UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
Beatriz dos Santos
Guanosina e Neuroplasticidade:
Estudo de Proteínas Envolvidas na Sinaptogênese e na Transmissão Glutamatérgica e Purinérgica
Florianópolis 2020
Beatriz dos Santos
Guanosina e Neuroplasticidade:
Estudo de Proteínas Envolvidas na Sinaptogênese e na Transmissão Glutamatérgica e Purinérgica
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Neurociências da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre em Neurociências.
Orientadora: Profa. Dra. Carla Inês Tasca Coorientadora: Dra. Leandra Celso Constantino
Florianópolis 2020
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor,
através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.
Santos, Beatriz dos
Guanosina e neuroplasticidade: estudo de proteínas envolvidas na sinaptogênese e na transmissão
glutamatérgica e purinérgica / Beatriz dos Santos ; orientador, Carla Inês Tasca, coorientador, Leandra Celso
Constantino, 2020. 59 p.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2020.
Inclui referências.
1. Neurociências. 2. Guanosina. 3. Neuroplasticidade. 4. Sinaptogênese. 5. Glutamato. I. Tasca, Carla Inês. II.
Constantino, Leandra Celso. III. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em
Neurociências. IV. Título.
Guanosina e Neuroplasticidade: Estudo de Proteínas Envolvidas na Sinaptogênese e na
Transmissão Glutamatérgica e Purinérgica
O presente trabalho em nível de mestrado foi avaliado e aprovado por banca examinadora composta pelos seguintes membros:
____________________________
Profa. Dra. Helena Iturvides Cimarosti (Universidade Federal de Santa Catarina)
____________________________
Profa. Dra. Cláudia Beatriz Nedel Mendes de Aguiar (Universidade Federal de Santa Catarina)
Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado adequado para obtenção do título de mestre em Neurociências.
____________________________ Prof. Dr. Eduardo Luiz Gasnhar Moreira
Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Neurociências
____________________________ Profa. Dra. Carla Inês Tasca
Orientadora
Florianópolis, 2020.
Documento assinado digitalmente Carla Ines Tasca
Data: 17/04/2020 10:49:35-0300 CPF: 522.999.880-68 Documento assinado digitalmente Eduardo Luiz Gasnhar Moreira Data: 17/04/2020 17:34:30-0300 CPF: 053.168.189-03
Agradeço primeiramente aos meus pais, Lúcia e João, por serem os guias de cada passo que dou e exemplos de seres-humanos, sem eles este trabalho teria sido impossível. À minha irmã Camila e ao meu sobrinho Gabriel, pelo amor e carinho recebido mesmo à distância e especialmente à minha prima Léia, por me trazer para esta cidade e ter me ajudado de todas as formas possíveis.
Ao meu ex-marido, pelo apoio desde o vestibular. Obrigada por estar ao meu lado sempre.
Aos amigos que fiz durante a graduação e espero que fiquem para a vida, em especial, Matheus, Karla e Samara e tantos outros que me fizeram rir e estiveram ao meu lado, tornando o mestrado mais leve e minha vida mais feliz.
Aos meus amigos e colegas do laboratório Neuroquímica 4, pelas instruções e auxílio, em especial ao Victor, à Luisa, à Naiani, à Gabi, ao Caio e ao Gianni.
Aos meus amigos e colegas do laboratório Neuroquímica 3, pelo empréstimo de material e troca de experiências, sem os quais não seria possível muitos dos experimentos.
À minha coorientadora Leandra, pela preocupação e dedicação.
Em especial, à minha orientadora Drª Carla Inês Tasca, pela imensa paciência, dedicação, apoio e conhecimento despendido.
Ao Laboratório Multiusuário de Estudos em Biologia da Universidade Federal de Santa Catarina (LAMEB/UFSC) pela disponibilização da sua infraestrutura para a realização dos ensaios experimentais.
À CAPES, pelo apoio financeiro desta pesquisa com bolsa auxílio.
Neuroplasticidade refere-se à capacidade que o sistema nervoso possui em modificar algumas das suas propriedades morfológicas e funcionais em resposta às alterações do ambiente, em apoio à aprendizagem e em resposta às doenças. Dos processos envolvidos na neuroplasticidade, a neurogênese é definida como o nascimento de novos neurônios e consiste em uma série de etapas: a proliferação, a diferenciação, a migração e a sobrevivência celular. A sinaptogênese é o processo de formação de sinapses entre os neurônios. Esses processos são modulados por fatores neurotróficos, como o BDNF e o VEGF, envolvem vias de sinalização como as vias da PI3K/Akt e Ras/Raf/MEK/ERK, além da modulação da transmissão excitatória glutamatérgica. A sinalização purinérgica desempenha um papel importante na neurodegeneração, neuroproteção, neurorregeneração e na neurogênese. A guanosina (GUO) é o nucleosídeo purinérgico endógeno derivado da guanina com efeitos neuroprotetores e neurotróficos. Demonstramos que o tratamento crônico com a GUO na dose de 8mg/kg, i.p., por 25 dias consecutivos em camundongos C57BL/6 promoveu a proliferação de células neuroprogenitoras na zona subventricular e no giro denteado da formação hipocampal, além de aumentar o número de neurônios nesta região. Este estudo visou identificar, na dose e tempo de administração que a GUO promoveu a neurogênese, alterações nos níveis de proteínas relacionadas à sinaptogênese e à neurogênese, além dos níveis de fatores neurotróficos e nas vias de sinalização e transmissão requeridas para a neuroplasticidade hipocampal. O tratamento com GUO (8 mg/kg, i.p., por 25 dias) em camundongos C57BL/6 não alterou o imunoconteúdo hipocampal de proteínas relacionadas à neuroplasticidade (DCX, PSD-95, SNAP-25, Sinaptofisina), fatores neurotróficos, como o BDNF e o VEGF e não alterou as proteínas envolvidas em vias de sinalização relacionadas à neuroplasticidade, como a Akt e as formas fosforiladas de p70S6k e ERK1/2. Porém, a GUO diminuiu o imunoconteúdo do receptor de adenosina A2A e do transportador glial de glutamato GLT-1, além de aumentar o imunoconteúdo da subunidade GluN1 do receptor NMDA. É amplamente estudado o efeito protetor da GUO sobre a excitotoxicidade glutamatérgica. Em uma avaliação ex vivo, observamos que o tratamento com GUO não alterou os efeitos do glutamato sobre o metabolismo (níveis de lactato extracelular). No entanto, a GUO preveniu a redução da viabilidade celular em fatias hipocampais submetidas à excitotoxicidade de glutamato in vitro. Estes resultados demonstram que a guanosina modula os sistemas purinérgico e glutamatérgico, confirma seu efeito neuroprotetor e sugere um possível papel na sinaptogênese.
Palavras-chave: Guanosina, neuroplasticidade, sinaptogênese, fatores tróficos, receptores de
morphological and functional properties in response to changes in the environment, in support of learning and in response to diseases. Of the processes involved in neuroplasticity, neurogenesis is defined as the birth of new neurons and consists of a series of stages: proliferation, differentiation, migration and cell survival. Synaptogenesis is the process of forming synapses between neurons. These processes are modulated by neurotrophic factors, such as BDNF and VEGF, involve signaling pathways such as the PI3K/Akt and Ras/Raf/MEK/ERK pathways, in addition to the modulation of glutamatergic excitatory transmission. Purinergic signaling plays an important role in neurodegeneration, neuroprotection, neuroregeneration and neurogenesis. Guanosine (GUO) is the endogenous purinergic nucleoside derived from guanine with neuroprotective and neurotrophic effects. We demonstrated that chronic treatment with GUO at a dose of 8 mg/kg, i.p., for 25 consecutive days in C57BL/6 mice promotes the proliferation of neuroprogenitor cells in the subventricular zone and in the dentate gyrus of the hippocampal formation, in addition to increasing the number of neurons in this region. This study aimed to identify, in the dose and time of administration that GUO promoted neurogenesis, changes in the levels of proteins related to synaptogenesis and neurogenesis, in addition to the levels of neurotrophic factors and in the signaling and transmission pathways required for hippocampal neuroplasticity. Treatment with GUO (8 mg/kg, i.p., for 25 days) in C57BL/6 mice does not alter the hippocampal immunocontent of neuroplasticity-related proteins (PSD-95, SNAP-25, Synaptophysin), neurotrophic factors, such as BDNF and VEGF and does not alter the proteins involved in signaling pathways related to neuroplasticity, such as Akt and the phosphorylated forms of p70S6k and ERK1 / 2. However, GUO decreased the immunocontent of the A2A adenosine receptor and the glial glutamate transporter GLT-1, in addition to increasing the immunocontent of the GluN1 subunit of the NMDA receptor. The protective effect of GUO on glutamatergic excitotoxicity is widely studied. In an ex vivo evaluation, we found that treatment with GUO does not alter the effects of glutamate on metabolism (extracellular lactate levels). However, GUO prevents the reduction of cell viability in hippocampal slices subjected to glutamate excitotoxicity in vitro. These results demonstrate that guanosine modulates the purinergic and glutamatergic systems, confirms its neuroprotective effect and suggests a possible role in synaptogenesis.
