Ana Paola Cotrim-Zúiiiga
Análise histopatológica e estudo da expressão de PCNA,
p53, AgNOR e de metaloproteinases de matriz no
carcinoma basalóide escamoso da cavidade oral
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia e Patologia Suco-Dental, da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Universidade Estadual de Campinas, para obtenção do título de Mestre.
Piracicaba
de
Ana Paola Cotrim-Zúiiiga
Análise histopatológica e estudo da expressão de PCNA,
p53, AgNOR e de metaloproteinases de matriz no
carcinoma basalóide escamoso da cavidade oral
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia e Patologia Suco-Dental, da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Universidade Estadual de Campinas, para obtenção do título de Mestre.
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Heron Fernando de Souza Gonzaga Prof. Dr. Lourenço Bozzo
Prof. Dr. Ricardo Della Coletta
Piracicaba
Ficha Catalográfica
Cotrim-Zúiiiga, Ana Paola.
C826a Análise histopatológica e estudo da expressão de PCNA, p53, AgNOR e de metaloproteinases de matriz no carcinoma basalóide escamoso da cavidade oral. I Ana Paola CotrimZúiiiga.
-Piracicaba, SP: [s.n.], 2001. X, 79f. : il.
Orientador : Prof. Dr. Ricardo Della Coletta.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
1. Câncer. 2. Proliferação celular. 3. Agressividade. I. Della Coletta, Ricardo. 11. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. 111. Título.
Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marilene Girello CRB/8-<3159, da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de P iracicaba - UNICAMP.
UNICAMP
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Tese de MESTRADO, em sessão pública realizada em 09 de Março de 20011 considerou a candidata ANA PAOLA COTRIM ZUNIGA aprovada.
2. Prof. Dr. HERON FERNANDO DE SOUZA GONZAGA. ______
~---~--n_
__Ao
Francisco
por estar sempre ao
meu lado, me dando forças para
superar as dificuldades, e apoio
para realizar meus sonhos.
Aos meus pais
Heitor e Odete
por
todo apoio e incentivo que sempre recebi,
que me ensinaram o valor do estudo e do
trabalho, me fazendo capaz de lutar
sempre e hoje vencer.
Ao Prof.
Dr.
Ricardo Della Coletta, que sendo meu orientador foi também meu amigo e Mestre, minha eterna gratidão por tudo o que me ensinou, pelo exemplo que me deu e minhas sinceras desculpas se nemAgradeço
Aos meus irmãos Heitor Manoel, Ana Raquel e ao Enivalde pelo apoio e carinho nesta etapa de minha vida.
À Ana Clara por trazer mais alegria e felicidade em minha vida.
Aos meus avós Rosa (in memorian), Rute, Euclides e Manoel (in memorian)
que sempre estarão olhando por mim e torcendo por meu sucesso.
À Ximena, Carlos e Ximeninha pela amizade e apoio constantes.
Ao Prot Dr. Oslei Paes de Almeida que acreditou em mim tendo me recebido na
disciplina de Patologia como aluna, agradeço por esta chance que me foi dada e pela confiança em mim depositada. Espero não decepcioná-lo.
Ao meu professor Prot Dr. Lourenço Bozzo que desde a graduação me acompanha abrindo caminhos e ampliando meus horizontes.
Aos meus amigos Ana Lúcia, Addah, Renatinha, Fábio Ramoa por estarem sempre dispostos a me ajudar, por serem responsáveis por muitos dos momentos que me lembrarei no futuro e sentirei saudades destes anos.
Aos professores que me acompanham desde a graduação Ricardo Bozzo, Renata Helena Bueno, Mario Roberto Viziolli, Osvaldir Padovani Júnior, Márcia Regina Brune/li e Solange Monteiro, obrigado pelos anos de convivência, pela amizade, pelos ensinamentos e pelo apoio nesta etapa de minha formação acadêmica.
Aos colegas de curso Hannah, Ha/bert, Fábio Alves, Rogério, Júnior, Rui, Gláucia, Cristina, Roberto, Paulo Bonan, Christianinha, Nadja, Newton, Paulo Faria, Cláudio, Cíntia, Danyel, Karina, Eduardo pela ajuda e companherismo.
Aos meus amigos que estiveram presentes nesta fase de minha vida Ricardo, Caro/, Fábio, Juliana, Renata, Marcelo.
Aos professores Jacks Jorge Júnior e Pablo Agustin Vargas pelo apoio, e
amizade que recebi durante estes anos.
Aos professores Osvaldo Di Hipólito Júnior, Edgard Graner e Márcio Ajudarte Lopes do curso de Pós-Graduação em Biologia e Patologia Buco-Dental e
Estomatopatologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba- UNICAMP.
Aos colegas da Disciplina de Estomatopatologia Ana Cristina do Amaral Godoy, Maria Helena de Vasconcelos Peron, Rosa Maria Fornasiare, Adriano Luis Martins, João Carlos Gomes da Silva e André Pereira, pela convivência e
À Faculade de Odontologia de Piracicaba- UNICAMP, na pessoa de seu diretor Prof. Antônio Wilson Sallun.
À Profa. Ora. Altair Antoninha Del Bel Cury, coordenadora dos cursos de pós-graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba- UNICAMP.
À Profa. Ora. Darcy O Tosello, coordenadora do programa de pós-graduação em Biologia e Patologia Buco-Dental da Faculadade de Odontologia de Piracicaba - UNICAMP.
À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-CAPES pela concessão da bolda de mestrado.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP, pela contribuição financeira na realização deste trabalho através do processo
SUMÁRIO
RESUMO ... 1
ABSTRACT ... 2
1. INTRODUÇÃO ... 3
2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1. Carcinoma Espinocelular (CEC) da Cavidade Oral .. . ... .. .. ... ... ... ... 5
2.2. Carcinoma Basalóide Escamoso (CBE) ... 16
2.3. Metaloproteinases de Matriz (MMPs) ... 21
2.4. Marcação pela prata das regiões organizadoras nucleolares (AgNOR) .. ... 25
2.5. Antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) .. . . ... .... .. .... ... ... .. ... 26
2.6. p53 ··· 27 3. PROPOSIÇÃO ... 29 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Amostras 4.1.1. CBE- 1 . .... ... .. ... .. .. ... ... ... ... .. ... .. ... .. ... .. .... ... . .. ... ... ... .. .. . ... 30 4.1.2. CBE-2 ... 30 4.1.3. CEC-1 ... 31 4.1.4. CEC-2 ... 32 4.2. Histoquímica ... .. .. . .. ... .... ... ... ... ... . .. ... ... .... ... .. ... .. ... .. .. . ... 33
4.3. Classificação Dos CECs ... 33
4.4. Coloração de AgNORs . .... .. ... .. ... .. . ... ... .... ... .... .. ... ... ... .. .. . .. ... ... 33
4.5. Análise lmunohistoquímica de PCNA, p53 e laminina ... 34
4.6. Contagem de Mitoses ... 35 4.7. RT- PCR ... 35 4.8. Análise Estatística ... 38 5. RESULTADOS 5.1. Características Histopatologicas ... .... ... .... ... ... 39 5.2. Potencial Proliferativo ... 46 5.3. Potenciallnvasivo ... 54 6. DISCUSSÃO ... 57 7. CONCLUSÕES ... 66 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 68
RESUMO
Carcinoma Basalóide Escamoso (CBE) é uma variante pouco comum, porém muito agressiva do Carcinoma Espinocelular (CEC) que acomete preferencialmente o trato aerodigestivo superior. Relatamos 2 casos de CBE comparando seu potencial de proliferação
e
invasividade com CEC indiferenciados com igual localizaçãoe
estado TNM, de pacientes com mesma idadee
sexo. A classificação dos tumores foi feita pela análise das características histopatológicas com auxilio das colorações de hematoxilinae
eosina (HE), ácido periódico de schiff (PAS), alcian bluee
reação de imunohistoquímica demonstrando a presença de laminina. A atividade de proliferação foi estudada pelos métodos quantitativose
morfológicos de AgNORs (região organizadora nucleolar arginofílica), análise imunohistoquímica da expressão de PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular) além da determinação do índice mitóticoe
o potencial de invasão foi avaliado pela reação em cadeia de polimerase transcriptase reversa (RT-PCR) para metaloproteinases de matriz (MMPs). A presença de mutações de p53 foi também verificada por imunohistoquímica. As características histológicas foram semelhantes as previamente descritas. Os índices de AgNORe
PCNA foram significativamente mais altos nos casos de CBE comparando com os casos de CEC. lmunohistoquímica para a proteína p53 mostrou uma maior quantidade de células positivas, além de uma coloração mais intensa nos CBEs que nos CECs. RT-PCR mostrou maior expressão de MMP-1, MMP-2e
MMP-9 nos CBEs. Esses resultados sugerem que os CBEs apresentam um comportamento mais agressivo que os CECs indiferenciados.ABSTRACT
Basaloid squamous carcinoma of the oral cavity: report of two cases and study of the AgNOR, PCNA, p53 and matrix metalloproteinase expression
Basaloid squamous carcinoma (BSC) is an uncommon aggressive variant of squamous cell carcinoma (SCC) with a predilection for the head and neck. In the English literature, approximately 40 cases of BSC have been described in the oral cavity. In this study, clinicopathologic features of 2 cases of BSC affecting the buccal mucosa are discribed. Additionally, we compared the proliferative and invasive potential of BSC cells with poorly-differentiated SCC, matched for age, sex, site and TNM status. Proliferative activity was studied by the argyrophilic nuclear organizer region (AgNOR) method and immunohistochemical quantífication of proliferatíng cell nuclear antígen (PCNA). The invasive potential was evaluated by semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) for matrix metalloproteinases (MMPs). Alterations of p53 and the presence of laminin were also investigated by immunohistochemistry. The tumors showed many clinicai and histopathologic similarities to cases previously reported. The AgNOR and PCNA índices were significantly higher in both cases of BSC than in SCC. lmmunostaining for the p53 protein showed a higher percent of positive cells, and more intense staining in the BSC than in the SCC tissues. RT -PCR studies clearly demonstrated that the expression of MMP-1, MMP-2, and MMP-9 were higher in cells from BSCs than from SCCs. Taken together, the data described here are compatible with the concept that BSC has a more aggressive biologíc behavior than the conventíonal SCC.
