonice Gonçalves da Rosa

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CLEONICE GONÇALVES DA ROSA

MICROENCAPSULAÇÃO DE EXTRATOS METANÓLICOS DE AMORA-PRETA (Rubus Fruticosus) E ÁCIDO GÁLICO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Agroindustrial, da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia Agroindustrial.

Comitê de orientação: Prof. Dr. Rui Carlos Zambiazi

Profª. Drª. Caroline Dellinghausen Borges

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Banca examinadora:

Prof. Dr. Rui Carlos Zambiazi– UFPel (Presidente/Orientador) Profª. Drª. Caroline Dellinghausen Borges – UFPEL (Orientadora) Drª. Roberta Manica-Berto – UFPEL

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AGRADECIMENTOS

À Deus por se fazer sempre presente em minha vida.

À minha família pelo apoio concedido para que eu pudesse continuar a minha jornada.

Ao professor Rui Zambiazi pela orientação, ensinamentos, dedicação, amizade, e pela oportunidade para que este trabalho fosse realizado.

À professora Caroline Borges por ser muito mais que orientadora, pela dedicação exclusiva, ensinamentos sem medidas, amizade e apoio sempre quando necessário. Sem a sua participação este trabalho não teria sido o mesmo.

À todos os colegas do laboratório de Cromatografia em especial Vanessa Pestana-Bauer e Andressa Jacques pela amizade e pelos ensinamentos; Fabiana Goularte, Roseane Dávila, Joseane Rutz, Ana Paula, Marina Pereira pela amizade e companheirismo. Às estagiárias Suzane Rickes, Fernanda Krumeireich, Michele Crizel pela ajuda sem medidas.

Aos colegas e amigos do DCTA por estarem sempre presente: Luiza Kuck, Miguel Telesca, Júlia Goldbeck, Joyce Borowisk, Vânia Pinto, Aline Tiecher, Nathan Vanier e Bruna Klein.

Aos participantes da banca pela disposição de participarem.

Ao professor Edilson Benvenutti e toda sua equipe pela realização das análises e pela compreensão.

Ao meu namorado Michael, amigo, companheiro, pela compreensão, ensinamentos e pelas palavras de incentivo em todos os momentos.

À UFPEL, CCQFA, CDETEC, DCTA, UFRGS pela oportunidade para a realização deste trabalho.

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““““Um cientista em seu laboratório não é somente um técnico, é também uma criança colocada diante de fenômenos naturais que a impressionam como um conto de fadas”

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Resumo

ROSA, Cleonice Gonçalves. Microencapsulação de extratos metanólicos de amora-preta (rubus fruticosus) e ácido gálico. 2012. 112f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Agroindustrial. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

Os frutos de amora-preta constituem-se em uma fonte alimentar de alto teor de compostos fenolicos, como o ácido gálico, ácido þ-hidroxibenzóico, epicatechina e quercitina. Dentre estes, o ácido gálico é encontrado em maior abundância. Estes compostos apresentam propriedades antioxidantes, no entanto devido à presença de ligações insaturadas na sua estrutura molecular são vulneráveis a ação de agentes oxidantes como luz, calor, oxigênio e umidade. Uma alternativa para manter a estabilidade destes compostos, é propiciar a sua proteção em uma matriz polimérica, os quais permanecem protegidos até o momento que esses compostos sejam liberados desta matriz. Desta forma, o objetivo deste estudo foi microencapsular ácido gálico nas matrizes de β-ciclodextrina (β-CDS), quitosana (Q), xantana (X) e o extrato fenólico de amora-preta na presença destes polimeros e do hidrogel de xantana e quitosana (H), confirmar a encapsulação pelas técnicas de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC), Análise Termogravimétrica (TGA), determinar a atividade antioxidante, avaliar a liberação controlada dos compostos fenólicos e determinar a eficiência da encapsulação. Pode-se concluir que o ácido gálico foi encapsulado nas matrizes Q, β-CDS e X, pelo método de liofilização, assim como o extrato fenólico de amora-preta que foi encapsulado nestas mesmas matrizes e adicionalmente na matriz H. Os encapsulados apresentaram características distintas ao ácido gálico e ao extrato fenólico na sua forma pura, sendo comprovado pelas técnicas de MEV, DSC e TGA. Na encapsulação do ácido gálico na matriz quitosana foi obtida a maior eficiência de encapsulação, com a formação de cápsulas com formato característico e maior proteção do núcleo, conforme resultados de DSC e TGA, sendo tambem matida a atividade antioxidante. Em relação ao extrato fenólico de amora-preta houve a formação

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de cápsulas de formato característico com as matrizes quitosana e xantana. A eficiência de encapsulação dos compostos foi dependente do revestimento utilizado. A maior atividade antioxidante foi relacionada a presença equitativa dos compostos fenólicos, ácido gálico e da epicatechina, nas microcápsulas revestidas com β-ciclodextrina e xantana. A liberação controlada do extrato fenólico das cápsulas foi influenciada pelo revestimento, assim como pelo solvente e pH do meio.

Palavras chaves: Micoencapsulação. Compostos bioativos. Pequenos frutos. Ácidos fenólicos. Biopolímeros.

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Abstract

ROSA, Cleonice Gonçalves. Microencapsulation of methanolics extracts of blackberry (Rubus fruticosus) and gallic acid. 2012. 121f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Agroindustrial. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

The blackberries fruits are a high food source of phenolic compounds such as gallic and þ-hydroxybenzoic acids and epicatechina. Among them, gallic acid is found in greater abundance. These compounds exhibit antioxidant properties; however, due to the presence of unsaturated bonds in its molecular structure, they are vulnerable to the action of oxidizing agents such as light, heat, oxygen and moisture. An alternative to maintain the stability of these compounds is to provide its protection in a polymer matrix, which remain protected until the time that these compounds are released from this matrix. Thus, the objective of this study was microencapsulate gallic acid in the matrixes β-cyclodextrin (β-CDS), chitosan (C), xanthan (X) and the phenolic extract of blackberry in the presence of these polymers and also in xanthan and chitosan hydrogel (H), to confirm the encapsulation by Scanning Electron Microscopy (SEM), Differential Scanning Calorimetry (DSC), Thermogravimetric Analysis Techniques (TGA), to determine the antioxidant activity, to evaluate the controlled release of phenolic compounds and determine the efficiency of encapsulation. It was concluded that the gallic acid was encapsulated in the matrices C, β-CDS and X by lyophilization method, as well as the extract phenolic of blackberry in these same matrixes and additionally in the H matrix. The encapsulated showed distinct characteristics to the gallic acid and phenolic extract in its pure form, being proved by the techniques of SEM, DSC and TGA. The encapsulation of gallic acid was obtained in the chitosan matrix greater encapsulation efficiency, with the capsules formation with characteristic shape and greater protection of the core, according to the results of DSC and TGA, is also maintained the antioxidant activity. In relation to the blackberry phenolic extract capsules have the formation of shaped characteristic matrices with chitosan and xanthan. The encapsulation efficiency was dependent on the compounds coating used. The highest antioxidant activity was fairly related to the presence of phenolic

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compounds, gallic acid and epicatechina, the microcapsules coated with β-cyclodextrin and xanthan. The controlled release of the phenolic extract of the capsules was influenced by coating, as well as the solvent and pH.

Key-words: Microencapsulation. Bioactive compounds. Small fruits. Phenolic acids. Biopolymers

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Lista de Figuras

Figura 1: Frutos de amoreira-preta cultivar Guarani. ... 19

Figura 2: Estrutura química dos flavonoides. ... 22

Figura 3: Estrutura química dos ácidos fenólicos: a) ácidos hidroxibenzoicos: R1 = H, R2 = H, ácido gálico, R1 = OH, R2 = OH. b) ácidos hidroxicinâmicos comum: ácido p-cumárico R1 = H, ácido caféico R1 = OH; ácido ferúlico R1 = OCH3 ... 23

Figura 4: Mecanismo de ação antioxidante dos compostos fenólicos frente a metais de transição. ... 26

Figura 5: Estrutura química da quitosana. ... 35

Figura 6: Estrutura química da β-ciclodextrina. ... 36

Figura 7: Estrutura química da molécula de xantana. ... 37

Figura 8: Estrutura química do hidrogel. ... 39

Artigo 1: Microencapsulation of gallic acid in chitosan, β-cyclodextrin and xanthan Figure 1: UV-visible absortion spectra: 1a1, 1a2 and 1a3) GA, 1b1) GA/C physical mixture, 1b2) GA/ β-CDS physical mixture, 1b3) GA/X physical mixture 1c1) GA/C microcapsule, 1c2) GA/ β-CDS microcaosule, and 1c3) GA/X microcapsule. ... 53