Keywords: Guanosine, neuroplasticity, synaptogenesis, trophic factors, adenosine receptors,
Figura 1 - A neuroplasticidade em diferentes níveis estruturais. ... 10 Figura 2 - Os fatores neurotróficos BDNF e VEGF aumentam a neuroplasticidade através da ativação de duas principais vias de sinalização. ... 16 Figura 3 - Sistema purinérgico e a guanosina ... 22 Figura 4- Imunomarcação demonstrando o efeito neurogênico da GUO no DG. ... 26 Figura 5 - Protocolo experimental demonstrando o tratamento, a divisão dos grupos
experimentas in vivo e os testes posteriormente realizados. ... 29 Figura 6 - Protocolo experimental demonstrando os grupos amostrais que compõe o teste de MTT e dosagem de lactato. ... 31 Figura 7 - Avaliação dos efeitos da GUO sobre os fatores neurotróficos BDNF e VEGF. ... 34 Figura 8 - Avaliação do imunoconteúdo de proteínas de vias de sinalização que propiciam à neuroplasticidade. ... 35 Figura 9 - Avaliação do efeito da GUO sobre proteínas relacionadas à sinaptogênese e à neurogênese. ... 36 Figura 10 - Avaliação do efeito da GUO sobre os níveis do receptor adenosinérgio A2A. ... 37 Figura 11 - Avaliação do efeito da GUO sobre o imunoconteúdo da subunidade GluN1 do receptor glutamatérgico NMDA e sobre o transportador glial GLT-1... 38 Figura 12 - Avaliação do efeito da GUO sobre a viabilidade celular de fatias hipocampais submetidas à excitotoxicidade glutamatérgica in vitro. ... 39 Figura 13 - Avaliação do efeito da GUO sobre os níveis de lactato extracelular em fatias hipocampais submetidas à excitotoxicidade glutamatérgica in vitro. ... 40
1.1 NEUROPLASTICIDADE ... 10
1.1.1 Neurogênese ... 11
1.1.2 Sinaptogênese ... 12
1.1.3 Mecanismos elementares da neuroplasticidade ... 13
1.1.4 Vias de sinalização envolvidas na neuroplasticidade ... 14
1.2 SISTEMAGLUTAMATÉRGICOENEUROPLASTICIDADE ... 17
1.3 EXCITOTOXICIDADE,METABOLISMOENEUROPLASTICIDADE ... 20
1.4 GUANOSINAEOSISTEMAPURINÉRGICO ... 21
2 OBJETIVOS ...27 2.1OBJETIVOSGERAIS ... 27 2.2OBJETIVOSESPECÍFICOS ... 27 3 MATERIAL E MÉTODOS ...28 3.1ANIMAIS ... 28 3.2ADMINISTRAÇÃODEGUANOSINA ... 28
3.3PREPARAÇÃODOTECIDOHIPOCAMPAL ... 28
3.3.1 Ensaio da viabilidade celular ... 29
3.3.2 Dosagem de lactato ... 30 3.4IMUNODETECÇÃODEPROTEÍNAS... 31 3.5ANÁLISEESTATÍSTICA ... 32 4 RESULTADOS ...34 5 DISCUSSÃO ...41 6 CONCLUSÕES ...47 7 PERSPECTIVA ...48 REFERÊNCIAS ...49
1 INTRODUÇÃO
1.1 NEUROPLASTICIDADE
A neuroplasticidade pode ser amplamente definida como a capacidade do sistema nervoso de responder a estímulos intrínsecos e/ou extrínsecos, reorganizando sua estrutura, função e conexões e pode ocorrer durante o desenvolvimento, em resposta ao ambiente, em apoio à aprendizagem e em resposta às doenças. (CRAMER et al., 2011).
A neuroplasticidade pode ser observada em várias escalas, desde o nível molecular até o comportamental, estando o comportamento adaptativo, o aprendizado e a memória no topo da hierarquia da neuroplasticidade (GULYAEVA, 2017).
A neuroplasticidade acontece em diferentes níveis estruturais e de forma bidirecional: ou seja, ela pode atuar promovendo a neurogênese ou a apoptose seletiva, a arborização ou a poda de ramos axonais e dendríticos, a sinaptogênese ou a eliminação sináptica, desta maneira influenciando a variabilidade e a seleção dentro das redes neuronais (Figura 1) (CASTRÉN & HEN, 2013).
Figura 1 - A neuroplasticidade em diferentes níveis estruturais.
A neuroplasticidade atua de forma bidirecional, modulando a variabilidade e a seleção dentro das redes neuronais: promoção da neurogênese ou da apoptose seletiva, a arborização ou a poda de ramos axonais e dendríticos, a sinaptogênese através dos espinhos dendríticos ou a eliminação sináptica e aumento ou diminuição da força sináptica. Fonte: adaptado pela autora a partir de CASTRÈN e HEN, 2013.
1.1.1 Neurogênese
A neurogênese é um processo definido como o nascimento de novos neurônios e consiste em uma série de etapas que podem ser examinadas separadamente: a proliferação, a diferenciação, a migração e a sobrevivência celular (KEMPERMANN et al., 1998; AIMONE et al., 2014; SINGH ET AL., 2017).
Durante o processo da neurogênese, as células podem sintetizar proteínas exclusivas em cada etapa, o que permite um estudo mais detalhado desse processo utilizando-se as técnicas de imunohistoquímica. Por exemplo, as proteínas Ki-67 e a PCNA (do inglês:
proliferating cell nuclear antigen) são indicadoras de proliferação celular. Também podem ser
utilizados marcadores exógenos que se incorporam ao DNA durante a fase S do ciclo celular, como é o caso do 5'-bromo-2'- desoxiuridina (BrdU, um análogo da timina), o que permite uma identificação da proliferação celular em qualquer tempo após a sua incorporação. Outros imunomarcadores específicos são utilizados para cada tipo de célula e em cada fase da maturação, como as proteínas DCX (doublecortina) e a Neu-N (do inglês: neuronal nuclei) que são exclusivas de neurônios imaturos e maduros, respectivamente (AIMONE et al. 2014).
As duas áreas principais do sistema nervoso central (SNC) onde ocorrem a neurogênese são a zona subventricular (SVZ, do inglês: subventricular zone) que reveste os ventrículos laterais e dá origem a precursores neuronais que migram em direção ao bulbo olfatório e a zona subgranular que reveste o giro denteado (DG, do inglês: dentate gyrus) do hipocampo e origina células granulares do DG (AIMONE et al., 2014; CASTRÉN & HEN, 2013; ERIKSSON et al., 1998).
A neurogênese hipocampal adulta é um fenômeno-chave para a função cognitiva e de particular importância, porque o hipocampo é a área crítica do cérebro envolvida com a aprendizagem, a memória e o humor (ANACKER & HEN, 2017; EICHENBAUM, 2017)
A interrupção deste processo foi postulada como um fator que contribui para a incidência de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e a doença de Huntington e ainda doenças neuropsiquiátricas, como a depressão, o transtorno bipolar, o estresse, a ansiedade e a esquizofrenia (BOUCKAERT et al., 2016; CHENG et al., 2016; ELVSÅSHAGEN et al., 2016; HORGUSLUOGLU et al., 2017; MURATA et al., 2017; SCHOENFELD & CAMERON, 2015; SINGH et al., 2016).
Dentre as doenças psiquiátricas, a depressão é uma doença crônica, heterogênea e incapacitante (KRISHNAN & NESTLER, 2011), que acomete 121 milhões de pessoas no mundo (OMS, 2015). Diversos fármacos antidepressivos que inibem a recaptação da serotonina (fluoxetina, por exemplo), tem como efeito o aumento da neurogênese (PETRIK et al., 2012; DENG & GAGE, 2015).
No entanto, a diminuição da neurogênese não é vista apenas em condições patológicas, mas também em condições fisiológicas. No envelhecimento, declínios nas taxas de proliferação e diferenciação das células progenitoras neurais do hipocampo também são observadas (RAO et al., 2006; SAHAY & HEN, 2007).
A neurogênese pode ser modulada por vários fatores intrínsecos e extrínsecos. O exercício físico (corrida, por exemplo), aprendizado, enriquecimento ambiental, são tidos como estimulantes da neurogênese (ERIKSSON et al., 1998; MA et al., 2017), enquanto a privação de sono, ingestão crônica de álcool e drogas, estresse e envelhecimento são fortes inibidores (ERIKSSON et al., 1998; KANDRATAVICIUS et al., 2007). O exercício físico e o estresse foram os primeiros fatores identificados e são conhecidos como os mais potentes moduladores da neurogênese (AIMONE et al., 2014; HORGUSLUOGLU et al., 2017).
1.1.2 Sinaptogênese
A sinaptogênese é o processo de formação de sinapses entre os neurônios. Sinapses imaturas entre dois neurônios são iniciadas pela extensão filopodial pré e/ou pós-sinápticas, podendo permanecer e amadurecer ou serem eliminadas (CASTRÉN & HEN, 2013).
