Dedicatória
Aos meus pais e irmãos pelaAgradecimentos
A DEUS por ter me dado a chance de alcançar mais um objetivo em minha vida e ter me dado forças para concluí-lo com satisfação e êxito.
À Profa Dra Urara Kawazoe pela imensa dedicação, compreensão, atenção e ética acima de tudo.
Aos meus pais Hélio Pínola Filho e Silvia Helena Bueno Pínola pela paciência, orientação e carinho cedidos durante a realização deste sonho.
Aos meus irmãos Rafaela Bueno Pínola e Gabriel Bueno Pínola por me agüentarem falar de frangos e vacinas e por não os deixar usar o computador.
Ao meu namorado Rodrigo Alberto Viaro pela paciência e companhia nos finais de semana e feriados passados no biotério e laboratório da UNICAMP. Pelas inúmeras viagens e passeios adiados. Por fazer sua moto saber ir de olhos fechados de Amparo à Campinas. Obrigada pela compreensão e carinho.
À técnica de laboratório Cirene Alves Lima pela colaboração durante os experimentos.
A todos os docentes do Departamento de Parasitologia que sempre estavam à disposição para esclarecimentos de dúvidas e pela ajuda na minha formação como Parasitologista.
A todos os funcionários do Departamento de Parasitologia da UNICAMP, especialmente ao técnico de laboratório João, por ajudar a descarregar os pesados sacos de ração.
Aos meus amigos e colegas do Departamento de Parasitologia, especialmente a Claudineide e Kelsen, pelas excelentes conversas, discussões e almoços.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa concedida parcialmente durante o curso.
À Nutron Alimentos por fornecer ração às aves para a realização dos experimentos.
À Merial Saúde Animal e a Globo Aves pelo fornecimento das aves durante a realização dos experimentos.
Ao senhor Félix, motorista, que durante anos me cedeu carona no trajeto Amparo – Campinas.
E a todas as pessoas que dê alguma forma contribuíram para a realização e término deste trabalho.
Resumo
Este estudo teve como objetivos obter o isolado precoce de Eimeria maxima “Ca” e posterior estudo comparativo da patogenicidade entre as aves (Gallus gallus) inoculadas com isolados: parental e precoce, com os seguintes critérios de avaliação: ganho de peso corporal, escore de lesão da mucosa intestinal e contagem de oocistos produzidos pelas aves infectadas. Para a obtenção do isolado precoce foram inoculados sucessivamente em aves sadias, os primeiros oocistos eliminados, a partir da geração parental. Os oocistos contidos nas fezes foram isolados e cultivados em solução de dicromato de potássio 2% para a esporulação. Através deste processo foram realizadas 25 passagens dos primeiros oocistos nas aves até a estabilização do período pré-patente. Foi obtida uma redução de 36 horas na eliminação dos primeiros oocistos, de 124h30min para 88h30min. Os isolados parental e precoce foram comparados quanto a patogenicidade, através da inoculação de doses específicas em aves sadias. Nesse estudo foram utilizadas 75 aves distribuídas em cinco grupos: I e II para a produção de oocistos, III e IV para ganho de peso e escore de lesão e grupo V como controle negativo (aves sadias). Houve uma diminuição significativa da patogenicidade em aves infectadas com o isolado precoce quando comparadas a aves inoculadas com a geração parental. As aves infectadas com o isolado precoce obtiveram uma média de escore de lesão da mucosa do intestino estatisticamente inferior à parental. O valor médio do escore de lesão obtido pelo isolado precoce foi de 0,77 enquanto que a geração parental 1,67. As aves infectadas com o isolado precoce apresentaram uma redução significativa na produção de oocistos, quando comparadas à respectiva geração parental. Apresentaram, também, ganho de peso estatisticamente superior em relação à geração parental. Este isolado precoce é um excelente candidato à produção e comercialização de uma vacina viva atenuada. No entanto, testes em bateria e no campo sobre imunidade protetora desse isolado precoce devem ser realizados no futuro que poderá caracterizá-lo confiável para o uso comercial como vacina viva atenuada no controle da coccidiose aviária.