Figure 2: SEM micrographs: 2a1) GA, 2b1) C, 2c1) GA/C physical mixture and 2d1) microcapsule. ... 54

Figure 3: SEM micrographs: 3a2) GA, 3b2) β-CDS, 3c2) GA/β-CDS physical mixture and 3d2) GA/β-CDS microcapsule. ... 55

Figure 4: SEM micrographs: 4a2) GA, 4b2) X, 4c2) GA/X physical mixture and 4d2) GA/X microcapsule. ... 56

Figure 5: DSC thermograms: 5a1, 5a2 and 5a3) GA, 5b1) C, 5b2) β-CDS, 5c3) X, 5c1) GA/C physical mixture, 5c2) GA/ β-CDS physical mixture, 5c3) GA/X physical mixture 5d1) GA/C microcapsule, 5d2) GA/ β-CDS microcapsule, and 5d3) GA/X microcapsule. ... 58 Figure 6: TGA thermograms: 6a1, 6a2 and 6a3) GA, 6b1) C, 6b2) β-CDS, 6c3) X, 6c1) GA/C physical mixture, 6c2) GA/ β-CDS physical mixture, 6c3) GA/X

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physical mixture 6d1) GA/C microcapsule, 6d2) GA/ β-CDS microcapsule, and 6d3) GA/X microcapsule. ... 60 Artigo 2: Encapsulação de extrato metanólico de amora-preta (Rubus

fruticosus) rico em compostos fenólicos

Figura 1: Micrografias de MEV nas encapsulações: 1a1) EF, 1b1) β-CDS, 1c1) EF/β-CDS mistura física e 1d1) EF/β-CDS microcápsulas. ... 83 Figura 2: Micografias de MEV nas encapsulações: 2a2) EF, 2b2) Q, 2c2) EF/Q mistura física e 2d2) EF/Q microcrocápsulas. ... 83 Figura 3: Micografias de MEV nas encapsulações: 3a3) EF, 3b3) X, 3c3) EF/X mistura física e 3d4) EF/X microcápsulas. ... 84 Figura 4: Micografias de MEV nas encapsulações: 4a4) EF, 4b4) H, 4c4) EF/H mistura física e 4d4) EF/H microcápsulas. ... 85 Figura 5: Termogramas de DSC: 5a1, 5a2, 5a3 e 5a4) EF, 5b1) β-CDS, 5b2) Q, 5b3) X, 5b4) H, 5c1) EF/β-CDS mistura física, 5c2) EF/Q mistura física, 5c3) EF/X mistura física, 5c4) EF/H mistura física e 5d1) EF/β-CDS microcápsula, 5d2) EF/Q microcápsula, 5d3) EF/X microcápsula, 5d4) EF/H microcápsula. . 86 Figura 6: Termogramas de TGA: 6a1, 6a2, 6a3 e 6a4) EF, 6b1) β-CDS, 6b2) Q, 6b3) X, 6b4) H, 6c1) EF/β-CDS mistura física, 6c2) EF/Q mistura física, 6c3) EF/X mistura física, 6c4) EF/H mistura física e 6d1) EF/β-CDS microcápsula, 6d2) EF/Q microcápsula, 6d3) EF/X microcápsula, 6d4) EF/H microcápsula. . 88

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Lista de Tabelas

Artigo 1: Microencapsulation of gallic acid in chitosan, β-cyclodextrin and xanthan

Table 1: Efficiency of encapsulation and antioxidant activity measurements. .. 51 Artigo 2: Encapsulação de extrato metanólico de amora-preta (Rubus

fruticosus) rico em compostos fenólicos

Tabela 1: Eficiência da encapsulação nas microcápsulas fenólicas. ... 77 Tabela 2: Atividade antioxidante do extrato fenolico e das microcápsulas fenólicas. ... 79 Tabela 3: Transições térmicas do EF, polímeros, misturas físicas e das microcápsulas. ... 88

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Sumário INTRODUÇÃO GERAL...15 Hipoteses...17 Objetivo Geral...17 Objetivo especifico...17 1.1 Amora-preta... 18 1.2 Metabolismo secundário ... 20

1.3 Estrutura dos compostos fenólicos ... 21

1.4 Mecanismo de ação antioxidante dos compostos fenólicos ... 24

1.5 Instabilidade dos compostos fenólicos frente às condições de processamento e armazenamento de alimentos ... 27

1.6 Microencapsulação ... 29

1.7 Revestimentos utilizados na microencapsulação ... 33

1.7.1 Quitosana ... 34

1.7.2 β-ciclodextrina (β-CD) ... 35

1.7.3 Xantana ... 36

1.7.4 Hidrogel ... 37

1.8 Técnicas utilizadas na confirmação da encapsulação ... 39

1.8.1 Microscopia Eletrônica de Varredura-MEV ... 39

1.8.2 Análises térmicas ... 40

1.8.2.1 Calorimetria Diferencial de Varredura-DSC ... 40

1.8.2.2 Análise Termogravimétrica-TGA ... 41

1.8.3 Eficiência da encapsulação ... 41

Microencapsulation of gallic acid in chitosan, β-cyclodextrin and xanthan ... 44

Abstract ... 45

1. Introduction ... 46

2. Material and methods ... 48

2.1 Material... 48

2.2 Preparation of microcapsules of GA with C, β-CDS and X ... 48

2.3 Preparation of the mixture of GA with C, β-CDS and X ... 48

2.4 Physical-chemical evaluations ... 49

2.4.1 Efficiency of encapsulation ... 49

2.4.2 Evaluation of antioxidant activity ... 49

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2.4.4 SEM Analysis ... 50

2.4.5 Differential Scanning Calorimetry Analysis ... 50

2.4.6 Thermogravimetric Analysis ... 50

2.4.7 Statistical analysis ... 50

3. Results and discussion ... 51

3.1 Efficiency of encapsulation ... 51

3.2 Antioxidant activity ... 51

3.3 UV-visible spectroscopic analysis ... 52

3.4 SEM Analysis ... 54

3.5 Differential Scanning Calorimetry (DSC) Analysis ... 57

3.6 Thermogravimetric Analysis ... 59

4. Conclusion ... 60

Acknowledgments ... 60

References ... 61

Encapsulação de extrato metanólico de amora-preta (Rubus fruticosus) rico em compostos fenólicos ... 69

1 Introdução ... 71

2 Material e Métodos ... 73

2.1 Reagentes ... 73

2.2 Obtenção do extrato metanólico de amora preta rico em compostos fenólicos (EF) ... 73

2.3 Obtenção do hidrogel (H) ... 74

2.4 Preparação das microcápsulas com EF na presença de β-CDS, Q, X e H 74 2.5 Preparação da mistura física do EF com β-CDS, Q, X e H. ... 75

2.6 Avaliações físico-químicas ... 75

2.6.1 Eficiência da encapsulação ... 75

2.6.2 Atividade antioxidante ... 75

2.6.3 Liberação controlada simulando o processamento de alimentos ... 76

2.6.4 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 76

2.6.6 Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) ... 76

2.7.7 Análise termogravimétrica (TGA) ... 76

2.8 Análises estatísticas ... 77

3. Resultados e Discussão ... 77

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3.2 Atividade antioxidante ... 78

3.3 Liberação controlada ... 79

Tabela 3: Percentual de liberação dos compostos fenólicos em água a 25 °C 80 3.4 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ... 82

3.5 Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) ... 85

3.6 Análise termogravimétrica (TGA) ... 87

4. Conclusão ... 89 Agradecimentos ... 89 5 Referências ... 90 CONCLUSÕES GERAIS ... 96 REFERÊNCIAS GERAIS ... 97

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INTRODUÇÃO GERAL

A amoreira-preta (Rubus fruticosus) é uma planta que produz frutos de alto valor nutritivo e com valor econômico significativo. Seu cultivo vem crescendo em diversas regiões do Brasil, principalmente no Rio Grande do Sul por apresentar adequação ao clima predominantemente temperado (ANTUNES, 2002).

Os frutos de amora-preta apresentam diferentes fitoquímicos como carotenoides, vitaminas, tocoferois e compostos fenolicos. Dentre estes, os polifenois são os compostos majoritários, e em relação aos compostos fenólicos, o ácido gálico (ácido 3,4,5-trihidróxibenzóico) é encontrado em maior abundância (CHIM, 2008; JACQUES et al., 2010).

Os polifenois atuam como antioxidantes naturais nos alimentos, e proporcionam ao organismo propriedades benéficas, como ação antioxidante, anti-inflamatória e antibacteriana. Existe na literatura uma variedade de estudos pré-clinicos de pesquisas epidemiológicas, sugerindo que polifenois oriundos de vegetais podem retardar os riscos de doenças cardiovasculares, doenças neurodegenerativas, diabetes e osteoporose (CHANWITHEESUK; TEERAWUTGULRAG; KILBURN; RAKARIYATHAM, 2007; HO et al., 2010; JUNG et al., 2010; PAL et al., 2010).