Mais de 90% de todas as sinapses excitatórias no SNC ocorrem em estruturas denominadas espinhas dendríticas, que são pequenas protuberâncias que emergem na superfície de muitos neurônios (HARRIS & KATER, 1994). As espinhas dendríticas são altamente dinâmicas e sua estabilização e morfologia são influenciadas pela atividade sináptica. Essa regulação extrínseca da morfogênese da espinha sustenta o desenvolvimento cerebral dependente da experiência e o armazenamento de informações dentro dos circuitos cerebrais (LAI & IP, 2013; WOOLFREY & DELL'ACQUA, 2015).
Da mesma maneira que a neuroplasticidade reorganiza as redes de neurônios motores em resposta a movimentos repetitivos, as respostas fisiológicas recorrentes ao estresse podem modificar os caminhos neurais envolvidos na percepção sensorial, atenção, regulação
emocional, memória e atividade autonômica (PAL & ELBERS, 2018). A expressão anormal de proteínas no cérebro maduro causa a desestabilização de neurônios e seus processos, levando à plasticidade e conexão aberrante dos circuitos cerebrais (GULYAEVA, 2017).
Distúrbios neurológicos e genéticos que resultam em déficit cognitivo, como as síndromes de Down e do X-frágil, também demonstram anormalidades nas espinhas dendríticas (FIALA et al., 2002, BAGNI & ZUKIN, 2019). Além disso, alterações na morfologia e na densidade de espinhas dendríticas também são observadas em distúrbios de humor, como no transtorno depressivo (QIAO et al., 2016).
A manutenção e o remodelamento adaptativo de circuitos neurais no SNC de mamíferos adultos são mediados, em grande parte, pelas mesmas vias de sinalização de neurotransmissores e fatores neurotróficos que regulam a formação de circuitos neurais durante o desenvolvimento (GULYAEVA, 2017). Entre essas vias de sinalização neurotróficas dependentes de atividade, destacam-se as que envolvem o glutamato, o principal neurotransmissor excitatório do SNC e diversos fatores neurotróficos (ROTHMAN & MATTSON, 2013).
1.1.3 Mecanismos elementares da neuroplasticidade
No sistema nervoso, a formação de sinapses entre os neurônios depende de sua atividade elétrica e os fatores neurotróficos pertencentes à família das neurotrofinas, que são produzidas pelas células-alvo, desempenham um papel crucial na formação de redes neurais dependentes de atividade (ROTHMAN & MATTSON, 2013), sendo considerados mediadores moleculares da neuroplasticidade (GULYAEVA, 2016). Dentre todas as neurotrofinas, o BDNF (do inglês: brain derived neurotrophic factor) é uma neurotrofina que desempenha vários papéis proeminentes na plasticidade sináptica, além de estar envolvida na manutenção de neurônios nos principais circuitos cerebrais envolvidos nas funções emocional e cognitiva (PHILLIPS, 2017).
A sinalização por BDNF medeia a regulação positiva de proteínas envolvidas na neurogênese, aprendizado, memória e sobrevivência neuronal, incluindo proteínas que regulam a biogênese mitocondrial, controle de qualidade das proteínas e resistência das células ao estresse oxidativo e metabólico (LEAL et al., 2017; ROTHMAN & MATTSON, 2013; VON BOHLEN UND HALBACH & VON BOHLEN UND HALBACH, 2018).
Déficits na sinalização do BDNF contribuem para a patogênese de várias doenças e distúrbios, como a doença de Huntington, doença de Alzheimer e depressão (CHOI et al., 2018; DUNCAN et al., 2009; GIUFFRIDA et al., 2018; ILLARIOSHKIN et al., 2018).
Além do BDNF, outras famílias de neurotrofinas e fatores de crescimento neuronal atuam no hipocampo sobre a neuroplasticidade, como o IGF (do inglês: Insulin-like growth
factor), FGF (do inglês: fibroblast growth factor), NGF (do inglês: Nerve growth factor) e VEGF
(do inglês: vascular endotelial growth factor) (CASTRÉN & ANTILA, 2017; COOPER et al., 2018). O VEGF é conhecido principalmente por sua indução de angiogênese e modulação da permeabilidade vascular. No entanto, diversos estudos atribuem ao VEGF um papel relevante na neuroplasticidade, acelerando o desenvolvimento de neurônios e o crescimento dendrítico e axonal. Também foi observado que o VEGF foi capaz de aumentar a neurogênese adulta após um dano isquêmico, transformando as células astrogliais em novos neurônios (transdiferenciação) (KILIC, KILIC et al., 2006; PAN et al., 2017; SHEN et al., 2016; THEIS & THEISS, 2018; WANG et al., 2017a).
1.1.4 Vias de sinalização envolvidas na neuroplasticidade
As funções neuronais, incluindo a plasticidade sináptica, dependem da regulação adequada das proteínas sinápticas, muitas das quais podem ser rapidamente controladas por fosforilação/defosforilação (WOOLFREY & DELL'ACQUA, 2015). Um potencial para processar diferentes substratos faz com que as proteínas cinases, fosfatases e proteases sejam as principais participantes, fornecendo plasticidade cerebral em nível molecular (BORODINOVA et al., 2017).
É bem conhecido que os fatores neurotróficos, como o BDNF e o VEGF, têm seus efeitos mediados por receptores de membrana do tipo tirosina cinase, com a subsequente fosforilação de proteínas reguladoras e início da transcrição de genes que controlam a homeostase do cálcio, as funções sinápticas e a sobrevivência dos neurônios (ILLARIOSHKIN et al., 2018). De fato, esse evento ativa importantes vias, destacando-se duas delas (Figura 2): 1- Ras/Raf/proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAP) cinase/ERK (cinases ativadas por sinais extracelulares (Ras/Raf/MEK/ERK) e; 2- fosfotidilinositol 3-cinase/Akt (PI3K/Akt) (BAGNI & ZUKIN, 2019; BURGERING & COFFER, 1995; GIACHELLO et al., 2010;).
Na via 1, a Ras (uma proteína G monomérica) ativa a Raf (uma serina/treonina cinase) que fosforila a MEK, ativando as ERK 1/2 e estas, por sua vez fosforilam substratos citosólicos e nucleares, essenciais para alterar a expressão gênica e assim, modulam a proliferação celular e a neuroplasticidade (ZHANG et al., 2018; BAGNI & ZUKIN, 2019).
No hipocampo as ERK1/2 parecem estar envolvidas na plasticidade sináptica, desempenhando um papel importante na neurogênese e na plasticidade estrutural das espinhas dendríticas, além de participarem da formação da memória em mamíferos (NIKOLAIENKO et al., 2017; NUMAKAWA et al., 2018; SNIDER et al., 2018; TANG & YASUDA, 2017).
Na via 2, o PI3K converte o 4,5-bifosfato (PIP2) em fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3), que recruta a Akt na membrana plasmática (POMPURA & DOMINGUEZ-VILLAR, 2018; YUDUSHKIN, 2020). A Akt ou proteína cinase B (PKB) é uma família de proteínas serina/treonina cinases composta por três membros: Akt1 (também chamada de PKBα) é amplamente expressa nos tecidos, Akt2 (PKBβ) é expressa em tecidos cuja insulina modula o metabolismo de glicose, tais como músculo esquelético, tecido adiposo e fígado, e Akt3 (PKBγ) expressa no pulmão, rim e predominantemente no cérebro (BURGERING & COFFER, 1995).
A Akt exerce uma regulação crítica na homeostase celular, atuando no controle do metabolismo, da sobrevivência, da proliferação e do crescimento celular (POMPURA & DOMINGUEZ-VILLAR, 2018; YUDUSHKIN, 2020). A proteína Akt está envolvida na sobrevivência celular em vários níveis. Além de ativar a mTOR (alvo mecanístico da Rapamicina), ela atua inibindo a GSK3 (glicogênio sintase cinase-3) e a proteína pró apoptótica BAD (CHENG et al.; 2018; TAO et al., 2017).
Por fim, a mTOR ativada regula a síntese proteica através da fosforilação e inativação do repressor da tradução de RNAs mensageiros (RNAm), a proteína de ligação ao fator de iniciação eucariótico 4E (4E-BP1), e pela fosforilação e ativação da proteína ribossomal S6 cinase de 70 kDa (p70S6K), que culmina na tradução de proteínas requeridas para a neuroplasticidade (HAY & SONENBERG, 2004).
Figura 2 - Os fatores neurotróficos BDNF e VEGF aumentam a neuroplasticidade através da ativação de duas principais vias de sinalização.
