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robertodeoliveiramarchesini

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Academic year: 2021

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(1)Universidade Federal de Juiz de Fora Pós-Graduação em Ciências Biológicas Mestrado em Comportamento e Biologia Animal. Roberto de Oliveira Marchesini. ESTUDO FILOGENÉTICO DE REPRESENTANTES DA SUBCLASSE PERITRICHIA STEIN, 1859 (ALVEOLATA: CILIOPHORA) COM BASE EM SEQUÊNCIAS DE 18S-rDNA E CARACTERIZAÇÃO MULTIDISCIPLINAR DE Rhabdostyla inclinans KENT, 1881 (PERITRICHIA, EPISTYLIDIDAE). Juiz de Fora 2015 1.

(2) Roberto de Oliveira Marchesini. ESTUDO FILOGENÉTICO DE REPRESENTANTES DA SUBCLASSE PERITRICHIA STEIN, 1859 (ALVEOLATA: CILIOPHORA) COM BASE EM SEQUÊNCIAS DE 18S-rDNA E CARACTERIZAÇÃO MULTIDISCIPLINAR DE Rhabdostyla inclinans KENT, 1881 (PERITRICHIA, EPISTYLIDIDAE). Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Biológicas, Área de concentração: Comportamento e Biologia Animal, da Universidade Federal de Juiz de Fora, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre.. Orientador: Prof. Dr. Roberto Júnio Pedroso Dias Co-orientadores: Prof. Dra. Marta D´Agosto Dr. Marcus Vinicius Xavier Senra. Juiz de Fora 2015 2.

(3) 3.

(4) Roberto de Oliveira Marchesini. ESTUDO FILOGENÉTICO DE REPRESENTANTES DA SUBCLASSE PERITRICHIA STEIN, 1859 (ALVEOLATA: CILIOPHORA) COM BASE EM SEQUÊNCIAS DE 18S-rDNA E CARACTERIZAÇÃO MULTIDISCIPLINAR DE Rhabdostyla inclinans KENT, 1881 (PERITRICHIA, EPISTYLIDIDAE). Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Biológicas, Área de concentração: Comportamento e Biologia Animal, da Universidade Federal de Juiz de Fora, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre.. Aprovado em 23 de fevereiro de 2015. Banca Examinadora:. Prof. Dr. Roberto Júnio Pedroso Dias (Orientador) Universidade Federal de Juiz de Fora. Dr. Marcus Vinicius Xavier Senra Universidade Federal de Juiz de Fora. Dr. Júlio Fernando Vilela Universidade Federal do Rio de Janeiro 4.

(5) Dedico esta dissertação aos meus pais Palmira e Roberto, a minha irmã, Raquel e a minha avó Aparecida, pelo apoio familiar incondicional. A Enir Bastos Marchesini (in memoriam) por inspiração.. 5.

(6) AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por me manter saudável e forte durante a minha caminhada acadêmica e por me cercar de pessoas muito especiais e sempre dispostas a contribuir. É graças à contribuição destas pessoas que finalizo esta pequena etapa de planos maiores que estão por vir. Aos meus pais, Palmira Marchesini e Roberto Marchesini por sempre me apoiarem nos momentos mais difíceis. Por sempre servirem de base para que eu pudesse prosseguir com os meus sonhos e minhas ideias. Serei eternamente grato a tudo que fizeram e fazem por mim. Por isso, dedico a minha dissertação a vocês. À minha família por me apoiar e ajudar sempre em momentos cruciais da minha vida. Ao meu grande orientador, amigo, conselheiro, professor Dr. Roberto Júnio Pedroso Dias, por contribuir muito com minha carreira científica, sendo um exemplo de pessoa a ser seguida tanto como profissional quanto no pessoal. Agradeço pela sua grande paciência em entender e compreender as minhas dificuldades, e principalmente por sua capacidade de motivação que me ajudou a enfrentar as dificuldades inerentes da carreira acadêmica e da vida. À professora Dra. Marta D’Agosto, pelas oportunidades, apoio e confiança desde a iniciação científica. Ao professor Dr. Inácio Domingos da Silva-Neto, por sua disposição em sempre me receber muito bem em seu laboratório na UFRJ e seu grande exemplo em dedicação e paixão no estudo dos ciliados. Ao amigo Dr. Marcus Senra por dedicação nos ensinamentos das técnicas moleculares e ajuda na elaboração das árvores, por sua grande ajuda e paciência, sem ele esta dissertação não teria a qualidade na filogenia molecular que será apresentada. À professora Dra. Sthefane D’Ávila, pela contribuição e dedicação na correção da escrita do capítulo dois dessa dissertação durante o exame de qualificação. À professora Dra. Isabel Martinele por apoio, hospedagem e ajuda durante a coleta na sua cidade natal de Santa Rita de Minas e por sempre estar disposta a ajudar. Ao Professor Dr. Roberto da Gama Alves pelo incentivo a docência e por ser um exemplo de profissional com ética e seriedade em seu trabalho. À todos os professores que contribuíram para minha formação.. 6.

(7) À Parceria com Ana Carolina Lamego, Iara Novelli, Iollanda Ianov e Marcela Miranda que contribuíram com amostras para o presente estudo. Que esta parceria possa ser mantida para trabalhos futuros. Aos alunos do Laboratório do professor Dr. Inácio Domingos da Silva-Neto, Pedro Henrique Campello Nunes e Marcelo Sales por sempre me receberem bem e por terem ajudado com os seus ensinamentos na técnica do Protargol Wilbert (1975) e nos procedimentos da microscopia eletrônica de Varredura. À amiga, Bianca Sartini um agradecimento muito especial. Pois comecei a observar, raspar, triar e identificar os meus primeiros peritríqueos com ela. Sem você não teria condições de chegar onde cheguei. Obrigado por estar ao meu lado sempre, ensinando e escutando todo este tempo. Você foi e será uma grande professora. À amiga e companheira de todas as horas Franciane Cedrola por estar sempre disposta a ajudar em todos os momentos, pelos seus conselhos e por me entender nos momentos mais difíceis. Obrigado por esses quatro anos de Laboratório de Protozoologia e seis anos de convivência na Academia. À doutoranda, amiga e companheira de turma do mestrado, Luisa Oliveira, por sua ajuda diária no Laboratório de Protozoologia, ajudando sempre a manter a organização e as compras fundamentais para a execução dos projetos no Laboratório. Aos antigos amigos do Laboratório de protozoologia da UFJF pelo grande aprendizado e ajuda diária: Alyssa Rossi, Diego Marques e Mariana Rossi. Aos amigos e companheiros de trabalho do laboratório de Protozoologia: Amanda Macedo, Elen Furtado, Felipe dos Santos, Lucas Rieger, Priscila Fregulia, Rafaela Venançoni, Raquel Tostes e Talys Henrique Assumpção pela convivência diária e momentos de descontração. À amiga Rosângela, por ser exemplo de pessoa amiga e caridosa que está sempre disposta ajudar. Aos prestativos membros da secretaria, Marlu, Rita e Osmar sempre dispostos a ajudar e a tirar dúvidas mais burocráticas. À FAPEMIG pela concessão da bolsa de mestrado.. 7.

(8) “Nada em biologia faz sentido, exceto pela luz da evolução.” Theodosius Dobzhansky 8.

(9) LISTA DE ILUSTRAÇÕES. Figura 1. Proposta de classificação dos eucariotos elaborada por ADL et al. (2012), com base em dados moleculares e incluindo táxons recentemente descobertos.......................................23. Figura 1.1. Árvore filogenética de Verossimilhança Máxima (ML) inferida a partir de sequências do gene 18S-rDNA, contendo 1525 pares de base usando o modelo de substituição de. nucleotídeo. GTR+G+I,. com. configuração. mais. estringente.................................................................................................................................57. Figura 1.2. árvore filogenética de representantes das classes Nassophorea, Phyllopharyngea e Oligohymenophorea (barras cinzas) com base em sequências do gene 18S-rDNA.................95. Figura 2. Esquema do ciclo de vida de Epistylis pygmaeum (Peritrichia, Epistylididae) conforme GILBERT & SCHRÜDER (2003)...........................................................................25. Figura 2.2. Rhabdostyla inclinans fotomicrografias do organismo in vivo e desenhos esquemáticos.............................................................................................................................96. Figura 3. Desenhos esquemáticos de representantes das famílias que compõem a ordem Sessilida (Ciliophora, Peritrichia).............................................................................................26. Figura 4. Diferença entre um representante da família Epistylididae em relação a um membro da família Operculariidae..........................................................................................................27. 9.