Abstract
The aim of this study was to obtain a precocious line of Eimeria maxima, “Ca” strain and the comparative pathogenicity study between precocious line and parental strain. The criteria used for this evaluation was: body weight gain, lesion score of intestinal mucosa and oocyst counting dropped by infected chickens. The precocious line was obtained by successive oral inoculation of parental E. maxima oocysts in chickens. First oocysts eliminated after inoculation were collected, isolated and cultivated in 2% dichromate potassium solution for their sporulation. The pre-patent period of first oocysts elimination diminished and stabilized after 25 passages in chickens. It was obtained a time reduction of 36 hours between precocious line and parental strain: 124h30’ for parental strain and 88h30’ for precocious line. The comparative evaluation of pathogenicity between precocious line and parental strain were performed using body weight gain, lesion score and oocyst production compared to non - infected chickens in groups of five chickens per cage with three replications. Parental strain infected in chickens showed loss of body weight while in chickens inoculated with precocious line showed weight gain of 75% when compared to non-infected control birds. The lesion score of intestine mucosa was 0.8 for chickens with precocious line and 1.7 for parental strain showing statistically significant difference. The precocious line showed also significant less oocyst production than parental strain in infected chickens. The precocious line of E. maxima obtained in the present study seems a good candidate for live attenuated vaccine against avian coccidiosis although there is a need for complementary study about protective immunity in battery and field tests.
Keywords: Eimeria maxima; Attenuation; Precocious line; Pathogenicity, chickens.
Índice
1 – Introdução ... 1
1.1 – Biologia ... 2
1.2 – Medicamentos anticoccidianos e vacinas vivas ... 10
2 – Justificativa ... 16
3 – Objetivos ... 17
4– Material e Métodos ... 18
4.1 – Obtenção do isolado precoce ... 20
4.2 – Produção de oocistos ... 21
4.3 – Patogenicidade ... 22
4.4 – Análise Estatística ... 24
5 – Resultados ... 26
5.1 – Obtenção de oocistos precoces de E. maxima “Ca” ... 26
5.2 – Estudo Comparativo da Patogenicidade entre as amostras parental e precoce de E. maxima “Ca” ... 29
5.2.1 – Ganho de peso corporal ... 29
5.2.2 – Escore de lesão da mucosa intestinal ... 32
5.2.3 – Produção de oocistos por ave ... 36
6 – Discussão ... 39
6.1 – Obtenção de oocistos precoces ... 39
6.2 – Patogenicidade ... 41
7 – Conclusões ... 49
Lista de Figuras e Tabelas
Figura 1: Ciclo de vida de Eimeria spp ... 5
Figura 2: Distribuição dos grupos de aves ... 26
Figura 3: Período pré-patente (horas) das gerações de E. maxima “Ca” ... 27
Figura 4: Comparação da porcentagem do ganho de peso entre as aves inoculadas com a geração parental e o isolado precoce de E. maxima “Ca” e as aves sadias (controle negativo) ... 31
Figura 5: Comparação dos valores médios do escore de lesão da mucosa intestinal entre as aves infectadas com a geração parental e o isolado precoce de E. maxima “Ca” ... 33
Figura 6: Aspecto macroscópico do duodeno e dos intestinos delgado anterior e médio de uma ave sadia (A) e de aves infectadas com a geração parental (B) e precoce (C) de E. maxima “Ca”, após sete dias de infecção ... 34
Figura 7 Comparação entre os intestinos das aves necropsiadas: controle negativo - não infectado (A), infectadas com o isolado precoce (B) e parental (C) ... 35
Figura 8: Eliminação de oocistos de E. maxima “Ca” parental e precoce entre o quinto e o décimo sexto dia após inoculação em aves sadias ... 37
Figura 9: Fezes eliminadas pelas aves infectadas com a geração parental (A) e precoce (B) ... 38
Quadro 1: Características diferenciais das espécies de Eimeria ... 9
Quadro 2: Características das vacinas vivas contra coccidiose aviária ... 13
Quadro 3: Características do escore de lesão para Eimeria maxima ... 24
Tabela 1: Obtenção de oocistos precoces de E. maxima “Ca” através de passagens sucessivas em aves experimentalmente inoculadas ... 28
Tabela 2: Comparação da patogenicidade entre a geração parental, isolado precoce de E. maxima “Ca” e o controle negativo ... 30
1 - Introdução
A avicultura brasileira está situada entre as maiores do mundo, possuindo cerca de 32 milhões de matrizes de corte em alojamento no mês de agosto de 2008 e estimativa de 11 milhões de toneladas de carne de frango e 5,2 bilhões de cabeças de pintos de corte até o final do ano, segundo a União Brasileira de Avicultura (UBA, 2008) e a Associação Brasileira dos Produtores e Exportadores de Frangos (ABEF, 2008). A produção nacional de carne de frango per capita estimada para o ano de 2008 é de 38,5 quilogramas, correspondendo a um aumento de 1,8% ao ano anterior segundo a UBA. Com esses dados, o Brasil é considerado o maior exportador do mundo no ano de 2008 com um total estimado até ao final do ano em 3,8 milhões de toneladas de carne de frango exportados para diversos países correspondendo a um aumento de 16,3% em relação ao ano anterior e, o terceiro maior produtor, ficando atrás somente de Estados Unidos e China. O desempenho do Brasil e dos outros países produtores no setor da avicultura, poderia ser melhor se não fossem as doenças que afetam a produção gerando perdas econômicas.