Key words: basaloid squamous carcinoma, squamous cell carcinoma, proliferation, invasive
1. Introdução
Carcinoma basalóide escamoso (CBE) é considerado uma variante de carcinoma espinocelular (CEC), como primeiramente proposto por Wain et ai. em 1986. Embora possa acometer ambos os sexos, predomina em homens acima dos 60 anos de idade (Akyol et ai., 1995; Wieneke et ai., 1999) O CBE apresenta uma predileção pela região de cabeça e pescoço, mas pode afetar outros sítios como pulmão (Singh et ai., 1996), esôfago (Koide et ai., 1999), região anal (Wong et ai., 1999), pênis (Lam et ai., 1999), amídala (Khurana et ai., 1997) e cérvix uterino (Grayson et ai., 1999). Aproximadamente 100 casos de tumores na região de cabeça e pescoço foram descritos, aonde as regiões mais comuns foram laringe e base da língua (Banks et ai., 1992; Abiko et ai., 1998) sendo que destes, 40 casos acometiam a cavidade bucal. As características histológicas do CBE incluem o padrão basocelular associado ao CEC, carcinoma "in situ" ou diferenciação escamosa (Wain et ai., 1986). O comportamento do CBE parece ser mais agressivo que o CEC convencional, e pacientes com CBE apresentam um prognóstico pouco favorável (Coppola et ai., 1993; Altavilla et ai., 1999). Entretanto, devido ao limitado número de casos de CBE afetando a cavidade oral, poucos dados referentes as suas propriedades biológicas influenciando o prognóstico são encontrados na literatura.
Este trabalho descreve as características clínicas e histopatológicas de dois novos casos de CBE na cavidade oral e avalia o potencial proliferativo e invasivo deste tumor. Os resultados obtidos nos casos de CBEs são comparados a dois casos de CECs indiferenciados, de pacientes de mesma
idade
e
sexoe
com tumores de mesma localizaçãoe
estado TNM. As características histopatológicas foram analisadas pela coloração de HE. Outras colorações foram utilizadas para auxiliar a classificação dos tumores, como o PAS, alcian bluee
a reação de imunohistoquímica para laminina. A atividade proliferativa foi verificada por análise quantitativae
morfométrica de AgNOR, reação de imunohistoquímica verificando a expressão de PCNAe
contagem de células em mitose por campo. Pelo fato da proteína p53 poder identificar carcinomas de fenótipo bastante agressivos foi analisada a positividade esta proteína através de reação imunohistoquímica. A capacidade de invasão dos tumores foi determinada pela análise da expressão de MMPs, as principais enzimas que degradam componentes da matriz extracelular, através de mRNA extraído de tecidos fixados em formale
embebidos em parafina.2. Revisão da Literatura
2.1. Carcinoma Espinocelular (CEC) da Cavidade Oral
CEC ou carcinoma de células escamosas é uma neoplasia maligna derivada da camada espinhosa do epitélio estratificado (Rey, 1999), que representa cerca de 95% de todas as neoplasias malignas que afetam a cavidade oral. Nos EUA os CECs orais representam cerca de 3% dos cânceres em homens e 2% nas mulheres (Neville et ai., 1998), com cerca de 30.000 novos casos ao ano (Regezi et ai., 1999). No Brasil os CECs orais representam 7% de todos os cânceres nos homens (sendo o 52 mais freqüente) e 1,7% nas
mulheres (sendo o 82 mais freqüente), estimando-se mais de 8.000 novos casos em homens e 3.000 novos casos em mulheres a cada ano. A incidência dos casos de CEC oral no território brasileiro é bastante heterogenia, os homens dos estados de São Paulo e Rio de Janeiro parecem ser os mais afetados, com uma taxa de 13,5 a 20,6 a cada 100.000. As mulheres dos estados do Rio de Janeiro e Rondônia são mais afetadas com uma incidência de 4,4 a 6,7 a cada 100.000 (INCA, 2001).
Um grande número de fatores contribuem para o desenvolvimento do CEC oral, contudo, o consumo de cigarro e álcool encabeçam esta lista. Outro ponto interessante é que existem fortes evidências para uma relação entre dose e tempo de exposição dos carcinógenos encontrados no cigarro e álcool para o desenvolvimento do CEC oral (Scully et ai., 2000- a). Todas as formas de fumo
são ligadas a etiologia do CEC oral (Regezi et ai., 1999). A fumaça do tabaco é uma mistura composta por mais de 5 mil elementos diferentes, e muitos destes são carcinogênicos, capazes de induzir mutações no material genético celular, ou pró-carcinogênicos, que durante seu metabolismo induzem a formação de substâncias nocivas. Entre estas substâncias encontram-se os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, nitrosaminas, aldeídos e aminas aromáticas (Scully et ai., 2000 - a). O álcool é também considerado um fator de risco a vários tipos de câncer, incluindo o CEC. Contudo, o mecanismo pelo qual o álcool atua neste processo ainda é incerto. Embora o álcool seja conhecido por não ser mutagênico, carcinogênico ou clastogênico, os produtos de seu metabolismo, principalmente os acetaldeídos, são potentes produtores de radicais livres, causando mutações no DNA. Para o metabolismo do álcool são necessárias duas enzimas presentes no fígado e na mucosa do trato digestivo superior, incluindo a cavidade oral. A primeira enzima, a álcool desidrogenase, oxida o etanol tendo como produto o acetaldeído, uma substância citotóxica que produz radicais livres e mutações no DNA. Em seguida, a enzima aldeído desidrogenase atua transformando o acetaldeído em água e gás carbônico, inócuos a célula (Scully et ai., 2000 - a). Assim, se as células apresentam uma deficiência no metabolismo do acetaldeído, ou se são submetidas a doses de álcool em quantidade e freqüência além de sua capacidade de metabolismo, pode ocorrer acúmulo de acetaldeído nocivo à célula (Scully et ai., 2000- a).