(10) Figura 5. Características diagnósticas de peritríqueos dos gêneros Zoothamnium (Zoothamniidae) e Carchesium (Vorticellidae)........................................................................28. Figura 6. Esquema de trofontes de três famílias de “peritríqueos sessilídeos”.......................29. Figura. 7.. Hipótese. filogenética. sobre. relação. entre. as. subclasses. da. classe. Oligohymenophorea, destacando relação entre as ordens da subclasse Peritrihia: Sessilida e Mobilida....................................................................................................................................30. Figura 8. Árvore filogenética apresentando relações evolutivas entre ciliados peritríqueos com base nas sequências de 18S-rDNA, com nova proposta de duas ordens para subclasse Peritrichia: Vorticellida e Operculariida...................................................................................31. Figura 9. Árvore filogenética inferida a partir de sequências de 18S-rDNA...........................32. Figura 10. Desenho das principais características necessárias a descrição contemporânea de espécies de protozoários ciliados peritríqueos..........................................................................33. Prancha 1.1 Protozoários ciliados Peritríqueos encontrados em diversos ambientes de água doce em Minas Gerais e com sequências do gene 18S-rDNA..................................................59. Prancha 1.2 Rhabdostyla inclinans epibionte de Aeolosoma hemprichi encontrado em bromélias no Brasil...................................................................................................................98. 10.

(11) LISTA DE TABELAS. Tabela 1. Classificação do Phylum Ciliophora........................................................................24. Tabela 1.1. Espécies de peritríqueos (Ciliophora, Peritrichia) encontrados em diversos ambientes do estado de Minas Gerais com informações sobre ambiente, hospedeiro e localidade (coordenadas geográficas).......................................................................................42. Tabela 1.2. Caracterização morfométrica de Rhabdostyla inclinans (Müller, 1773) Roux, 1901 epibionte de Aeolosoma hemprichi Ehrenberg, 1831.............................................................................83. Tabela 2.2. Comparação entre as populações de Rhabdostyla inclinans encontradas em bromélias do Brasil e as revisadas por FOISSNER et al. (1992)..............................................99. 11.

(12) SUMÁRIO. RESUMO..................................................................................................................................14 ABSTRACT..............................................................................................................................16 INTRODUÇÃO........................................................................................................................18 1. Caracterização geral da subclasse Peritrichia (Alveolata, Ciliophora) ........................18 2. Sistemática. da. Subclasse. Peritrichia:. classificação. tradicional. e. filogenia. molecular.......................................................................................................................19 3. Caracterização multidisciplinar de ciliados..................................................................21 4. Escopo da pesquisa.......................................................................................................22. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................................34. SEÇÃO 1 - ESTUDO FILOGENÉTICO DE REPRESENTANTES DA SUBCLASSE PERTRICHIA. STEIN,. 1859. (ALVEOLATA:. CILIOPHORA). BASEADO. EM. SEQUÊNCIAS DE 18S-rDNA COM ÊNFASE NAS FAMÍLIAS EPISTYLIDIDAE E OPERCULARIIDAE RESUMO..................................................................................................................................38 INTRODUÇÃO........................................................................................................................40 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................................41 Coleta e processamento inicial das amostras................................................................41 Investigação morfológica e identificação das espécies.................................................43 Extração de DNA, amplificação por PCR e sequenciamento.......................................43 Análises filogenéticas....................................................................................................44. RESULTADOS.........................................................................................................................45. DISCUSSÃO............................................................................................................................47 12.

(13) 1. Peritrichia: grupo natural?.......................................................................................47 2. Peritrichia: Operculariida + Vorticellida?...............................................................48 3. Operculariida...........................................................................................................48 4. Vorticellida Utz et al., 2010....................................................................................49 5. 4.1. Vaginicola crystalina: lórica e evolução em Peritrichia..................................49 6. 4.2. Zoothamniidae: grupo natural?........................................................................50 7. 4.3. Epistylididae: um clado ou um grado?.............................................................51 8. 4.4.. “Vorticelídeos”:. Vorticellidae. +. Astylozoidae. +. Ophrydiidae. +. Opisthonectidae.......................................................................................................53 9. Considerações finais................................................................................................55. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................................60. ANEXO 1.1...............................................................................................................................66 ANEXO 1.2...............................................................................................................................69 ANEXO 1.3...............................................................................................................................72 ANEXO 1.4...............................................................................................................................74. SEÇÃO 2 - Rhabdostyla inclinans (CILIOPHORA, PERITRICHIA) EPIBIONTE DE Aeolosoma hemprichi (OLIGOCHAETA, AEOLOSOMATIDAE) EM BROMÉLIAS NO BRASIL: CARACTERIZAÇÃO MULTIDISCIPLINAR E POSIÇÃO FILOGENÉTICA SURPREENDENTE. RESUMO..................................................................................................................................75 INTRODUÇÃO........................................................................................................................76 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................................77 Coleta e processamento das amostras...........................................................................77 Caracterização morfológica...........................................................................................78 Parâmetros ecológicos...................................................................................................78 Caracterização molecular: extração de DNA, PCR e análises filogenéticas.................79. 13.

(14) RESULTADOS.........................................................................................................................81 Morfologia.....................................................................................................................81 Parâmetros ecológicos...................................................................................................82 Caracterização molecular e Posição filogenética..........................................................83. DISCUSSÃO............................................................................................................................84 Morfologia.....................................................................................................................84 Parâmetros ecológicos...................................................................................................85 Filogenia Molecular......................................................................................................88 1.. Rhabdostyla inclinans é um vorticelídeo com características morfológicas de epistilídeo? ........................................................................................................88. 2.. Rhabdostyla. e. Epistylis. representam. um. exemplo. de. convergência. evolutiva?...........................................................................................................90 3.. A relação filogenética entre os “rabdostilídeos”...............................................91. 4.. Importância da caracterização multidisciplinar de ciliados Peritrichia.............92. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................100. ANEXO 2.1.............................................................................................................................109 ANEXO 2.2.............................................................................................................................112 ANEXO 2.3.............................................................................................................................115 ANEXO 2.4.............................................................................................................................118. CONSIDERAÇÕES FINAIS..................................................................................................120. 14.

(15) RESUMO. O presente trabalho amplia o conhecimento acerca da filogenia de microeucariotos ciliados (Alveolata, Ciliophora) da subclasse Peritrichia Stein, 1859 baseada em análises de sequências de 18S-rDNA e compara sistemática tradicional do grupo com a filogenia baseada em dados moleculares. A proposta apresenta ainda a caracterização multidisciplinar de uma espécie de ciliado peritríqueo epistilídeo com dados morfológicos, ecológicos e moleculares. A dissertação está dividida em dois capítulos (seções). No capítulo 1 foi realizado um estudo filogenético de representantes da subclasse Peritrichia, com inclusão de 12 novas sequências de 18S-rDNA (11 espécies e quatro gêneros - Epistylis, Opercularia, Orborhabdostyla, Rhabdostyla) obtidas de organismos coletados em ecossistemas na região Sudeste do Brasil, mais precisamente no estado de Minas Gerais. Neste capítulo foi discutida a validade de algumas famílias da subclasse Peritrichia e investigado se as principais características morfológicas usadas para definir a sistemática do grupo refletem genuína divergência evolutiva. As principais contribuições deste estudo foram: 1a subclasse Peritrichia está dividida em dois grandes clados; 2a família Operculariidae parece ser um grupo natural; 3a família Epistylididae é um grado e não um clado natural e, portanto, necessita de importante revisão sistemática, havendo representantes desta família se agrupando em distintos ramos da subclasse Peritrichia, 4os epistilídeos Rhabdostyla e Orborhabdostyla não se agruparam em mesmo clado tal como estabelecido na sistemática atual, baseado em similaridades morfológicas, 5a família Zoothamniidae é parafilética, e 6os “vorticelídeos” não constituem um agrupamento natural, necessitando de importante revisão das principais características morfológicas usadas atualmente como sinapomorfias morfológicas. No capítulo 2 (seção 2) foi realizada caracterização multidisciplinar de uma população de Rhabdostyla inclinans epibionte de anelídeos Aeolosomatidae coletada em tanques de bromélia. Neste estudo foi discutida pela primeira vez a posição filogenética de um representante do gênero Rhabdostyla dentro da subclasse Peritrichia e apresentado dados detalhados da morfologia desta população, bem como informações ecológicas sobre a relação epibiótica. As duas sequências de 18S-rDNA de R. inclinans obtidas se agruparam entre representantes da família Vorticellidae, o que refuta a classificação tradicional deste gênero como um epistilídeo (Epistylididae) baseada em caracteres morfológicos. Os resultados moleculares ressaltam necessidade de se ampliar número de sequências de espécies do gênero Rhabdostyla nos bancos de dados genéticos para melhor entendimento da filogenia de peritríqueos epistilídeos¸ 15.