Os parasitos em geral são as principais causas de prejuízos econômicos para a indústria avícola mundial. Dentre os parasitos aviários, os protozoários coccídeos são os mais importantes. No Brasil, não existem dados recentes visando determinar as perdas anuais do setor avícola por coccidiose, mas Castro (1994) considerou que os prejuízos anuais associados a essa parasitose podem chegar a US$ 30 milhões e, segundo Bellaver et al. (2005), a doença atingiu 65% das empresas do setor no ano de 2005. Calcula-se que os gastos mundiais com
esta doença, incluindo os prejuízos zootécnicos e a utilização de medicamentos com fim preventivo e curativo cheguem a 800 milhões de dólares anualmente (Allen & Fetterer, 2002).
A coccidiose aviária é uma das doenças parasitárias mais importantes em aves domésticas, sendo uma das mais antigas e severas formas de enteropatia (Ruff, 1999; Kawazoe, 2000). É uma doença conhecida de longa data, pois, em 1873, Rivolta & Silvestrini haviam descrito a presença de um parasito tetraporicístico que denominaram genericamente de Eimeria avium.
1.1 – Biologia
A coccidiose ou eimeriose das aves domésticas (Gallus gallus) que atinge tanto frangos de corte como matrizes e aves de postura é causada por protozoários pertencentes ao gênero Eimeria, família Eimeriidae (Levine, 1982), subordem Eimeriorina, ordem Eucoccidiorida, subclasse Coccidia, classe Sporozoea e ao filo Apicomplexa (Levine, 1970). As espécies são: Eimeria acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox e E. tenella (Borges, 2000; Kawazoe, 2000). Essas sete espécies de Eimeria infectam aproximadamente 30 bilhões de aves domésticas anualmente em todo o mundo (Shirley et al., 2005).
Os protozoários do filo Apicomplexa são parasitos intracelulares obrigatórios, transmitidos para novas células hospedeiras por estágios invasivos extracelulares, os quais são equipados com elementos especializados do
citoesqueleto e organelas secretórias na porção anterior, pertencente ao complexo apical, que deu nome ao filo (Kawazoe, 2000).
O complexo apical é formado por: dois anéis polares elétron - densos, um conóide formado por diversos microtúbulos em espiral dentro do anel polar, roptrias (formação de vacúolos parasitóforos) saculares ou tubulares, micronemas (responsáveis pela adesão e reconhecimento da célula hospedeira), grânulos densos (remodelação metabólica para o desenvolvimento do parasita) e microtúbulos subpeliculares que se estendem ao longo do anel polar (Current et al., 1990). Existe também uma organela descoberta recentemente chamada de apicoplasto, em seres pertencentes ao filo Apicomplexa (Köhler et al., 1997).
As três principais espécies de Eimeria que ocorrem no Brasil são: E. acervulina (Tyzzer, 1929), E. tenella (Raillet et al., 1981) e E. maxima (Tyzzer, 1929). E. mitis (Tyzzer, 1929) também é comum em frangos de corte, embora não seja monitorada pois não produz lesões macroscópicas que facilitem esse monitoramento e, também, por não ser considerada importante para a cadeia produtiva (Costa, 2002).
Klein (1996), entre 1993 e 1995 isolou e caracterizou cinco espécies de eimérias em 74 criações de frango da Europa, Américas Central, do Sul, África do Sul, EUA e Tailândia, encontrando infecções monoespecíficas e mistas que incluem as espécies E. acervulina, E. brunetti, E. mitis, E. maxima e E. tenella. Segundo uma pesquisa de Terra et al. (2001) em um município do interior do Estado de São Paulo, a espécie mais encontrada nos lotes foi E. maxima e a menos freqüente foi E. necatrix. Shirley (1994) e Smith et al. (2002) comentam que
a elevada freqüência de E. maxima é atribuída a variação antigênica encontrada entre as diferentes populações.
