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CAROLINA STEFANO MANTOVANI
"ESTUDO DE REGIÕES EVOLUTIVAMENTE
CONSERVADAS E DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO
POSSIVELMENTE ENVOLVIDOS NA REGULAÇÃO
DA EXPRESSÃO DO GENE DA MIOSTATINA
EM VERTEBRADOS"
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A Miostatina (MSTN) é uma proteína que regula negativamente a formação de musculatura esquelética, e sua estrutura e função são conservadas em diversas espécies, incluindo humanos. O nocaute de seu gene causa hiperplasia e hipertrofia das fibras musculares, o que despertou grande interesse médico e agropecuário desde a descoberta deste gene. Trabalhos anteriores descrevem a função da proteína, mas ainda faltam dados sobre a regulação da sua expressão gênica. Recentemente, o promotor do gene da Mstn foi identificado e caracterizado pelo nosso grupo de pesquisa, a partir de uma abordagem filogenética. Entretanto, além do promotor, também existem outros elementos cis-reguladores que podem atuar como estimuladores ou silenciadores do processo de transcrição gênica. Em conjunto com o promotor gênico, esses elementos controlam a taxa de transcrição e conferem especificidade espacial e temporal para sua expressão. Sendo assim, a proposta deste trabalho foi identificar e caracterizar possíveis elementos cis-reguladores da Mstn a fim de ampliar o conhecimento sobre a sua regulação transcricional. Para tal, análises de genômica comparativa, semelhantes àquelas empregadas na identificação do promotor gênico da Mstn, foram realizadas para localizar regiões evolutivamente conservadas (ECRs) adjacentes ao lócus da Mstn de humano, camundongo e galinha, bem como para identificar potenciais sítios de ligação para fatores transcricionais conservados nessas regiões. Além disso, foi realizada uma análise da evolução desses possíveis elementos cis-reguladores, a fim de identificar polimorfismos que tenham o potencial de afetar a atividade transcricional da Mstn. Nossos resultados revelaram a existência de um arcabouço regulatório ancestral composto por sítios de ligação conservados em várias das ECRs analisadas, o qual tem sido mantido entre 310 e 430 milhões de anos. Além disto, foram identificados polimorfismos, bem como sítios de ligação grupo-específicos, os quais podem estar envolvidos na regulação diferencial da atividade da Mstn e, portanto, na geração de diferentes fenótipos musculares entre os animais. Dentre as oito ECRs estudadas, duas possuem maior potencial de estarem envolvidas na miogênese, uma vez que nelas foram identificados sítios de ligação para importantes fatores relacionados a este processo. Análises funcionais das ECRs 2 e 5/6 em células C2C12 em diferenciação confirmaram o potencial dessas ECRs de humano e
viii camundongo de atuarem como elementos cis-reguladores, uma vez que mostraram que eles são capazes de modificar a expressão do gene repórter EGFP em comparação ao controle. As ECRs de galinha, por outro lado, não geraram resultados significativos, reforçando a hipótese de que as diferenças nos TFBS encontradas no grupo das aves geram alterações funcionais nas ECRs. O desenrolar de novos estudos a partir dos resultados obtidos neste trabalho permitirão estabelecer o papel específico das ECRs identificadas, bem como determinar a importância das variações de sequências destes elementos reguladores em diferentes animais. No longo prazo, nossas pesquisas poderão subsidiar o desenvolvimento de estratégias que possibilitem a modulação da atividade da Mstn em patologias humanas que afetam a musculatura esquelética.
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The Myostatin protein (MSTN) is an important regulator of skeletal muscle deposition in vertebrates, and its structure and function are conserved in several species, including humans. The knockout of this gene causes hyperplasia and hypertrophy of muscle fibers, which has aroused great medical and agricultural interest since its discovery. Previous studies have described the function of this protein, but data on the regulation of Mstn gene expression are still scarce. Recently, the Mstn gene promoter has been identified and characterized by our research group from a phylogenetic approach. However, in addition to the promoter, there are also other cis-regulatory elements that can act as enhancers or silencers of gene transcription process. Along with the gene promoter, these elements control the transcription rate and provide spatial and temporal specificity for its expression. Thus, the purpose of this study was to identify and characterize potential Mstn cis-regulatory elements in order to increase knowledge of the transcriptional regulation of this gene. For this purpose, comparative genomic analysis similar to those employed in the identification of the Mstn promoter were performed to locate evolutionary conserved regions (ECRs) adjacent to the locus of the Mstn gene in human, mouse and chicken, as well as to identify potential transcription factors binding sites (TFBS) conserved in these regions. Furthermore, an evolutionary analysis of the putative cis-regulatory elements has been performed in order to identify polymorphisms that have the potential to affect the transcriptional activity of Mstn. Our results indicate the existence of an ancestral regulatory framework that comprises conserved TFBS in almost all of the ECRs analyzed, which has been maintained between 310 and 430 million years. Furthermore, polymorphisms were identified, as well as group-specific binding sites, which may be involved in the differential regulation of Mstn activity and, therefore, in the generation of different muscle phenotypes in animals. Among the eight ECRs studied, two of them have great potential to be involved in myogenesis, given that binding sites for important factors related to this processes were identified. Functional analyses of ECRs 2 and 5/6 in differentiating C2C12 cells confirmed the potential of the human and mouse ECRs as cis-regulatory elements, once they have shown that they are able to enhance the expression of the EGFP reporter gene, when compared to the control. The chicken ECRs, on the other hand, did not generate significant
x results, supporting the hypothesis that the differences found in the TFBS pattern in birds generate functional modifications in the ECRs. The development of new studies from the results obtained here may help to establish the specific role of the ECRs identified, as well as determine the importance of the variation in the sequence of these regulatory elements in different animals. In the long run, our research may lay the foundation to the development of strategies that allow the modulation of Mstn activity in human pathologies affecting skeletal muscle.