A radiação solar, particularmente os raios ultravioletas, é a principal causa de carcinomas de pele, sendo também responsável pela etiologia de CECs no lábio, principalmente inferior (Cotran et ai., 2000). De acordo com o comprimento de onda, os raios ultra-violetas (raios UV) são classificados em raios UV-C (200-280nm), em raios UV-A (320-400nm) e em raios UV-B (280-320nm). A penetração dos raios UV-B e UV-C tem aumentado com a destruição da camada de ozônio, enquanto que a penetração dos raios W-A independem da proteção desta camada. Dois mecanismos podem estar envolvidos na indução do câncer de pele e lábio inferior por raios UV: alteração do DNA (pela formação de dímeros de pirimidina) e supressão imunológica. Pesquisas indicam que a exposição acumulativa e excessiva ao sol durante os primeiros 1 O a 20 anos de vida aumenta muito o risco de câncer de pele, mostrando que a infância
é uma fase particularmente vulnerável aos efeitos nocivos do sol sobre este órgão (INCA, 2001).
A associação do CEC oral com outros fatores como agentes externos, como sífilis, vírus, estado sistêmico do paciente, como a desnutrição, anemia ferropriva e deficiência de algumas vitaminas tem sido sugerida (Cotran et ai., 2000). A radiação X pode causar cânceres orais, principalmente como efeito colateral após tratamentos radioterápicos, resultando em carcinomas orais e sarcomas (Fietcher et ai., 1995). DNA de vírus do papiloma humano (HPV) tem sido encontrado no câncer bucal, não estando ainda clara sua relação com a etiologia deste tumor (Neville et ai., 1998; Cotran et ai., 2000).
Os agentes carcinogênicos ou pró-carcinogênicos atuam na célula epitelial normal, causando mutações no DNA. O acúmulo destas mutações altera grupos de genes que desempenham características específicas na célula, são estes: os proto-oncogenes, os genes supressores de tumor, as telomerases e os genes que regulam o processo de apoptose. Para que o tumor seja capaz de invadir os tecidos adjacentes e produzir metástases, suas células devem ter a capacidade de degradar a matriz extracelular, assim os genes que transcrevem as principais enzimas ligadas a degradação da matriz extracelular, as MMPs, também devem estar ativos (Scully et ai., 2000- a).
CEC oral pode se apresentar clinicamente como uma massa exofítica, com ou sem ulceração, uma lesão branca, eritroplasia ou eritroleucoplasia. O lábio inferior representa cerca de 30% dos cânceres de boca. O CEC de língua
é a lesão maligna intra-oral mais comum e representa 40% dos carcinomas de boca (Regezi et ai., 1999). É seguido pelo soalho bucal, que representa 20% dos sítios do tumor. A gengiva, rebordo alveolar, palato mole e mucosa jugal são os sítios com menores freqüências de acometimento por CECs (Neville et ai., 1998).
O estadiamento do câncer é baseado no tamanho da lesão primária, em sua dispersão para linfonodos regionais e na presença ou ausência de metástases. O sistema foi desenvolvido pela União Internacional Contra o Câncer (UICC)
e
é denominado de Sistema TNM de Classificação dos Tumores Malignos. A letra T representa o tamanho e as características do tumor primário, N as características dos linfonodos das cadeias de drenagem linfática do órgãoem que o tumor se localiza e M a presença ou ausência de metástases à
distância. O estadiamento TNM varia para cada forma especifica de câncer, mas existem princípios gerais aonde estes parâmetros recebem graduações, geralmente de TO a T4, de NO a N3 e de MO a M1. Uma lesão in situ é
classificada como Tis, e com o aumento de tamanho a classificação varia de T1
à T4. NO indica que não há linfonodos afetados, enquanto N1 à N3 indicam um número crescente de linfonodos afetados. MO representa a ausência de metástases distantes e M1 a presença de metástases (Cotran et ai., 2000). O
símbolo "X" é utilizado, substituindo o número referente a graduação, quando uma categoria não pode ser devidamente avaliada.
Histologicamente as lesões de CEC apresentam-se como uma proliferação epitelial com células espinhosas pleomórficas (muitas vezes esta proliferação mostra-se em forma de gotas), com núcleos hipercromáticos, nucléolos evidentes, sendo comum figuras de mitoses atípicas. A proliferação epitelial frequentemente mostra um padrão invasivo ao tecido conjuntivo subjacente, formando ninhos ou ilhas epiteliais malignas (Regezi et ai., 1999). Focos de células queratinizadas isoladas ou massas esféricas de queratina em profundidade (pérolas de queratina) podem ser observados. Segundo o grau de diferenciação celular, os CECs podem ser classificados em bem diferenciado, moderadamente diferenciado e indiferenciado (pouco diferenciado). Esta graduação é feita de acordo com os graus de diferenciação, pleomorfismo celular e atividade mitótica (Cawson et ai., 1995).
Os carcinomas bem diferenciados representam a maioria dos carcinomas bucais e se assemelham ao tecido epitelial escamoso normal. Estes tumores apresentam freqüentemente um padrão sólido, contendo proporções variadas de células escamosas e basais, com evidente queratinização e poucas figuras de mitoses (Anneroth et ai., 1987). Geralmente estes carcinomas possuem crescimento lento e são menos invasivos quando comparados com os carcinomas indiferenciados. Apresentam margens definidas sem invasão vascular e com evidente resposta infamatória linfomonoplasmocitária (Anneroth et ai., 1987). Metástases regionais e eventualmente a distância ocorrem nos casos mais avançados (Fietcher et ai., 1995). O prognóstico do CEC com esta diferenciação é bastante favorável.
Os carcinomas moderadamente diferenciados apresentam células espinhosas bem evidentes com acentuado pleomorfismo nuclear, maior número de mitoses (incluindo mitoses atípicas), hipercromatismo, nucléolos bem evidentes e poucas pérolas de queratina, embora possa ocorrer queratinização de células individuais (Cawson et ai., 1995). Geralmente são mais invasivos e mostram crescimento mais rápido do que os carcinomas bem diferenciados, o que pode tornar o prognóstico pior nos casos não diagnosticados precocemente (Fietcher et ai., 1995).
Os carcinomas indiferencíados apresentam pouca ou nenhuma evidência de queratinização e as células neoplásicas mostram alto grau de pleomorfismo e hipercromasia. Apresentam um crescimento difuso com as células demonstrando elevado potencial mitótico. Os CECs indiferenciados apresentam um
comportamento bastante agressivo, caracterizado pela alta capacidade de invasão e de lançar metástases (Anneroth et ai., 1987; Fletcher et ai., 1995).
Os CECs se disseminam através de invasão das estruturas adjacentes e de metástases linfáticas que embora não ocorram no estágio inicial, o atraso no diagnóstico faz com que 21% dos pacientes apresentem metástases cervicais ao diagnóstico. O tratamento e prognóstico dos pacientes acometidos por CEC dependem do estágio clínico do tumor e consistem de excisão cirúrgica, radioterapia e/ou quimioterapia. Em geral a sobrevida de 5 anos é pequena, chegando a cerca de 45 a 50%. Como o prognóstico declina com o aumento de tamanho e estágio clínico do tumor, o diagnóstico e tratamento precoces são essenciais para prevenir morte prematura ou desfiguramento estético (Cawson et ai., 1995).
CEC oral pode apresentar 5 variantes raras que apresentam características clínicas, histológicas e de comportamento bastante distintas. O carcinoma de células fusiformes é uma variante rara do CEC, caracterizada por epitélio escamoso superficial displásico associado a células anaplásicas epiteliais com padrão fusiforme (Fietcher et ai., 1995). Clinicamente acomete predominantemente o trato aerodigestivo superior, laringe, hipofaringe, esôfago e pulmão. Na cavidade oral afeta com maior freqüência o lábio e ocasionalmente a língua. Apresenta-se tipicamente como uma massa ou úlcera granular séssil, causando dor e parestesia. O tumor apresenta crescimento rápido e metástase precoce (Neville et ai., 1998). Histologicamente mostra-se como um tumor bifásico composto predominantemente por feixes de células anaplásicas em
forma de fuso associado a áreas típicas de CEC. O elemento escamoso normalmente consiste em carcinoma "in situ", podendo também se apresentar como ilhas do epitélio escamoso displásico em meio as células fusiformes. Uma transição direta entre os dois tipos de células pode ser notada (Neville et ai., 1998). A natureza epitelial das células fusiformes pode ainda ser comprovada pela imunocitoquímica (mostrando antígenos contra citoqueratinas) e pelas características ultraestruturais (tonofilamentos no citoplasma e desmossomos). Nota-se pleomorfismo celular com hipercromatismo nuclear e numerosas figuras de mitoses atípicas. Metástases deste tumor mostram principalmente células escamosas e raramente células fusiformes. Aproximadamente um terço dos casos relatados na literatura de carcinoma de células fusiformes ocorreram após tratamento radioterápico em lesões de CEC, mas este dado não explica sozinho a patogênese da doença (Neville et ai., 1998). O tratamento eletivo é a cirurgia radical com esvaziamento cervical. A radioterapia ou quimioterapia são ineficazes. O prognóstico é ruim, com uma taxa de sobrevida após 5 anos de 30%, semelhante aos CEC orais indiferenciados.