No entanto, a eficácia desses compostos depende da sua preservação e biodisponibilidade, sendo este o grande obstáculo, já que estes compostos são suscetíveis à degradação durante o processamento da fruta quando submetida a diferentes condições de temperatura, luz e oxigênio. Além disto, uma pequena proporção dos compostos permanecem disponíveis após a administração oral, devido sua baixa solubilidade nas condições encontradas no trato gastro-intestinal (pH, enzimas, presença de outros nutrientes) (CHIM, 2008; JACQUES et al., 2010; FANG; BHANDARI, 2011; MAZZEO et al., 2011; SUÁREZ-JACOBO et al., 2011).

Assim, uma alternativa para melhorar a biodisponibilidade destes compostos é a microencapsulação. Este técnica é definida como a tecnologia que protege materiais em uma certa embalagem, seja de natureza sólida, líquida ou gasosa, sob a forma de cápsulas de pequeno tamanho, que são

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seladas e que podem liberar seu conteúdo em quantidades controladas sob certos estímulos. A liberação controlada faz com que o composto encapsulado seja liberado no local, tempo e taxa desejada. Algum dos mecanismos de liberação são a mudança na temperatura, umidade ou pH, aplicação de pressão ou de cisalhamento e adição de surfactantes (GOUIN, 2004; RAI et al., 2009; FANG; BHANDARI, 2010; NEDOVIC, 2011).

A composição do material de revestimento é um dos principais determinantes das propriedades funcionais da microcápsula, e de como ela pode ser usada para melhorar o desempenho de um determinado composto ativo (DESAI; PARK, 2005).

Biopolímeros como a ciclodextrina têm sido utilizados para microencapsular frações de compostos fenólicos extraídos de vegetais como

Hypericum perforatum (KALOGEROPOULOS et al., 2010), e também

compostos fenólicos puros como a quercitina, ácido ferúlico e kaempferol (PRALHAD; RAJENDRAKUMAR, 2004; BERGONZI et al., 2007; WANG; CAO; SUN; WANG, 2011). Entretanto, estes biopolímeros ainda não foram utilizados para encapsular frações fenólicas de amora-preta e de ácido gálico puro. A quitosana tem sido utilizada para encapsular extratos fenólicos obtidos de fontes naturais, como da erva mate (DELADINO; ANBINDER; NAVARRO; MARTINO, 2008; HARRIS et al., 2011). Não existem relatos na literatura sobre a encapsulação de polifenois de amora-preta com quitosana e/ou compostos isolados. Em relação à goma xantana e o hidrogel, formado pelo sinergismo entre xantana e quitosasna, não existem relatos da encapsulação de compostos fenólicos.

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Hipoteses

É possível microencapsular o ácido gálico e o extrato fenólico de amora-preta nas matrizes de β-ciclodextrina, quitosana, xantana e hidrogel.

A microencapsulção mantém a atividade antioxidante dos compostos encapsulados e propicia a sua liberação controlada.

Objetivo geral

Encapsular frações metanólicas ricas em compostos fenólicos extraídas de amora-preta, e encapsular o composto majoritário presente na amora-preta (ácido gálico), ambos nas matrizes de quitosana, β-ciclodextrina e xantana, pelo método de liofilização. Os extratos fenólicos também foram encapsulados na matriz hidrogel (xantana/quitosana).

Objetivos específicos

Confirmar a encapsulação por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC), Análise Termogravimétrica (TGA) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).

Investigar a eficiência de encapsulação, a capacidade antioxidante das microcápsulas e a liberação controlada dos componentes encapsulados.

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1 Revisão da Literatura 1.1 Amora-preta

A amoreira-preta é uma espécie nativa do Brasil, mas o seu cultivo comercial iniciou a partir da década de 70 por pesquisadores da Embrapa Clima Temperado (CPACT/Pelotas-RS), através de cultivares oriundas dos EUA. Inicialmente foram introduzidas três cultivares: Brazos, Cherokee e Comanche. Os estudos avançaram por volta dos anos 80 com o plantio de novas cultivares oriundas da Universidade do Arkansas: Ébano (1981), Negrita (1983), Tupy e Guarani (1998), Caingangue (1992) e Xavante (2004) (SANTOS; RASEIRA; MADAIL, 1997).

A cultura de amoreira-preta vem se destacando no estado do Rio Grande do Sul, principal produtor brasileiro, sendo produzida também em outros estados como Santa Catarina, Paraná e na região serrana de Minas Gerais e São Paulo. No Rio Grande do Sul, os principais municípios produtores são Campestre da Serra, Ipê e Vacaria (ANTUNES; CHALFUN; REGINA, 2000; PAGOT, 2010).

As vantagens encontradas pelos agricultores para a sua produção é o baixo custo de implantação, reduzida utilização de defensivos agrícolas e por apresentar-se como uma cultura de retorno rápido. Apresenta ainda boa adaptação em climas temperados, onde há predominância de temperaturas médias no verão, com intensidade luminosa moderada, chuvas frequentes e sem excesso durante o período de frutificação, e temperaturas baixas no inverno, que coincide com a fase de dormência da planta, propiciando um bom índice de brotação (ANTUNES, 2002).

O fruto de amora-preta da cultivar Guarani (Figura 1) foi selecionado no Brasil a partir de cruzamentos realizados nos EUA (Arkansas) entre as variedades ‘Lawton’ x (‘Darrow’ x ‘Brazos’) x (‘Shaffer Tree’ x ‘Brazos’). Esta cultivar apresenta porte ereto, vigorosa e com espinhos, sendo pertencente à família das Rosaceae, gênero Rubus e que floresce ao final de agosto e durante todo mês de setembro ou até o início de outubro. Produz frutos agregados (denominados minidrupas), que pesam cerca de 5 gramas, de coloração negra, aroma ativo e sabor doce ácido, sendo caraterizado como um

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fruto climatérico (RASEIRA; SANTOS 1984). Físico-quimicamente o fruto apresenta, aproximadamente, 87% de água, 7% de carboidratos, sabor equilibrado (acidez/açúcar), consistência firme, película resistente, teor de sólidos solúveis entre 8 e 9 ºBrix, alguns minerais como cálcio, potássio, sódio, ferro e fósforo e baixo valor calórico, com apenas 32 calorias em 100 g de fruta (POLING, 1996; CHIM, 2008). Apresenta também fitoquímicos como carotenoides, vitaminas, tocoferois e compostos fenólicos (CHIM, 2008).

Figura 1: Frutos de amoreira-preta cultivar Guarani. Fonte: Arquivos do autor.

O consumo de amora-preta no Brasil ainda é limitado na forma in natura, devido à falta de estrutura de resfriamento e logística de comercialização pelos produtores. No entanto, uma pequena parcela de produtores na região de Vacaria já vem explorando o mercado interno e externo.

A maior demanda da fruta ainda é na forma de produtos como geleias, sucos, néctar e polpas. A aplicação de tecnologias é uma forma facilitadora do consumo de amora, devido a dificuldades de conservação, por se tratar de um fruto climatérico e com alta concentração de água. Frutos climatéricos, após a

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colheita, apresentam um pico de respiração e significativo incremento na produção do hormônio vegetal etileno, o qual é o principal agente promotor do amadurecimento e senescência em frutos. Entretanto, a utilização de tecnologias para a conservação de frutos, provocam a degradação parcial dos compostos bioativos, como demonstrado em estudos com geleias (MOTA, 2007; CHIM, 2008), sucos (GRANADA, VENDRUSCULO e TREPTOW, 2001; MOTA, 2006), néctar (LEITÃO, 2007) e polpas (JACQUES, 2010).

1.2 Metabolismo secundário

As plantas e os organismos sésseis, que não apresentam capacidade de locomoção em casos de perigo ou que não possuem um sistema imunológico no combate a patógenos, são capazes de sintetizar uma enorme variedade de compostos de baixo peso molecular, denominados metabólitos secundários (MS). Esses compostos podem agir como protetores biológicos de herbívoros e de estresses abióticos ambientais, como da radiação UV. Apesar da enorme variedade de MS, a origem das vias biossintéticas é bastante diferenciada. Os precursores geralmente derivam de vias metabólicas básicas como da glicólise, do ciclo de Krebs ou pela via do chiquimato (WINK, 2010).