(16) bem como instiga revisão e busca de novos caracteres morfológicos a serem usados como sinapomofias dos clados que compõem a subclasse Peritrichia. Palavras-chave:. Epistylis,. filogenia. molecular,. Opercularia,. Operculariidae,. Orborhabdostyla, sistemática.. 16.

(17) ABSTRACT. This work extends the knowledge of the phylogeny of ciliated micro-eukaryote (Alveolata, Ciliophora) of Peritrichia Stein, 1859 subclass based on analysis of 18S-rDNA sequences and compares traditional systematics of the group to the phylogeny based on molecular data. The proposal also presents a multidisciplinary characterization of Rhabdostyla inclinans (Peritrichia, Epistylididae) with morphological, ecological and molecular data. The dissertation is divided into two chapters (sections). In Chapter one (section 1) a phylogenetic study of representatives of Peritrichia subclass was performed with inclusion of 12 new sequences of 18S-rDNA (11 species and four genera - Epistylis, Opercularia, Orborhabdostyla, Rhabdostyla) obtained from organisms collected in ecosystems in the Southeast region Brazil, more precisely in the state of Minas Gerais. In this chapter was discussed the validity of some families of peritrichs and investigated whether the main morphological characteristics used to define the systematics of the group reflect genuine evolutionary divergence. The main contributions of this study were: 1Peritrichia subclass is divided in two major clades; 2Operculariidae family seems to be a natural group; 3There are representatives of the Epistylididae family grouping in different branches of the subclass Peritrichia. This fact suggests that Epistylididae family is a grade and not a natural clade and therefore requires systematic review. ; 4The Rhabdostyla and Orborhabdostyla epistilids did not grouped in the same clade as set out in the current system based on morphological similarities; 5Zoothamniidae family is paraphyletic; 6vorticelids did not formed a natural group requiring major review of the main morphological features currently used as morphological synapomorphies. In chapter two (section 2) was performed a multidisciplinary characterization of epibionts population of Rhabdostyla inclinans on Aeolosomatidae collected in bromeliad tanks in Brazil. This study discusses for the first time phylogenetic placement of the Rhabdostyla genus within peritrich subclass and presents detailed morphology data for this population. Data about information of Epibiotic relationship are presented too. The two 18S-rDNA sequences of Rhabdostyla inclinans obtained clustered with representatives of Vorticellidae family, which refutes the traditional classification of this genus as a epistilid (Epistylididae) based on morphological characters. The molecular results highlight the need to expand the number of sequences of Rhabdostyla genus in genetic databases to better understand the phylogeny of epistilids peritrichs and instigate review and 17.

(18) search for new morphological characters to be used as synapomorphy of clades that constitute Peritrichia subclass. Keywords: Epistylis, molecular phylogeny, Opercularia, Operculariidae, Orborhabdostyla systematics.. 18.

(19) INTRODUÇÃO. 1. Caracterização geral da subclasse Peritrichia (Alveolata, Ciliophora) Os microeucariotos ciliados (Ciliophora) estão inseridos atualmente em um clado conhecido como SAR (Stramenopiles (Patterson, 1989) ADL et al. 2005, Alveolata CavalierSmith, 1981, Rhizaria Cavalier-Smith, 2002) em classificação baseada em múltiplos marcadores moleculares (Figura 1; p. 23), sendo os Alveolata constituídos pelos clados Apicomplexa Levine, 1980, Dinoflagellata Bütschli, 1885 e Ciliophora Doflein, 1901 (ADL et al., 2012). A monofilia do filo Ciliophora é suportada tanto por dados moleculares (múltiplos marcadores) como por sinapomorfias morfológicas (aparato nuclear, conjugação e infraciliatura) e está dividido em dois subfilos e 11 classes (Tabela 1; p. 24). A classe Oligohymenophorea de Puytorac et al., 1974 possui seis subclasses, dentre elas a subclasse Peritrichia (sensu LYNN, 2008), contendo mais de 1000 espécies descritas. Os peritríqueos estão divididos em duas ordens: Sessilida Kahl, 1933 e Mobilida Kahl, 1933 (LYNN, 2008). Os sessilídeos (Ordem Sessilida) são um grupo de peritríqueos caracterizados pela presença de um ciclo de vida polimórfico, com grande parte dos táxons apresentando uma fase séssil no ciclo de vida. As duas fases do ciclo são o trofonte (geralmente séssil) e o telotróquio (livre natante) (Figura 2, a-b: trofonte, d: telotróquio; p. 25). Estes ciliados são comumente encontrados em ecossistemas marinhos e de água doce, sendo raros em ecossistemas edáficos (FOISSNER et al., 1999). Os trofontes são responsáveis pela nutrição do organismo usando desenvolvida ciliatura adoral para filtrar partículas em suspensão, bactérias e outros microeucariotos (CORLISS, 1979; LYNN, 2008). O trofonte possui um zoóide (organismo responsável pelas funções fisiológicas) e um pedúnculo proteico (haste que prende o zoóide ao substrato). O telotróquio é o “zoóide” livre-natante responsável pela dispersão. e. reprodução. sexuada. em. ciliados. peritríqueos,. sendo. diferenciado. morfologicamente do trofonte por apresentar uma ciliatura somática desenvolvida na região aboral (banda telotrocal), o que permite sua natação em busca de substrato ideal para fixação (GILBERT & SCHRÖDER, 2003). O telotróquio possui reduzida ciliatura oral (pequenos “bastões”) (WILLIAMS & CLAMP, 2007), sendo incapaz de se alimentar, tendo como função primordial dispersão e reprodução. A complexidade fisiológica, plasticidade ecológica e predileção por ambientes enriquecidos organicamente torna este grupo de ciliados bons indicadores da qualidade da água de ecossistemas aquáticos continentais (MADONI, 2005). 19.

(20) Os sessilídeos podem ser encontrados aderidos a substratos inanimados e vivos, havendo ampla gama de estudos sobre a relação epibiótica entre sessilídeos e invertebrados e vertebrados aquáticos (CORLISS, 1979; DIAS et al., 2008, 2009; FERNANDEZLEBORANZ & TATO-PORTO, 2000; FOISSNER et al., 1992; KAHL, 1935; SMITH, 1986). Segundo COOK et al. (1998) a epibiose pode ter natureza oportunista, facultativa e não especializada, com os epibiontes colonizando substratos inertes, animais e plantas ou associações obrigatórias e altamente específicas, havendo adaptações morfológicas e comportamentais entre epibionte e basibionte (hospedeiro) que proporcionam este modo de vida (WAHL, 1989). Os mobilídeos (Ordem Mobilida) são um grupo de peritríqueos móveis e simbiontes com corpo discóide, apresentando região aboral côncava e adoral convexa, possuindo um complexo disco adesivo de constituição proteica no polo aboral responsável pela adesão temporária ao substrato. O disco adesivo é a principal característica morfológica dos mobilídeos, sendo uma sinapomorfia para o grupo (ZHAN et al., 2009). Os mobilídeos podem ser encontrados vivendo como comensais ou parasitos em diversos hospedeiros vertebrados e invertebrados, alimentando-se das bactérias e detritos presentes na epiderme destes hospedeiros. Em casos de grande infestação e em hospedeiros debilitados estes organismos podem agravar o estado de saúde dos seus hospedeiros os levando a morte (LOM, 1995).. 2. Sistemática da Subclasse Peritrichia: classificação tradicional e filogenia molecular A classificação estabelecida para os peritríqueos sessilídeos propõe divisão deste grupo em 14 famílias (Figura 3; p. 26). A família Epistylididae Kahl, 1933 apresenta como principal característica morfológica zoóide com aparato oral “epistiliforme” (colar peristomial proeminente e disco peristomial largo) e pedúnculo rígido sem espasmonema e aqueles da família Operculariidae Fauré-Fremiet in Corliss, 1979 com pedúnculo semelhante aos epistilídeos apresentam região oral “operculariforme” (colar peristomial não-eversível e disco peristomial com pedúnculo alongado) (Figura 4; p. 27). Os representantes das famílias Vorticellidae Ehrenberg, 1838 e Zoothamniidae Sommer, 1951 possuem espasmonema no pedúnculo, havendo diferença apenas no modo de contração desta fibrila (LYNN, 2008). Em Vorticellidae o modo de contração do espasmonema é espiral, enquanto que em Zoothamniidae o modo de contração é em zigue-zague (Figura 5; p. 28). A família Vaginicolidae de Fromentel, 1874 (Figura 3; p. 26, 12) é representada por organismos que 20.