O carcinoma escamoso verrucoso é uma variante do CEC de baixo grau de malignidade, relacionado ao uso de tabaco, principalmente o hábito de mascar fumo (Regezi et ai., 1999). Desde sua descrição em 1948, tem sido diagnosticado também em outros sítios, incluindo mucosa de laringe, vagina e reto, e na pele das mamas, axilas, canal auricular e regiões plantares. Vários autores associam o desenvolvimento do carcinoma verrucoso com a presença
do HPV, principalmente os subtipos 16 e 18 (Neville et ai., 1998). Clinicamente se caracteriza por uma placa espessa, difusa, bem demarcada e indolor, de crescimento lento, exofítico, com projeções papilares ou verruciformes, acometendo preferencialmente o vestíbulo mandibular, a mucosa jugal, o palato duro e a gengiva inserida (Neville et ai., 1998). Histologicamente é caracterizado por um epitélio acantolítico hiperparaqueratótico com criptas interpapilares largas e alongadas contendo células escamosas bem diferenciadas, acantose intensa e hiperparaqueratinização (Fietcher et ai., 1995).
Há duas formas de manifestação, a forma pura e a forma híbrida. Na forma pura da lesão há mínima atipia celular e a invasão dos tecidos em profundidade ocorre em forma de ninhos de células que parecem empurrar (deslocar) as estruturas subjacentes. Há infiltrado inflamatório denso composto de linfócitos, plasmócitos e macrófagos na margem profunda da lesão, delimitando a massa tumoral. Pérolas de queratina na forma de inclusões microcísticas em vários tamanhos e micro abscessos podem ser observados. Reação de corpo estranho ao material queratinizado também pode ser observado. Figuras de mitoses são raras e concentradas na região basal e peribasal. Invasão da membrana basal e de estruturas glandulares não são aparentes. No entanto, nos casos mais avançados, este tumor pode invadir os tecidos adjacentes, incluindo músculo, cartilagem e osso. A progressão de crescimento é lenta, a destruição local é mínima, metástases regionais ou a distância são pouco freqüentes. Na forma
híbrida da lesão pode-se notar áreas de CEC com atipias nucleares. O crescimento é mais acentuado, podendo promover invasão regional. Na realidade, o carcinoma verrucoso ocupa posição intenmediária entre a hiperplasia verrucosa e o CEC. A metástase é extremamente rara e assim o tratamento de eleição é a ressecção cirúrgica com margem de segurança, sem esvaziamento cervical. A radioterapia ou quimioterapia não são indicadas (Neville et ai., 1998). O prognóstico, na maioria dos casos, é excelente decorrente do alto nível de diferenciação celular, crescimento lento e baixa invasividade local.
O carcinoma escamoso papilífero é uma neoplasia do trato aerodigestivo superior, sendo uma variante rara do CEC, relatada como um carcinoma escamoso invasivo com componente exofitico papilífero. Esta neoplasia mostra algumas características clínicas e histológicas semelhantes ao carcinoma verrucoso, onde ambos tem um padrão de crescimento exofítico e papilífero (Ferlito et ai., 1999). Apesar de algumas semelhanças com o carcinoma verrucoso, deve-se diferenciar histologicamente estas duas entidades, visto que o carcinoma escamoso papilífero é mais agressivo e requer um tratamento mais específico e agressivo. Ocorre com maior freqüência na laringe, seguida pela orofaringe e nasofaringe. Muitos trabalhos relacionam a infecção pelo HPV e a patogenia nestas lesões, porém ainda é incerto seu papel na etiologia do tumor. Microscopicamente o carcinoma escamoso papilífero é composto por estruturas exofíticas papilares cobertas por epitélio que mostra pleomorfismo nuclear e figuras de mitoses atípicas, contento no centro estroma fibrovascular.
Um padrão invasivo está freqüentemente presente e proeminente nesta lesão. Em alguns casos o tumor mostra reação inflamatória moderada de células inflamatórias mononucleares no tecido conjuntivo subjacente. Algumas células do epitélio podem apresentar ainda núcleos picnóticos circundados por halo perinuclear, compatíveis com alterações celulares induzidas por partículas virais denominadas de coilocitose.
O carcinoma adenoescamoso é definido pela Organização Mundial de Saúde como sendo um tumor maligno com padrões histológicos de adenocarcinoma e CEC. O componente glandular e escamoso se apresentam em grande proximidade, mas são distinguíveis. Esta variação rara e agressiva do CEC oral pode também acometer os tratos gastrointestinais, sistema respiratório e genitourinário além da pele. Na região de cabeça e pescoço a maioria dos casos acomete a laringe e os seios paranasais. As metástases são freqüentes afetando em ordem decrescente os linfonodos regionais, pulmão, fígado e ossos. Alguns autores relatam a origem das células tumorais como sendo do epitélio de superfície e relatam a presença de glândulas adjacentes normais, sugerindo que esta neoplasia não se origine do epitélio dos duetos das glândulas salivares, contradizendo outros relatos da literatura (Napier et ai., 1995).
2.2. Carcinoma Basalóide Escamoso (CBE)
O CBE é uma variante rara do CEC com predileção pela região de cabeça e pescoço, mas também sendo encontrada em outros sítios como pulmão (Singh et ai., 1996), esôfago (Koide et ai., 1999), ânus (Wong et ai., 1999}, pênis (Lam et ai., 1999}, amígdalas (Khurana et ai., 1997}, e cérvix uterino (Grayson et ai., 1999). Afeta predominantemente homens de 40 a 85 anos de idade com história de abuso de álcool e tabaco. Clinicamente se apresenta como uma massa ou úlcera de crescimento exuberante, podendo ser dolorido ou causar disfagia. Aproximadamente 80% dos pacientes apresentam metástases cervicais ao diagnóstico (Neville et ai., 1998).
Na cavidade oral, 40 casos de CBE foram descritos, entre estes tumores, 17 (42.5%) tiveram origem na base da língua, (Wain et ai., 1986; Banks et ai., 1992; Luna et ai., 1990) 12 (30%) no soalho bucal (Campman et ai., 1994; Coppola et ai., 1993), 4 (10%) na região anterior da orofaringe (Aitavilla et ai., 1999), 2 (5%) no palato (Lovejoy et ai., 1992; Hellquist et ai., 1994), 3 (7,5%) na mucosa jugal (Wain et. ai, 1986; Cadier et ai., 1992; Araujo et ai., 1993), 1 (2,5%) na maxila (Wedenberg et ai., 1997) e 1 {2,5%) na mucosa gengiva! (Abiko et ai., 1998). O CBE apresenta dois componentes, o de carcinoma de células escamosas, bem ou moderadamente diferenciado, e um epitélio basalóide invasivo, organizado em ilhas, cordões ou lóbulos semelhantes
ã
glândulas.O CBE foi considerado uma entidade distinta do CEC a partir de 1986, com a descrição detalhada de 1 O casos de CBE feita por Wain et a!.. Estes
autores descreveram como características relevantes para o diagnóstico do CBE:
(a) predileção pela região de cabeça e pescoço de homens entre os 60 e 70 anos de idade;
(b) lesão apresentando-se clinicamente como uma massa exofítica e ulcerada infiltrando o tecido conjuntivo subjacente;
(c) presença simultânea do padrão basalóide e escamoso, que pode ser in situ ou invasivo;
(d) o padrão basalóide é composto de massas sólidas de células num arranjo lobular em grande proximidade a mucosa de superfície. As células basalóides são pequenas, com citoplasma escasso e núcleo hipercromático sem nucléolos evidentes; (e) as áreas centrais das ilhas tumorais freqüentemente
apresentam necrose por coagulação (comedonecrose);
(f) as ilhas basalóides apresentam espaços microcísticos contendo material positivos ao PAS e/ou Alcian Blue.