A planta de amoreira-preta produz frutos com uma variedade de produtos naturais como carotenoides, vitaminas, tocoferois e compostos fenólicos. Os compostos fenólicos constituem um grupo quimicamente heterogêneo, com aproximadamente 10.000 compostos, onde são agrupados em diferentes classes, de acordo com a sua estrutura química básica, podendo ser subclassificados em flavonoides (flavonas, flavonois, flavanonas, flavanonais, flavanois, antocianidina, isoflavonas, e chalconas) e não flavonoides (ácidos fenólicos) (ANDERSEN; MARKHAM, 2010; FRAGA, 2010).

Os principais compostos fenólicos encontrados na amora-preta cultivar Guarani são a quercitina (flavonol), catechina e epicatechina (flavanois), e os ácidos gálico, þ-hidroxibenzóico, elágico e cafeico (não flavonoides) (CHIM, 2008).

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1.3 Estrutura dos compostos fenólicos

Os compostos fenólicos podem ser encontrados em todas as partes do vegetal, mas encontram-se distribuídos em quantidades diferenciadas em cada uma delas, podendo estar mais concentrados nos frutos e nas folhas. O tipo e a variedade de polifenois variam com o estádio de desenvolvimento da planta, grau de maturação, condições ambientais, solo e manejo (TAIZ; ZEIGER, 2004).

A estrutura desses compostos é bastante diversificada, podendo variar desde moléculas simples, contendo um único anel aromático hidroxilado, a moléculas complexas na forma de polímeros.

Os flavonoides (Figura 2) são compostos que possuem o mesmo núcleo flavona C15 (C6-C3-C6), com duas moléculas de benzeno (A e B) ligadas através

de um oxigênio contendo um anel pirano (C). Esta estrutura básica é comum para flavonas, flavonois, flavanonas, flavanonais, flavanois, antocianidina, isoflavonas, e chalconas (de la ROSA; ALVAREZ-PARRILLA; GONZÁLEZ-AGUILAR, 2010).

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Figura 2: Estrutura química dos flavonoides.

Fonte: Adaptado de de la ROSA, ALVAREZ-PARRILLA, GONZÁLEZ-AGUILAR, 2010.

O anel C dos flavonois apresenta uma dupla ligação entre as posições 2 e 3, uma cetona na posição 4 e um grupamento hidroxila na posição 3 do segundo anel. Este grupamento 3-hidroxila é encontrado mais comumente em

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frutas e hortaliças na forma glicosilada. Semelhante às flavonas estas agliconas são altamente diversificada em hidroxilação e padrões de metilação. Os flavonois agliconas mais comum são a quercetina e o kaempferol (de la ROSA; ALVAREZ-PARRILLA; GONZÁLEZ-AGUILAR, 2010; FRAGA, 2010).

Os flavanois são normalmente denominados de flavan-3-ois, pois o grupamento OH esta quase sempre ligado na posição 3 do anel C; ou ainda são denominados como catequinas. Os flavanois não apresentam grupamentos cetonicos como os flavanonois e podem apresentar-se como dois epímeros dependendo da estereo configuração entre o anel B e a posição 2 do carbono, e o grupamento hidroxila na posição 3. Estes dois epímeros, (-) epicatequina e (+) catequina, e seus respectivos derivados epigalocatequina e galocatequina são conjuntamente categorizados como flavanois. Galocatequina e epigalocatequina apresentam um grupamento hidroxila extra no anel B. Muitas frutas e hortaliças apresentam flavanois e seus ésteres de ácido gálico. Outra característica importante dos flavanois é sua capacidade de formar polímeros, sendo muitas vezes referidos como procianidinas, proantocianidinas ou taninos condensados (de la ROSA; ALVAREZ-PARRILLA; GONZÁLEZ-AGUILAR, 2010; FRAGA, 2010).

Os ácidos fenólicos são subclassificados em dois grandes grupos: ácidos hidroxibenzoicos e ácidos hidroxinâmicos. Os ácidos hidroxibenzoicos apresentam uma estrutura geral C6-C1 (Figura 3), derivado do ácido benzoico.

Variações na estrutura encontram-se nas hidroxilações e metilações do anel aromático (TSAO, 2010).

Figura 3: Estrutura química dos ácidos fenólicos: a) ácidos hidroxibenzoicos: p-hidróxibenzoico, R1 = H, R2 = H; ácido gálico, R1 = OH, R2 = OH. b) ácidos hidroxicinâmicos: ácido p-cumárico R1 = H; ácido cafeico R1 = OH; ácido ferúlico R1 = OCH3

Fonte: TSAO, 2010.

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Originados do ácido hidroxibenzoico derivam os ácidos: þ-hidroxibenzoico, vanílico, siríngico, salicílico (2-hidroxibenzoato), gálico e elágico. Esses compostos podem se apresentar nas células na forma solúvel, conjugado com açúcares ou com ácidos orgânicos, ou constituindo a parece celular juntamente com ligninas. O ácido gálico é um derivado trihidroxil, que constitui os galotaninos hidrolisáveis, onde o produto de sua condensação dímera forma o ácido elágico. Os ácidos hidroxicinâmicos são þ-cumárico, cafeico, ferúlico e ácido cinapico. Estes compostos ocorrem normalmente na sua forma conjugada como ésteres de hidroxiácidos como o chiquimico e tártarico e também de forma pura (RICE-EVANS; PACKER, 2003).

1.4 Mecanismo de ação antioxidante dos compostos fenólicos

O extresse oxidativo é um estado de desequilíbrio, em que quantidades excessivas de oxigênio ou nitrogênio reativos (ROS e RNS, ânion superóxido, peróxido de hidrogênio), levam a oxidação de macromoléculas como enzimas, proteínas, DNA e lipídeos (DIMITRIOS, 2006). A molécula de O2 no seu estado

fundamental é um radical, uma vez que contém dois elétrons desemparelhados no último orbital, reagindo lentamente com os componentes celulares que não possuem elétrons desemparelhados. Entretanto, é a reação do O2 com íons de

metais de transição e radicais livres, produzidos de forma endógena no organismo (elétrons que podem escapar da cadeia transportadora de elétrons, sistemas enzimáticos, células imunes e exposição a radiações ionizantes), que levam a formação de ROS e iniciam reações em cadeia, atacando biomoléculas. Dessa forma, embora certo nível de ROS esteja envolvido na regulação dos processos fisiológicos, o excesso na produção destes compostos leva a superestimação de algumas vias intracelulares, associando ao aparecimento de diversas doenças (CERQUEIRA; GENNARI; AUGUSTO, 2007; RODRIGO; MIRANDA; VERGARA, 2011; CHOI; LEE; HONG; LEE, 2011).

A ação dos antioxidantes é de retardar, inibir ou evitar a oxidação dos compostos oxidáveis com a inativação dos radicais livres, o que leva a redução do extresse oxidativo. As propriedades antioxidativas dos compostos fenólicos podem ser medidas avaliadas por mecanismos de inativação de radicais como

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ROS; formação de ROS suprimindo ou inibindo algumas enzimas ou metais traços quelantes envolvidos na produção de radicais livres; ou ainda regulando e protegendo as defesas antioxidantes (COTELLE, 2001; FRAGA; GALLEANO; VERSTRAETEN; OTEIZA, 2010). Os polifenois (POH) apresentam hidroxilas fenólicas que são propensas a doar um átomo de hidrogênio ou um elétron para o radical livre (R) e promover a organização do elétron desemparelhado pela ressonância do anel (Eq.1). A ação antioxidativa dos compostos fenólicos na presença do radical livre depende de sua estrutura.

R + POH → RH + PO . Eq. (1)

Os radicais intermediários fenoxi (PO .) são relativamente estáveis

devido a ressonância, e portanto uma nova reação em cadeia não é facilmente iniciada. Além disso, os radicais fenoxi atuam como terminadores de propagação, reagindo com outros radicais livres (Eq.2).

PO. + R .POR Eq. (2)

A ação antioxidante dos ácidos fenólicos e de seus ésteres depende do número de hidroxilas livres na molécula e de seu impedimento estérico. Neste caso, o ácido hidroxicinâmico demonstra-se mais eficaz que ácido hidroxibenzoico, devido ao efeito de estabilização do radical ariloxi do grupo CH=CH-COOH- ligado ao anel fenila por ressonância. Para os flavonoides,

como a quercetina, os principais fatores que determinam a reação com os radicais livres são: a estrutura orto-dihidroxi no anel B que tem propriedades de doador de elétrons, o que confere maior estabilidade a forma do radical e participa da deslocalização de elétrons; a dupla ligação nos carbonos 2 e 3, com a função oxo no carbono 4 do anel, que é responsável pela deslocalização eletrônica do anel B; os grupos hidroxil ligados nos C3 e C5 com a função oxo no carbono 4 nos anéis A e C, que são essenciais para a neutralização dos radicais livres; e o grupo hidroxila no carbono 3, que apresenta importante atividade antioxidante, sendo que as glicosilações no C3 podem reduzir a sua atividade antioxidante (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996; RYAN; HYNES, 2007; GALLEANO; VERSTRAETEN; OTEIZA; FRAGA, 2010).