Segundo Levine (1988), o ciclo de vida do protozoário do gênero Eimeria realiza-se em um único hospedeiro (monoxeno) e possui três fases distintas: uma fase no ambiente externo (esporogonia) e duas dentro das células do tubo digestório das aves (merogonia e gametogonia), sendo necessário o desenvolvimento completo das três fases para haver a formação final dos oocistos, o estágio de resistência (Figura 1).
A transmissão, infecção e a contaminação ocorrem via fecal-oral, isto é, pela ingestão de oocistos esporulados, contendo no seu interior quatro esporocistos com dois esporozoítos cada (Long, 1987), que podem estar presente na ração, água ou no ambiente.
A membrana do oocisto se rompe pela ação mecânica inicial da moela e pelos estímulos de temperatura e gás carbônico liberando os esporocistos. No duodeno, a ação da tripsina digere uma estrutura chamada corpo de Stieda e os sais biliares estimulam a mobilidade dos esporozoítos, promovendo a excistação e sua liberação para a luz intestinal. Uma vez livres na luz intestinal, os esporozoítos invadem ativamente a célula hospedeira, formando um vacúolo parasitóforo, geralmente em um enterócito, células da lâmina própria ou criptas epiteliais transformando-se em trofozoítos ou merontes uninucleados com forma arredondada (Long, 1987).
Figura 1: Ciclo de vida de Eimeria spp. em aves domésticas (Weck-Heimann, 2001). Oocistos esporulados são ingeridos e liberam os esporocistos e esporozoítos (A) que invadem enterócitos (1). Na merogonia (2) ocorre a transformação em trofozoítos uninucleares, iniciando-se a divisão assexuada com formação de merozoítos (3) dentro do vacúolo parasitóforo. Os merozoítos são liberados e invadem outras células intestinais (4). Após 3 ou mais gerações assexuadas (5, 6), os merozoítos invadem células epiteliais e se desenvolvem em formas sexuadas: masculina (microgametas) (7) ou feminina (macrogametas) (8) por meio da gametogonia. Após a fertilização dos gametas (9), forma-se o zigoto (10) que fabricam uma parede cística (11) originando os oocistos. Oocistos não esporulados (12) são liberados com as fezes e a esporulação ocorre no meio externo em condições adequadas do meio ambiente através da esporogonia, originando oocistos viáveis (A).
Primeiramente ocorre o ciclo assexuado com a formação de merozoítos por um processo de merogonia onde ocorre a divisão sucessiva do núcleo, com a formação final de merozoítos dentro do meronte. Cada meronte produz no seu interior um número variável de merozoítos, dependendo da espécie de Eimeria. Após romperem a célula hospedeira, os merozoítos atingem a luz intestinal e invadem novas células epiteliais intestinais formando uma nova geração de merozoítos. Alguns desses merozoítos, pelo mesmo processo, originam uma terceira e quarta geração de merontes, enquanto outros ao penetrarem em novas células iniciam a fase sexuada com formação de gametas masculinos (microgametas) e femininos (macrogametas). Nesta fase pode ocorrer recombinação genética e fertilização cruzada (Rollinson et al., 1979; Shirley & Harvey, 2000) A fusão destas formas origina um zigoto que elabora ao seu redor uma membrana cística dando origem ao oocisto. Essa forma é eliminada junto com as fezes para o meio externo (Kawazoe, 2000).
Os oocistos que não completam a esporulação são inviáveis enquanto os oocistos esporulados são infectantes e podem sobreviver no ambiente por um período de três a seis meses. As espécies de Eimeria de aves domésticas não parasitam outras espécies de animais na natureza, sendo consideradas espécie – específicas (Joyner, 1969).
O diagnóstico específico tem sido feito tradicionalmente pelos itens abaixo: a) Período pré-patente: intervalo de tempo decorrente entre a infecção e o
aparecimento das primeiras formas detectáveis do agente infeccioso, neste caso, os oocistos.
c) Localização e morfologia dos parasitos no intestino das aves;
d) Localização, intensidade e característica das lesões macroscópicas na mucosa intestinal associada com a morfologia dos oocistos, gametócitos ou esquizontes (Hemsley, 1964);
e) Tempo de esporulação dos oocistos (Long et al., 1976; Long & Joyner, 1984; Tsuji, 1997).