Em microscopia eletrônica, as células basalóides apresentam forma poligonal, com núcleo claro contendo cromatina fina e dispersa. O citoplasma apresenta desmossomos relativamente pequenos evidenciando claramente interligações celulares fracas e poucos tonofilamentos (Wain et ai., 1986; Abe et ai., 1996). Com menor freqüência pode se observar características de malignidade, como o núcleo grande e irregular com numerosos nucléolos. Os espaços cístícos identificados em microscopia óptica são visualizados em
microscopia eletrônica como delineados por membrana basal e preenchidos frouxamente por grânulos estrelados ou aglomerados paralelos de laminina basal (Wain et ai., 1986). Não são vistos grânulos secretores, neurosecretores ou miofilamentos com corpos densos e organização citoplasmática, sugerindo um padrão similar as células indiferenciadas (Wain et ai., 1986; Coppola et ai., 1993; Abe et ai., 1996). Circundando as ilhas de células basalóides pode-se observar dupla camada de células basais (Ferlito et ai., 1997).
Não há um consenso sobre a origem das células basalóides, duas teorias foram sugeridas: que seriam provenientes de células primitivas totipotentes localizadas na base do epitélio ou na proximidade dos duetos das glândulas salivares da laringe, hipofaringe e língua (Wain et ai., 1986), ou que seriam originadas de células basais pluripotentes do epitélio escamoso (Abe et ai., 1996). Esta segunda hipótese esta fundamentada no padrão de marcação imunohistoquímica para citoqueratina. O CBE apresenta células periféricas dos ninhos basalóides positivas somente para citoqueratina 14 e 19, em epitélio normal citoqueratina 14 é expressa somente na camada basal do epitélio e citoqueratina 19 nas camadas basal e suprabasal (Abe et ai., 1996).
O comportamento biológico do CBE foi demonstrado ser pior quando comparado com o CEC de mesma região. Contudo, devido ao pequeno número de tumores que afetam a cavidade bucal, pouco se conhece sobre as propriedades biológicas deste tumor quando atinge a cavidade bucal. Ferlito et ai., em 1997, analisando o CBE de laringe e hipofaringe,
consideraram o CBE uma entidade distinta, com comportamento biológico mais agressivo que o CEC, tendo como base a maior freqüência de metástases regionais e a distância e a evidência de alta atividade proliferativa, como revelado pela imunoreatividade para p53 e MIB-1/Ki-67. Coppola et ai. (1993) compararam o CBE com CECs de soalho bucal e demonstraram que o CBE apresenta maior agressividade com propensão a invasão perineural e do tecido ósseo adjacente, concluindo que o CBE comparado ao CEC apresenta maior potencial de recorrência e metástase. Abiko (1997) estabeleceram uma cultura de células provenientes de CBE e determinou "in vitro" o comportamento e propriedades biológicas destas células. Estes autores mostraram que o CBE quando comparado as células do CEC apresentam uma maior capacidade proliferativa e de invasão, concluindo que o CBE apresenta um comportamento biológico agressivo e um elevado potencial invasivo. Por outro lado, no estudo de Sarbia et ai. (1986) em CBE de esôfago comparados a CECs de mesma região, o índice de sobrevida, índices mitóticos e apoptóticos não apresentaram diferenças estatisticamente significante, mas o índice de proliferação celular foi significantemente mais alto em CBE. Assim, Sarbia et ai. (Sarbia et ai., 1986) concluíram que o CBE é uma variante do CEC com pobre grau de diferenciação, alto índice proliferativo e prognóstico semelhante ao do CEC de mesmo local. A afirmação de que o comportamento biológico do CBE é mais agressivo que o comportamento do CEC é baseada na maior capacidade infiltrativa, principalmente em
nervos, vasos sangüíneos, músculo e osso, maior ocorrência de metástases regionais e à distância.
Apesar de bem estabelecidas as características histopatológicas do CBE, seu diagnóstico histopatológico pode ser confundido com o carcinoma adenóide cístico, carcinoma adenoescamoso, carcinoma neuroendócrino, carcinoma indiferenciado de células pequenas, adenocarcinoma de células basais e ameloblastoma maligno periférico (Barnes et ai., 1996; Van der Wal et ai., 1994; Ide et ai., 1996). Dentre estes, o carcinoma adenóide cístico é o mais freqüentemente confundido. No carcinoma adenóide cístico há células mioepiteliais e padrão tubular, não observado no CBE. Além disto, a presença simultânea de CEC, carcinoma in situ ou diferenciação escamosa focal excluem a possibilidade de carcinoma adenóide cístico. O tratamento adequado para o CBE consiste na ressecção cirúrgica associada a esvaziamento cervical e radioterapia pós-operatória. Quimioterapia pode ser utilizada como tratamento adjuvante (Wain et ai., 1986; Banks et ai., 1992; Coppola et ai., 1993; Altavilla et ai., 1999; Luna et ai., 1990; Ferlito et ai., 1997).
2.3. Metaloproteinases de Matriz (MMPs)
MMPs são endopeptidases que apresentam a capacidade de degradar componentes básicos da matriz extracelular, regulando sua composição. Estas enzimas desempenham papéis fundamentais em processos fisiológicos como no remodelamento tecidual durante o desenvolvimento, involução do útero no pós-parto, angiogênese, cicatrização e migração celular; e também em processos patológicos como na invasão e metástase de células tumorais, patogênese da artrite reumatóide e doença periodontal (lkebe et ai., 1999; Birkedai-Hansen et
ai., 1993; Coletta et ai., 1999).
Estas enzimas são endopeptidases secretadas na forma de zimógeno que dependem do íon zinco para sua ativação. Na estrutura das MMPs é possível identificar dois domínios: o de ativação, onde a estrutura sofre proteólise, e o domínio do núcleo enzimático, que contém o sítio de ligação ao íon zinco (Birkedai-Hansen et ai., 1993). A ativação da forma zimógeno é o resultado da ação de enzimas proteolíticas como a tripsina, a plasmina, elastase e catepsina 8, que removem a porção N-terminal. Em seguida, há ruptura da ponte existente entre o aminoácido cisteína e o íon zinco, que bloqueia o sitio ativo da molécula. Para o funcionamento das MMPs ainda deve haver, interação com íon zinco em dois resíduos de histidina localizados no domínio catalítico da molécula, e a estabilidade da estrutura terciária que é conferida por dois átomos de cálcio (Coletta et ai., 1999).
As MMPs são uma família de enzimas que apresentam grande homologia entre si, e são divididas em 4 grupos baseando-se em sua estrutura
e especificidade ao substrato (Tabela 1). As enzimas do grupo das colagenases, gelatinases, estromelisinas são secretadas pelas células, enquanto que as enzimas que compõem o quarto grupo, grupo das MMPs de membrana (MT-MMPs), são moléculas transmembrânicas (Thomas et ai., 1999). Apesar de existir 50% de homologia entre as colagenases de fibroblasto e as estromelisinas, as enzimas apresentam substratos diferentes. Enquanto a estromelisina (MMP-3, -10) é capaz de degradar vários substratos incluindo proteoglicanas, laminina, colágeno tipo IV, V, Vil, e X, e gelatina, a colagenase tem sua atividade dirigida primariamente contra moléculas de colágeno nativo (Gross et ai., 1965; Coletta et ai., 1999). A especificidade das colagenases pelo colágeno nativo é surpreendente. As colagenases (MMP-1, -8, -13) clivam as cadeias da tripla hélice do colágeno tipo I em um único ponto da molécula entre um resíduo de glicina e um de leucina ou isoleucina dependendo da cadeia alfa em questão. As gelatinases (MMP-2, -9) são capazes de degradar colágeno tipo V e Vil, elastina e gelatina (Coletta et ai., 1999).