(21) possuem uma lórica que está presa ao substrato obliquamente e não possui um pedúnculo em sua base (KAHL, 1935). As famílias Astylozoidae Kahl, 1935 e Opisthonectidae Foissner, 1976 são formadas por organismos que não possuem um trofonte típico (Figura 6; p. 29), sendo a primeira composta por organismos semelhantes ao trofonte e com pedúnculo não desenvolvido, enquanto na segunda família encontramos organismos similares a telotróquios com desenvolvida ciliatura da banda telotrocal (WILLIAMS & CLAMP, 2007). A família Ophrydiidae Ehrenberg, 1838 (Figura 3; p. 26, 6) possui pedúnculo sem mionema, vacúolo contrátil com um longo canal coletor e matriz extracelular gelatinosa unindo os zoóides da colônia (LYNN, 2008). Nesta introdução apresentamos apenas detalhes morfológicos das famílias que serão abordadas no capítulo 1 desta dissertação. A primeira sequência de 18S-rDNA para um ciliado peritríqueo foi obtida por LYNN & SOGIN (1988) para Opisthonecta henneguyi Fauré-Fremiet, 1906 (Peritrichia, Opisthonectidae). Entretanto, o primeiro estudo interessado na filogenia interna de Peritrichia foi realizado por MIAO et al. (2001) ao acrescentar seis novas sequências de 18S-rDNA de peritríqueos dos gêneros Epistylis Ehrenberg, 1830 e Vorticella Linnaeus, 1767. Em estudo mais aprofundado, utilizando sequências de 18S-rDNA de representantes de oito famílias da subclasse Peritrichia, MIAO et al. (2004) detectaram contrastes entre a sistemática tradicional da subclasse e a hipótese filogenética apresentada nesta proposta com base em dados moleculares. Um exemplo evidente foi o agrupamento do epistilídeo Epistylis galea Ehrenberg, 1831 entre os opercularídeos, algo que diverge em muito da proposta de classificação do grupo. Este estudo despertou atenção para necessidade de se ampliar número de sequências de 18S-rDNA para ciliados peritríqueos a fim de melhor esclarecer a filogenia interna neste clado. Estudos posteriores sobre filogenia de Peritrichia, utilizando sequências de 18S-rDNA, contestaram a monofilia das seguintes famílias: Astylozoidae (SUN et al., 2011, 2012 a; WILLIAMS & CLAMP, 2007), Epistylididae (UTZ et al., 2010), Ophrydiidae (UTZ et al., 2010; WILLIAMS & CLAMP, 2007), Vorticellidae (SUN et al., 2011, 2012 a; UTZ et al., 2010, WILLIAMS & CLAMP, 2007) e Zoothamniidae (CLAMP & WILLIAMS, 2006; LI et al., 2014). Com ampliação de sequências de 18S-rDNA de ciliados mobilídeos GONG et al. (2006) investigaram a monofilia de Peritrichia contendo as ordens Sessilida e Mobilida, corroborando formato espiral da ciliatura oral como sinapomorfia do grupo, entretanto, os dados moleculares não suportaram esta hipótese, que posteriormente foi rejeitada por ZHAN et al. (2009), que sugeririam que esta similaridade morfológica se tratava de convergência 21.

(22) evolutiva visto mesmo hábito de vida séssil de sessilídeos e mobilídeos. Estes autores propuseram a criação da nova subclasse Mobilia Kahl, 1933 para incluir os antigos mobilídeos (ordem Mobilida) independente da subclasse Peritrichia (Figura 7; p. 30). Em investigação da filogenia interna da subclasse Peritrichia (sensu ZHAN et al., 2009) com inclusão de novas sequências de 18S-rDNA de epistilídeos e opercularídeos UTZ et al. (2010) propuseram divisão de peritríqueos em dois clados, as ordens: Operculariida Jankowski, 1980 e Vorticellida de Fromentel, 1875 (Figura 8; p. 31). Contudo, não foram propostas diagnoses, incluindo caracteres morfológicos exclusivos, para estas duas novas ordens, não havendo, até o momento, sinapomorfias para reconhecer estes táxons. Em estudo recente sobre validade do gênero Vorticella, SUN et al. (2012) demonstraram, com base em sequências de 18S-rDNA, que este gênero é um grado e não um clado (Figura 9; p. 32). Os autores demonstraram ainda que alguns representantes do gênero Vorticella, se agrupam em clado contendo representantes das famílias Astylozoidae e Opisthonectidae.. 3. Caracterização multidisciplinar de ciliados O entendimento sobre a sistemática e/ou parentesco evolutivo entre os microeucariotos ciliados, assim como de outros grupos de organismos, dependeram e dependem dos avanços tecnológicos da época (LYNN, 2008). Podemos dividir o conhecimento sobre sistemática de Ciliophora em cinco “Eras”, conforme recursos disponíveis na época. A Era da descoberta (1880–1930) foi a primeira, seguida pela Era da exploração (1930 –1950). Estas duas Eras foram baseadas em observações dos organismos com microscopia de luz e elaboração de desenhos esquemáticos detalhados, tendo como base conceitual que a evolução partia de formas mais simples para mais complexas. A Era da infraciliatura (1950–1970) foi baseada no uso de técnicas de impregnação pela prata que revela estruturas do córtex destes microorganismos, havendo importante progresso na descoberta de novas estruturas usadas na taxonomia e sistemática do grupo (Figura 10; p. 33). Na Era da ultraestrutura (1970–1990) detalhes minuciosos da infraciliatura oral dos ciliados foram desvendados com importantes progressos no entendimento da relação evolutiva das ciliaturas somática e oral entre os diversos grupos de ciliados. A Era atual, após advento da biologia molecular (1990–atual), se destina a entender as relações evolutivas entre os grupos de ciliados (YI & SONG, 2011) bem como melhor elucidar o conceito de espécies e biogeografia para estes organismos (GENTEKAKI & LYNN, 2010). 22.

(23) Estudos atuais tem demonstrado necessidade de se aplicar uma abordagem multidisciplinar na caracterização das espécies de ciliados para melhor elucidar as relações filogenéticas entre diversos grupos deste filo (FOISSNER et al., 2003; MODEO et al., 2006, 2013; ROSATI et al., 2004). MODEO et al. (2003) recomendam que estudos sobre caracterização taxonômica de espécies de ciliados deveriam informar dados sobre morfologia, ecologia e posição filogenética usando ao menos sequência de18S-rDNA. Estas descrições completas e robustas facilitarão a comparação entre espécies e serão úteis na interpretação da evolução do grupo para pesquisas futuras (MODEO et al., 2003; ROSATI et al., 2004). Visto que grande parte das mais de 8.000 espécies de ciliados foi descrita apenas com informações in vivo destes micro-organismos, é essencial incluir nos novos estudos taxonômicos uma caracterização multidisciplinar da espécie bem como realizar depósito de lâminas e DNA destes organismos em coleções reconhecidas (MODEO et al., 2003). Ao entendermos as Eras da ciliatologia, fica clara necessidade de realização de descrições e redescrições da ciliatofauna usando esta abordagem multidisciplinar.. 4. Escopo da pesquisa O presente trabalho apresenta estudo filogenético expandido sobre a subclasse Peritrichia (Ciliophora, Oligohymenophorea) e a caracterização multidisciplinar de uma espécie de ciliado deste grupo ressaltando a necessidade destas informações integradas para melhor esclarecimento da taxonomia e sistemática do grupo. A dissertação está dividida em duas seções. No capítulo 1 (seção 1) foram comparados dados da filogenia interna da subclasse Peritrichia, incluindo 12 novas sequências de 18S-rDNA para 11 espécies deste grupo, com a sistemática atual proposta para esta subclasse e interpretada a validade das sinapomorfias morfológicas atuais para definição de algumas famílias e gêneros. No capítulo 2 (seção 2) foram apresentados dados sobre a morfologia, morfometria, ecologia (relação epibiótica) e posição filogenética de Rhabdostyla inclinans (Peritrichia, Epistylididae) registrado pela primeira vez na América do Sul em tanques de bromélias infestando anelídeos da família Aeolosomatidae. Os dados obtidos trouxeram importantes avanços para o conhecimento sobre taxonomia e sistemática da subclasse Peritrichia e despertou o interesse para investigações de novos caracteres morfológicas e utilização de diferentes marcadores moleculares com intuito de entender a genuína divergência evolutiva em Peritrichia.. 23.