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DEDICATÓRIA ... xiii
AGRADECIMENTOS ... xv
LISTA DE ILUSTRAÇÕES ... xvii
LISTA DE TABELAS ... xix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... xxi
1. INTRODUÇÃO ...1
2. REVISÃO DE LITERATURA ...5
2.1 Os fatores de transcrição e a regulação diferencial da expressão gênica ... 5
2.2 O desenvolvimento da musculatura esquelética ... 11
2.3 Como atua a MSTN ... 14
2.4 Regulação da expressão do gene da Mstn ... 17
3. OBJETIVOS ... 21
3.1 Objetivo geral ... 21
3.2 Objetivos específicos ... 21
4. METODOLOGIA ... 23
4.1 Análises de Bioinformática ... 23
4.1.1 Busca por regiões evolutivamente conservadas no lócus gênico da Mstn .... 23
4.1.2 Identificação e categorização de sítios de ligação de fatores de transcrição conservados nas ECRs ... 23
4.1.3 Análise de dados de interação DNA-proteína ... 24
4.1.4 Análise evolutiva das ECRs ... 24
4.2 Desenho de primers para amplificação das ECRs ... 26
4.3 Extração de DNA genômico ... 28
4.4 Amplificação das ECRs por PCR ... 28
4.5 Purificação dos produtos de PCR ... 29
4.6 Preparação do vetor para clonagem ... 29
4.7 Reação de ligação ... 30
4.8 Transformação de bactérias competentes ... 31
4.9 Triagem dos clones e extração de DNA plasmidial ... 32
4.10 Cultura de células C2C12 ... 36
4.11 Transfecção de células C2C12 ... 37
4.12 Citometria de fluxo ... 39
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5. RESULTADOS ... 41
5.1 Regiões evolutivamente conservadas estão presentes no lócus gênico da Mstn .... 41
5.2 Vários TFBS são conservados nas ECRs de amniotos ... 46
5.3 Interação das ECRs 2 e 5 com os fatores de transcrição MYOD e MYOG no genoma do camundongo ... 51
5.4 Evolução das ECRs 2 e 5 nos vertebrados ... 54
5.4.1 As ECRs 2 e 5 estão presentes em vertebrados não amniotos ... 54
5.4.2 Busca por polimorfismos e assinaturas de grupo nas ECRs 2 e 5 ... 56
5.4.3 ECRs 2 e 5 em grupos de mamíferos e aves ... 62
5.5 Análise funcional das ECRs 2 e 5... 66
5.5.1 Obtenção de vetores de expressão contendo as ECRs 2 e 5/6 de humano, camundongo e galinha ... 66
5.5.2 Análises em cultura de células C2C12 indicam que as ECRs 2 e 5/6 possuem atividade cis-regulatória ... 70
6. DISCUSSÃO ... 79
6.1 Estudo dos fatores que interagem com TFBS conservados permite criar hipóteses sobre a função das ECRs identificadas ... 80
6.1.1 Os fatores que se ligam às ECR 3’-UTR A e ECR 3’-UTR B indicam um papel na miogênese e metabolismo ... 80
6.1.2 Os fatores que potencialmente se ligam à ECR 2 sugerem participação no desenvolvimento dos membros e do coração ... 84
6.1.3 Os fatores que potencialmente se ligam às ECR 3 e 4 atuam predominantemente no metabolismo energético e são responsivos a hormônios ... 91
6.1.4 As ECR 5 e 6 apresentam sítios de ligação para proteínas envolvidas no desenvolvimento da musculatura esquelética e cardíaca ... 96
6.1.5 As ECRs, os fatores de transcrição e a expressão do gene da Mstn ... 104
6.2 A evolução das ECRs envolvidas no contexto miogênico ... 107
6.2.1 Polimorfismos, assinaturas de grupo e origem das ECRs 2 e 5 ... 107
6.2.2 Mais TFBS encontrados nas ECRs 2 e 5 de mamíferos e/ou aves ... 109
6.3 Análise funcional das ECRs 2 e 5/6... 113
7. CONCLUSÕES ... 115
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 117
Bernstein HS, Coughlin SR. Pombe Cdc5-related protein. A putative human transcription factor implicated in mitogen-activated signaling. The Journal of Biological Chemistry. 1997; 272(9):5833-5837. ... 118
9. APÊNDICES ... 135
xiii Com muito amor e carinho, dedico esta Dissertação aos meus pais, Ângelo e Sônia, à minha irmã, Aline, ao meu namorado, Erik, e a todos os meus amigos, essenciais em minha vida, por todo o amor, apoio e incentivo que sempre ajudaram a iluminar minhas escolhas e meus caminhos.
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Agradeço sempre a Deus por tantas bênçãos em minha vida, e até mesmo pelos obstáculos que vez ou outra surgem em meu caminho, porque sei que posso transformá-los em aprendizado e superação, e me tornar uma pessoa melhor a cada dia.
Aos meus pais, Ângelo e Sônia, que sempre me incentivaram nos estudos, muito obrigada pela educação dada sempre com tanto amor. Não há nada no mundo que pague toda a atenção e amor com que me ensinaram os grandes valores desta vida. Vocês são meus maiores exemplos para todas as melhores coisas que eu consigo imaginar. Hidroginástica também vale?
À minha irmã Aline, companheira de brincadeiras e aprendizados desde a infância, mas que agora está seguindo seu próprio caminho, estudando para se tornar uma grande médica. Orgulho muito tenho de sua irmã ser. Que a força esteja com você. E claro, vida longa e próspera.
A meu namorado Erik, que chegou para transformar meu mundo, um verdadeiro Kairós em minha vida. Muito obrigada pelo amor, pelo companheirismo, pela cumplicidade, e por me ouvir e me apoiar em todas as situações, sempre alegrando e iluminando meus dias. Ainda temos muitas aventuras pela frente, mas acho que primeiro teremos que dar um jeito de dobrar o continuum espaço-tempo!
A minha orientadora, Profa. Dra. Lúcia Elvira Alvares, por me dar a oportunidade de fazer parte do Laboratório de Biologia do Desenvolvimento, por todos os ensinamentos, por sempre acreditar em mim e por ser muito compreensiva e acolhedora nos momentos mais difíceis.
A minhas companheiras fiéis da sala de alunos, Fernanda, Marina, Paula, Bianca, Lucimara, Viviane e Valquíria, sempre maravilhosas e divas, mesmo nos momentos em que sentíamos na pele os efeitos do aquecimento global concentrados na nossa salinha, e a todos os demais colegas e amigos do bloco H do Departamento de Bioquímica e Biologia Tecidual: Ricardo(s), Bruno, Selma, Luís, Amanda, Edilene, Mariana, Daniela, Bárbara, Monique, Natália, Cíntia, Marília e Nara que também estiveram sempre presentes ao longo desta jornada. A todos agradeço imensamente por compartilharem tantos bons momentos, e também pelo apoio e incentivo nos momentos de dificuldade. Vocês são responsáveis por tornar o nosso ambiente de trabalho muito especial.
À Fabi, minha maior companheira e ajudante nos experimentos de laboratório durante todo o ano de 2014. É impossível mensurar o quanto ela foi essencial para este
xvi projeto. Espero ter conseguido retribuir toda sua ajuda e dedicação compartilhando um pouquinho das minhas experiências. Aproveite muito este ano no país dos cangurus!
À querida Natália, muito mais do que uma técnica para o nosso laboratório, por estar sempre pronta para nos ajudar, e por deixar tudo muito bem organizado e preparado quando necessário.
Às queridíssimas Débora e Carla, que mesmo longe, continuaram sendo grandes e ótimas conselheiras.
Ao Prof. Dr. Henrique Marques-Souza e a todos os frequentadores do LaRGE, por compartilharem o espaço e os equipamentos do laboratório, e pela companhia e troca de experiências durante muitos meses de trabalho.
A todos os demais professores do DBBT, pelo grande exemplo profissional, e também por tudo o que pude aprender durante as reuniões de Departamento.
À Profa. Dra. Vera Nisaka Solferini e à sua técnica de laboratório, Célia, por cederem espaço para a realização dos experimentos com bactérias, e por toda a atenção e disponibilidade. Também aos alunos da Profa. Vera, por compartilharem comigo o espaço e por ajudarem a resolver algumas PCRs misteriosas.
Às minhas queridas amigas Jéssica e Priscila, que acabaram se tornando também contatos profissionais no LNBio, pela ajuda e pela amizade.
À Ana Helena e ao Sílvio, também do LNBio, por gentilmente cederem os mioblastos C2C12 de camundongo, e por toda a paciência e ajuda que nos deram com tanta dedicação durante os ensaios de cultura de células e citometria de fluxo, e ao Prof. Dr. Kleber Franchini, por permitir que isso fosse possível.
Ao Prof. Dr. José Xavier-Neto, Hozana e Luana, do LNBio, pela disponibilidade em ajudar sempre que precisamos, e por cederem uma alíquota do vetor pTK-EGFP.
À Profa. Dra. Mara Patricia Traina Chacon-Mikahil, por gentilmente ceder uma amostra de um de seus projetos para a extração de DNA, e ao Arthur Gáspari, por ser sempre tão solícito e até mesmo me levar para conhecer como é feita uma biópsia muscular. À Universidade Estadual de Campinas e ao Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural, pela oportunidade de crescimento profissional. À secretária Líliam Panagio, por toda a atenção e suporte dados ao longo deste trabalho.