Os fatores neurotróficos, BDNF e VEGF (em verde), se ligam aos seus receptores do tipo tirosina cinase (representado em roxo) para ativar duas vias principais de sinalização, através da fosforilação. Na via em laranja (à esquerda), a ativação ocorre de Raf para Ras, MEK e ERK 1/2, e na via em vermelho (à direita), PI3K ativa Akt que inibe a BAD (proteína pró apoptótica) e ativa a mTOR, que por sua vez, inibe a 4E-BP1 e ativa p70S6k. A ativação da ERK 1/2, p70S6k e inibição da 4E-BP1, propiciam a síntese de proteínas que sustentam a neuroplasticidade, dentre elas: a PSD-95 e subunidades dos receptores glutamatérgicos NMDA (GluN1) e AMPA (GluA1) (As setas azuis indicam a ativação e as setas em preto a inibição). Abreviaturas: 4E-BP: proteína ligante do fator de elongamento 4E; Akt: proteína cinase B; AMPA: alfa-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiónico; BDNF: fator neurotrófico derivado do encéfalo; ERK: cinases ativadas por sinais extracelulares; MEK: proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAP) cinase; mTOR: proteína alvo mecanístico da rapamicina; NMDA: N-metil-D-aspartato; p70S6K: proteína ribossomal S6 cinase de 70 kDa; PI3K: fosfatidilinositol 3’ cinase; PSD-95: proteína de densidade pós-sináptica de 95 kDa, VEGF: fator de crescimento vascular endotelial . Figura elaborada usando imagens do BioRender. Fonte: autora
Já foi demonstrado que a ativação da mTOR promove um aumento da proliferação de células-tronco neurais e da neurogênese em camundongos idosos (ROMINE et al., 2015). Além disso, a mTOR tem um papel proeminente na sinaptogênese, regulando a síntese de proteínas
envolvidas na formação das espinhas dendríticas, como a proteína de densidade pós-sináptica de 95kDa (PSD-95) e de subunidades do receptor ionotrópico de glutamato, AMPA (GluA1) (CAVALLERI et al., 2018; ZHUANG et al. 2016).
Desta forma, a plasticidade sináptica da transmissão glutamatérgica emerge como um mecanismo particularmente poderoso para o ajuste fino da codificação e armazenamento de informações em todo o cérebro (GULYAEVA, 2016; DIERING & HUGANIR, 2018).
1.2 SISTEMA GLUTAMATÉRGICO E NEUROPLASTICIDADE
O papel do neurotransmissor glutamato é conhecido há mais de meio século (OLNEY, 1969), enquanto várias outras funções reguladoras do glutamato no cérebro são mostradas desde então, como o controle da neurogênese, crescimento de neuritos, sinaptogênese e sobrevivência dos neurônios (GULYAEVA, 2016).
O aminoácido L-glutamato é considerado o principal mediador de sinais excitatórios no SNC de mamíferos, estando envolvido nos principais aspectos funcionais do cérebro incluindo a cognição, memória e aprendizagem (DANBOLT, 2001). Sua ação ocorre por meio da ligação com seus receptores: ionotrópicos, alfa-amino-3-hidróxi-metilisoxazolepropionato (AMPA), N-metil-D-aspartato (NMDA) e cainato; e metabotrópicos (mGluR1 a mGluR8). A retirada do glutamato da fenda sináptica é dependente da recaptação promovida pelos transportadores de aminoácidos excitatórios (EAATs) localizados na superfície das células gliais e denominados de EAAT1 e EAAT2 para humanos (GLAST e GLT-1 para roedores, respectivamente) e os neuronais (EAAT3, EAAT4 e EAAT5) (POPOLI & PEPPONI, 2012).
As respostas mediadas por receptores de glutamato, dependentes da transcrição retardada, mediadas por cinases e proteases, sustentam diferentes formas de plasticidade neuronal (GULYAEVA, 2016).
Uma consequência da forte ativação do receptor NMDA e da resultante “inundação” de íons Ca2+ dentro do dendrito pós-sináptico é a inserção de novos receptores AMPA na membrana sináptica, fortalecendo a transmissão, este fenômeno é conhecido como potenciação de longa duração (LTP, do inglês: long-term potentiation) (BEAR et al., 2017; LARSON & MUNKÁCSY, 2015). Por outro lado, neurônios que disparam fora de sincronia perdem suas conexões e as sinapses cuja atividade falha em correlacionar-se com aquela da célula pós-sináptica são enfraquecidas e eliminadas, desencadeando uma forma oposta de
plasticidade sináptica, a depressão de longa duração (LTD, do inglês: long-term depression) (BEAR et al., 2017; CITRI & MALENKA, 2007; DIERING & HUGANIR, 2018). É proposto que esses processos opostos sejam a codificação molecular da memória (NABAVI et al., 2014).
Portanto, a plasticidade sináptica excitatória deve adicionar, remover ou modificar receptores AMPA (AMPARs) para alterar a força sináptica (WOOLFREY & DELL'ACQUA, 2015). De fato, o tamanho das sinapses individuais se correlaciona intimamente com o número de AMPARs que eles possuem (MATSUZAKI et al., 2004).
Os AMPARs são altamente dinâmicos, submetidos à endocitose contínua, exocitose, difusão lateral no plano da membrana, aprisionamento reversível nas sinapses na densidade pós-sináptica (PSD) e modificações nas propriedades do canal iônico (CITRI & MALENKA, 2007; DIERING & HUGANIR, 2018).
Os novos AMPARs sinápticos são estabilizados por meio de sua interação com a PSD, mediada por proteínas, como a PSD-95. Paralelamente, ocorrem mudanças estruturais e morfológicas na sinapse, de modo que pode ocorrer o crescimento de novas espinhas dendríticas, o aumento de espinhas pré-existentes, e a divisão de espinhas únicas em duas sinapses funcionais (BEAR et al., 2017; CITRI & MALENKA, 2007; ZENG et al., 2016).
A manutenção dessas alterações por mais de algumas horas depende da transcrição
de novo, bem como da síntese proteica dendrítica local. Fatores de tradução, ribossomos e
mRNAs são encontrados em dendritos na base de espinhas dendríticas pós-sinápticas (Hay & Sonenberg, 2004), presumivelmente para fornecer às sinapses um suprimento das proteínas críticas necessárias para manter a força sináptica (CITRI & MALENKA, 2007; WOOLFREY & DELL'ACQUA, 2015).
Além do papel bem estabelecido como gatilho para a transmissão sináptica rápida por LTP e LTD mediada por AMPARs, um crescente número de evidências indica que os próprios receptores NMDA (NMDARs) também são dinamicamente regulados e sujeitos a plasticidade de longo prazo dependente de atividade (DIERING & HUGANIR, 2018).
Antagonistas dos NMDARs, como o MK-801 (dizolcipina) e a cetamina demonstraram efeitos sobre a neurogênese. O tratamento com MK-801 induz neurogênese em animais jovens e idosos, através da ativação da via de sinalização de Wnt/β-catenina no hipocampo de ratos hemiparkinsonianos (PÉREZ-DOMPER et al., 2017; SINGH ET AL., 2017). A cetamina também aumenta a liberação de BDNF e a conectividade sináptica, opondo-se a déficits causados pelo estresse crônico e depressão (GERHARD et al., 2016; GERHARD & DUMAN,
2018) e ativa a mTOR, levando ao aumento das proteínas envolvidas no processo de sinaptogênese e aumento do número e função de novas sinapses no córtex pré-frontal de ratos (LI et al., 2010), sugerindo que o sistema de neurotransmissão glutamatérgica também pode atuar modulando negativamente a neurogênese (SINGH et al., 2017)
Paralelamente às modificações no terminal pós-sináptico, há um aumento no tamanho da zona ativa pré-sináptica, de modo que as sinapses potencializadas sejam aumentadas por um longo período de tempo (CITRI & MALENKA, 2007). A exocitose vesicular libera neurotransmissores para mediar muitos eventos biológicos, incluindo a transmissão sináptica essencial para as funções cerebrais (WU et al., 2014). As vesículas alojadas nas zonas ativas se fundem com a membrana plasmática quando um potencial de ação aciona o influxo de Ca2+, via canais de cálcio dependentes de voltagem (RIZO, 2018).
Esse influxo de cálcio pode aumentar diretamente a liberação do neurotransmissor ou pode levar a modificações bioquímicas de proteínas no terminal pré-sináptico (WU et al., 2014; RIZO, 2018). A liberação é principalmente controlada por componentes que possuem homólogos na maioria dos tipos de transporte de membrana intracelular e subjacentes a um mecanismo geral de fusão de membrana, bem como por fatores especializados que ajudam a conferir a regulação rígida da fusão das vesículas sinápticas (JAHN & SCHELLER, 2006; PFEFFER, 2007; RIZO, 2018).
As proteínas SNAREs (do inglês: Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment
protein receptor) são caracterizadas por sequências com cerca de 65 resíduos chamados
motivos SNARE que têm propensão a formar estruturas helicoidais (DASTE et al., 2015 et al., 2017). Os SNAREs neuronais envolvidos na liberação de neurotransmissores são a sintaxina-1, SNAP-25 e a sinaptobrevina-2 (também chamada de VAMP-2) (RIZO, 2018). A sinaptobrevina é frequentemente referida como v‐SNARE devido à sua localização nas vesículas, enquanto a sintaxina-1 e a SNAP‐25 são chamadas de t‐SNAREs, porque se localizam na membrana alvo (do inglês: target) (JAHN & SCHELLER, 2006; PFEFFER, 2007; RIZO, 2018).