(24) Figura 1. Proposta de classificação dos eucariotos elaborada por ADL et al. (2012), com base em dados moleculares e incluindo táxons recentemente descobertos. Os antigos “protistas” ciliados (Filo Ciliophora: indicado na seta) se inserem nesta proposta no táxon SAR (diatomáceas, alveolados e amebóides) dentro de Alveolata.. 23.

(25) Tabela 1. Classificação do Phylum Ciliophora (LYNN, 2008)*. a táxon. estabelecido com base em dados moleculares, mas sem sinapomorfias morfológicas. Tabela 1. Classificação do Phylum Ciliophora. Fonte: LYNN (2008). Marcados com quadrado: Phylum Ciliophora, Classe Oligohymenophorea e Subclasse Peritrichia com suas respectivas ordens.. 24.

(26) Estágio livrenatante. Estágio não livre-natante. Figura 2. Esquema do ciclo de vida de Epistylis pygmaeum (Peritrichia, Epistylididae). Estágios do ciclo de vida: (a) zoóide recém-fixado (CORLISS, 1979), (b) colônia com dois zoóides, (c) zoóide livre-natante, (d) telotróquio (CORLISS, 1979) e (e) cisto. Setas pretas indicam caminhos bem estudados para peritríqueos e as setas em cinza indicam possíveis caminhos que necessitam de mais estudos a fim de maior esclarecimento. Fonte: Modificado de GILBERT & SCHRÜDER (2003).. 25.

(27) Figura 3. Desenhos esquemáticos de representantes das famílias que compõem a ordem Sessilida (Ciliophora, Peritrichia). Os círculos em volta dos números indicam as famílias que já possuem ao menos um representante com 18S-rDNA sequenciado. Legenda: 1. Astylozoidae; 2. Ellobiophryidae; 3. Epistylididae; 4. Lagenophryidae; 5. Operculariidae; 6. Ophrydiidae; 7. Opisthonectidae; 8. Rovinjellidae; 9. Scyphidiidae; 10. Termitophryidae; 11. Usconophryidae; 12. Vaginicolidae; 13. Vorticellidae; 14. Zoothamniidae. Fonte: Modificado de LYNN & SMALL (2002).. 26.

(28) O PD. OC. PC. Figura 4. Diferença entre um representante da família Epistylididae em relação a um membro da família Operculariidae. As setas largas indicam a diferença entre as áreas peristomiais. A- Estrutura oral “epistiliforme” constituído por colar peristomial evertido e disco peristomial curto e largo. B- Estrutura oral “operculariforme” constituído por um disco peristomial largo e pedunculado formando um Opérculo, colar peristomial não evertido. Legenda: PC = colar peristomial; PD = disco peristomial; O = opérculo; OC = ciliatura oral. Fonte: FOISSNER et al. (1992).. 27.

(29) Figura 5. Características diagnósticas de peritríqueos dos gêneros Zoothamnium (Zoothamniidae) e em Carchesium (Vorticellidae). Na parte superior da imagem está apresentada a diferença na estrutura do espasmonema contrátil (extensão do corpo celular no interior do pedúnculo), sendo contínuo em Zoothamnium e descontínuo Carchesium. Na parte inferior da imagem está demonstrada a forma de contração do espasmonema no pedúnculo destes organismos. No gênero Vorticella, o mionema é contínuo, mas como um membro da família Vorticellidae a contração do espasmonema é em espiral. Em Zoothamnium (família Zoothamniidae) a contração é em zigue-zague. Fonte: Modificado de CLAMP & WILLIAMS (2006).. 28.

(30) Figura 6. Esquema de trofontes de três famílias de “peritríqueos sessilídeos”. Trofonte de vorticelídeo (centro) se fixa ao substrato por meio de um pedúnculo (St) que possui um espasmonema contrátil (filamento sólido) em seu centro. A banda telotrocal (TB) dos cinetossomos está inativa, com cílios não funcionais. Trofonte astylozóide (direita) utiliza a ciliatura oral (OC) do seu peristômio para nadar e se alimentar. Como nos vorticelídeos, falta ciliatura telotrocal ciliada. A escópula do astylozoídeo é inativa. Geralmente há um vestígio de pedúnculo (VSt) a partir da escópula. Trofonte de opistonectídeo (esquerda) utiliza a ciliatura da banda telotrocal para nadar. Os cílios orais são utilizados somente para alimentação. Não há vestígio de pedúnculo associado à escópula (Sc). Fonte: WILLIAMS & CLAMP (2007).. 29.

(31) Oligohymenophorea Figura 7. Hipótese filogenética sobre relação entre as subclasses da classe Oligohymenophorea, destacando relação entre as ordens da subclasse Peritrihia: Sessilida e Mobilida, com base em sequencias de 18S-rDNA e apresentando valores de bootstrap conforme quatro métodos de reconstrução: análise bayesiana (BI), verossimilhança máxima (ML), parcimônia máxima (MP) e agrupamentos vizinhos (NJ). Símbolos ao lado do nome dos táxons são os números de acesso no GenBank de cada sequência. *: valores de bootstrap < 50. N: incongruência na topologia naquele ramo conforme método de reconstrução filogenética utilizado. Novas sequências acrescentadas neste estudo estão em negrito. Fonte: ZHAN et al. (2009).. 30.

(32) Figura 8. Árvore filogenética apresentando relações evolutivas entre ciliados peritríqueos com base nas sequências de 18S rDNA, com nova proposta de duas ordens para subclasse Peritrichia: Vorticellida e Operculariida. Os valores acima dos ramos indicam suporte de bootstrap para o nó ao lado por máxima verossimilhança (ML) e máxima parcimônia (MP). Os valores abaixo dos ramos indicam a probabilidade posterior estimada pelo algoritmo de agrupamento de vizinhos (NJ) e pela inferência Bayesiana (BI). Fonte: UTZ et al. (2010). 31.

(33) Figura 9. Árvore filogenética inferida a partir de sequências de 18S-rDNA. Valores numéricos mostrados próximos aos nós são valores de bootstrap para as análises de Máxima Verossimilhança (ML), Máxima Parcimônia (MP) e Agrupamento de Vizinhos (NJ), respectivamente. A barra de escala corresponde a 10 substituições por 100 posições de nucleotídeos. A classificação segue LYNN (2008). As fotografias ao lado dos clados mostram a morfologia geral dos gêneros. Fonte: SUN et al. (2012).. 32.

(34) DORSAL. PD. AC. 21c Vestíbulo. VENTRAL. UM PC CV2. Mi. V CS. CV1. UM. AC. EM. FV. Ma. GK. CF V. FV My. SS. FR. AW PK1. PK3. CS. PK2. CF. Sc My´. St. 21a. 21b. Figura 10: Esquema com as principais características necessárias a descrição contemporânea de espécies de protozoários ciliados peritríqueos com alta qualidade e confiabilidade. a- Peritríqueo b- Infraciliatura oral c- Visão superior do peritríqueo com determinação da região dorsal e ventral por meio do infundíbulo. AC= ciliatura espiral adoral; AW= coroa ciliar aboral; CF= citofaringe; CS= citóstoma; CV1= primeiro vacúolo contrátil 1; CV2= segundo vacúolo contrátil, raro entre os peritríqueos; EM= membrana epistomial; FR= filamento reticular; FV= vacúolo alimentar; GK= cinécia germinal; Ma= macronúcleo; Mi= micronúcleo; My= mionema somático; My’= mionema do pedúnculo ou espasmonema; PC= colar peristomial; PD= disco peristomial; PK1-3= policinécias infundibulares ou orais 1,2 e 3; SC= escópula; SS= estriações peliculares (“silver line system”); ST= pedúnculo; UM= membrana ondulante; V= vestíbulo. Fonte: FOISSNER et al. (1999).. 33.