Ao CNPq, pelo auxílio financeiro concedido para a realização deste projeto (bolsa de Mestrado, processo número 131448/2013-7).
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Figura 1. Mecanismos pelos quais os fatores de transcrição podem ser ativados por
dimerização. ... 6 Figura 2. Mecanismos pelos quais os fatores de transcrição podem ser ativados ... 7 Figura 3. A região de controle gênico de um gene eucariótico típico.. ... 8 Figura 4. Potenciais mecanismos pelos quais um fator de transcrição pode reprimir a expressão gênica... 9 Figura 5. Ativação gênica tecido-específica ... 10 Figura 6. Representação esquemática do desenvolvimento dos somitos ao longo do eixo ântero-posteior de um embrião de camundongo ... 12 Figura 7. Origem somítica dos progenitores miogênicos dos músculos epaxiais, hipaxiais e dos membros em embriões de aves e camundongos (corte transversal) ... 13 Figura 8. Captura de tela da página da ferramenta online BLAST, disponível no banco de dados Ensembl, evidenciando os parâmetros utilizados nas buscas feitas por BLASTN. ... 25 Figura 9. Vetor plasmidial pTK-EGFP, utilizado para as clonagens ... 30 Figura 10. Passos para a transformação térmica de bactérias competentes e obtenção de colônias isoladas... 32 Figura 11. Estratégia para verificação da presença do plasmídeo de interesse nas bactérias utilizando primers do vetor pTK-EGFP para realização de PCR ... 33 Figura 12. Esquema simplificado do planejamento experimental com as células C2C12. ... 37 Figura 13. Organização das quatro placas de seis poços e da placa de 12 poços com células C2C12 para as transfecções ... 38 Figura 14. ECRs nas vizinhanças do gene da Mstn do homem (H.sap), camundongo (M.mus) e galinha (G.gal) ... 45 Figura 15. TFBS conservados nas ECRs do lócus gênico da Mstn, utilizando como base a fita direta (+) do DNA de humano ... 49 Figura 16. Picos de ChIP-Seq identificados no browser genômico da UCSC para a ECR 2 em células C2C12 em diferentes tempos de indução da diferenciação. ... 52 Figura 17. Picos de ChIP-Seq identificados no browser genômico da UCSC para a ECR 5 em células C2C12 em diferentes tempos de indução da diferenciação. ... 53
xviii Figura 18. Localização das principais variações de nucleotídeos encontradas nas
sequências dos cinco blocos de TFBS da ECR 2 e dos seis blocos da ECR 5 ... 57 Figura 19. Imagem representativa das ECRs de interesse obtidas por meio de PCR a partir de DNA genômico dos organismos em estudo ... 66 Figura 20. Verificação da clivagem do vetor pTK-EGFP pela enzima de restrição SmaI .. 67 Figura 21. Verificação da reação de ligação. ... 67 Figura 22. Exemplo representativo da triagem dos clones por PCR a partir das colônias de bactérias ... 68 Figura 23. Exemplo representativo da verificação dos DNAs plasmidiais extraídos das bactérias competentes transformadas com as reações de ligação das ECRs de interesse no vetor pTK-EGFP ... 69 Figura 24. Definição das condições de análise na citometria de fluxo ... 71 Figura 25. Apresentação de dados representativos da citometria de fluxo que demonstram a porcentagem de células C2C12 transfectadas expressando a proteína fluorescente EGFP e um número com unidade arbitrária que representa a mediana da intensidade de fluorescência do EGFP... 71 Figura 26. Porcentagem de células C2C12 transfectadas que expressam a proteína
fluorescente EGFP e intensidade de fluorescência por grupo experimental no experimento que se iniciou com a transfecção de células com 60-70% de confluência. ... 72 Figura 27. Imagens representativas de células C2C12 pós-transfecção depois de 72h de permanência em meio de diferenciação ... 73 Figura 28. Definição das condições de análise na citometria de fluxo para o experimento de transfecção com as células com confluência >90% ... 74 Figura 29. Apresentação de dados representativos da citometria de fluxo para o
experimento de transfecção com as células confluência >90% ... 74 Figura 30. Porcentagem de células C2C12 transfectadas que expressam a proteína
fluorescente EGFP e intensidade de fluorescência por grupo experimental (Média + Desvio Padrão) no experimento que se iniciou com a transfecção de células com >90% de
confluência. * p ≤ 0,05. ... 75 Figura 31. Exemplo representativo dos dois experimentos de gráficos de FITC/SSC
mostrando a separação das células em dois grupos distintos, um marcado por uma elipse laranja e outro por um retângulo verde, diferentemente do que ocorre nos gráficos de FITC/FSC, em que as células ficam mais dispersas. ... 76
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Tabela 1. Sequências dos primers desenhados para amplificação das ECRs de humano (H.sap), camundongo (M.mus) e galinha (G.gal) por PCR ... 27 Tabela 2. Quantidades necessárias dos produtos de PCR das ECRs para as reações de ligação com 100 ng do vetor pTK-EGFP. ... 31 Tabela 3. Tamanho (pb) de cada uma das ECRs identificadas em humano, camundongo e galinha. ... 43 Tabela 4. Identidade de sequência (%) entre as ECRs do homem, camundongo e galinha. 43 Tabela 5. Distância (kb) entre o promotor gênico da Mstn e as ECRs identificadas em humano, camundongo e galinha. ... 44 Tabela 6. Distância (kb) entre as diferentes ECRs do humano, camundongo e galinha presentes no lócus gênico da Mstn . ... 44 Tabela 7. Sumário dos locais e processos nos quais os fatores de transcrição que
potencialmente interagem com os TFBS conservados nas ECRs atuam... 50 Tabela 8. Conservação dos TFBS da ECR 2 entre as espécies representantes de répteis, anfíbios e peixes em comparação com os TFBS conservados entre mamíferos e aves ... 60 Tabela 9. Conservação dos TFBS da ECR 5 entre as espécies representantes de répteis e anfíbios em comparação com os TFBS conservados entre mamíferos e aves... 61 Tabela 10. Comparação entre os TFBS encontrados nas análises grupo-específicas da ECR 2 ... 63 Tabela 11. Comparação entre os TFBS encontrados nas análises grupo-específicas da ECR 5 ... 64
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3C Chromosome Conformation Capture AR Androgen Receptor
bHLH basic-Helix-Loop-Helix
BLAST Basic Local Alignment Search Tool BLAT BLAST-Like Alignment Tool
bZIP basic leucine ZIPper
ChIP-Seq Chromatin ImmunoPrecipitation Sequencing
COUPTF1 Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor 1 DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO Dimetilsulfóxido
ECR Evolutionary Conserved Region
ECR Browser Evolutionary Conserved Region Browser EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein ENCODE ENCyclopedia Of DNA Elements ER Estrogen Receptor
ERR1 Estrogen-Related Receptor 1
FSC Forward-Scattered light GC Glicocorticoide
GR Glucocorticoid Receptor
GRE Glucocorticoid Response Element HNFs Hepatocyte nuclear factors
LB Luria Bertani LDM Lábio DorsoMedial LVL Lábio VentroLateral
MEDLINE MEDical literature analysis and retrieval system onLINE
MEFs Myocyte enhancer factors
MRFs Myogenic Regulatory Factors MSTN proteína Miostatina
Mstn gene da Miostatina
Fontes adotadas para identificar e diferenciar as siglas das proteínas e de seus genes
xxii Mulan MUltiple sequence Local AligNment and conservation visualization tool
MYOG Miogenina
OMIM Online Mendelian Inheritance in Man P/E Promoter/Enhancer
PAX PAired-boX
PCR Polymerase Chain Reaction
PPAR Peroxisome Proliferator-Activated Receptor PR Progesterone Receptor
PubMed Public Medline RB Retinoblastoma RXR Retinoid X Receptor SSC Side-Scattered light TFs Transcription Factors
TFBS Transcription Factor Binding Sites
TK Thymidine Kinase
TRANSFAC TRANScription FACtor database
UCSC University of California, Santa Cruz
VSMC Vascular Smooth Muscle Cells
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A Miostatina (MSTN), também conhecida como GDF-8, é membro da superfamília TGF-β de fatores de crescimento e transformação e representa a principal proteína reguladora da deposição de músculos esqueléticos nos vertebrados. Em concordância com sua função, a inativação do gene da Mstn em camundongos resulta em um aumento na massa da musculatura esquelética da ordem de duas a três vezes, consequência tanto de hiperplasia quanto de hipertrofia das fibras musculares (McPherron et al., 1997). Portanto, aMstn é um regulador negativo da deposição de musculatura esquelética. A ação da Mstn
sobre a regulação do número e tamanho das fibras musculares é provavelmente resultado de seu efeito direto sobre a proliferação e/ou diferenciação de mioblastos durante o desenvolvimento embrionário (Ríos et al., 2001; Ríos et al., 2002; Lee, 2004).