Quando uma v-SNARE interage com uma t-SNARE, seus domínios helicoidais se entrelaçam formando um complexo estável denominado trans-SNARE que prende uma membrana a outra, aproximando a vesícula sináptica com a membrana do terminal sináptico, promovendo a fusão das membranas e a consequente exocitose de neurotransmissores (DASTE et al., 2015; PFEFFER, 2007; WANG et al., 2017b).
Após a exocitose, as vesículas sinápticas precisam ser recicladas dentro de segundos a minutos (WANG et al., 2017b) para garantir uma neurotransmissão contínua. Dentro deste contexto, a sinaptofisina é uma proteína de vesícula sináptica necessária para a recuperação eficiente das proteínas v-SNAREs, intimamente relacionada à sinaptobrevina-2 (WANG et al., 2017b). Por ser a segunda proteína mais abundante nas vesículas sinápticas, também pode ser utilizada como marcador pré-sináptico em diversos ensaios científicos (KOLOS et al., 2015).
1.3 EXCITOTOXICIDADE, METABOLISMO E NEUROPLASTICIDADE
A participação dos receptores glutamatérgicos na sinaptogênese e neurogênese já está bem consolidada. No entanto, também é muito conhecida a participação destes receptores nos mecanismos de neurodegeneração. Uma excessiva estimulação de seus receptores, por excesso de glutamato na fenda sináptica, principalmente dos NMDARs, ocasiona um aumento do influxo de cálcio que pode levar ao desequilíbrio da homeostase celular, geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), ativação da cascata apoptótica e consequente morte neuronal, caracterizando assim, o fenômeno de excitotoxicidade glutamatérgica (WANG & QIN, 2010). Os astrócitos são considerados as células mais importantes para apoiar os neurônios vizinhos na prevenção deste processo de excitotoxicidade, pois além de captar da fenda sináptica o excesso de neurotransmissor, podem atuar como eventuais provedores de energia (KUMAGAI, 2019).
Segundo Magistretti e Allaman (2018), há uma comunicação metabólica entre astrócitos e neurônios em resposta à estimulação neuronal por glutamato. Desta forma, os astrócitos transferem o ácido orgânico L-lactato, oriundo da via glicolítica, para os neurônios, para atender às necessidades energéticas neuronais e para fornecer sinais que modulam as funções neuronais, incluindo a excitabilidade, a plasticidade e a consolidação da memória.
O L-lactato é um metabólito comum entre a glicólise e a fosforilação oxidativa, sendo até considerado o combustível preferido para o metabolismo cerebral (SMITH et al., 2003). Porém, se e quando os neurônios produzem ou consomem L-lactato durante a atividade neural permanece uma questão controversa (SAN MARTÍN et al., 2013). No entanto, há evidências de que o aumento da atividade neuronal, como observado na neuroplasticidade, envolve um aumento de captação e metabolismo de glicose pelo cérebro, mas estudos adicionais ainda são necessários (SHIMADA et al., 2017). Estudos também observaram que a
atividade neuronal é acompanhada por um aumento agudo de L-lactato tecidual (BARROS, 2013; HU & WILSON, 1997). Este aumento na captação e utilização de L-lactato pelos neurônios está relacionado à captação de glutamato por astrócitos (PELLERIN & MAGISTRETI, 1994).
É amplamente estudada a interação da guanosina com o sistema glutamatérgico, principalmente em eventos que culminam com a excitotoxicidade glutamatérgica. Nestas situações, a GUO é capaz de promover a proteção de células nervosas acometidas por eventos excitotóxicos. Além disso, a guanosina também demonstrou efeitos neurotróficos importantes (LANZNASTER et al., 2016).
1.4 GUANOSINA E O SISTEMA PURINÉRGICO
A sinalização purinérgica parece desempenhar um papel importante na neurodegeneração, neuroproteção, neurorregeneração e na neurogênese (BURNSTOCK, 2017; ROTERMUND, 2019).
As purinas são uma classe de moléculas orgânicas aromáticas essenciais para todas as células, compostas pelas bases nitrogenadas derivadas da adenina e da guanina, incluindo os nucleotídeos com um ou mais fosfatos, como trifosfato (ATP), adenosina-5’-difosfato (ADP), adenosina-5´-monofosfato (AMP), 5’-trifosfato (GTP), guanosina-5’-difosfato (GDP), guanosina-5’-monofosfato (GMP) e os nucleosídeos adenosina, inosina e guanosina. Ainda, fazem parte das purinas as bases nitrogenadas oriundas do seu catabolismo, como a hipoxantina, xantina e ácido úrico (JACKSON et al., 2013; SINGH et al., 2017) (Figura 3).
Os efeitos extracelulares das purinas derivadas da adenina são mediados pelos receptores purinérgicos do tipo P1 ou P2. Os receptores do tipo P2 são receptores para ATP e ADP, e são subdivididos em P2X (ionotrópicos) e P2Y (metabotrópicos, acoplados às proteínas G) (BURNSTOCK; 2017). Os receptores da família P1 são receptores metabotrópicos para adenosina, e são divididos em quatro subtipos: A1 (expresso em todo o SNC), A2A (expresso no estriado, núcleo accumbens, hipocampo e córtex cerebral), A2B (pouco expresso no cérebro) e A3 (moderadamente expresso no cerebelo e hipocampo) (BURNSTOCK, 2017; PALMER & STILES, 1995). Receptores P1 acoplam-se principalmente à adenilato ciclase. A1 e A3 são acoplados negativamente à adenilato ciclase através das proteínas Gi/o (diminuindo
os níveis de AMPc), enquanto que A2A e A2B são acoplados positivamente à adenilato ciclase através de Gs (aumentando os níveis de AMPc) (BURNSTOCK, 2017).
Figura 3 - Sistema purinérgico e a guanosina
Compõem o sistema purinérgico as purinas derivadas das bases nitrogenadas adenina e guanina, incluindo-se os nucleotídeos: adenosina-5’-trifosfato (ATP), adenosina-5’-difosfato (ADP), adenosina- 5´-monofosfato (AMP), e guanosina-5’-trifosfato (GTP), guanosina-5’-difosfato (GDP), guanosina-5’-monofosfato (GMP). Também participam deste sistema os nucleosídeos adenosina, inosina e guanosina, as bases nitrogenadas adenina, guanina, hipoxantina e seus metabólitos xantina e ácido úrico. Os efeitos extracelulares das purinas derivadas da adenina são mediados pelos receptores para adenosina do tipo P1 (metabotrópico), divididos em quatro subtipos: A1, A2A, A2B e A3. Os receptores do tipo P2 são receptores para ATP e ADP, e são subdivididos em P2X (ionotrópicos) e P2Y (metabotrópicos). Ainda não foi identificado um receptor para a guanosina. Figura elaborada usando imagens do BioRender. Fonte: autora
Diferentemente da adenosina, a guanosina (GUO) não possui receptores conhecidos. Apesar de estudos demonstrarem que a GUO possui sítios de ligação específicos, uma proteína receptora própria para a GUO ainda não foi identificada (TRAVERSA et al., 2002; VOLPINI et al., 2011;).
A GUO é o nucleosídeo purinérgico endógeno derivado da guanina com importantes efeitos neuroprotetores e neurotróficos, já descritos em vários estudos (LANZNASTER et al., 2016; RATHBONE et al., 1999; SCHMIDT et al., 2007). No meio extracelular, a GUO pode ser proveniente da defosforilação do GMP por meio da atividade da enzima ecto-5´-nucleotidase,
ou pode ser liberada por células gliais por transportadores de nucleosídeos (LANZNASTER et al., 2016; SCHMIDT et al., 2007).
Em cultura de astrócitos de córtex de ratos após serem submetidas à privação de glicose e oxigênio (PGO) seguida por reoxigenação, condições que mimetizam a isquemia em humanos, observou-se um aumento da liberação de purinas, principalmente as derivadas da guanina, como a guanosina, GTP, GMP e a própria guanina (CICCARELLI et al., 1999). In vivo, em estudo que avaliou isquemia focal no córtex cerebral em ratos, foi observado um aumento na concentração de GUO que começou 2 horas após a isquemia e permaneceu por 7 dias (UEMURA et al., 1991), sugerindo as purinas derivadas da guanina como moléculas com um papel neurorremediador em situações de dano celular, principalmente o dano excitotóxico.
Sabe-se também que a GUO pode atuar aumentando a quantidade de adenosina disponível no meio extracelular e ela própria pode se ligar aos receptores de ADO com baixa afinidade (CICCARELLI et al., 1999; JACKSON et al., 2013; RATHBONE et al., 1991; RATHBONE et al., 1992). In vitro, a GUO demonstrou interação com adenosina e foi capaz de regular a disponibilidade da ADO, aumentando seus níveis extracelularmente (JACKSON et al., 2013), apesar do mecanismo pelo qual isso acontece não estar compreendido.