A expressão das MMPs pode ser regulada de forma diferente por fatores de crescimento, hormônios e outros agentes químicos. Dois fatores têm sido muito pesquisados, interleucina-1
13,
que estimula a expressão de MMPs e o fator de crescimento transformante13
que, em várias linhagens de células, inibe a expressão gênica das MMPs (Coletta et ai., 1999). A expressão das MMPs pode ocorrer de forma constitutiva na célula ou ser induzida. MMP -1 e -2 são expressas de forma constitutiva em várias células, enquanto MMP - 9 tem suaexpressão induzida por diversos fatores. Fragmentos de matriz extracelular clivados por MMPs podem potencializar a expressão das MMPs. Extracelularmente, a atividade das MMPs é controlada pelo mecanismo de ativação e pela ação de seus inibidores teciduais específicos (TIMPs) (Thomas et ai., 1999).
Vários estudos mostraram que as gelatinases (MMP-2 e -9), estromelisinas (MMP-3, -10 e -11), colagenases (MMP-1 e -13) e as MMPs transmembrânicas (MT1-MMP) são expressas em câncer oral e podem ter funções importantes no desenvolvimento do tumor (lkebe et ai., 1999; Kurahara et ai., 1999; Thomas et ai., 1999). A membrana basal que separa o epitélio do tecido conjuntivo é a primeira barreira para a invasão do tumor epitelial. A habilidade da MMP-2 e MMP-9 de iniciar a destruição da membrana basal e degradar seus componentes colagênicos e não colagênicos mostra que estas enzimas são importantes neste processo. A expressão de MMP-2 esta associada a metástase em linfonodos (Thomas et ai., 1999). Alguns estudos mostram que a presença de MMP-2 em carcinomas pode ser também proveniente do estroma tumoral, sugerindo que para a invasão tumoral, as células neoplásicas são capazes de utilizar MMPs produzida pelas células do estroma (Thomas et ai., 1999). Foi clonado um novo membro da família MMP, que apresenta uma expressão bastante aumentada nos fibroblastos normais que envolvem as células cancerosas em um tumor de mama. Tal descoberta indica que as células tumorais são capazes de induzir a expressão de MMPs também em células normais (Declerk et ai., 2000).
Tabela 1 Família das MMPs humanas
Grupo Nome da Enzima Abreviatura Substrato
Colagenase intersticial MMP-1 Colágeno -1, 11, 111, IV, V, Vil, VIII, X, gelatina,
(/)
(de fibroblastos) Pró-MMP-2, Pró-MMP-9
(I) (/)
(1l Colagenase de neutrófilos MMP-8 Colágeno I, Vil, VIII, X, XI
c (I)
Colagenase 3 MMP-13 Fibronectina, gelatina, laminina, ligações
O>
(1l
o proteína-proteoglicano, proteoglicanos,
(,)
vitronectina, colágeno I
Gelatinase A (72 kDa) MMP-2 Gelatina, Colágeno -1, IV, V, IX, XI, XIV,
(/) elastina, fibronectina, laminina, ligações
(I) (/) proteína-proteoglicano, proteoglicanos, (1l c :;::; tenacin, vitronectina (1l (I)
Gelatinase B (92 kDa) MMP-9 Pró- MMP-9, -13, gelatina, fibronectina,
<.9
elastina, colágeno IV, V, Vil, X
Estromelisina 1 MMP-3 Colágeno -11, 111, IV, V, IX, X, XI, elastina, porção protéica de proteoglicanos, laminina, Pró- MMP-1, -7, -8, -9,-13
Estromelisina 2 MMP-10 Fibronectína, gelatina, laminina, proteína ligada a proteoglicanos, proteoglicanos,
(/)
tenascin, vitronectina, colágeno IV, V, IX, X
(1l c .!!1 Indeterminado MMP-19 Desconhecido (I) Enamelisina MMP-20 Amelogenina E
o Metaloelastase MMP-12 Elastina, Colágeno-IV, gelatina, fibronectina,
~
....
(/)w vitronectina, laminina, proteoglicanos
Matrilisina MMP-7 Colágeno -IV, X, elastina, fibronectina, gelatina, laminina, proteoglícanos, proteínas ligadas a proteoglicanos, tenascin,
vitronectin, Pró- MMP-1, -2, -9 MT1-MMP MMP-14 Pró- MMP-2, -13
(I) (1l MT2-MMP
MMP-15 Colágeno -1, 11, 111, elastina, fibronectina,
-o c (1l
(/) .o ~ gelatina, laminina
Cl. E
:E (I) MT3-MMP MMP-16 Proteoglicanos, tenascina, vitronectina
:E E
MT4-MMP MMP-17 Desconhecido
2.4. Marcação pela prata das regiões organizadoras de nucléolo (AgNOR)
O nucléolo contém grandes alças de DNA que se localizam nos braços curtos dos cromossomos 13, 14, 15, 21 e 22. Cada uma das alças, denominadas de regiões organizadoras nucleolares (NORs), contém um grupamento de genes para a transcrição do rRNA. Nas NORs os genes de rRNA são transcritos com uma freqüência elevada e estão localizados em duplas em cada um dos cinco pares de cromossomos acrocêntricos, totalizando 20 NORs por célula diplóide. No início do processo de compactação do rRNA, a porção 5' de cada transcrito está envolvida por um grânulo rico em proteínas ácidas. Estes grânulos não aparecem em outros tipos de transcritos de RNA, presumivelmente refletindo a primeira das interações proteína-RNA que acontecem no nucléolo (Aiberts et ai., 1997; Derenzini et ai., 2000). Estas regiões podem ser demonstradas por impregnação pela prata devido a argirofília destas proteínas associadas. A técnica quantitativa e morfométrica de AgNOR avalia o grau de dispersão das NORs, que reflete a atividade proliferativa de uma célula (Alves et ai., 1999; Derenzini et ai., 2000).
Uma característica das células malignas é a presença de nucléolos grandes e de formato irregular. A relação entre o tamanho do nucléolo e a distribuição de NORs foi documentada. As NORs se apresentam maiores e mais numerosas em células neoplásicas e em células normais com capacidade proliferativa aumentada. A quantidade de NORs está intimamente relacionada com a velocidade de proliferação celular, assim como o tamanho da NOR reflete
a quantidade de proteínas relacionadas a proliferação celular (Sirri et ai., 2000; Derenzini et ai., 2000). A análise da coloração de AgNOR pode ser realizada por dois métodos, análise quantitativa e análise morfométrica. A técnica quantitativa é baseada na contagem do número de pontos marcados pela prata em microscópio óptico comum. Este método é fácil e acessível, mas as NORs podem estar agrupadas ou sobrepostas, o que torna este método subjetivo e difícil de ser reproduzido, e ainda a contagem não considera as dimensões das NORs, o que particularmente em células malignas é muito variável. Tendo em vista estas desvantagens foi desenvolvido por Derenzini et ai. (1989) o método morfométrico de análise, que consiste em medição, automática ou semi-automática, da área ocupada pelas estruturas coradas pela prata, realizada por um sistema de analise de imagens. Este método apresenta maior rapidez, precisão e é mais objetivo que a simples contagem das NORs. A limitação deste método é a necessidade de equipamento adequado (Treré et ai., 2000).
2.5. Antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA)
PCNA é uma proteína nuclear não histônica de 36 kDa, componente da maquinaria de duplicação do DNA e que esta envolvida também na regulação do crescimento celular (Akyol et ai., 1998; Alberts et ai., 1997). Como uma proteína auxiliar das polimerases delta e ipsilon, PCNA é necessário para a duplicação do DNA in vivo e in vitro, e, pelo menos in vitro, também é necessário no processo de reparo do DNA (Alves et ai., 1999). O PCNA atua como uma pinça de deslizamento, auxiliando a DNA polimerase delta
na duplicação da fita contínua do DNA. Estudos recentes revelaram uma notável característica do PCNA, sua habilidade de interagir com múltiplos fatores, estando assim envolvido na união do fragmento de Okazaki, reparo do DNA, metilação do DNA e montagem da cromatina (Aiberts et ai., 1997). PCNA é expresso em quantidades diferentes durante o ciclo celular e apresenta sua taxa de síntese diretamente relacionada com o índice de células em proliferação. Como estas reações ocorrem durante a replicação do DNA, PCNA pode ser utilizado como marcador para células em proliferação.