O gene da Mstn é altamente conservado entre os vertebrados, tanto em estrutura quanto em função. A região codificadora da porção C-terminal é idêntica em humano, rato, camundongo, porco, peru e galinha. A função deste gene é igualmente conservada, uma vez que mutações resultam em fenótipos de musculatura dupla em raças de gado, como Belgian Blue e Piedmontese (Kambadur et al., 1997; Grobet et al., 1997; McPherron & Lee 1997), cachorros (Mosher et al., 2007) e ovelhas (Clop et al., 2006). De fato, uma criança nascida com músculos proeminentes foi identificada como portadora de mutação no gene da Mstn, demonstrando que a função da MSTN é mantida também em humanos (Tobin & Celeste, 2005).
A MSTN é sintetizada como uma proteína precursora, contendo uma sequência sinal, um pró-peptídeo N-terminal, e um domínio C-terminal considerado como a molécula ativa. A MSTN é secretada na corrente sanguínea em uma forma latente, unida a seu pró-peptídeo, e apenas após processamento proteolítico a forma madura da MSTN é liberada. Tanto a forma não processada como a forma madura da MSTN formam dímeros ligados por pontes dissulfeto, e apenas o dímero processado representa a forma ativa da proteína (Joulia-Ekaza & Cabello, 2007). O dímero ativo é capaz de ligar-se aos receptores de activina do tipo II (ActRIIA e ActRIIB), desencadeando uma cascata de sinalização interna nas células, mediada pelas proteínas SMADs (Lee & McPherron, 2001). Tanto no soro
2 sanguíneo, quanto no músculo esquelético, a MSTN pode ser encontrada ligada a diversas proteínas capazes de modular sua ativação, sua secreção, ou sua ligação aos receptores (Joulia-Ekaza & Cabello, 2007; Lee, 2004).
Interessantemente, níveis aumentados de Mstn são detectados no sangue de pacientes em condições de perda ou atrofia muscular. Por exemplo, a Mstn está envolvida em processos de caquexia, uma síndrome degenerativa que leva a uma perda dramática de tecido adiposo e muscular esquelético e que pode acometer pacientes com doenças graves, tais como o câncer em estágio terminal e AIDS, podendo levar à morte (Jespersen et al., 2006). Em contraste, a inibição da MSTN melhora o processo de regeneração após injúria ou, em doenças degenerativas, tais como distrofias de Duchenne e Becker (Joulia-Ekaza & Cabello, 2007).
Apesar do amplo interesse em desenvolver estratégias que possibilitem modular os níveis de MSTN em diferentes contextos biológicos, pouco se sabe sobre os mecanismos que regulam a sua expressão gênica. Entretanto, é possível que justamente na compreensão mais aprofundada deste processo esteja o segredo para o desenvolvimento de melhores estratégias terapêuticas. Sendo assim, a proposta deste trabalho foi identificar e caracterizar possíveis elementos cis-reguladores da Mstn a fim de ampliar o conhecimento sobre a sua regulação transcricional. Para tal, análises de genômica comparativa, semelhantes àquelas empregadas na identificação do promotor da Mstn por Grade et al. (2009), foram realizadas para localizar regiões evolutivamente conservadas (ECRs1) adjacentes ao lócus da Mstn de humano, camundongo e galinha, bem como para identificar potenciais sítios de ligação para fatores transcricionais conservados (TFBS2) nessas regiões, especialmente aqueles relacionados ao desenvolvimento da musculatura esquelética. Além disso, foram feitas análises evolutivas mais detalhadas desses elementos cis-reguladores a fim de identificar polimorfismos que tenham o potencial de afetar a atividade transcricional da Mstn. Nossos resultados revelaram a existência de um arcabouço regulatório ancestral composto por TFBS conservados em várias das ECRs analisadas, o qual tem sido mantido entre 310 e 500 milhões de anos. Além disto, foram identificados polimorfismos, bem como TFBS espécie ou grupo-específicos, os quais podem estar envolvidos na regulação diferencial da
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do inglês, Evolutionary Conserved Regions 2
3 atividade da Mstn e, portanto, na geração de diferentes fenótipos musculares entre os animais.
Dentre as ECRs estudadas, duas possuem maior potencial de estarem envolvidas na miogênese (ECR 2 e 5), uma vez que nelas foram identificados sítios de ligação para importantes fatores relacionados a este processo. Para testar essas ECRs com relação a sua capacidade de alterar os níveis de transcrição de um promotor mínimo no contexto miogênico, elas foram clonadas em vetores de expressão contendo o gene repórter EGFP3 e transfectadas em mioblastos C2C12 de camundongo. Os resultados indicam que essas porções de DNA apresentam, de fato, atividade cis-regulatória, como predito pelas análises de bioinformática, uma vez que são capazes de modular a transcrição do gene repórter.
O desenrolar de novos estudos a partir dos resultados obtidos neste trabalho permitirão estabelecer o papel específico das ECRs identificadas, bem como determinar a importância das variações de sequências destes elementos reguladores em diferentes animais. No longo prazo, nossas pesquisas poderão subsidiar o desenvolvimento de estratégias que possibilitem a modulação da atividade da Mstn em patologias humanas que afetam a musculatura esquelética.
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2.1
Os fatores de transcrição e a regulação diferencial da expressão gênicaO genoma dos organismos é capaz de especificar vários tipos celulares morfologicamente distintos, e também de dirigir os complexos e ordenados processos do desenvolvimento e da diferenciação, levando à formação das variadas estruturas que compõem os organismos multicelulares (Bulger & Groudine, 2011). Sabe-se que as proteínas, codificadas pelos genes, são as principais responsáveis por exercer as mais diversas funções nos organismos. Surpreendentemente, após a conclusão e análise do sequenciamento do genoma humano, foi identificado que aproximadamente 99% dos cerca de 3,3 bilhões de nucleotídeos que constituem o genoma humano não codificam proteínas (Kellis et al., 2014). Estudos de genômica comparativa revelaram que a maioria das regiões conservadas identificadas nos mamíferos consiste justamente de elementos não codificantes, o que indica que essas regiões têm uma significância funcional muito grande, provavelmente auxiliando no controle da expressão dos genes (Kellis et al., 2014). De fato, esse controle é muito importante para garantir a especificidade temporal e espacial da expressão dos genes e regular sua atividade em resposta a estímulos específicos (Latchman et al., 1997).