Além dos efeitos neuroprotetores e tróficos da GUO, têm sido demonstrado que ela apresenta efeitos comportamentais, alguns dos quais envolvendo a participação dos receptores de adenosina. A GUO apresenta efeito antinociceptivo em murinos (SCHMIDT et al., 2010) e este efeito parece ser dependente da ativação dos receptores adenosinérgicos A1 e A2A (SCHMIDT et al., 2010). O tratamento com GUO em camundongos apresentou efeito tipo-ansiolítico, comparado com o fármaco diazepam (VINADÉ et al., 2003) e este efeito parece estar relacionado com a modulação do sistema adenosinérgico, através da ativação dos receptores A1 e do sistema glutamatérgico (ALMEIDA et al., 2017), sugerindo que este nucleosídeo possa modular uma interação entre estes dois sistemas.
É amplamente estudada a interação da GUO com o sistema glutamatérgico, principalmente em eventos que culminam com a excitotoxicidade glutamatérgica. Nestas situações, a GUO é capaz de promover a proteção de células nervosas acometidas por eventos excitotóxicos (LANZNASTER et al., 2016).
A GUO recuperou o comprometimento da captação de glutamato causada pela PGO, um efeito que ocorreu via sinalização acoplada à proteína G sensível à toxina Pertussis e pelo bloqueio do receptor A2A, mas não via receptor A1 (DAL-CIM et al., 2013). A GUO também
reduziu a liberação de glutamato e protegeu as fatias de hipocampo por meio da modulação do transporte reverso de glutamato (DAL-CIM et al., 2016).
A neuroproteção atribuída a GUO foi verificada através de estudos in vivo e in vitro. Em modelos de isquemia in vitro, o tratamento com a GUO previne o aumento da produção de EROs e a despolarização da membrana mitocondrial em fatias hipocampais de ratos (DAL-CIM et al., 2012; 2013; THOMAZ, 2015), além de demonstrar ações anti-inflamatórias pela inibição da ativação do fator nuclear kappa-B. Esses efeitos neuroprotetores foram mediados pelo receptor A1 da adenosina e pela sinalização das vias MAPK/ERK (DAL-CIM et al., 2012; 2013). No entanto, Lanznaster e colaboradores (2019) demonstraram que a GUO não previne a perda de viabilidade celular em fatias hipocampais de camundongos que não expressam o receptor A2A (knock-out para o receptor A2AR) submetidas à PGO, em relação às fatias de animais selvagens. Desta maneira, demonstrou-se que a presença do A2AR é fundamental para a ocorrência do efeito neuroprotetor da guanosina.
Diversos estudos demonstraram o efeito protetor da GUO em modelos de doenças neurodegenerativas. Foi observado que a GUO foi capaz de reduzir a apoptose tanto em cultura de astrócitos de ratos com adição de estauposporina (DI IORIO et al., 2004), quanto em cultura de células de células SH-SY5Y com adição do peptídeo beta-amiloide, (PETTIFER et al., 2004). Esse efeito é mediado pela ativação das vias PI3K/Akt e MAPK (DI IORIO et al., 2004).
Em modelos animais da doença de Parkinson, com o tratamento da GUO foi observada a diminuição de apoptose neuronal e aumento de neurônios dopaminérgicos, acompanhados de redução da bradicinesia (SU et al., 2009).
Também foi observado que a GUO exerce um efeito tipo-antidepressivo que envolve as vias de sinalização da PI3K e da mTOR (BETTIO et al., 2012; BETTIO et al., 2014). Este efeito pode estar relacionado, em parte, à sua capacidade de modular defesas antioxidantes, prevenindo o desequilíbrio oxidativo no hipocampo em animais submetidos à protocolos indutores de estresse (BETTIO et al., 2014).
Porém, quando testada em um paradigma comportamental de avaliação de memória aversiva, a esquiva inibitória, a GUO apresentou efeito amnésico, assim como antagonistas de receptores de glutamato em murinos (ROESLER et al., 2000; VINADÉ et al., 2003; VINADÉ et al., 2004). A GUO também preveniu convulsões induzidas pelo ácido quinolínico, um agonista do receptor glutamatérgico NMDA (SOARES et al., 2004).
Diversos trabalhos demonstraram que além dos efeitos neuroprotetores, a GUO também possui efeitos neurotróficos (RATHBONE et al., 1991; 1992). Dos efeitos tróficos atribuídos a GUO, in vitro foi verificado que a guanosina e a adenosina estimularam a proliferação de diversos tipos celulares e evidências demonstraram que a proliferação foi por meio da ativação do receptor de adenosina A2A (RATHBONE et al., 1992). A estimulação da proliferação de astrócitos in vitro, após adição de guanosina ao meio, aumenta os níveis de AMPc intracelular e seu efeito é abolido após utilização de um antagonista de receptor A2A e aumentado com um antagonista de receptor A1, indicando que o aumento de AMPc pode ser o segundo-mensageiro envolvido neste efeito (RATHBONE et al., 1991).
Em cultura de células PC12 (Feocromocitoma) de ratos, a GUO em sinergismo com o NGF, aumentou a quantidade de neuritos e suas ramificações (GYSBERS & RATHBONE, 1996). E em cultura de astrócitos de camundongos neonatos, verificou-se o aumento dos níveis de mRNA para NGF e aumento da liberação de NGF, após a adição de GUO no meio (MIDDLEMISS et al., 1995). Foi sugerido por Su e colegas (2009) que a GUO também possa aumentar a síntese de outro fator de crescimento, o FGF-2 em ratos. Dessa forma, a GUO pode ter um papel na síntese e liberação de fatores tróficos.
No sistema nervoso periférico, a perda funcional após lesão medular é causada, em parte, pela desmielinização dos axônios que sobrevivem ao trauma e a administração de GUO melhorou a função locomotora e a remielinização da medula espinal e um dos achados foi o aumento da quantidade de células da linhagem de oligodendrócitos endógenos (JIANG et al., 2003).
Estudos demonstraram que a GUO foi capaz de aumentar a proliferação de células progenitoras neuronais na zona subventricular (SU et al., 2009), além de aumentar a quantidade de neurônios imaturos no DG do hipocampo (BETTIO et al., 2016).
Por fim, em meu Trabalho de conclusão de curso, foi verificado que o tratamento com a guanosina, na dose de 8 mg/kg por 25 dias consecutivos, apresentou efeito tipo-antidepressivo no teste de suspensão pela cauda e não demonstrou alteração nos testes comportamentais que avaliaram a memória. Além disso, a GUO foi capaz de induzir a proliferação de células progenitoras neurais na zona subventricular e na zona subgranular do DG da formação hipocampal. No DG da formação hipocampal foi observado que estas células que proliferam, se diferenciam para formar neurônios imaturos, demonstrando que a GUO é
capaz de induzir a neurogênese no DG da formação hipocampal (artigo submetido à publicação) (Figura 4).
Com base no exposto, este trabalho avaliou a modulação da GUO sobre a neuroplasticidade. Investigou-se se a administração de GUO que induziu a neurogênese em camundongos adultos pode aumentar os níveis de fatores tróficos e ativar vias de sinalização que culminam na neurogênese e na sinaptogênese, além de alterar os níveis e/ou funcionalidade de proteínas relacionadas à transmissão purinérgica e glutamatérgica.
Figura 4- Imunomarcação demonstrando o efeito neurogênico da GUO no DG.
Fotomicrografias representativas do DG do hipocampo mostrando células neuroprogenitoras BrdU positivas (em vermelho), um marcador de proliferação celular e a expressão de DCX, um marcador de neurônio imaturo, juntamente com a coloração Hoechst33342 (núcleo). Essas marcações juntas demonstram o efeito neurogênico da guanosina, aumentando a proliferação celular e a diferenciação em neurônios. Barra de escala 100 µm. Fonte: B. Santos e T. Piermartiri.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
Investigar por quais mecanismos a guanosina promoveu um aumento da neurogênese hipocampal em camundongos da linhagem C57BL/6 e se a guanosina é capaz de modular a expressão e a funcionalidade de proteínas envolvidas em outro parâmetro da neuroplasticidade, a sinaptogênese.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Neste trabalho foi verificado se a guanosina na dose e tempo de administração que promoveu a neurogênese, altera no hipocampo:
✓ Níveis dos fatores neurotróficos: BDNF e VEGF.
✓ Vias de sinalização envolvidas na neuroplasticidade e síntese proteica: Akt, ERK 1/2 e sua forma fosforilada pERK 1/2 e a p70S6k e sua forma fosforilada p-p70S6k (Levy et al., 2018).
✓ Proteínas relacionadas à sinaptogênese: PSD-95, sinaptofisina, SNAP-25 ✓ Proteína relacionada à Neurogênese: DCX
✓ Receptor relacionado ao sistema purinérgico: A2A.
✓ Proteínas relacionadas ao sistema glutamatérgico: receptor NMDA e o transportador glial de glutamato GLT-1 (EAAT2).