(35) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ADL, S.M.; SIMPSON, A.G.; LANE, C.E.; LUKES, J.; BASS, D.; BOWSER, S.S.; BROWN, M.; BURKI, F.; DUNTHORN, M.; HAMPL, V.; HEISS, A.; HOPPENRATH, M.; LARA, E.; IEGALL, L.; LYNN, D.H.; MCNAUS, H.; MITCHELL, E.A.D.; MOZLEYSTANRIDGE, S.E.; PARFREY, L.W.; PAWLOWSKY, J.; RUECKERT, S.; SHADWICK, L.; SCHOCH, C.; SMIRNOV, A.; SPIGEL, F.W. The revised classification of eukaryotes. The Journal of Eukaryotic Microbiology, v.59, n. 5, p. 429-514, 2012. CLAMP, J. C.; WILLIAMS, D. A molecular phylogenetic investigation of Zoothamnium (Ciliophora, Peritrichia, Sessilida). Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 53, p. 494-498, 2006.. CORLISS, J.O. The ciliated protozoa. Pergamon Press, London, 455p, 1979.. COOK, J. A.; CHUBB, J. C.; VELTKAMP, J. Epibionts of Asellus aquaticus (L.) (Crustacea, Isopoda): an SEM study. Freshwater Biology, v. 39, p. 423-438, 1998.. DIAS, R. J. P.; CABRAL, A. F.; MARTINS, R. T.; STEPHAN, N. N. Occurrence of peritrich Ciliates on Limnic ologochete Limnodrilus hoffmeisteri in Neotropic. Journal of Natural History, v. 43, p.1-15, 2009.. FERNANDEZ-LEBORANS, G.; TATO-PORTO M. L. A review of the species of protozoan epibionts on crustaceans. i. peritrich ciliates. Crustaceana, v. 73, n. 6, p. 643-683, 2000.. FOISSNER, W.; BERGER, H.; KOHMANN, F. Taxonomische und ökologoische Revision der Ciliaten des Saprobiensystems-Band II: Peritrichia, Heterotrichida, Odontostomatida. Informationsberichte des Bayer. Landesamtes für Wasserwirtschaf, v. 92, p. 1-502, 1992.. FOISSNER, W.; STRÜDER-KYPKE M.; VAN DER STAAY, G. W. M.; MOON-VAN DER STAAY, S.-Y.; HACKSTEIN, J. H. P. Endemic ciliates (Protozoa, Ciliophora) from tank bromeliads (Bromeliaceae): a combined morphological, molecular, and ecological study. European Journal of Protistology, v. 39, p. 365-372, 2003. 34.

(36) GENTEKAKI, E.; LYNN, D. H. Evidence for cryptic speciation in Carchesium polypinum Linnaeus, 1758 (Ciliophora: Peritrichia) inferred from mitochondrial, nuclear, and morphological markers. Journal of Eukaryotic Microbiology, v.57, n. 6, p. 508-519, 2010.. GILBERT, J. J.; SCHRÖDER, T. The ciliate epibiont Epistylis pigmaeum: selection for zooplakton hosts, reproduction and effect on two rotifers. Freshwater Biology, v. 48, p. 878896, 2003.. GONG, Y.-C.; YU, Y.-H.; VILLALOBO, E.; ZHU, F.-Y.; MIAO, W. Reevaluation of the phylogenetic. relationship. between. mobilid. and. sessilid. peritrichs. (Ciliophora,. Oligohymenophorea) based on small subunit rRNA genes sequences. Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 53, p. 397-403, 2006.. KAHL, A. Peritrichia und Chonotricha, p. 651-885. In: Urtiere Oder Protozoa. Deutschlands, G. Fischer, 1935.. LOM, J. The morphology and morphogenesis of the buccal ciliary organelles in some peritrichous ciliates. Arch. Protistenkd, v. 107, p. 131-162, 1964.. LYNN, D. H. The Ciliated Protozoa. Characterization, Classification, and Guide to the Literature, 3rd ed. Springer, Dordrecht, 605 p, 2008.. MADONI, P. Ciliated protozoans communities and saprobic evaluation of water quality in the hilly zone of some tributaries of the Po River (northern Italy). Hydrobiologia, v. 541, p. 5569, 2005.. MIAO, W.; YU, Y.-H.; SHEN, Y.-F. Phylogenetic relationships of the Subclass Peritrichia (Oligohymenophorea, Ciliophora) with emphasis on the genus Epistylis, inferred from small subunit rRNA gene sequences. Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 48, p. 583-587, 2001.. 35.

(37) MIAO, W.; FEN, W.-S.; YU, Y.-H.; ZHANG, X.-Y.; SHEN, Y.-F. Phylogenetic relationships of the Subclass Peritrichia (Oligohymenophorea, Ciliophora) inferred from small subunit rRNA gene sequences. Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 51, p. 180-186, 2004.. MODEO, L.; ROSATI, G.; ANDREOLI, I.; GABRIELLI, G.; VERNI, F.; PETRONI G. Molecular systematics and ultrastructural characterization of a forgotten species: Chattonidium setense (Ciliophora, Heterotrichea). Proceedings of the Japan Academy, v. 82, p. 359-374, 2006.. MODEO, L.; PETRONI, G.; LOBBAN, C. S.; VERNI, F.; VANNINI C. Morphological, ultrastructural, and MolecularCharacterization of Euplotidium rosati n. sp. (Ciliophora, Euplotida) from Guam. Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 60, p. 25-36, 2013.. ROSATI, G.; MODEO, L.; MELAI, M.; PETRONI, G.; VERNI, F. A multidisciplinary approach to describe protists: a morphological, ultrastructural, and molecular study on Peritromus kahli Villeneve-Brachon, 1940 (Ciliophora, Heterotrichea). Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 51, p. 49-59, 2004.. SMITH, M. E. Distribution Patterns and Seasonal Occurrence of Rhabdostyla sp. on Dero nivea (Oligochaeta, Naididae). American Midland Naturalist, v. 116, p. 348-355, 1986.. SUN, P.; CLAMP, J. C.; XU, D.; KUSUOKA, Y.; HORI, M. Molecular phylogeny of the family Vorticellidae (Ciliophora, Peritrichia) using combined datasets with a special emphasis on the three morphologically similar genera Carchesium, Epicarchesium and Apocarchesium. International Journal of Systematic Evolutionary and Microbiology v. 61, p. 1001-1010, 2011.. SUN, P.; CLAMP J. C.; XU, D.; KUSUOKA, Y; MIAO, W.Vorticella Linnaeus, 1767 (Ciliophora, Oligohymenophora, Peritrichia) is a grade not a clade: redefinition of Vorticella and the Families Vorticellidae and Astylozoidae using molecular characters derived from the gene coding for small subunit ribosomal RNA. Protist, v. 163, p. 129-142, 2012 a.. 36.

(38) UTZ, L. R. P.; SIMÃO, T. L. L.; SAFI, L. S. L.; EIZIRIK, E. Expanded phylogenetic representation of genera Opercularia and Epistylis sheds light on the evolution and higherlevel taxonomy of peritrich ciliates (Ciliophora: Peritrichia). Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 57, p. 415-420, 2010.. WAHL, M. Marine epibiosis. I. Fouling and antifouling: some basics aspects. Marine Ecology Progress Series, v. 58, p. 175-189, 1989.. WILLIAMS, D.; CLAMP, J. C. A molecular phylogenetic investigation of Opisthonecta and related genera (Ciliophora, Peritrichia, Sessilida). Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 54, p. 317-323, 2007.. YI, Z.; SONG, W. Evolution of the order Urostylida (Protozoa, Ciliophora): new hypotheses based on multi-gene information and identification of localizedincongruence. Plos One, v.6, e17471, 2011.. ZHAN, Z., XU, K., WARREN, A.; GONG, Y. Reconsideration of phylogenetic relationships of the subclass Peritrichia (Ciliophora, Oligohymenophorea) based on small subunit ribosomal RNA gene sequences, with the establishment of a new subclass Mobilia Kahl, 1933. Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 56, p. 552-558, 2009.. 37.