Embora, a maioria dos autores reconheça que esses métodos de diagnóstico são primitivos, demorados e, freqüentemente, fracassam na identificação das espécies de Eimeria responsáveis pelo problema (Sluis, 1993), muitos estudos ainda são desenvolvidos com base nessa metodologia. Prado (2005) em sua dissertação de mestrado testou um protocolo de PCR para o diagnóstico de coccidiose aviária em amostras de campo, mas segundo o autor, do modo como foi utilizado este método de diagnóstico não pareceu adequado, prático e satisfatório.
A localização dos parasitos no intestino e o seu grau de patogenicidade variam conforme a espécie: E. mitis e E. praecox são espécies de localização superficial da mucosa intestinal desenvolvendo-se nas células da cripta e, são consideradas pouco patogênicas; E. necatrix e E. tenella localizam-se nas partes mais profundas da mucosa (camada subepitelial) e são altamente patogênicas, estando associadas à forma aguda grave da doença; E. acervulina e E. maxima possuem desenvolvimento epitelial e são consideradas de patogenicidade mediana, apresentando alta morbidade, devido à forma subclínica da doença.
O Quadro 1 apresenta as características diferenciais das espécies de Eimeria de aves domésticas.
Os parasitos modificam as estruturas das vilosidades intestinais dos enterócitos causando, dentre outras ocorrências, aumento da taxa de conversão alimentar, prejudicando a ingestão de ração, digestão, absorção, transporte de nutrientes na corrente sanguínea, e pode diminuir em até 85% a atividade digestiva de uma série de enzimas do pâncreas e mucosa intestinal, podendo ocorrer necrose da parede intestinal em alguns casos, ocasionando perda de peso e aves apáticas sendo esses fatores muito importantes para a economia avícola (Fernando & McCraw, 1977; Joyner, 1982; Bordin, 1994; Anuário da Avicultura Industrial, 2000; Williams, 2005).
Quadro 1. Características diferenciais das espécies de Eimeria ESPÉCIES CARACTERÍSTICAS Lesões macroscópicas Medida do oocisto Média (μm) Localização do parasito no intestino Patoge- nicidade * Imuno-genicidade* Período pré – patente (horas) E. acervulina
Infecção leve: estrias transversais esbranquiçadas com oocistos; Infecção grave: parede espessada pelas placas. 18,3 x 14,6 Epitelial ++ ++ 96 E. brunetti Coagulação, necrose, enterite mucóide sanguinolenta no intestino posterior. 24,6 x 18,8 2ª geração de esquizonte sub–epitelial +++ ++++ 120
E. maxima Parede espessada, exudato mucóide cor de laranja, petéquias.
30,5 x 20,7
Gametócito
sub–epitelial +++ ++++ 126 E. mitis Sem lesão. Exudato
mucóide. 16,2 x 16,0 Epitelial ++ ++ 138 E. necatrix Formação de gases, pontos brancos (esquizontes), petéquias, exudato mucóide sanguinolento. 20,4 x 17,2 2ª geração de esquizonte sub–epitelial ++++ ++ 99
E. praecox Sem lesões. Exudato mucóide 21,3 x 17,1 Epitelial + ++++ 84 E. tenella Início: hemorragia na luz do ceco. Mais
tarde: mucosa espessada, tecido necrótico do coágulo sanguíneo em forma de charuto. 22,0 x 19,0 2ª geração de esquizonte sub–epitelial ++++ ++ 128
* + = graus de patogenicidade e imunogenicidade segundo o autor.
Fonte: Research Report 163. 1973. College of Agriculture Experiment Stations, University of Geórgia, Athens, Long, P.L., 1987.
1.2 - Medicamentos Anticoccidianos e Vacinas Vivas
O controle da coccidiose aviária tem sido realizado mediante o uso de medicamentos anticoccidianos (Peterson & Laborde, 1961; Vertommen, 1994; Allen et al., 1998; Williams, 1999; Youn & Noh, 2001) desde a década de 1940 em diferentes sistemas de produção, mas o contínuo surgimento de isolados resistentes a praticamente todas os medicamentos comerciais, tem limitado a estratégia de controle (Kawazoe et al., 1991 e 1994; Chapman, 1993; Conway et al., 1995; Chapman, 1997). O primeiro relato de ineficiência parcial da atuação dos medicamentos anticoccidianos às espécies de Eimeria aviária foi realizado por Horton Smith (1951). Anos depois, Jeffers (1974a, 1974b, 1974c) relatou o encontro de diversos isolados de E. acervulina e E. maxima nos EUA resistentes a vários medicamentos anticoccidianos. Hodgson et al. (1969), Bourdeau et al. (1994), McDougald & Seibert (1998), Laurent et al. (2001), Youn & Noh (2001) também relataram resistências aos anticoccidianos.