✓ A funcionalidade do sistema glutamatérgico, através de um protocolo de indução de excitotoxicidade in vitro.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
Foram utilizados 14 camundongos machos da linhagem C57BL/6 com 2 meses de idade no início do experimento. Os animais foram mantidos no Biotério Setorial do Departamento de Bioquímica, em ciclo 12h claro/escuro com acesso a água e alimento à vontade. As metodologias empregadas neste estudo envolvendo o uso de animais foram aprovadas pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da UFSC sob o protocolo CEUA/UFSC – PP955. Os animais foram uma doação do Prof. Dr. Rui Daniel Schroder Prediger.
3.2 ADMINISTRAÇÃO DE GUANOSINA
A guanosina foi administrada via intraperitoneal (8 mg/Kg em 0,9 % salina), uma vez ao dia por 25 dias consecutivos, sendo esta dose escolhida pelo seu efeito promotor de neurogênese hipocampal, previamente verificado (SANTOS, 2017) (Figura 5).
3.3 PREPARAÇÃO DO TECIDO HIPOCAMPAL
A eutanásia dos animais foi realizada por decapitação. O encéfalo foi removido e acondicionado em placas contendo tampão Krebs-Ringer bicarbonato (KRB) sobre o gelo. Em seguida, foi realizada a dissecação encefálica para extração dos hipocampos. Os hipocampos direitos foram utilizados para a imunodetecção de proteínas, enquanto os hipocampos esquerdos foram utilizados para os ensaios de viabilidade celular e para a dosagem de lactato (Figura 5). O tampão KRB apresenta a seguinte composição: NaHCO3 25mM; NaCl 1,22 mM; KH2PO4 0,4mM; KCl 3mM; MgSO4 1,2 mM; CaCl2 1,3 mM e D-Glicose 10 mM. Esta solução tampão foi gaseificada com carbogênio (95% de O2 e 5% de CO2), para atingir o pH de 7,4 e mantida a temperatura de 4 °C (OLIVEIRA et al., 2002).
Figura 5 - Protocolo experimental demonstrando o tratamento, a divisão dos grupos experimentas in vivo e os testes posteriormente realizados.
Os animais receberam injeções intraperitoneais de guanosina 8mg/kg (grupo GUO) ou salina 0,9% (grupo CTL), uma vez ao dia por 25 dias consecutivos. No 26º dia, 24 h após a última injeção, foi realizada a retirada do encéfalo e dissecação dos hipocampos. Com os hipocampos direitos, foi realizado o ensaio de Western blotting para detecção do imunoconteúdo proteico, enquanto os hipocampos esquerdos foram fatiados para a realização do ensaio de viabilidade celular pelo método do MTT, além da quantificação da liberação de lactato pelas fatias após o período de incubação.
3.3.1 Ensaio da viabilidade celular
Com os hipocampos esquerdos, foram obtidas fatias medindo 400 μm de espessura, utilizando-se um fatiador de tecidos (McIlwain Tissue Chopper). As fatias ficaram em recuperação em KRB por 10 min, a 37ºC. Logo após, as fatias foram organizadas entre os seguintes grupos: Hipocampos de animais que receberam a guanosina (grupo GUO) ou a solução salina (0,9%) foram divididos entre o grupo que in vitro recebeu o dano celular excitotóxico e o grupo que recebeu apenas o tampão KRB.
O dano celular excitotóxico foi induzido através da incubação das fatias de hipocampo por 1 hora com glutamato (10 mM) (Molz et al., 2008) em tampão KRB. Após este período, o meio foi retirado e substituído por meio de cultura composto por 50 % de Krebs-Ringer, 50 % de meio de cultura (Dubelco’s-MEM), 20 mM de HEPES (pH 7,4) e as fatias incubadas por mais 4 horas. O meio foi retirado e acondicionado em freezer a -20ºC para a sua posterior utilização no ensaio de dosagem de lactato (descrito no item subsequente). Logo após, o meio foi substituído por uma solução de 0,5 mg/ml de MTT (em 200 μL) e as fatias hipocampais foram incubadas à 37ºC por 30 minutos, para avaliação da viabilidade celular das fatias pelo método
de redução do MTT (brometo de 3-[4,5-Dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólio = Thiazolyl blue) (Figura 6).
O MTT é um sal de tetrazólio solúvel em água, que é convertido a um formazam púrpura insolúvel após clivagem do anel de tetrazólio por desidrogenases mitocondriais ou agentes redutores celulares (Jacobsson & Fowler, 1999). Esta solução foi descartada e o sal de formazam reduzido nas fatias cerebrais foi solubilizado pela adição do mesmo volume de dimetil-sulfóxido (DMSO). A viabilidade celular foi obtida através da leitura da absorbância pelo leitor de placas MultileitoraInfinite 200M (TECAN) em comprimento de onda de 540 nm.
3.3.2 Dosagem de lactato
Após o descongelamento do meio de incubação composto por 50% de Krebs-Ringer, 50% de meio de cultura (Dubelco’s-MEM), 20 mM de HEPES (pH 7,4) e 100 µg/ml de gentamicina em que as fatias foram incubadas por 4 horas, após o dano celular excitotóxico promovido pelo glutamato, foi dosado o lactato liberado no meio de incubação. Foi utilizado o Kit Lactato Enzimático de acordo com as instruções do fabricante (Labtest, ref.: 138) (Figura 6). O sistema utiliza a enzima lactato oxidase na determinação da concentração de lactato presente em uma amostra. O lactato é determinado de acordo com as seguintes reações:
Na presença de oxigênio, a lactato oxidase catalisa a oxidação do ácido lático, promovendo a formação de piruvato e peróxido de hidrogênio. Em seguida, ocorre uma reação de acoplamento entre o peróxido de hidrogênio, 4-aminoantipirina e TOOS (N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina), catalisada pela peroxidase, produzindo uma quinoneimina que tem máximo de absorbância em 550 nm. A intensidade da cor do produto da reação é diretamente proporcional à concentração do lactato na amostra.
Figura 6 - Protocolo experimental demonstrando os grupos amostrais que compõe o teste de MTT e dosagem de lactato.
Os hipocampos de animais que receberam a guanosina ou a salina, grupos GUO e CTL, respectivamente(n=7), foram divididos entre o grupo que in vitro recebeu o dano celular excitotóxico (KRB + GLU) e o grupo que recebeu apenas o tampão KRB. Após 4h de incubação das fatias com KRB + DMEM, este meio foi retirado e acondicionado adequadamente para a quantificação do lactato presente na amostra.
3.4 IMUNODETECÇÃO DE PROTEÍNAS
Após a dissecação dos hipocampos em tampão KRB gelado, foi realizada a homogeneização mecânica em 300 μL de tampão de amostra [Tris 50 mM pH 7,0, EDTA 1 mM, NaF 100 mM, PMSF 0,1 mM, Na3VO4 2 mM, Triton X-100 1%, glicerol 10% e coquetel inibidor de proteases (Sigma-Aldrich)] e os homogenatos foram centrifugados a 10.000 g a 4ºC durante 10 min. Os sobrenadantes foram diluídos 1/1 (v/v) em solução Tris 100 mM pH 6,8/ EDTA 4 mM/ SDS 8%, fervidos durante 5 min e após dosagem de proteínas, (Peterson, 1977) foram adicionados glicerol 40% (glicerol, Tris 100 mM, azul de bromofenol; pH 6,8) na proporção de 25:100 (v/v) e β-mercaptoetanol (concentração final de 8%). As proteínas (80 μg proteínas total/poço) foram separadas por eletroforese em gel SDS-PAGE (gel de poliacrilamida contendo SDS), utilizando géis de entrada 4 % e separação de 8 %, 10 % e 12 %, de acordo com o peso molecular de cada proteína estudada. A eletroforese (sistema de eletroforese vertical mini VE) foi realizada com corrente fixa de 15 mA e voltagem máxima de 150 V por gel durante aproximadamente 2:30 h.
Após a corrida, as proteínas foram transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose (poro 0,45 μm), utilizando-se o aparato para transferência semidry (Amersham Biosciences). Para certificação do processo de transferência, as membranas foram coradas com Ponceau 0,5% em ácido acético 1%.
Em seguida, as membranas foram bloqueadas por 1 h com albumina (ou leite desnatado) 5 % em TBS (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) e lavadas com TBS-T (Tween-20 0,05 %, Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5). Por fim, as membranas foram incubadas com os anticorpos primários específicos contra as proteínas de interesse (Tabela 1). Para a detecção dos complexos imunes, as membranas foram incubadas por 1 h com anticorpo secundário específico (ligado à peroxidase) reativo ao animal que produziu o anticorpo primário (goat
anti-mouse IgGe ou goat anti-rabbit IgG). Após lavagens com TBS e TBS-T, foram reveladas em
fotodocumentador Chemidoc® (BioRad) que emite quimioluminescência induzida por reagentes adicionados a membrana de nitrocelulose (Kit super ECL, Amersham RPN2235), de acordo com as recomendações do fabricante. As imagens foram quantificadas por densidade óptica (D.O.) das bandas proteicas dos complexos imunes (software Image Lab, Bio-Rad 6.1). O imunoconteúdo das proteínas totais foi determinado pela razão da D.O. das bandas pela D.O. da banda de β-tubulina neuronal III. Os níveis das fosfo-proteínas foram determinados pela razão da D.O. da banda fosforilada sobre a D.O. da banda total. Os anticorpos primários empregados e especificações estão sumarizados na Tabela 1.