2.6. p53
p53 é um gene supressor de tumor localizado no braço curto do cromossomo 17, que codifica uma fosfoproteína nuclear de 53 kDa. Mutações no gene supressor de tumor p53 são as alterações mais comuns no câncer humano (Akyol et ai., 1998; Alberts et ai., 1997), sendo o gene que apresenta a maior freqüência de mutações em CEC inclusive CEC de boca. Mutações ou deleções no gene p53 podem alterar a atividade da proteína p53 e levar a distúrbios no controle do ciclo celular. Ao contrario dos outros genes supressores de tumor que apresentam um padrão recessivo de expressão, isto é, manifestam a alteração quando os dois alelos se apresentam mutados, as mutações em p53 tem efeito dominante. Esta característica ocorre pelo fato da estrutura molecular da proteína ser de homotetrâmero, ou seja, a formação de p53 normal depende da associação de 4 moléculas do transcrito de p53. Assim, se uma unidade do tetrâmero for proveniente do alelo alterado, não haverá a
formação de p53 funcionante e as importantes funções de p53 não são desempenhadas. Em células normais, a proteína p53 atua e rapidamente é degradada (meia vida de 20 minutos), não se acumulando em níveis detectáveis por imunohistoquímica. As mutações no gene p53 levam a formação de proteínas alteradas com meia vida de 6 à 8 horas, que se acumulam nas células neoplásicas e podem ser detectadas por imunohistoquímica (Alves et ai., 1999). A versão mutante de p53 esta envolvida em cânceres de mama, colo uterino,
ovário e pulmões.
A proteína p53 atua como fator de transcrição para várias outras proteínas e tem como função manter a integridade do material genético celular. Ao sinal de falha no DNA celular p53 ativa a transcrição de p21 (Waf1/Cip1) (proteína de 21 kDa) que mantém a célula em G1, permitindo a checagem do DNA e a atuação dos mecanismos de reparo do DNA. Se estes mecanismos falharem ou não forem capazes de corrigir os erros do DNA, p53 aciona a apoptose pela estimulação da família do gene bcl-2, promovendo a morte da célula danificada. Em ambos os casos, p53 previne a replicação de DNA danificado e o acúmulo de mutações. A proteína p53 também pode ser inativada por outros fatores incluindo interações com MDM2 (Agarwal et ai., 1999). A expressão aumentada de MDM2 é um evento precoce do CEC oral, levando a inativação de p53 funcional, contribuindo assim para a carcinogênese
3. Proposição
O objetivo deste estudo foi descrever as características histopatológicas, a atividade proliferativa e a expressão de MMPs e p53 em 2 casos de CBE e comparar os resultados com CECs indiferenciados de mesma localização e estado TNM de pacientes com mesma idade e sexo, com a finalidade de avaliar o potencial proliferativo e invasivo deste tumor.
4. Materiais e Métodos
4.1. Amostras
4.1.1. CBE-1
Um homem de 58 anos branco foi encaminhado ao Orocentro com a queixa principal de uma massa na região posterior esquerda da mucosa jugal. O paciente relatou que há dois meses percebeu o aumento de volume e o sangramento na região. O paciente relatou ser fumante e fazer uso de bebidas alcoólicas há 40 anos. Ao exame clínico notou-se uma massa avermelhada, irregular, ulcerada, coberta por tecido necrótico, com 2,5 x 2 em de tamanho, envolvendo a região posterior da mucosa jugal e fórnice vestibular. Notou-se também a presença de linfonodo metastático medindo 1 ,5 x 2 em na região submandibular. A impressão clínica foi de CEC e a biopsia incisional foi realizada. O tecido foi fixado em solução de formo! a 10% e embebido em parafina. No exame histológico o diagnóstico foi de CBE. A conduta terapêutica foi radioterapia. O paciente faleceu 12 meses após o diagnóstico.
4.1.2. CBE-2
Uma mulher de 63 anos branca foi encaminhada ao Orocentro com a queixa principal de disfagia e sangramento durante a mastigação por 1 mês, devido a um nódulo na mucosa esquerda. A paciente relatou o surgimento deste nódulo há 8 ou 9 meses, com crescimento lento e indolor. A paciente apresentava uma história de tabagismo (10 a 15 cigarros/dia) e consumo de
bebidas alcoólicas (2 copos de pinga/dia) por mais de 30 anos. Ao exame clínico notou-se uma massa granular, exofítica, ulcerada, medindo 6 x 4 em na mucosa jugal esquerda infiltrando a região de fórnice, trigonoretromolar e parte anterior do pilar amigdaliano. As cadeias ganglionares não apresentaram linfonodos palpáveis. A radiografia panorâmica mostrou erosão óssea focal. Os exames físico e laboratorial não apresentavam alterações. Foi realizada biopsia incisional com o diagnóstico de CBE. A paciente optou por não realizar tratamento cirúrgico, assim foi realizada somente radioterapia. Antes do tratamento radioterápico, a paciente foi encaminhada para tratamento odontológico, que consistiu de extrações dentais e enucleação de cisto residual. A radioterapia teve início em novembro de 1999 e término em fevereiro de 2000, com uma dose acumulada de 70 Gy. Durante o tratamento radioterápico a paciente desenvolveu xerostomia associada a mucosite leve, que foi tratada com saliva artificial. O tumor persistente teve seu tamanho diminuído, eliminando a queixa de disfagia. Foi realizado acompanhamento até seu falecimento em junho
de 2000, 8 meses após o diagnóstico.
4.1.3. CEC-1
Paciente do sexo masculino, 58 anos, branco, foi encaminhado ao Orocentro com a queixa principal de uma massa na região posterior da mucosa jugal causando disfagia. O paciente relatou que dois meses antes de comparecer ao nosso serviço havia notado o surgimento e crescimento da lesão, não apresentando inicialmente sintomatologia dolorosa. O paciente
relatou ser tabagista (5 cigarros/dia) há 15 anos e ex-etilista (3 copos pinga/dia) por 30 anos tendo parado de beber a 1 ano. Ao exame físico regional notou-se assimetria devido a abaulamento do lado direito da face, e cadeia ganglionar cervical palpável. O paciente fazia uso de próteses totais superior e inferior, e ao exame clínico verificou-se uma massa irregular fixa ulcerada mediando aproximadamente 5x5x2 em na mucosa jugal direita. Através de biopsia incisional, o diagnostico histológico confirmou a hipótese clínica de CEC. O paciente faleceu 6 meses após o término do tratamento radioterápico.
4.1.4. CEC-2
Paciente do sexo feminino, branca, 63 anos, foi encaminhada ao Orocentro, com queixa principal de aumento de volume que a 6 meses apresentava sintomatologia dolorosa com o uso da prótese total. A paciente relatou que por mais de 40 anos teve o hábito de fumar cigarro de corda e há 4 anos fazia uso de cigarro com filtro (10 cigarros/dia). Ao exame físico o estado geral da paciente era bom sem cadeias ganglionares palpáveis. A paciente fazia uso de próteses totais, contudo, utilizava somente a prótese superior pelo desconforto causado pela lesão com o uso da prótese inferior. A lesão apresentava as bordas endurecidas e de aspecto moriforme, medindo 5x3 em e afetava a mucosa jugal esquerda se estendendo para o rebordo alveolar. Foi realizado biópsia incisional que confirmou o diagnóstico clínico de CEC indiferenciado. Após encaminhamento da paciente a um centro de tratamento foi perdido o contato.
4.2. Histoquímica
Todas as amostras de tecido foram fixadas em solução tamponada de formal a 1 O% e embebidas em parafina. Cortes de 5 ~-tm foram corados com hematoxilina e eosina (HE), ácido periódico de schiff (PAS) e alcian blue. Os cortes em HE foram utilizados para a análise morfológica e contagem de mitoses. As amostras coradas com PAS, que evidencia glicogênio e muco, e alcian blue, que evidencia proteoglicanos, glicosaminoglicanos e mucina (Terry et ai., 2000), foram utilizados para verificação da positividade dos espaços microcísticos.
4.3. Classificação dos CECs
A graduação histológica dos CEC utilizados como controles foi baseada na classificação proposta por Anneroth et ai. (1987). Este sistema de graduação utiliza os seguintes critérios para classificação dos CECs: grau de queratinização, polimorfismo nuclear, número de mitoses, padrão de invasão dos tecidos adjacentes, estágio de invasão e intensidade de infiltrado inflamatório.