A expressão gênica é regulada principalmente pelos chamados “fatores de transcrição” (TFs4), proteínas que possuem domínios de ligação ao DNA que conferem a eles a habilidade de se ligar a sequências específicas do DNA (Latchman et al., 1997). A base de dados TFClass5 (Wingender et al., 2013) fornece uma classificação abrangente de fatores de transcrição de humanos, de acordo com seus domínios de ligação ao DNA. Esta base de dados já tem nove superclasses identificadas, que compreendem 40 classes e 111 famílias. Contando por genes, 1558 fatores de transcrição humanos foram classificados até agora, e quando são incluídas as isoformas geradas por splicing alternativo ou eventos de processamento pós-traducionais, são mais de 2900 diferentes fatores (Wingender et al., 2013).
4
do inglês, Transcription Factors 5
6 É interessante analisar algumas características de certos domínios de ligação ao DNA, uma vez que eles podem ser muito importantes na determinação das possíveis funções desses fatores. Por exemplo, os fatores das classes basic leucine zipper (bZIP),
basic helix-loop-helix (bHLH) e bHLH-ZIP possuem motivos HLH ou ZIP, os quais são
capazes de mediar a dimerização desses fatores como um pré-requisito para a ligação ao DNA. Em outras palavras, os fatores de transcrição dessas classes precisam formar homo ou heterodímeros para poderem se ligar ao DNA (Figura 1). Como a dimerização é dependente da abundância de cada fator de e/ou de outros fatores que podem potenciar ou inibir a dimerização, a variedade de combinações de fatores existentes é que vai determinar sua ação regulatória específica nos diferentes contextos celulares (Funnell & Crossley, 2012).
Figura 1. Mecanismos pelos quais os fatores de transcrição podem ser ativados por dimerização (a)
entre fatores iguais (homodimerização) ou (b) entre fatores diferentes (heterodimerização); A = fator ativador. Figura adaptada de Latchman (1997).
Também existem fatores de transcrição que dependem de ligantes específicos, como hormônios, para poderem se ligar ao DNA, como é o caso dos membros da família de receptores de hormônios esteroides. Na ausência de um estímulo hormonal, esses fatores podem estar em um estado inativo, e a partir do momento em que o estímulo hormonal ocorre, eles passam a ser ativados especificamente nos locais afetados pelo sinal. Podem
7 também ser necessários outros tipos de modificações pós-traducionais, como fosforilação, para a ativação correta dos fatores (Figura 2).
Figura 2. Mecanismos pelos quais os fatores de transcrição podem ser ativados, como (a)
associação a um ligante, (b) modificações pós-traducionais, como a fosforilação, ou (c) modificações após a ligação do fator ao DNA, que permitem a associação com coativadores; A = fator ativador; CoA = fator coativador; L = ligante; P = fosforilação (um tipo de modificação pós-traducional). Figura adaptada de Latchman (1997).
Alguns desses fatores se ligam a sequências chamadas de promotores, que em geral estão localizados imediatamente upstream ao sítio onde a RNA polimerase II inicia a transcrição do gene. A esta região se ligam fatores de transcrição basais que estão presentes em todas as células, auxiliando a ligação e a atividade da RNA polimerase II (Gilbert, 2013). Em geral, os promotores apenas têm a função de permitir a associação da maquinaria basal da transcrição gênica, sem, entretanto, determinar a especificidade espacial e temporal da expressão, e sem controlar sua taxa de transcrição.
8 Na realidade, a RNA polimerase II é recrutada e estabilizada nos promotores por sequências de DNA chamadas de enhancers, as quais controlam a eficiência e a taxa de transcrição de promotores específicos, além de conferir especificidade espacial e temporal a sua expressão (Gilbert, 2013). Os enhancers possuem sítios de ligação para fatores de transcrição específicos, os quais, juntamente com proteínas adaptadoras e correguladoras, facilitam a aproximação de um enhancer com um promotor específico, permitindo a de interação com os componentes da maquinaria transcrição basal (Figura 3). Deste modo, os
enhancers são capazes de interferir na taxa da transcrição dos genes de maneira temporal e
espacialmente diferenciais. Os fatores de transcrição podem gerar modificações conformacionais no DNA e/ou recrutar enzimas (como acetiltransferases de histonas) que podem desfazer os nucleossomos da área, e estabilizar o complexo de iniciação da transcrição (Gilbert, 2013). Esses enhancers são capazes de ativar a transcrição de genes independentemente da distância que estão de um promotor ou sua posição em relação a ele, ou seja, upstream ou downstream, ou até mesmo dentro do próprio gene (Bulger & Groudine, 2010).
Figura 3. A região de controle gênico de um gene eucariótico típico. As sequências reguladoras
servem como sítios de ligação para os fatores de transcrição, e formação de alças de DNA permite que essas proteínas de regulação gênica liguem-se em quaisquer dessas posições para interagirem com as proteínas que se associam no promotor. Muitas proteínas de regulação gênica atuam por um mediador, enquanto outras influenciam os fatores gerais de transcrição e a RNA polimerase diretamente (Adaptado de Biologia Molecular da Célula - Artmed 2010).
9 Além de fatores de transcrição ativadores da expressão gênica, existem também fatores capazes de reprimir a transcrição (Figura 4), que permitem uma regulação ainda mais fina do controle da transcrição gênica.
Figura 4. Potenciais mecanismos pelos quais um fator de transcrição pode reprimir a expressão
gênica. A repressão pode ocorrer (a) pela ligação do repressor (R) ao DNA, que impede o ativador (A) de se ligar e ativar a expressão gênica; (b) pela interação direta do repressor com o ativador em solução, impedindo o ativador de se ligar ao DNA; (c) pela ligação do repressor ao DNA juntamente com o ativador, neutralizando sua habilidade de ativar a expressão gênica; ou (d) pela repressão direta por um fator de transcrição inibitório; A = fator ativador; B = fator repressor. Figura adaptada de Latchman (1997).
As diferentes combinações de fatores de transcrição dentre os complexos multiproteicos de ligação ao DNA permitem com que proteínas individuais participem de múltiplas vias regulatórias. Além disso, diversas combinações de possíveis associações entre diferentes fatores de transcrição auxiliam na modulação da especificidade da ligação ao DNA e no controle espacial e temporal da expressão dos diferentes genes (Funnell & Crossley, 2012). Como os próprios fatores de transcrição são proteínas, eles também podem ser regulados ao nível da expressão gênica. Alguns dos fatores são constitutivamente e
10 amplamente expressos nos organismos, participando de diversos processos, como os próprios fatores basais que compõem o complexo de iniciação da transcrição. Existem também fatores que são transcritos apenas em determinados contextos, exercendo suas funções de maneira específica (Figura 5).
Figura 5. Ativação gênica tecido-específica pode ser mediada (a) pela síntese de um fator de
transcrição apenas em um tecido específico ou (b) pela ativação de um fator em um tecido específico (a ativação pode se dar por algum dos mecanismos descritos na figura 2); A = fator ativador. Figura adaptada de Latchman (1997).
Enfim, o mecanismo de regulação diferencial da expressão dos genes pela atuação dos fatores de transcrição envolve a coordenação de múltiplas proteínas de maneira combinatorial, capaz de integrar de maneira efetiva várias vias de sinalização molecular (Remenyi et al., 2004). Deste modo, os fatores de transcrição estabelecem uma intricada rede regulatória da expressão gênica capaz de garantir a especificidade temporal e espacial dos diferentes mecanismos que compõem o processo de desenvolvimento dos seres vivos.