(39) SEÇÃO 1. ESTUDO FILOGENÉTICO DE REPRESENTANTES DA SUBCLASSE PERTRICHIA STEIN, 1859 (ALVEOLATA: CILIOPHORA) BASEADO EM SEQUÊNCIAS DE 18S-rDNA COM ÊNFASE NAS FAMÍLIAS EPISTYLIDIDAE E OPERCULARIIDAE RESUMO A filogenia da subclasse Peritrichia e dos seus principais clados internos ainda não está resolvida. Para contribuir com melhor entendimento sobre a filogenia de Peritrichia e de seus principais clados (famílias e gêneros) foram sequenciadas sete espécies da família Epistylididae e quatro espécies da família Operculariidae. As árvores filogenéticas de verossimilhança máxima e inferência Bayesiana apresentaram topologias similares. A subclasse Peritrichia permaneceu monofilética. As duas novas ordens de peritríqueos baseadas em sequências do gene 18S-rDNA Vorticellida e Operculariida se mantiveram com valores de suporte máximo. A família Operculariidae e o gênero Opercularia permaneceram como um clado natural, indicando que o opérculo pode ser um bom marcador filogenético. As sequências de Epistylis nympharum e Rhabdostyla inclinans agruparam-se entre os “vorticelídeos” com valor de suporte máximo, indicando que dentro de Vorticellida o gênero Epistylis, Rhabdostyla e família Epistylididae não formam grupos naturais. A família Epistylididae apresentou representantes distribuídos em três clados muito distintos, indicando que características utilizadas para reunir representantes desta família como a área peristomial “epistiliforme” e o pedúnculo rígido não são bons marcadores filogenéticos. A sequência de Orborhabdostyla sp. 1 agrupou-se junto a sequência de Orborhabdostyla bromelicola, sugerindo que o novo gênero possa ser um grupo natural. As espécies de Epistylis chrysemydis do Brasil e de Epistylis hentscheli do Brasil agruparam-se com as suas respectivas espécies da China. A partir dos resultados apresentados conclui-se que há necessidade de investigar mais detalhadamente os caracteres morfológicos dos peritríqueos, a fim de encontrar marcadores filogenéticos confiáveis e aumentar o número de sequências de 18S-rDNA de outros peritríqueos ainda não sequenciados, assim como testar outros marcadores moleculares.. 38.

(40) Palavras-chave: filogenia molecular, marcadores filogenéticos, monofilética, Operculariida, Vorticellida. 39.

(41) INTRODUÇÃO Os microeucariotos do filo Ciliophora constituem um grupo natural com mais de 8.000 espécies divididas em dois subfilos e 11 classes. A classe Oligohymenophorea possui seis subclasses, dentre elas a subclasse Peritrichia, contendo mais de 1.000 espécies descritas. Os peritríqueos estão divididos em duas ordens: Sessilida Kahl, 1933 e Mobilida Kahl, 1933 (sensu LYNN, 2008) e são comumente encontrados em ecossistemas aquáticos, sendo mais abundantes em ambientes enriquecidos organicamente e com elevada densidade bacteriana, sendo raros em ambientes edáficos. Estudos moleculares recentes sugerem que as duas ordens (Sessilida e Mobilida) não constituem juntas grupos irmãos e propõem a separação da antiga subclasse Peritrichia em duas subclasses: Peritrichia1 (sensu ZHAN et al., 2009) contendo representantes da antiga ordem Sessilida (∼800 espécies) e Mobilia2 contendo representantes da antiga ordem Mobilida (250 espécies) (ZHAN et al., 2009). Iremos adotar neste estudo a proposta elaborada por ZHAN et al. (2009), ou seja, os termos Peritrichia e peritríqueos se referem aos antigos representantes da ordem Sessilida (sensu LYNN, 2008). Embora muitos estudos sobre filogenia molecular tenham corroborado propostas de classificação baseadas em dados morfológicos para ciliados, alguns resultados têm mostrado propostas incongruentes (LI & SONG, 2006; RAGAN et al., 1996; STRÜDER-KYPKE et al., 2000). Os peritríqueos comparativamente com outros grupos de ciliados tem sido negligenciados em relação ao número de sequências do gene 18S-rDNA disponíveis no GenBank (DIAS, 2012), sendo necessário ampliar estudos com esse intuito. Nos últimos quinze anos, estudos sobre filogenia interna de Peritrichia com base em sequências de 18SrDNA, gene alfa-tubulina e região espaçadora ITS tem demonstrado a formação de clados radicalmente diferentes daqueles propostos na classificação elaborada com base em caracteres morfológicos (CLAMP & WILLIAMS, 2006; DIAS et al., 2012; GONG et al., 2010; LI et al., 2008; MIAO et al., 2001, 2004; MARTÍN-CERECEDA et al., 2007; UTZ & EIZIRIK, 2007; WILLIAMS & CLAMP, 2007; UTZ et al., 2010; SUN et al., 2010, 2011, 2012 a, 2013). No presente estudo obtivemos 12 novas sequências do gene 18S-rDNA para 11 espécies de peritríqueos, pertencentes a duas famílias distintas, com objetivo de esclarecer e ampliar o conhecimento acerca da filogenia interna de Peritrichia, com ênfase na validade das famílias Epistylididae e Operculariidae. Foram discutidos ainda a validade e relevância das principais características morfológicas usadas para separar os principais grupos de. 40.

(42) peritríqueos, tais como: estilo de vida, presença de mionema no pedúnculo, padrão de contração do pedúnculo, morfologia do peristômio e presença de lórica.. MATERIAL E MÉTODOS Coleta e processamento inicial das amostras: Os peritríqueos sequenciados neste estudo foram coletados em taques de bromélias, córregos e lagos urbanos em dois municípios do estado de Minas Gerais: Juiz de Fora (microrregião de Juiz de Fora) e Santa Rita de Minas (microrregião de Caratinga) (Tabela 1.1; p. 42). As coletas foram feitas esporadicamente ao longo dos anos de 2013 e 2014. A metodologia de coleta variou de acordo com o ambiente e o hospedeiro amostrado. As espécies Epistylis chrysemydis Bishop & Jahn, 1941, Opercularia sp. 1 e Opercularia sp. 2 foram encontradas sob a carapaça de cágados. Para a coleta dos peritríqueos, os cágados foram capturados com rede e sua carapaça foi raspada com estilete. Após a raspagem, uma pipeta de Pasteur foi utilizada para lançar jatos de água mineral sobre a parte raspada da carapaça e um recipiente de acrílico recebia toda a água da lavagem (protocolo CEUA/UFJF n° 023/2015 / IBAMA/SISBIO solicitação n° 453571). Para obtenção de Epistylis plicatilis Ehrenberg, 1831 e Epistylis hentscheli Kahl, 1935 foram utilizados substratos artificiais (UTZ et al., 2008) submersos em um córrego urbano durante sete dias para colonização destes ciliados coloniais. O epistilídeo epibionte de copépodos Epistylis nympharum Engelmann, 1862 foi coletado em um lago eutrófico com o auxílio de uma rede de plâncton 30 µm. As espécies Epistylis sp. 1, Opercularia nutans (Ehrenberg, 1831) Stein, 1854 e Opercularia articulata Goldfuss, 1820 foram encontradas como epibiontes de moluscos ancilídeos (Gastropoda, Ancylidae) em um córrego urbano. Os moluscos foram coletados com puçá, analisados em microscópio estereoscópio e os peritríqueos foram raspados com agulhas e isolados em saleiras conforme a espécie. As espécies Rhabdostyla inclinans (Mueller, 1773) Roux, 1901 e Orborhabdostyla sp.1 foram coletadas em ambientes bromelícolas com o auxílio de uma pipeta de acrílico (injetor de temperos de 50 mL) com bulbo na extremidade (Tabela 1.1; p. 42).. 41.