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados gerados por Western blotting foram analisados por teste-t de Student utilizando-se o software Prisma GraphPad® versão 6.0. Os dados obtidos pelo teste de Viabilidade celular por redução do MTT e a dosagem de lactato foram analisados através de análise de variância (ANOVA) de duas vias seguida pelo post hoc de Bonferroni, utilizando-se os softwares Microsoft Excel® 2016 e GraphPad® 6. Os dados foram expressos como erro padrão da média e foram considerados significativos valores com p < 0,05.
Tabela 1 - Proteínas-alvo e especificações dos anticorpos primários utilizados no ensaio de Western blotting.
Anticorpo Produzido em:
Diluição Código Fabricante/ país
BDNF coelho 1:500 SC20981 SC/EUA
VEGF camundongo 1:1000 SC7265 SC/EUA
A2A coelho 1:200 SC13937 SC/EUA
AKT coelho 1:1000 #9272 CST/EUA
ERK 1/2 coelho 1:20000 #9102 CST/EUA
pERK 1/2 camundongo 1:5000 P0074 Sigma/ EUA
p70S6k coelho 1:1000 #2708 CST/EUA
p-p70S6k coelho 1:1000 #9234 CST/EUA
GluN1 coelho 1:1000 06587 CST/EUA
GLT-1 (EAAT2)
coelho 1:500 SC15317 SC/EUA
DCX coelho 1:1000 4604S CST/EUA
SNAP25 coelho 1:1000 3926S CST/EUA
Sinaptofisina camundongo 1:1000 S5768 Sigma/ EUA
PSD-95 coelho 1:2000 2507S CST/EUA
B tubulina III neuronal
camundongo 1:1000 T8578 Sigma/ EUA
Relação dos anticorpos utilizados neste estudo, em qual animal foi produzido, qual a diluição dos anticorpos primários, o código, o fabricante e país que produziu cada um deles. Abreviações: CST – Cell Signalling Technology, SC – Santa Cruz, EUA – Estados Unidos da América.
4 RESULTADOS
A GUO foi administrada na dose de 8 mg/kg, i.p., por 25 dias consecutivos em camundongos C57BL/6 e as análises de imunoconteúdo proteico e a toxicidade glutamatérgica
in vitro foram realizadas na formação hipocampal. Conforme descrito anteriormente
(SANTOS, 2017), neste mesmo protocolo de tratamento observamos um aumento de proliferação neuronal, ou seja, neurogênese hipocampal. Portanto, analisamos o imunoconteúdo de proteínas envolvidas nos processos de neurogênese e sinaptogênese.
EFEITOS DA GUO NA MODULAÇÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS À NEUROPLASTICIDADE:
Nas análises referentes aos fatores neurotróficos BDNF e VEGF, que ativam importantes vias que culminam na neuroplasticidade, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos CTL e GUO (Figura 7).
Figura 7 - Avaliação dos efeitos da GUO sobre os fatores neurotróficos BDNF e VEGF.
Os valores representam a densidade óptica (D.O.) e são expressos como médias ± E.P.M em comparação com o grupo CTL tratado com veículo. BDNF (p=0,8840; t=0.1491, n=7); e VEGF (p=0,9411; t=0.07862; n=3). Os dados foram avaliados pelo teste t de Student.
Para avaliarmos por quais vias de sinalização intracelular a GUO poderia estar atuando para desempenhar seu efeito neurogênico, analisamos o imunoconteúdo da proteína Akt,
além de investigarmos a fosforilação das proteínas ERK 1/2 e da p70S6k. Não foi verificada diferença estatisticamente significativa entre os grupos CTL e GUO (Figura 8).
Figura 8 - Avaliação do imunoconteúdo de proteínas de vias de sinalização que propiciam à neuroplasticidade.
Os valores representam a densidade óptica (D.O.) e são expressos como médias ± E.P.M em comparação com o CTL tratado com veículo. Akt (p=0,5501; t=0.6330, n=4); p-p70S6k (p=0,5085; t=0.7028; n=4); p-ERK1 (p=0,3855; t=0.9075; n=6); e p-ERK2 (p=0,1302; t=1.686; n=5). Os dados foram avaliados por teste t de Student.
Com o intuito de avaliar uma possível modulação da GUO sobre os níveis de proteínas utilizadas como marcadores do processo de sinaptogênese, foram avaliadas as proteínas PSD-95 (pós-sináptica), Sinaptofisina e SNAP-25 (pré-sinápticas). Além disto, analisamos os níveis da proteína doblecortina (DCX), que é um marcador de neurônio imaturo, portanto utilizada
na avaliação de neurogênese. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos CTL e GUO (Figura 9).
Figura 9 - Avaliação do efeito da GUO sobre proteínas relacionadas à sinaptogênese e à neurogênese.
Os valores representam a densidade óptica (D.O.) e são expressos como médias ± E.P.M em comparação com o CTL tratado com veículo. PSD-95 (p=0,1480; t=1.601, n=5);DCX (p=0,2264; t=1.289; n=6); Sinaptofisina (p=0,2850; t=1.146; n=5); e SNAP-25 (p=0,5284; t=0.6492; n=7). Os dados foram avaliados pelo teste t de Student.
EFEITOS DA GUO NA MODULAÇÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS AOS SISTEMAS PURINÉRGICO E GLUTAMATÉRGICO:
Diversos estudos demonstram que um dos possíveis sítios de interação da guanosina é o receptor adenosinérgico A2A. Dessa forma, avaliamos se houve alteração do seu imunoconteúdo após o tratamento com GUO. Foi observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos CTL e GUO, demonstrando que a GUO pode alterar os níveis do
receptor A2A, sugerindo assim, que esse receptor poderia estar envolvido com o efeito neurotrófico da GUO (Figura 10).
Figura 10 - Avaliação do efeito da GUO sobre os níveis do receptor adenosinérgio A2A.
Os valores representam a densidade óptica (D.O.) e são expressos como médias ± E.P.M em comparação com o CTL tratado com veículo. A2A (p= 0,0305; t=2,517 df=10, n=6). Os dados foram avaliados por teste t de Student.
Investigamos o imunoconteúdo da subunidade GluN1 do receptor NMDA, que é a subunidade obrigatória deste receptor ionotrópico. Verificou-se uma diferença estatisticamente significativa entre os grupos CTL e GUO, sugerindo uma modulação positiva da GUO sobre a sinaptogênese. Ao analisarmos os níveis proteicos do transportador glial de glutamato, GLT-1, foi observada uma redução estatisticamente significativa do seu imunoconteúdo no grupo GUO, em relação ao grupo CTL. Esses resultados demonstram que a modulação da GUO sobre o sistema glutamatérgico poderia promover a neuroplasticidade (Figura 11).
Figura 11 - Avaliação do efeito da GUO sobre o imunoconteúdo da subunidade GluN1 do receptor glutamatérgico NMDA e sobre o transportador glial GLT-1.
Os valores representam a densidade óptica (D.O.) e são expressos como médias ± E.P.M em comparação com o CTL tratado com veículo. NMDAr (p=0,0347; t=2,442, n=6); e GLT-1 (p=0,0027; t=6.614; n=3). Os dados foram avaliados pelo teste t de Student.
EFEITOS DA GUO SOBRE A EXCITOTOXICIDADE GLUTAMATÉRGICA in vitro:
Com o intuito de investigar o possível efeito neuroprotetor da GUO neste tratamento, utilizamos um protocolo de dano hipocampal excitotóxico ex vivo, largamente utilizado em nosso laboratório. As fatias hipocampais advindas de animais que receberam a administração da GUO (8 mg/kg, i.p., por 25 dias) ou veículo (salina 0,9%) foram submetidas à incubação com glutamato (10 mM) e a viabilidade celular foi avaliada conforme descrito na Metodologia. O glutamato in vitro diminuiu a viabilidade celular somente nas fatias hipocampais oriundas dos animais controle (CTL, que receberam salina), mostrando que o tratamento in vivo com a guanosina atenuou o dano glutamatérgico in vitro (Fig. 12).
Figura 12 - Avaliação do efeito da GUO sobre a viabilidade celular de fatias hipocampais submetidas à excitotoxicidade glutamatérgica in vitro.
Os valores representam a densidade óptica (D.O.) de redução do MTT e são expressos como médias ± E.P.M (n =5). CTL: Salina; GUO: guanosina; GLU: glutamato; DMEM: meio de incubação (do inglês: Dulbecco´s modified Eagle medium). Os resultados foram avaliados por ANOVA de duas vias seguida pelo post hoc de Bonferroni, que indicou diferença significativa entre os grupos que receberam Salina: CTL DMEM e CTL GLU (*p<0,005).
Após o dano excitotóxico, também foi avaliado os níveis de lactato presente no meio de incubação, ou seja, a liberação de lactato pelas fatias hipocampais. O glutamato diminui os níveis de lactato extracelular nos dois tratamentos in vivo (Figura 13).