A ação antioxidante in vivo e in vitro dos compostos fenólicos presentes no néctar de amora-preta foi estudada por Araújo (2009). O potencial antioxidante in vitro permaneceu estável no período de 90 dias sob

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armazenamento refrigerado, e nos estudos in vivo foram capazes de reduzir a iniciação das reações de peroxidação lipídica em ratos hamster.

Outra propriedade antioxidante de alguns compostos fenólicos com grupamentos dihidroxi, encontrada no processamento de alimentos, é sua capacidade de conjugar metais de transição, impedindo a formação de radicais livres, induzida por metais. O desencadeamento dessas reações de oxidação ocorre quando íons metálicos ativos como Cu+ ou Fe2+ interagem com o H2O2

para formar o radical OH. (Equação 3), que é o ROS mais reativo, já conhecido,

sendo capaz de iniciar reações em cadeia por abstrair radicais H,a partir de qualquer molécula. Compostos fenólicos como grupos galatos e catecois podem inibir a oxidação induzida por metais e a formação de radicais de oxigênio, por coordenação com Fe2+,aumentando a auto-oxidação de Fe2+, ou formação de complexos inativos de Cu2+, Fe2+ e Cu+, com interação mais fraca (MILLER; CASTELLUCCIO; TIJBURG; RICE–EVANS, 1996; SAKIHAMA; COHEN; GRACE; YAMASAKI, 2002; KHOKHAR; APENTEN, 2003; JOMOVA; VALKOB, 2011).

H2O2 + Cu+ ou Fe2+ → Cu2+/Fe3+ + -OH + ·OH- Eq. (3)

Figura 4: Mecanismo de ação antioxidante dos compostos fenólicos frente a metais de transição.

Fonte: DAI; MUMPER, 2010.

Além de agirem como antioxidantes, alguns compostos fenólicos podem iniciar um processo de auto-oxidação e comportarem-se como pró-oxidantes. Pró-oxidantes são substâncias endógenas ou exógenas que possuem a capacidade de oxidar moléculas-alvo. Os polifenois apresentam essas características na presença de condições que favoreçam sua auto-oxidação, como pH do meio elevado e altas concentrações no meio de íons de metais de transição e de moléculas de oxigênio (HALLIWELL, 2008). Compostos fenólicos de baixo peso molecular, como quercetina e ácido gálico, possuem

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atividades pró-oxidantes, enquanto polifenois de elevado peso molecular, como taninos condensados e hidrolisados, apresentam pouca ou nenhuma atividade pró-oxidante (HAGERMAN et al., 1998).

Ao invés de ocorrer uma reação de redução, em que ocorre a terminação de um radical livre, por ação de um segundo radical, na autoxidação o radical fenoxi pode interagir com o oxigênio e produzir quinonas (P=O) e o ânion superóxido (O2. -). Íons de metais de transição podem também induzir a ação pró-oxidante de polifenois (DAI; MUMPER, 2010) (Eq.4).

PO· + O2→ P=O + O2· -

Cu2+ ou Fe3+ + POH → Cu+ ou Fe2+ + PO· + H+

PO· + RH → POH + R· R· + O2 → ROO·

ROO· + RH → ROOH + R·

ROOH + Cu+ ou Fe2+ → Cu2+ ou Fe3+ + RO· + OH- Eq. (4)

1.5 Instabilidade dos compostos fenólicos frente às condições de processamento e armazenamento de alimentos

Os polifenois, como mencionado anteriormente, apresentam em sua estrutura uma variedade de grupamentos químicos capazes de agirem como antioxidantes, contribuindo para o benefício da saúde. Uma alternativa na indústria de alimentos é a substituição dos antioxidantes e corantes sintéticos por estes compostos naturais extraídos de vegetais. Porém, estes compostos apresentam certa instabilidade nas condições de processamento e armazenamento de alimentos.

Jacques (2010) avaliou a estabilidade ao armazenamento dos fitoquimicos, presentes em polpas de amora-preta, sob as temperaturas de -10ºC, -18ºC e -80ºC, por 6 meses. Nesse estudo, a autora concluiu que o conteúdo de fenois totais permaneceu inalterado em todas as temperaturas utilizadas durante 4 meses de armazenamento. Os fenois individuais apresentaram instabilidade durante o armazenamento, sendo o ácido cafeico, o composto fenólico que apresentou maior sensibilidade nas diferentes temperaturas avaliadas. O conteúdo antociânico total demonstrou-se inalterado

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nos 6 meses de armazenamento a – 80 ºC, porém em – 10ºC e -18 ºC apresentou decréscimo após 4 meses de estocagem.

O perfil de compostos fenólicos de amora-preta no processamento e armazenamento de geleias light e convencionais foi avaliado por Chim (2008). Durante o processo de elaboração das geleias ocorreu uma degradação parcial de todos os compostos fitoquímicos avaliados; no entanto, esta degradação foi menos intensa na elaboração de geleia light. Durante o armazenamento o composto fenólico que apresentou maiores perdas foi a catechina, nas duas formulações de geleia.

Suárez-Jacobo et al. (2011) avaliaram uma nova tecnologia no processamento de sucos de maçã (ultra-pressão de homogeneização-UHPH), com intuito de preservar os fitoquímicos e substituir processos térmicos de pasteurização. Nas avaliações de atividade antioxidante determinadas por FRAP (método de redução por ferro) e DPPH (atividade sequestradora do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila) não observou-se alteração da atividade antioxidante em função do processamento utilizado; no entanto, a determinação da atividade antioxidante por TEAC (capacidade antioxidante equivalente ao trolox) e por ORAC (capacidade de absorção de radicais oxigênio) demonstraram diferenças significativas entre os processamentos. Quanto ao teor total de fenois e o conteúdo individual o autor concluiu que UHPH é um processamento promissor para substituir a pasteurização, e preservar a qualidade do suco de maçã.

O efeito da cocção e do vapor sobre o conteúdo fenólico de vegetais congelados (cenoura, couve-flor e espinafre) foi avaliado no estudo realizado por Mazzeo et al. (2011). Os vegetais tratatos com vapor apresentaram aumento do conteúdo fenólico; no entanto, a fervura apresentou um efeito marcante no padrão nutricional dos vegetais congelados em comparação ao vapor, levando a uma perda acentuada dos fitoquímicos.

Fang e Bhandari (2011) estudaram o efeito da secagem por spray drying de sucos de bayberry e a conservação dos fitoquímicos em umidade controlada por um período de armazenamento de 6 meses. Foi possível concluir que o conteúdo total de fenois e de antocianinas foi retido durante o processo de secagem, demonstrando que esta técnica é satisfatória para manter a conservação dos fitoquímicos. Os produtos na forma de pós de bayberry com

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Aw entre 0,11 e 0,44, armazenados por 6 meses em temperatura de 5 ºC, apresentaram um decréscimo de 6 a 8 % no conteúdo de fenois e de 7 a 27% no conteúdo de antocianinas, respectivamente. Em temperatura de 25 ºC os compostos bioativos apresentaram um decréscimo de 6% e 9% para compostos fenólicos e de 9% e 37% para compostos antocianicos; e em 40 ºC ocorreu uma redução de 7% e 37% para fenois e de 9 % e 34 % para antocianinas, respectivamente. As antocianinas foram os fitoquímicos mais facilmente degradados em relação aos outros compostos fenólicos.

1.6 Microencapsulação

Os fitoquímicos, incluindo os compostos fenólicos, em geral apresentam instabilidade durante o processamento e armazenamento de alimentos. Uma forma de manter a estabilidade desses compostos até que sejam liberados nos sítios onde a absorção é desejada ou durante o processamento, é a microencapsulação (RAI et al., 2009; FANG; BHANDARI, 2010).

A microencapsulação é definida como a tecnologia que protege materiais em uma certa embalagem, seja de natureza sólida, líquida ou gasosa, na forma de cápsulas de pequeno tamanho, que são seladas e que podem liberar seus conteúdos em quantidades controladas sob certos estimulos. A forma e tamanho das microcápsulas dependem da estrutura do composto a ser encapsulado. As microcápsulas mais simples podem consistir em um núcleo rodeado por uma parede ou uma barreira de espessura uniforme ou não uniforme. O núcleo pode ser composto por apenas um ou diferentes tipos de ingredientes, e o material de parede ou revestimento pode ser único ou de múltiplas camadas (GOUIN, 2004; NEDOVIC, 2011).