11
2.2
O desenvolvimento da musculatura esquelética
Dentre os complexos e importantes processos que fazem parte do desenvolvimento dos organismos está o desenvolvimento da musculatura esquelética, também regulado por diversos fatores de transcrição. Os aspectos regulatórios da miogênese serão abordados a seguir, juntamente com alguns aspectos morfológicos do desenvolvimento muscular esquelético embrionário.
Os processos que ocorrem durante o desenvolvimento e diferenciação da musculatura esquelética são regulados principalmente pelos chamados fatores regulatórios miogênicos (MRFs6), os quais fazem parte de um grupo de fatores de transcrição músculo-específicos da classe bHLH, composto por MYOD, MYF5, Miogenina (MYOG) e MRF4 (Molkentin & Olson, 1996). A transcrição de genes músculo-específicos é dependente de interações de dímeros formados entre os MRFs e as chamadas proteínas E (fatores de transcrição mais ubiquamente expressos), por meio de um processo mediado pelos motivos
helix-loop-helix presentes nestas proteínas (Olson, 1993). A família das proteínas E inclui
os produtos gênicos de E2A (E12/E47), de E2-2 (ITF-2A e 2B), e de HEB (HEBα e HEBβ), que interagem com os MRFs. Todos os dímeros bHLH se ligam em E-boxes, que são sequências consenso de DNA compostas pelos nucleotídeos CANNTG (Parker et al., 2006). MYOD E MYF5 têm um papel importante na determinação de progenitores miogênicos em mioblastos, MYOG é importante na diferenciação de mioblastos em miotubos, e MRF4 é importante tanto na determinação como diferenciação dessas células (Ito et al., 2012).
Todos esses fatores são expressos em locais e momentos específicos durante a miogênese, que ocorre a partir de estruturas chamadas somitos, os quais se formam progressivamente pela segmentação do mesoderma paraxial de ambos os lados do tubo neural, seguindo um gradiente anteroposterior (Figura 6). Todos os músculos esqueléticos do tronco e dos membros são derivados dos somitos, os quais inicialmente constituem um pequeno conjunto epitelial de células. O fator de transcrição PAX3 é expresso no mesoderma pré-somítico e ao longo do somito epitelial (Buckingham & Rigby, 2014). Em seguida, as células do somito epitelial se distribuem em duas porções: um esclerótomo
6
12 mesenquimal ventral, que posteriormente dará origem a cartilagens e aos ossos da coluna vertebral e costelas, além de um sindétomo adjacente (que constitui uma fonte de tendões e ligamentos no tronco); e uma parte dorsal, o dermomiótomo, que retém uma estrutura epitelial por mais tempo, e que dará origem à derme dorsal e a todos os músculos esqueléticos do tronco e dos membros, assim como às células musculares endoteliais e lisas dos vasos sanguíneos, e também gordura marrom (Buckingham & Rigby, 2014).
Figura 6. Representação esquemática do desenvolvimento dos somitos ao longo do eixo
anteroposterior de um embrião de camundongo. O fator de transcrição PAX3 é expresso no mesoderma pré-somítico, na porção epitelial do somito e nas células em migração (azul claro). Progenitores musculares iniciais são caracterizados pela expressão dos fatores de transcrição PAX3 e PAX7 (azul escuro). As células miogênicas já em diferenciação expressam fatores reguladores miogênicos (vermelho). As células progenitoras musculares que migram para membros precisam da expressão de PAX3, mas não podem ainda expressar os MRFs da diferenciação. Apenas quando chegam aos membros é que essas células são capazes de se diferenciar. P: posterior; A: anterior; TN: tubo neural; NC: notocorda. Imagem adaptada de Buckingham & Rigby (2014).
A miogênese se inicia no somito, onde Myf5 é o primeiro gene regulatório miogênico a ser ativado no domínio epaxial (dorsomedial) dos somitos, adjacente ao tubo neural. Subsequentemente, esse gene é ativado também no domínio hipaxial. O gene intimamente relacionado, Mrf4, também é ativado cedo, apesar de em estágios mais tardios ele ser expresso apenas em células musculares em diferenciação. MyoD é transcrito apenas
13 após o estabelecimento da expressão de Myf5 no dermomiótomo (Buckingham & Rigby, 2014). As células miogênicas então delaminam do dermomiótomo, especialmente a partir dos lábios dorsomedial (LDM) e ventrolateral (LVL), para formar os músculos diferenciados subjacentes do miótomo, o qual subsequentemente crescerá e se dividirá para formar os músculos do tronco (Pownall et al., 2002; Figura 7). Células também delaminam do dermomiótomo hipaxial para migrar para os membros, onde Myf5 e MyoD são ativados, levando a formação de músculo esquelético (Buckingham & Rigby, 2014). Em seguida, a porção central do dermomiótomo sofre uma transição epitélio-mesenquimal que desencadeia a invasão do miótomo por uma população de progenitores musculares (Manceau et al., 2008). Essas células podem tanto ativar Myf5 e MyoD e se diferenciarem, como podem proliferar, formando uma população de células reserva para o crescimento muscular durante o desenvolvimento (Buckingham & Rigby, 2014).
Figura 7. Origem somítica dos progenitores miogênicos dos músculos epaxiais, hipaxiais e dos
membros em embriões de aves e camundongos (corte transversal). Os progenitores musculares se originam dos lábios dorsomedial (LDM) e ventrolateral (LVL) do dermomiótomo. Células do LDM migram ventrolateralmente, se diferenciam e formam os músculos miotomias, os quais darão origem aos músculos epaxiais das costas. O LVL fornece progenitores que migram ventralmente para formar os músculos centrais da parede corporal; progenitores que migram dorsolateralmente para formar o miótomo hipaxial; e progenitores que delaminam do LVL e migram para as regiões ventral e dorsal de formação dos membros, onde eles se diferenciam para formar a musculatura dos membros. TN: tubo neural; NC: notocorda. Imagem adaptada de Pownall et al. (2002).
14 É importante ressaltar que a ativação dos fatores regulatórios miogênicos também possibilita a regulação da expressão de outros genes importantes para a diferenciação miogênica. Por exemplo, MYOD é capaz de induzir a transcrição do gene do retinoblastoma (RB), e níveis elevados da proteína RB são essenciais para a parada no ciclo celular, início da diferenciação terminal e sobrevivência dos miócitos pós-mitóticos (Magenta et al., 2003).
2.3
Como atua a MSTN
É consenso na literatura que a MSTN é um poderoso inibidor da deposição dos músculos esqueléticos nos animais. Contudo, seus mecanismos de ação ao nível mo lecular ainda não foram plenamente estabelecidos. Por este motivo, apresentamos a seguir uma breve revisão dos trabalhos mais importantes que tratam deste importante tema.
Há fortes evidências de que a MSTN é capaz de limitar o tamanho dos músculos esqueléticos pela inibição do crescimento hiperplásico dos mioblastos em desenvolvimento, portanto diminuindo o número de células que se irão se diferenciar em miofibras maduras (Rodgers & Garikipati, 2008). De fato, experimentos realizados em mioblastos C2C12 de camundongo demostraram que o aumento dos níveis de MSTN no meio leva à diminuição da proliferação dessas células por meio da regulação positiva de p21, diminuição dos níveis e da atividade de Cdk2, e pela promoção da degradação de ciclina D1, regulando negativamente a atividade de Cdk4, de modo a impedir a progressão do ciclo celular da fase G1 para a fase S (Thomas et al. 2000; Yang et al., 2007). A inibição do crescimento de mioblastos esqueléticos proliferativos consiste na ação biológica mais fundamental da MSTN, e há relatos de que essa função seja amplamente conservada entre várias classes de vertebrados (Rodgers & Garikipati, 2008).