4.4. Coloração de AgNORs
A coloração de AgNOR foi adaptada a partir da técnica original descrita por Chatterjee et ai. (1997). Cortes de 4~-tm foram diafanizados em xilol e reidratados em concentrações decrescentes de álcool, seguidos por incubação
gelatina e 1% ácido fórmico. As regiões arginofílicas nucleares foram visualizadas em microscopia de luz e o número e a área dos NORs foram determinados em 500 células para cada amostra, utilizando o sistema de análise de imagem KONTRON400 (Zeiss).
4.5. Análise lmunohistoquímica de PCNA, p53 e laminina
As reações de imunohistoquímica para PCNA, p53 e laminina foram realizadas em cortes de 3!J.m. Os cortes foram diafanizados em xilol, hidratados em concentrações decrescentes de álcool, tratados em peróxido de hidrogênio a 3%, seguido por incubação com ácido cítrico à 10mM, pH 6,0 no microondas (2 ciclos de 12 min). Depois de lavados em PBS, os cortes foram tratados com 1% BSA em PBS por 1 h e incubados com anticorpo monoclonal anti-PCNA (PC10), diluído 1:3.000, anticorpo monoclonal anti-p53 diluído a 1:500 ou anticorpo monoclonal anti-laminina diluído a 1:50, seguidos pelo método ABC (StrepABC Complex/HRP Duet Kit, Dako). As reações foram reveladas com solução 0,6 mg/ml 3,3'-diaminobenzidina tetrahidrocloride (DAB, Sigma) acrescida de 0,01% H202 e 0,01% de DMSO. As reações controle não mostraram marcação. A porcentagem de células positivas foi determinada pela contagem de 500 células para cada amostra.
4.6. Contagem de Mitoses
Seções de 51lm coradas com HE de cada tumor tiveram o número de células em mitose contadas com o auxilio de um retículo de integração Zeiss com área total de 0,0256 mm2, contendo uma lente ocular de 10x e uma
objetiva de 40x. Foram estabelecidos os seguintes critérios:
(a) foram contados campos aleatórios até um total de 1000 células, o que significou aproximadamente 8 campos nos casos de CBE e 15 campos nos casos de CEC.
(b) foram consideradas apenas mitoses morfologicamente bem estabelecidas.
Os resultados foram expressos como a porcentagem de células em mitose por campo± desvio padrão.
4.7. RT-PCR
A expressão de MMPs foi analisada pela técnica da transcriptase reversa-reação em cadeia de polimerase (RT-PCR) como descrita por Krafft et ai. (1997), com pequenas modificações. Resumindo, 6 a 10 cortes com 611m de espessura foram diafanizados em xilol, centrifugados e o precipitado resultante foi lavado com 1 ml de etanol 100%. ORNA foi extraído pela técnica do isotiocianato de guanidina (Trizol™, Gibco). As amostras foram transferidas para tubos de polipropileno, livres de Dnase e Rnase, contendo 2001-11 de clorofórmio e centrifugadas por 15min à 4°C e 12000g. A fase aquosa resultante da
centrifugação foi transferida para um novo tubo e 500~-tl de isopropanol foram adicionados. Após incubação por 1 O min, as amostras foram submetidas a nova centrifugação por 10 min à 4°C, 12000g. O precipitado de RNA foi lavado com 1 ml de etano! a 75%, seco por 10 mina temperatura ambiente e ressuspendido em 20 ~-ti de água. A concentração e pureza do RNA de cada amostra foi determinada por espectrofotometria a 260/280 nm no aparelho Genesys 2 (Spectronic Dust. Rochester, NY). Um micrograma de RNA total foi transcrito reversamente a cDNA, adicionando a mistura contendo 1~-tl de Oligo-dt (0,5 mg/ml), 2 !-!1 de 10x tampão de síntese, 1 ~-ti da mistura de dNTPs e 1 ~-ti de Superscript 11 RT (20 U/ml; Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA). A mistura foi incubada por 50 min à 42° C e posterior 15 min à 70° C. A reação foi terminada pela adição de 1 !-!1 de E. co/i Rnase H por 20 min à 37° C. O cDNA resultante foi amplificado a 50 !-!1 pela Reação em Cadeia e Polimerase (PCR), contendo 1~-tl
de cada primer, 2mM MgCiz, 0.8 mM dNTPs (Gibco BRL, Gaithersburg, MO, USA) e 0.025 U/j.!l Taq DNA polimerase (Gibco BRL, Gaithersburg, MO, USA). Foram utilizados primers para MMP-1, MMP-2, MMP-9 e ~-actina (Tabela 2), utilizada como controle interno da reação. As reações iniciaram por desnaturação à 93oc por 3 min, seguida de 40 ciclos de amplificação (desnaturação à 93oc por 45 seg, anelamento à 580C por 45 seg e extensão à
noc
por 90 seg) utilizando um termociclador 9700 (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA). Quinze microlitros do produto do PCR foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida a 5% e corado com nitrato de prata(Sanguinetti et ai., 1994). As bandas foram densitometradas e seus valores normalizados por ~-actina. A documentação e análise densitométrica foi realizada no sistema de densitometria de imagem (Model GS-700 810-RAD) e analisado programa Molecular Analyst TM (810-RAD).
Tabela 2. Descrição do primers utilizados para RT-PCR
Primer Seqüência 5'~ 3' Pares de
Bases
MMP-1 Sense GGT GAT GAA GCA GCC CAG 438
Anti-sense CAG TAG AAT GGG AGA GTC
MMP-2 Sense CCA CGT GAC AAG CCC ATG GGG CCC C 480 Anti-sense GCA GCC TAG CCA GTC GGA TTT GAT G
MMP-9 Sense GGT CCC CCC ACT GCT GGC CCT TCT ACG GCC 640 Anti-sense GTC CTC AGG GCA CTG CAG GAT GTC ATA GGT
~-actina Sense TCA GAA GGA CTC CTA TGT GG 506
Anti-sense TCT CTT TGA TGT CAC GAC CG Fonte: Coletta et ai., 1999
4.8. Análise Estatística
Todas as reações foram repetidas no mínimo 3 vezes. A análise estatística foi realizada pelo teste T (Student) com critério bi-caudal. A correlação entre o número de AgNORs por núcleo e os índices PCNA e p53 em cada lesão foi verificada pelo coeficiente de correlação de Pearson. Em nossa comparação, p::;0.05 foi considerado como indicativo de diferença estatisticamente significante.
5. Resultados
5.1. Características Histopatológicas
As características histopatológicas dos 2 casos de CBE foram bastante similares. Os tumores apresentavam um padrão basalóide associado ao padrão escamoso (Fig. 1), contudo, o componente basalóide foi predominante, representando aproximadamente 80% do tumor. As células basalóides apresentam relação núcleo/citoplasma aumentada, escasso citoplasma, e núcleos irregulares
e
hipercromáticos sem nucléolos proeminentes. Figuras de mitose, incluindo mitoses atípicas, e pleomorfismo nuclear foram freqüentes (Fig. 2). O padrão basalóide se apresentou como ilhas, massas sólidase
ocasionalmente como arranjo lobular com os núcleos em paliçada na periferia (Fig. 2). Muitos destes lóbulos apresentavam necrose central (Fig. 3). Nos dois casos de CBE pode se observar a proliferação das células basalóides e do componente escamoso a partir do epitélio de superfície (Fig. 4). Os CBEs apresentavam espaços microcísticos positivos para PAS e Alcian Blue (Fig 5 A e B), sendo que as áreas de necrose central nas ilhas basalóides eram negativas para estas colorações. As reações de imunohistoquímica para laminina demonstraram positividade para esta proteína no material que preenchia os espaços microcísticos (Fig 6). O componente escamoso se apresentava de moderadamente a bem diferenciado e o estroma fibroso que envolvia os tumores apresentava discreto infiltrado inflamatório.Figura 1 - Corte histológico de um dos casos do CBE evidenciando suas características histopatológicas. Note o padrão basalóide, organizado em ilhas ou lóbulos com necrose central e paliçamento periférico, associado a áreas de carcinoma espinocelular bem diferenciado. (x 80)