Em relação à estrutura, as cápuslas podem ser classificadas em dois grupos: microcápsulas e microesferas. São consideradas microcápsulas quando o núcleo é nitidamente concentrado na região central, circundado por um filme definido e contínuo do material de parede; e microesferas quando o núcleo é uniformemente disperso em uma matriz (AZEREDO, 2005; DESAI; PARK, 2005).

A encapsulação tem como objetivos, dependendo do composto encapsulado, reduzir a reatividade do núcleo com o ambiente, propiciar a

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liberação controlada, diminuir a velocidade de evaporação ou de transferência do material do núcleo para o meio, facilitar a manipulação do material encapsulado, mascarar sabor e odor desagradáveis ou de promover a diluição homogênea do material encapsulado em uma formulação alimentícia (SCHROOYEN; VAN DER MEER; DE KRUIF, 2001).

Para garantir a proteção do núcleo existe uma variedade de técnicas de encapsulação, que deve ser escolhida de acordo com as propriedades do material de parede e dos compostos a serem encapsulados.

A liofilização é a técnica mais eficiente para proteger contra a decomposição química, minimizar perdas de atividade devido a baixa temperatura de processamento e reduzir o teor de umidade para níveis muito baixos, quando comparados a outros métodos como de coprecipitação, neutralização, atomização e evaporação de solvente (YAMADA et al., 2000).

A técnica de liofilização consiste no congelamento do material, seguida de uma redução de pressão e adição de calor suficiente para permitir que a água contida no material congelado passe diretamente do estado sólido para o gasoso (sublimação). A encapsulação por liofilização é conseguida por uma homogeneização do núcleo em uma matriz polimérica, seguida de congelamento e secagem. Esta encapsulação, geralmente, resulta em cápsulas de formas incertas (GIBBS; KERMASHA; ALLI; MULLIGAN, 1999).

Assim, esta técnica permite proteger o núcleo da exposição ao oxigênio, luz, umidade, etc. Como ingredientes alimentares suceptíveis a degradação por tais condições incluem-se aromas, sabores, pigmentos, nutrientes, adoçantes, enzimas, conservantes, antioxidantes, etc. Estes ingredientes podem ser encapsulados na presença de carboidratos, lipídeos e/ou proteínas (CHAMPAGNE; FUSTIER, 2007).

A liberação controlada é definida como um método pelo qual um ou mais agentes ativos ou ingredientes são liberados no local, tempo e taxa desejada. É uma tecnologia inovadora que pode aumentar a eficácia de muitos ingredientes, assim o desempenho de ingredientes naturais pode ser melhorado, e oferece alternativas viáveis para a utilização de aditivos químicos (POTHAKAMURY; BARBOSA-GNOVAS, 1995).

Alguns dos mecanismos de liberação combinam os seguintes estímulos: mudança na temperatura, umidade ou pH, aplicação de pressão ou de

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cisalhamento e adição de surfactantes (FAVARO-TRINDADE; PINHO; ROCHA, 2008).

São poucos os estudos envolvendo a microencapsulação de compostos fenólicos extraídos de fontes naturais, sendo mais abrangente a encapsulação de compostos já purificados comercialmente. A maioria dos estudos já realizados são baseados na síntese e caracterização das cápsulas, liberação controlada, eficiência de encapsulação, atividade antioxidante em escala analítica e solubilidade. Há poucos estudos de aplicação de cápsulas em ensaios in vivo e no processamento de alimentos.

Pralhad e Rajendrakumar (2004) avaliaram a inclusão de quercitina em 2-hidroxipropil-βciclodextrina e β-cilcodextrina pelo método de liofilização. Os complexos de inclusão com quercetina aumentaram 10 vezes a sua solubilidade, quando comparado ao composto puro. A formação dos complexos foi confirmada por técnicas de FTIR, MEV e Raio-X.

O microencapsulamento do extrato de folhas de oliveira em quitosana pela técnica de spray-drier foi estudado por Kosaraju, D’ath e Lawrence (2006). A confirmação da encapsulação foi realizada pelas técnicas de DSC e FTIR, indicando que há interação dos compostos fenólicos com a quitosana. A eficiência de encapsulação foi de 27%.

A estabilidade no armazenamento de microcápsulas de compostos fenólicos extraídos de amora silvestre (cloudberry) na presença de maltodextrina, obtidas por liofilização foram avaliadas por Laine (2008) e seus colaboradores. A microencapulação melhorou a estabilidade dos compostos fenólicos durante o armazenamento.

Deladino, Anbinder, Navarro e Martino (2008) avaliaram a encapsulação de compostos fenólicos presentes em extratos aquosos de erva mate (Ilex

paraguensis) pelos métodos de coacervação simples e complexa, nas matrizes

de alginato de cálcio e alginato de cálcio-quitosana. As cápsulas de alginato de cálcio apresentaram retenção de 85% dos polifenois; no entanto, as cápsulas de alginato-quitosana apresentaram eficiência de encapsulação de 50%, devido a perdas ocorridas durante a imersão em quitosana. Resultados eficientes de cinética de liberação foram obtidos com a combinação dos polímeros alginato-quitosana.

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Harris et al. (2010) promoveram a formação de nanopartículas e microesferas de compostos fenólicos extraídos de erva-mate (Ilex paraguensis) na matriz de quitosana. Os dois sistemas de encapsulamento proporcionaram estabilidade dos polifenois, mantiveram atividade antioxidante e apresentaram liberação dos compostos antioxidantes. Sendo estas técnicas promissoras para aplicações nutracêuticas e na produção de comésticos.

Extratos ricos em compostos fenólicos extraídos de Hypericum

perforatum foram encapsulados com β-ciclodextrina por liofilização

(Kalogeropoulos et al., 2010). A encapsulação foi confirmada pelas técnicas de DSC e RMN, sendo a eficiência de encapsulação de 27,5, 30 e 35% para catequina, epicatequina, e quercetina, respectivamente. Assim, os autores concluíram que a encapsulação melhora a estabilidade térmica dos antioxidante presentes na erva.

Zheng et al. (2011) avaliaram a microencapsulação do extrato fenólico de bayberry em etil celulose, pelo método de separação de fases. De acordo com seus resultados, a atividade antioxidante e a estabilidade durante a estocagem dos polifenois foi protegida pela encapsulação. As microcápsulas apresentaram superfície lisa de tamanho de 10 a 97µm. A taxa de liberação dos polifenois das microcápsulas sob fluido gástrico foi de 2,56 a 15,14%, e no fluido intestinal a taxa de liberação foi de até 87,37%.

A microencapsulação do ácido trans-ferúlico na matriz de hidroxipropil-β-ciclodextrina, por liofilização, foi estudada por Wang, Cao, Sun e Wang (2011). Os resultados das análises de espectroscopia UV/visível e FTIR, DSC, difratometria de raios X e microscopia eletrônica de varredura comprovaram a encapsulação. A solubilidade e estabilidade do ácido ferúlico foram melhoradas; entretanto, a decomposição induzida pela irradiação foi reduzida no complexo de inclusão.

Naringina e quercetina foram microencapsuladas na presença de celulose acetato ftalato, em estudos realizados por Sansone (2011) e colaboradores, pela técnica de spray drier. Foi avaliada no período de 12 meses a estabilidade durante o armazenamento e a atividade antioxidante. A microencapsulação aumentou a estabilidade e a preservação das propriedades antioxidantes.

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1.7 Revestimentos utilizados na microencapsulação

Os revestimentos utilizados na microencapsulação são, principalmente, polissacarídeos puros ou associados a proteínas, lipídeos e fosfolipídeos. Os polissacarídeos diferem um do outro quimicamente em termos do tipo, número e sequência dos monossacarídeos que compõem a cadeia polimérica. Essas diferenças irão interferir nas propriedades moleculares como peso molecular, grau de ramificação, estrutura, flexibilidade, carga elétrica, tipos de interações e também nas propriedades funcionais como de espessantes, solubilidade, gelificação, capacidade de retenção de água, emulsificação e digestibilidade (ZELLER; SALEEB; LUDESCHER, 1999).

A escolha do agente encapsulante depende de uma série de fatores, entre eles a não reatividade com o material a ser encapsulado, o processo utilizado para a formação da microcápsula e o mecanismo de liberação. O encapsulante ideal deve apresentar baixa viscosidade em concentrações elevadas e ser de fácil manipulação durante o processo; possuir baixa higroscopicidade, para facilitar a manipulação e evitar aglomeração; não ser reativo com o material a ser encapsulado; apresentar a propriedade de selar e reter o material ativo dentro da estrutura da cápsula; liberar completamente o solvente ou outros materiais utilizados durante o processo de encapsulação; proporcionar máxima proteção ao material ativo contra condições adversas, tais como luz, pH, oxigênio e ingredientes reativos; ser solúvel em solventes comumente usados; possuir as propriedades desejadas de liberação do material ativo; não apresentar sabor desagradável no caso de consumo oral; e ser econômico (TOLSTOGUZOV, 2004; PARK; YE; PARK, 2005).