Medicamentos como os ionóforos, que geralmente atuam desestabilizando as membranas do parasito (Kawazoe et al., 2000) podem ser uma alternativa para o controle da doença, mas os mesmos têm se tornado ineficientes no controle da coccidiose (LI et al., 2004).
A falta de eficiência dos anticoccidianos, o desinteresse das indústrias farmacêuticas em desenvolver novos medicamentos devido ao alto custo para a pesquisa de novos fármacos, além da proibição desses medicamentos em aves consumidas nos países da Europa e Ásia devido aos possíveis riscos à cadeia
alimentar, outras alternativas têm sido utilizadas para o controle da coccidiose, entre estas, as vacinas vivas.
A utilização de vacinas vivas no controle da doença não é uma estratégia recente (Williams, 2002), porém, sua utilização permaneceu por longo tempo como medida secundária. Atualmente, esta metodologia tornou-se de uso freqüente nas granjas comerciais (Oviedo-Rondón et al., 2005; Shirley et al., 2007). A vacinação das aves ainda no incubatório tende a ser a técnica mais segura ao consumidor final, por não deixar resíduos na carcaça (Ruff, 1999).
Existem dois tipos de vacinas vivas: as que contêm oocistos de isolados selvagens (vacinas virulentas) e as que contêm oocistos de isolados precoces (vacinas atenuadas). As últimas são resultantes de passagens sucessivas dos primeiros oocistos eliminados após infecções nas aves sadias, o que culmina com a diminuição do ciclo do parasito e muitas vezes com atenuação da virulência do isolado, permitindo o uso das mesmas para imunização das aves. A margem de segurança das vacinas atenuadas tem sido maior do que das vacinas virulentas em relação ao aparecimento de um quadro clínico agudo da doença. Este fato se deve, em parte, pelo ciclo de vida mais curto nos isolados precoces do que nas gerações parentais correspondentes (McDonald et al., 1984; McDonald et al., 1986; Shirley, 1994; Danforth, 1998; Montes et al., 1998; Muir et al., 2000; Shirley et al., 2005).
As vacinas feitas com parasitos atenuados têm como vantagens principais à produção de um número menor de oocistos eliminados durante cada ciclo de infecção e menor lesão na mucosa intestinal, além de conferir imunidade protetora nas aves (Shirley et al., 1997; Shirley, 1999; Shirley et al., 2005; Meeusen et al.,
2007). As amostras atenuadas ainda apresentam as seguintes características: diminuição do período pré-patente, decréscimo da virulência, estabilidade genética, redução do potencial reprodutivo fazendo com que o número de esporozoítos que penetram nas células do hospedeiro seja menor, levando a um desenvolvimento ótimo da imunidade com uma menor lesão do epitélio intestinal (Jeffers, 1975; Williams, 1994; Williams, 1998). No Quadro 2 estão as características das vacinas vivas contra a coccidiose para uso em galinhas.
Coccivac é o nome comercial da primeira vacina viva comercialmente disponível em 1952, nos Estados Unidos. Entretanto, durante os últimos quarenta anos, o uso de vacinas vivas para o controle da coccidiose tem ocorrido em uma escala relativamente pequena quando comparada ao uso dos anticoccidianos profiláticos.
Apesar do custo mais elevado das vacinas vivas em relação aos anticoccidianos, essas vacinas tem sido empregadas em aves reprodutoras e em frangos de corte. Essas vacinas não protegem das infecções coccidianas, mas sim da patogenicidade, sendo possível encontrar oocistos em locais de infecção controlada.
No Brasil, são comercializadas tanto vacinas virulentas (Coccivac B® e D®, Immunox®); como atenuada (Livacox®). Contudo, prováveis variações antigênicas existentes em diversos isolados de Eimeria spp. de campo podem levar a menor eficiência dessas vacinas comerciais na proteção imunológica (Danforth, 1998, Kawazoe & Manarini, 2001; Smith et al., 2002).