A atuação da MSTN durante a fase de diferenciação dos mioblastos, por sua vez, ainda é motivo de controvérsia. McFarlane et al. (2011) relataram que, além de bloquear a proliferação de mioblastos humanos pela regulação da progressão do ciclo celular pela regulação positiva direcionada à proteína p21, a MSTN regula negativamente a diferenciação miogênica por meio da inibição de fatores regulatórios miogênicos, incluindo MYOD. Da mesma maneira, outros estudos in vitro mostraram que a MSTN está envolvida com a inibição da diferenciação de mioblastos (Ríos et al., 2002; Langley et al., 2002). Por
15 outro lado, Manceau et al. (2008) demonstraram que a superexpressão da Mstn em massas musculares embrionárias de galinha e camundongo in vivo não inibe a diferenciação miogênica dos progenitores musculares, como sugerido pelos estudos in vitro, mas sim, aumenta sua diferenciação terminal. Portanto, os autores sugerem que, na realidade, a MSTN atue regulando o balanço entre a proliferação e diferenciação de progenitores musculares embrionários pela promoção antecipada da diferenciação terminal dessas células através da ativação de p21 e MYOD.
Manceau et al. (2008) ainda ressaltam que o efeito da MSTN nos progenitores musculares embrionários é bastante complexo, e que o contexto em que a atividade da MSTN é testada durante a diferenciação muscular poderia explicar as diferenças observadas entre seus resultados e aqueles de estudos in vitro anteriores. É possível que a MSTN, por si só, não seja um fator crucial para promover a diferenciação, mas sim, deixe os progenitores musculares em um estado em que eles sejam capazes de responder aos sinais apropriados que favorecem a diferenciação, e tais sinais são apenas encontrados in
vivo, dentro do miótomo.
É importante ressaltar que a MSTN também está envolvida na regulação da homeostase do músculo maduro, e apesar de muitas semelhanças, o contexto pós-natal também apresenta diferenças importantes em relação ao contexto do desenvolvimento embrionário. No caso das células satélites dos músculos adultos, por exemplo, sabe-se que elas compartilham a mesma origem e possuem algumas características celulares e moleculares semelhantes aos progenitores musculares embrionários, porém, há uma diferença muito importante: elas são quiescentes e apenas são ativadas em momentos específicos, como durante o processo de regeneração muscular, enquanto os progenitores musculares embrionários se proliferam e se diferenciam ativamente e continuamente para formar os músculos (Manceau et al., 2008). Nas células satélites musculares adultas, a MSTN também é expressa e atua regulando a progressão da fase G1 para a fase S do ciclo celular (McCroskery et al., 2003). Neste caso, entretanto, as células permanecem quiescentes e não chegam a atingir o estado de diferenciação terminal, uma vez que estão localizadas em um nicho muito particular, abaixo da lâmina basal das fibras musculares (Manceau et al., 2008). A MSTN também causa a redução da renovação de células satélites e da síntese de proteínas nas miofibras adultas (Rodgers & Garikipati, 2008).
16 Wang & McPherron (2012) descobriram que a inibição da MSTN leva à ativação das células satélites, entretanto, a hipertrofia das miofibras precede a ativação dessas células. Em outras palavras, a hipertrofia muscular gerada pela ausência da MSTN é capaz de ocorrer sem a necessidade imediata das células satélites. Isso provavelmente se deve ao fato de a MSTN regular negativamente a atividade da via AKT, importante via promotora de síntese proteica nos músculos (Morissette et al., 2009), e pelo fato de que a MSTN também leva ao aumento da atividade do sistema ubiquitina-proteassoma, induzindo atrofia. Sendo assim, a MSTN tem um importante papel no balanço proteico muscular, tanto pela regulação da síntese, como da degradação de proteínas (Rodriguez et al., 2014).
Consistente com a atuação da MSTN, níveis aumentados desta proteína são observados no sangue de pacientes humanos durante condições de perda e atrofia muscular, como processos de caquexia que acompanha alguns tipos de câncer e a AIDS (Lokireddy et al., 2012; Gonzalez-Cadavid et al., 1998). Este fato contribuiu para o aumento do interesse por este gene na busca de aplicações práticas para o tratamento de doenças relacionadas à musculatura esquelética. Sabe-se que a inibição da atividade da MSTN seja capaz de influenciar significativamente a fisiologia do músculo esquelético, melhorando processos de regeneração após injúrias ou em doenças degenerativas como as atrofias de Duchenne e Becker (Joulia-Ekaza e Cabello, 2007).
Além do músculo esquelético, outros sítios de expressão da Mstn já foram descritos em mamíferos, incluindo coração, glândulas mamárias, adipócitos e cérebro (George et al., 2010; Manickam et al., 2008; Sharma et al., 1999). Há estudos que mostram que a MSTN também tem um importante efeito no estado metabólico do tecido adiposo e hepático, de modo a ter um potencial papel na obesidade, diabetes e adaptação ao exercício (Allen et al., 2011; Elliott et al., 2012).
Interessantemente, a Mstn é regulada positivamente após a manifestação de condições patológicas no coração, como infarto do miocárdio (Sharma et al., 1999), o que sugere um papel desta proteína na fisiopatologia cardíaca. Uma vez que mutantes constitutivos para a Mstn têm um grande aumento de massa corporal metabolicamente ativa, efeitos indiretos são observados no sistema cardiovascular, prejudicando a análise da função da MSTN nestes mutantes (Biesemann et al. 2014). Sendo assim, a partir de uma estratégia de inativação linhagem-específica da Mstn em camundongos adultos, Biesemann
17 et al. (2014) relataram que a MSTN é capaz de regular a homeostase energética no coração e evitar a falência cardíaca. A inativação da Mstn em cardiomiócitos adultos levou a grandes mudanças no metabolismo cardíaco, incluindo acúmulo de glicogênio, hipertrofia cardíaca, redução de mais de 50% da fração de ejeção e um aumento dramático na letalidade. Aparentemente, a perda precoce da MSTN durante o desenvolvimento, como ocorre nos mutantes constitutivos, favorece uma adaptação mais lenta e menos desordenada para compensar sua ausência, permitindo ao organismo reagir melhor ao se deparar com a situação patológica. Enquanto isso, circuitos compensatórios que são ativados após uma perda aguda da MSTN podem acabar se tornando prejudiciais ao organismo (Biesemann et al., 2014).
É de fundamental importância que este fato seja considerado no desenvolvimento de inibidores da MSTN na tentativa de tratar doenças relacionadas a esta molécula. Os possíveis efeitos não tradicionais da MSTN fora da musculatura esquelética precisam ser considerados (Elliott et al., 2012), assim como os possíveis mecanismos compensatórios de sua perda, a fim de evitar o desenvolvimento de efeitos colaterais indesejados.
Por enquanto, pouca atenção tem sido dada à regulação da expressão do gene da
Mstn, entretanto, é possível que justamente na compreensão mais aprofundada deste
processo esteja o segredo para o desenvolvimento de melhores estratégias terapêuticas. O conhecimento a respeito de sua regulação gênica poderia permitir a modulação de sua atividade em determinados momentos e locais de interesse, sem afetar sua ação em outros contextos, evitando prejudicar a formação e/ou manutenção de outros tecidos e órgãos. A identificação e caracterização funcional do promotor da Mstn e de outros elementos cis-reguladores é crucial para o entendimento da especificidade tecidual de sua expressão, e dos mecanismos que permitem a modulação de sua transcrição durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal, e em diferentes condições fisiológicas e patológicas.