(43) Tabela 1.1: Espécies de peritríqueos (Ciliophora, Peritrichia) encontrados em diversos ambientes do estado de Minas Gerais com informações sobre ambiente, hospedeiro e localidade (coordenadas geográficas). Espécies de Peritrichia. Ambiente / Hospedeiro. Localidade. Epistylis chrysemydis. Lago / cágados. A1. Epistylis plicatilis. Córrego / Hirudinea. A2. Epistylis hentschel. Córrego / *. A3. Epistylis nympharum. Lago / copepoda. A4. Epistylis sp.1. Córrego / molusco. A5. Oipercularia articulata. Córrego / molusco. A6. Opercularia nutans. Córrego / molusco. A7. Opercularia sp.1. Lago / cágado. A8. Opercularia sp.2. Lago / cágado. A9. Orborhabdostyla sp.1. Bromélia / *. B1. Rhabdostyla inclinans 1. Bromélia / anelídeo. A10. Rhabdostyla inclinans 2. Bromélia / anelídeo. A11. Microrregião de Juiz de Fora: A1 (21°47'18.12"S; 43°21'56.24"W); A2 (21°44'3.41"S; 43°19'37.39"W); A3 (21°42'42.51"S; 43°37'17.50"W); A4 (21°44'45.64"S; 43°21'35.58"W); A5 (21°39'17.19"S; 43°25'31.17"W); A6 (21°39'17.19"S; 43°25'31.17"W); A7 (21°39'17.19"S; 43°25'31.17"W); A8 (21°27'35.87"S; 43°33'7.93"W); A9 (21°47'18.12"S; 43°21'56.24"W); A10 (21º46’38.77”S; 43º22’13.90”W); A11 (21º46’38.77”S; 43º22’13.90”W); B- microrregião de Caratinga: B1 (19°52'28.83"S; 42° 7'58.84"W). * representa espécies que não foram encontradas como epibionte.. No laboratório as amostras foram colocadas em placas de Petri contendo água do local de coleta (previamente filtrada) e foram observadas sob microscópio estereoscópio para verificar a ocorrência dos ciliados. Todos os peritríqueos foram triados com auxílio de micropipetas (DRAGESCO & DRAGESCO-KERNÉIS, 1986) e isolados em uma saleira para fixação conforme técnica a ser realizada: em álcool absoluto para estudo molecular, solução de Bouin para realização da técnica de impregnação pela prata (WILBERT, 1975), formaldeído 4% para realização da técnica do carbonato de prata (FOISSNER et al., 1991).. 42.

(44) Investigação morfológica e identificação das espécies A observação dos ciliados in vivo é essencial no estudo da morfologia e taxonomia dos peritríqueos (FOISSNER, 1992; FOISSNER et al., 2002). As espécies de peritríqueos detectadas nas saleiras in vivo foram colocadas entre lâmina e lamínula e observadas utilizando microscópio Olympus BX51 com contraste interferencial diferencial (DIC) em aumentos de 100x, 200x, 400x, 800x, 1000x e 2000x e fotografadas com auxílio de uma câmera acoplada ao microscópio pelo programa Software Image pro-plus 5.0 Olympus®. As características utilizadas na observação in vivo para identificação dos peritríqueos foram: presença de mionema (espasmonema) no pedúnculo, morfologia do zoóide, formato da colônia, número de zoóides na colônia, contratilidade do zoóide, formato do disco e colar peristomial, posição do vacúolo contrátil, posição e formato do aparato nuclear, detalhe das estriações peliculares (“silverline system”), presença e coloração de grânulos corticais, presença de simbiontes (algas endossimbiontes, bactérias ectossimbiontes), morfologia do infundíbulo, detalhe da ciliatura oral e presença de mionemas e grânulos tecoplasmáticos no pedúnculo. A identificação foi baseada nos trabalhos de KAHL (1935), FOISSNER et al. (1992) e FOISSNER et al. (2009). A terminologia e a sistemática para as famílias seguem proposta de LYNN (2008).. Extração de DNA, amplificação por PCR e sequenciamento Os peritríqueos triados e isolados de seus hospedeiros em saleiras foram lavados por mais de uma vez utilizando água mineral esterilizada. Após etapas de lavagem os ciliados foram fixados em etanol absoluto (n~20) e mantidos em tubos de 1,5 mL dentro da geladeira para posterior realização da extração de DNA. O DNA genômico foi extraído utilizando o (Kit DNeasy® Blood and Tissue) Qiagen (2006), seguindo as orientações do fabricante (Anexo 1.1; p. 66) para extrações de tecidos animais. O DNA dos indivíduos extraídos foi estocado em freezer -20°C em microtubos de 2 mL. As reações de amplificação das sequências de 18SrDNA foram realizadas em termociclador “Applied Biosystems Gene Amp® PCR System 9700”, em eppendorfs de 200μL, em um volume final de 50μL, contendo: 39,8μL de H2O; 5μL de tampão 10X; 1,5μL de MgCl2 (50mM); 0,5μL de DNTP (25mM); 1,0μL de cada iniciador (50μM); 0,25μL de Taq Platinum® DNA polimerase (Invitrogen) (5U/μL); e 1,0μL de DNA genômico purificado. Os parâmetros de ciclagem foram os seguintes: um ciclo de 94 °C por 2 min; 35 ciclos de: 94 °C por 30 segundos (desnaturação das fitas de DNA), 50 °C por 30 segundos 43.

(45) (anelamento dos iniciadores) e 72 °C por 2 minutos (extensão das fitas de DNA); terminando com um ciclo de 72 °C por 7 minutos para a finalização na polimerização de eventuais fitas inacabadas. Foram utilizados os iniciadores específicos para peritríqueos Peri_57F (5`CAT GCA TGT GTA AGT ATA AGT A) e Peri_1385R (5`CGG TGT GTA CAT TTT GC) conforme DIAS (2012) para amplificação de sequências do 18S-rDNA. As reações de sequenciamento foram montadas empregando-se produtos de pelo menos quatro reações de PCR purificados para cada espécie de peritríqueo, utilizando o kit “QIAquick PCR Purification” (Qiagen). Para as reações padrão de sequenciamento foram utilizados 5-100 ng de DNA e 3,2 ρmoles de iniciadores internos a sequência de interesse em um volume máximo de 7,0 μL. Os iniciadores utilizados para o sequenciamento do amplicon foram: Peri_396R (5`- GAG AGT TGT TAT TTC TTG TC); Peri_975F (5`- GGA AAC TCA TCA GGG CAA) e Peri_1042R (5`- TGC ACC ACC ACT AGA CC) (DIAS, 2012). Os sequenciamentos foram realizados na Unidade Multidisciplinar de Genômica do IBCCF/UFRJ em sequenciador automático de DNA ABI 3130xl. Os produtos dos sequenciamentos foram editados manualmente utilizando o programa Geneious 6.0 (Biomatters Limited). Análises filogenéticas As sequências do gene 18S-rDNA utilizadas na análise filogenética estão listadas no anexo 1.2 (p. 69). Foram utilizados como grupo externo as classes Phyllopharyngea de Puytorac et al., 1974 (n=2) e Nassophorea Small & Lynn, 1981 (n=1). Dentro da classe Oligohymenophorea de Puytorac et al., 1974 foram usados representantes das subclasses Scuticociliatia Small, 1967 (n=2), Hymenostomatia Delage & Hèrouard, 1896 (n=3), Mobilia Zhan et al. 2009 (n=3), Peniculia Faurè-Fremiet in Corliss, 1956 (n=3), Astomatia Schewiakoff, 1896 (n=3) e 56 sequências de 18S-rDNA de representantes da subclasse Peritrichia. Foram selecionadas sequências maiores que 1500 pb e provenientes de estudos que realizaram identificação das espécies usando as técnicas ciliatológicas necessárias para identificação dos peritríqueos. As sequências foram alinhadas pelo programa MAFFT versão 7 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) (KATOH & STANDLEY, 2013), levando em consideração a estrutura secundária do RNA. A edição das sequências foi feita manualmente no programa MEGA5 (TAMURA et al., 2011). Após a remoção de sítios de natureza ambígua e sequências dos iniciadores, o alinhamento foi editado de modo que todas as sequências tivessem o mesmo tamanho. O produto desta edição foi refinado utilizando o programa Gblocks (v0.91b) selecionando três configurações distintas: mais restringente, menos 44.

Referências

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