É importante conhecer as características elétricas dos polissacarídeos, para que a associação entre os polissacarídos possa ser realizada. Alguns polissacarídeos são neutros (amido, celulose), outros são aniônicos (alginato, carragena, xantana e goma arábica) ou catiônicos (quitosana). Os grupamentos mais importantes em polímeros, geralmente, são os grupamentos sulfato na carragena, grupo carboxila na pectina, alginato na xantana e carboximetilcelulose e grupamentos amino na quitosana (AGNIHOTRI; MALLIKARJUNA; AMINABHAVI, 2004).

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1.7.1 Quitosana

A quitosana apresenta-se como um biopolímero catiônico obtido a partir da desacetilação da quitina (poli-N-acetil-2-amino-2desoxi-D-glicopiranose). É formado por unidades de 2-desoxi-N-acetil-D-glicosamina e 2-desoxi-D-glicosamina unidos por ligações glicosídicas β-1→4. A quitina é originada da estrutura do exoesqueleto de crustáceos, insetos, moluscos e parede celular de fungos. Este polímero é acetilado, sendo a quitosana a sua forma desacetilada. Desta forma, qualquer polímero de quitina que possua um grau de desacetilação maior do que 40% pode ser considerado quitosana (KUMAR, 2000).

Estruturalmente, a quitosana possui em sua cadeia polimérica três grupos funcionais reativos (Figura 5): O grupo amino na posição C-2; o grupo hidroxila na posição C-6; e o grupo hidroxila secundário na posição C-3. Os grupos amino presentes em toda a extensão da cadeia polimérica, propiciam a quitosana um caráter de polieletrólito catiônico (pKa ≥ 6,5), fazendo com que o polímero seja solúvel em soluções com o pH < 6,5 e possa reagir com muitas superfícies/polímeros negativamente carregados. Este polissacarídeo é uma base fraca, sendo insolúvel em água e solventes orgânicos, porém é solúvel na maior parte dos ácidos orgânicos, como por exemplo, em ácido acético e fórmico e também em ácidos inorgânicos como o ácido clorídrico (SHAHIDI; ARACHCHI; JEON, 1999).

Dessa forma, devido suas próprias características como caráter catiônico, não toxicidade, abundância, hidrofilicidade, biodegradabilidade, biocompatibilidade e propriedades antibacterianas, a quitosana tem sido alvo de uma variedade de estudos nas áreas de química, biotecnologia e tecnologias em geral (AGNIHOTRI; MALLIKARJUNA; AMINABHAVI, 2004).

A quitosana apresenta um grande potencial para aplicações na indústria farmacêutica como encapsulante de drogas lipofílicas (RIBEIRO; NEUFELD; ARNAUD; CHAUMEIL, 1999) e de alimentos como encapsulante de probioticos e prebioticos (CHÁVARRI et al., 2010), aromas (HIGUERA-CIAPARA; FELIX-VALENZUELA; GOYCOOLEA; ARGU¨ELLES-MONAL, 2003), enzimas (ANJANI; KAILASAPATHY; PHILLIPS, 2007), antioxidantes (WEERAKODY; FAGAN; KOSARAJU, 2008), etc. Esse biopolimero já foi utilizado para

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microencapsular compostos fenólicos extraídos de plantas (DELADINO; ANBINDER; NAVARRO; MARTIN, 2008; HARRIS et al., 2010), entretanto inexistem estudos com a utilização desse polímero para encapsular compostos fenólicos de amora-preta e ácido gálico puro.

Figura 5: Estrutura química da quitosana. Fonte: KUMAR, 2000.

1.7.2 β-ciclodextrina (β-CD)

A ciclodextrina consiste em oligômeros cíclicos de α-D-glicose unidos por ligações glicosídicas, sendo produzida pela transformação do amido por certas bactérias, como Bacillus macerans (SZENTE; SZEJTLI, 2004). A β-ciclodextrina é um oligossacarídeo cíclico cuja estrutura é formada por sete unidades de glicose, dispostas de maneira que a molécula assuma forma de cilindro oco com extremidades abertas (Figura 6). A cavidade da β-ciclodextrina possui caráter hidrofóbico, enquanto a superfície apresenta caráter hidrofílico. Essa propriedade permite que a solubilidade das moléculas encapsuladas seja aumentada através da formação dos complexos de inclusão (ASTRAY et al., 2009).

No momento que uma molécula hóspede (polifenol), de natureza apolar ou semi-apolar, ocupa o lugar da água, o sistema torna-se energicamente mais favorável e, portanto, mais estável do ponto de vista termodinâmico, formando ligações do tipo não covalente. Fatores como tamanho, geometria, polaridade da estrutura a ser encapsulada são decisivos para a obtenção de complexos.

As CDs são comumente utilizadas para proteger o sabor e aroma de alimentos (YULIANI et al., 2006), vitaminas (GONNET; LETHUAUT; BOURY,

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2010; NEVADO; PULGARÍN; LAGUNA, 2000), antioxidantes (WANG; CAO; SUN; WANG, 2011), pigmentos lipossolúveis (BLANCH et al., 2007), etc.

A β-ciclodextrina têm sido utilizada para microencapsular extratos fenólicos extraídos de plantas (KALOGEROPOULOS et al., 2010) e também compostos puros como ácido ferúlico (PRALHAD; RAJENDRAKUMAR, 2004; WANG; CAO; SUN; WANG, 2011) e kaempferol (MERCADER-ROS et al., 2010); entretanto, inexistem estudos com a utilização desses polímeros para encapsular extratos fenólicos de amora-preta.

Figura 6: Estrutura química da β-ciclodextrina. Fonte: SZENTE; SZEJTLI, 2004.

1.7.3 Xantana

A xantana é um polissacarídeo extracelular produzido por espécies de bactérias do gênero Xanthomonas. Estruturalmente (Figura 7), consiste em unidades de β-D glicose em ligação (1→4), sendo idêntica a estrutura da celulose. Na cadeia principal, a posição O-3 do resíduo da glicose é ocupada por uma cadeia trissacarídea lateral que possui uma unidade de ácido glicurônico entre duas unidades de D-manose. Cerca da metade dos grupos terminais da D-manose contém um resíduo de ácido pirúvico ligado, via grupamento ceto, nas posições 4 e 6 do açúcar com uma distribuição não conhecida. A unidade D-manose ligada a cadeia principal contém um grupo acetil na posição O-6. A presença dos grupamentos acetato e piruvato

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conferem ao polissacarídeo a possibilidade de ter grupos aniônicos dependendo do pH do meio (GARCÍA-OCHOA et al., 2000).

Figura 7: Estrutura química da molécula de xantana. Fonte: KLAIC, 2010.

Esta goma tem sido utilizada em diversos produtos como agente espessante (SOPADE et al., 2008) e estabilizante (GARCÍA-OCHOA et al., 2000). Como encapsulante tem sido empregada no revestimento de aromas (SECOUARD; GRISEL; MALHIAC, 2007), fármacos (TALUKDAR et al., 1998) e microorganismos (PAPAGIANNI; ANASTASIADOU, 2009). No entanto, não se tem referência de sua utilização na microencapsulação de compostos fenólicos.

1.7.4 Hidrogel

Um único material encapsulante pode não englobar todas as propriedades ideais de um encapsulante, por isso, na prática, pode-se utilizar combinações de materiais encapsulantes e/ou modificadores. Quando dois polímeros diferentes são misturados, podem formar uma fase ou um sistema de duas fases, dependendo da natureza dos polímeros envolvidos (MATALANIS; JONES; MCCLEMENTS, 2011).

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Em um sistema de uma fase, os dois polímeros podem existir como moléculas individuais ou como complexos solúveis que são distribuídos uniformemente em todo sistema.

Em um sistema de duas fases, a solução separa-se em duas fases diferentes. Conforme Dasha, Chiellini, Ottenbrite e Chiellini (2011) a separação pode ocorrer por dois mecanismos físico-quimicos: separação segregativa e separação associativa. Na separação segregativa, há uma força relativamente forte entre dois diferentes tipos de polímeros, onde a origem molecular desse feito é, geralmente, o efeito de exclusão estérica, ocorrendo a separação de fases quando ambos os biopolímeros são descarregados. Em concentrações baixas, os dois polímeros estão intimamente misturados e formam uma única fase em solução. Quando a concentração do polímero excede, ocorre a formação de fases, sendo uma fase rica de polímero e a outra esgotada no outro tipo de polímero.