2.4
Regulação da expressão do gene da Mstn
Tendo em vista a importância da compreensão da regulação da expressão da Mstn, nosso grupo de pesquisa identificou uma região evolutivamente conservada (ECR) de 260 pb, imediatamente upstream ao gene da Mstn de vertebrados amniotos (Grade et al. 2009). Análises funcionais deste segmento de DNA demonstraram sua capacidade de dirigir a
18 transcrição tanto in vitro quanto in vivo, confirmando tratar-se do promotor proximal do gene da Mstn (Grade et al., 2009). Interessantemente, foi demonstrado que além de conter o promotor, o fragmento estudado apresenta uma região que atua como enhancer, uma vez que ensaios de eletroporação de embriões de galinha in ovo revelaram sua atividade nos somitos, mas não no tubo neural (Grade et al., 2009). Por este motivo, este fragmento foi denominado de P/E (promoter/enhancer). A presença de potenciais TFBS conservados, alguns não apenas entre os amniotos, mas também em anfíbios e no gene da mstn b de peixes teleósteos, indica que há um repertório ancestral de fatores de transcrição envolvido na regulação da atividade do gene da Mstn (Grade et al., 2009).
Além dos fatores de transcrição analisados no P/E do gene da Mstn identificado por Grade et al. (2009), provavelmente existem muitas outras moléculas que atuam no controle da expressão deste gene. Antes mesmo da caracterização do promotor proximal do gene da
Mstn realizada por Grade et al. (2009), Ma et al. (2001) já haviam caracterizado um
fragmento de 3,3 kb contendo parte da região regulatória 5’ do gene da Mstn de humanos. Eles identificaram que essa região continha sítios putativos de elementos responsivos a glicocorticoides, a andrógenos e ao hormônio tireoide, e sítios para os fatores MYOD, MEF2, PPARγ e NFκB. O sítio de MYOD é especialmente interessante por esta ser uma molécula do contexto específico da musculatura esquelética que possivelmente está atuando para regular a expressão do gene da Mstn. Porém, como não foi feita uma comparação filogenética abrangente, provavelmente foram identificados elementos importantes para a regulação do gene da Mstn apenas de humanos, mas não o que há de mais conservado entre as espécies e que poderia ser mais significativo para compreender as funções da MSTN que foram preservadas ao longo do tempo evolutivo.
Allen & Unterman (2007) descreveram a importância dos fatores de transcrição FoxO e SMAD na regulação da expressão da Mstn, utilizando em suas análises a mesma região promotora caracterizada por Ma et al. (2001). Mutagêneses nos sítios desses fatores conservados diminuiu significativamente a atividade do promotor da Mstn, e ensaios de ligação mostraram que tanto FoxO1 como SMADs de fato se ligam a seus respectivos sítios no promotor. Neste caso, foram analisados sítios putativos de fatores de transcrição conservados entre cinco diferentes espécies de mamíferos, incluindo humano e camundongo, mas as aves não foram consideradas, diferentemente do que foi feito no
19 trabalho de Grade et al. (2009). Também é importante mencionar que o segmento genômico considerado por Ma et al. (2001) e Allen & Unterman (2007) como o promotor do gene da
Mstn, na verdade é uma região 5’ regulatória muito mais ampla do que a região promotora
proximal identificada por Grade et al., (2009). Tanto a região do promotor do gene da Mstn identificado por Ma et al. (2001), como aquela considerada por Grade et al. (2009) possuem também características de enhancer. Além dessa região 5’ mais proximal ao gene, provavelmente também existem diversos outros enhancers localizados em regiões mais distantes que estão controlando a transcrição do gene da Mstn em diferentes contextos do desenvolvimento embrionário e pós-natal. O foco do presente estudo está na identificação de possíveis enhancers envolvidos na regulação da expressão do gene da Mstn no contexto do desenvolvimento da musculatura esquelética de vertebrados.
21
3
3
.
.
O
O
B
B
J
J
E
E
T
T
I
I
V
V
O
O
S
S
3.1
Objetivo geral
Estudar regiões evolutivamente conservadas (ECRs) que correspondam a possíveis elementos cis-reguladores do gene da Mstn, com ênfase nos sítios de ligação para fatores de transcrição presentes nessas ECRs que possam estar envolvidos no contexto do desenvolvimento da musculatura esquelética de vertebrados.
3.2
Objetivos específicos
Identificar ECRs ao redor do gene da Mstn por meio de uma abordagem evolutiva, a partir de análises comparativas entre os genomas de galinha, camundongo e humano;
Identificar os sítios de ligação para fatores de transcrição que estejam conservados nessas ECRs e analisar suas possíveis funções a partir de comparações com dados da literatura;
Identificar as ECRs com potencial de serem elementos cis-reguladores relacionados ao desenvolvimento da musculatura esquelética de acordo com os sítios de ligação para fatores de transcrição encontrados;
Avaliar o nível de conservação filogenética das ECRs miogênicas e identificar os principais polimorfismos em seus sítios de ligação para fatores de transcrição, visando entender sua origem e evolução;
Testar o potencial das ECRs que possuem características miogênicas de alterar a expressão do gene repórter EGFP durante o processo de diferenciação de mioblastos C2C12 de camundongo, a fim de confirmar suas capacidades cis-regulatórias.
23
4
4
.
.
M
M
E
E
T
T
O
O
D
D
O
O
L
L
O
O
G
G
I
I
A
A
4.1
Análises de Bioinformática
4.1.1 Busca por regiões evolutivamente conservadas no lócus gênico da Mstn A busca por ECRs no lócus do gene da Mstn de vertebrados foi realizada utilizando a interface gráfica ECR Browser7 (Ovcharenko et al., 2004). Este navegador genômico
permite a visualização e análise de ECRs em genomas de espécies já sequenciadas. As ECRs foram identificadas pela comparação entre os genomas de vertebrados amniotos representados pela galinha, camundongo e humano, tendo o genoma humano como base para as comparações. Os parâmetros utilizados para definir as ECRs foram aqueles considerados padrão do algoritmo: 1) comprimento mínimo de 100 pb e 2) 70% de identidade de sequência.
4.1.2 Identificação e categorização de sítios de ligação de fatores de transcrição conservados nas ECRs
Após a identificação inicial das ECRs, as sequências conservadas foram encaminhadas, através da opção “Sintenia/Alinhamentos” do próprio ECR Browser, para o programa Mulan8 (Loots & Ovcharenko, 2007), para então serem processadas pela ferramenta de pesquisa multiTF9, capaz de identificar TFBS conservados entre as espécies comparadas. Essa ferramenta utiliza a biblioteca V10.2 do TRANSFAC10 (Matys et al., 2006) que possui um total de 467 famílias de fatores de transcrição de vertebrados. A similaridade de matriz foi pré-definida como “otimizada para função”, de forma a minimizar e balancear a abundância de hits falso-negativos de diferentes matrizes (Loots & Ovcharenko, 2007).
Em seguida, os fatores de transcrição que possivelmente estivessem envolvidos na regulação da atividade transcricional da Mstn foram categorizados e analisados com relação
7
Evolutionary Conserved Region Browser (http://ecrbrowser.dcode.org/) 8
MUltiple sequence Local AligNment and conservation visualization tool (http://mulan.dcode.org/) 9
multiTF identifica TFBS conservados entre múltiplas espécies (http://multitf.dcode.org/) 10