Na separação associativa existe uma atração eletrostática relativamente forte entre os dois tipos de polímeros fazendo com que eles associem um com outro. O exemplo mais comum deste tipo de interação de biopolimeros em alimentos é a atração eletrostática (atração entre as moléculas de cargas opostas). As fases do sistema consistem numa que é rica em biopolímeros e a outra que está esgotada em ambos os polímeros. A fase rica em polímeros pode formar um precipitado ou um coacervato ou coacervado, dependendo da força de atração e da natureza dos polímeros envolvidos, tendo como exemplo os hidrogeis (Fig.8).

Uma alternativa para alterar as propriedades químicas e físicas do revestimento é promover a formação do hidrogel entre a xantana e a quitosana. Este hidrogel é formado devido à interação eletrostática, consideravelmente forte, entre os grupamentos amino da quitosana (policátion) e os grupos carboxílicos da xantana (poliânion) (CHELLAT et al., 2000; HORN, 2008). Esta interação pode propiciar uma maior resistência às microcápsulas e uma mudança na taxa de liberação do ingrediente (MARTÍNEZ-RUVALCABA; CHORNET; RODRIGUE, 2006; BHATTARAI; GUNN; ZHANG, 2010). A indústria alimentícia tem utilizado hidrogeis para encapsulação de sabores, retardando sua liberação e aumentando a sua duração, de enzimas (MAGNIN; DUMITRIU; CHORNET, 2003; LIU et al., 2011) e de probioticos (ARGIN, 2007).

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Figura 8: Estrutura química do hidrogel. Fonte: CHELLAT et al., 2000.

1.8 Técnicas utilizadas na confirmação da encapsulação

Técnicas como Microscopia Eletrônica de Varredura, Calorimetria Diferencial de Varredura, Análise Termogravimétrica e Eficiência da Encapsulação são utilizadas para confirmar a encapsulação de compostos fenólicos.

1.8.1 Microscopia Eletrônica de Varredura-MEV

A microscopia eletrônica de varredura é utilizada para avaliar a morfologia e o tamanho de distribuição da partícula do material formado durante a microencapsulação. A microscopia eletrônica de varredura fornece informações sobre as características morfológicas das microesferas ou microcápsulas, como a presença de fissuras e poros, permitindo uma análise rápida e direta da eficiência do processo de encapsulação. A análise é feita através da comparação morfológica do núcleo, do revestimento e da mistura física com o complexo. Quando ocorre a encapsulação, a imagem, diferente da mistura física, deixa de apresentar dois componentes distintos, passando a ter apenas um componente, diferente da forma original. A desvantagem desta técnica é que apresenta dados apenas qualitativos, não quantitativos em relação a quantidade de formação de cápsulas (PRALHAD; RAJENDRAKUMAR, 2004; WANG; CAO; SUN; WANG, 2011).

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1.8.2 Análises térmicas

O termo análise térmica abrange um grupo de técnicas na qual uma propriedade física da substância é medida em função da temperatura, enquanto a substância é submetida a um sistema controlado de aquecimento ou de resfriamento. As técnicas termoanalíticas mais utilizadas para avaliar a formação das cápsulas são a calorimetria diferencial de varredura (DSC) e analise termogravimetrica (TGA). Estas técnicas são principalmente utilizadas para confirmar a encapsulação por serem relativamente simples e demandarem pouco tempo (TAKAHASHI, 2009).

Uma das vantagens na utilização de análises térmicas é a obtenção mais rápida dos dados. Embora esta técnica não substitua completamente os estudos de estabilidade clássicos, os quais exigem longo tempo de observação (PRALHAD; RAJENDRAKUMAR, 2004; NOVÁK et al., 2006; KALOGEROPOULOS et al., 2010; WANG; CAO; SUN; WANG, 2011).

1.8.2.1 Calorimetria Diferencial de Varredura-DSC

A calorimetria diferencial de varredura é uma técnica de análise térmica na qual se mede a diferença de energia fornecida à amostra e a um material de referência, em função da temperatura, enquanto a substância e o material são submetidos a uma variação controlada de temperatura (BROWN, 1998; HATAKEYAMA; QUINN, 1999).

A curva de DSC do revestimento, normalmente, apresenta eventos endotérmicos que correspondem a sua desidratação. A formação dos complexos pode ser feita comparando a curva do DSC das microcápsulas com a curva do revestimento individual, do núcleo e da mistura física (preparada na mesma proporção que os complexos). O composto a ser encapsulado, geralmente, apresenta-se na forma cristalina e sua curva é representada por um pico estreito, que corresponde ao seu ponto de fusão. A curva da mistura física é a soma do evento de desidratação do polímero com o pico de fusão do composto a ser encapsulado. Quando ocorre a formação do complexo

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espera-se que o pico de fusão desapareça devido a perda da estrutura cristalina causado pela encapsulação ou que ocorra deslocamento do pico de fusão para temperaturas diferentes (GIORDANO; NOVAK; MOYANO, 2001).

1.8.2.2 Análise Termogravimétrica-TGA

A análise termogravimétrica é a técnica de análise térmica mais usada e a mais simples. A diferença de temperatura entre a amostra e o material de referência é medida em função da temperatura ou do tempo, enquanto ambos são submetidos a uma mesma variação de temperatura controlada. Se a amostra passa por uma mudança de fase, a energia é absorvida ou emitida e a diferença de temperatura (∆T) entre ambos é detectada (BROWN, 1998; HATAKEYAMA; QUINN, 1999).

Os revestimentos quando analisados por TGA, sob atmosfera de nitrogênio, apresentam uma primeira perda de massa correspondente a evaporação da água absorvida e da água de cristalização, e uma segunda referente a degradação que ocorre em temperaturas normalmente acima de 200ºC. Dependendo da estrutura do composto, ocorre uma redução de 70 a 80% da massa (TROTTA; ZANETTI; CAMINO, 2000).

A maneira mais comum de se detectar a formação de complexos, utilizando o TGA, consiste em comparar a temperatura do início da degradação da molécula a ser encapsulada com a microcápsula. Para confirmar a encapsulação as microcápsulas devem apresentar maior resistência térmica quando comparada com o composto fenólico individualizado. A comparação da porcentagem de massa perdida do complexo em relação à mistura física é também um indicativo da formação de complexos (AMMAR; SALAMA; GHORAB; MAHMOUD, 2006; ARAÚJO et al., 2007).

1.8.3 Eficiência da encapsulação

A eficiência de encapsulação depende do revestimento utilizado, do método de dessorção do solvente e a formação das partículas para induzir agregação e o aprisionamento do composto de interesse (KALOGEROPOULOS et al., 2010).

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Na literatura existe uma diversidade de estudos relacionados à eficiência de encapsulação de compostos fenólicos, dessa forma, de acordo com o material encapsulado e a técnica utilizada é possível obter resultados diferenciados.

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1° ARTIGO

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Microencapsulation of gallic acid in chitosan, β-cyclodextrin and xanthan

Cleonice Gonçalves da Rosaa*, Caroline Dellinghausen Borgesb, Rui Carlos Zambiaziab, Michael Ramos Nunescd, Edilson Valmir Benvenuttic Suzane Rickes da Luzab and Roseane Farias D’Avilaa.

a Department of Agroindustrial Science and Technology, Federal University of

Pelotas, 96010-900, Pelotas, Brazil.

b Center of Chemistry, Pharmaceutical and Food Sciences, Federal University

of Pelotas, 96010-900, Pelotas, Brazil.

c Institute of Chemistry, Federal University of Rio Grande do Sul, 91501-970,

Porto Alegre, Brazil.

d Federal Institute of Science and Technology Santa Catarina, 88510000,

Lages, Brazil.

* Corresponding author. Tel./fax: +55-53-32757258. E-mail address: cleorosaqm@yahoo.com.br

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Abstract

Microencapsulation of gallic acid (GA) with chitosan (C), β-cyclodextrin (CDS-β) or xanthan (X) was prepared by lyophilization. The encapsulation was verified by UV-visible spectroscopy, scanning electron microscopy, differential scanning calorimetry and thermogravimetric analysis. Both the encapsulation efficiency and antioxidative activity were evaluated. According to our results, the gallic acid was efficiency encapsulated by lyophilization in matrices of chitosan, β-cyclodextrin and xanthan. The encapsulated gallic acid showed no loss of antioxidant capacity and different characteristics to the pure gallic acid being confirmed the techniques used. With the chitosan matrix was obtained a higher encapsulation efficiency, the formation of capsules with characteristic shape and greater protection of the core, according to results of DSC and TGA.

Referências

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