Quadro 2: Características das vacinas vivas contra a coccidiose aviária PRODUTO e FABRICANTE TIPO DE OOCISTO TIPO DE AVE ESPÉCIES INCLUÍDAS ADMINISTRAÇÃO/ OBSERVAÇÕES “Coccivac B” Schering Plough Animal Health, EUA.
Virulentos Frangos de corte E. acervulina, E. maxima, E. tenella, E. mivati Via oral * ou Pulverização spray “Coccivac D” Schering Plough Animal Health, EUA.
Virulentos
Matrizes e poedeiras
comerciais Todas as espécies
Via oral * ou Pulverização spray “Immucox” Vetech Laboratories, Canadá. Virulentos Frangos de corte E. acervulina, E. maxima, E. tenella e E. necatrix
Via oral ou spray no incubatório “Immucox” Vetech Laboratories, Canadá. Virulentos Matrizes e poedeiras comerciais E. tenella, E.maxima, E. brunetti, E. acervulina, E. necatrix
Via oral ou spray no incubatório “Paracox” Schering Plough Animal Health, Reino Unido. Atenuados Matrizes e poedeiras
comerciais Todas as espécies Via oral
“Paracox” 5 Schering Plough Animal Health, Reino Unido. Atenuados Frangos de corte E. acervulina, E. mitis, E. tenella, E. maxima (2)
Via oral * ou spray no incubatório “Livacox” Q Biopharm, República Tcheca. Atenuados Matrizes e poedeiras comerciais E. acervulina, E. tenella, E. maxima, E. necatrix
Via água, ocular ou spray no incubatório “Livacox” T Biopharm, República Tcheca. Atenuados Frangos de corte E. acervulina, E. maxima, E. tenella
Via oral *, ocular ou spray no incubatório ADVENT Novus International, EUA Virulentos Frangos de corte E. acervulina, E. maxima, E. tenella
Nobilis COX ATM Intervet International, Holanda. Virulentos Frangos de corte E. acervulina, E. maxima (2), E. tenella ionóforo-resistentes Spray Eimeriavax 4m Bioproperties Pty, Austrália. Atenuados Todos os tipos E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. tenella Via oral Eimerivac Plus Guangdong Academy of Agricultural Sciences, China. Atenuados Todos os tipos E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. tenella Via oral Inmuner Gel-Coc Vacunas Inmuner, Argentina. Virulentos e Atenuados Todos os tipos E. acervulina, E. maxima, E. tenella Via oral CoxAbic Abic, Israel. Antígeno morto
Poedeiras E. maxima Injeção
intramuscular Inovocox Embrex, EUA. Virulentos Frangos de corte E. acervulina, E. maxima, E. tenella Aplicação in ovo
* Via oral: ração, água de beber
Fonte: Shirley, et al., 2005; Shirley et al., 2007.
Essas vacinas têm mostrado eficiência na proteção imunológica contra a coccidiose nas aves em granjas comerciais. Estudos comparativos de eficiência entre vacinas vivas e anticoccidianos tem demonstrado melhor ganho de peso em aves vacinadas do que em aves com proteção anticoccidiana, especialmente no final do ciclo de criação (Chapman et al., 2002). Por outro lado, aves vacinadas com Paracox®, Livacox® e Immucox® têm apresentado lesões ao longo do seu ciclo de criação (Williams & Andrews, 2001, Chapman et al., 2002), sugerindo apenas proteção parcial nas aves.
Existem outros estudos referentes a diferentes tipos de vacinas. Esses estudos têm sido realizados caracterizando antígenos de diversas etapas do ciclo de desenvolvimento do parasita: antígenos de oocistos esporulados e não esporulados e esporozoítos de E. tenella (Gurnett et al., 1990); perfis antigênicos de organelas de esporozoítos (Kawazoe et al. 1992); antígenos comuns entre esporozoítos e merozoítos (Danforth & McAndrew, 1987; Castle et al., 1991); antígenos de gametócitos de E. maxima (Mencher et al., 1989; Wallach et al., 1992).
A produção de isolados precoces e a conseqüente atenuação desses isolados realizados a partir de gerações parentais de Eimeria, é um bom caminho a ser seguido para se obter uma vacina viva comprovadamente atenuada. Estudos adequados sobre atenuação de isolados precoces utilizando como parâmetros redução do período pré-patente, diminuição da patogenicidade e do número de oocistos produzidos, têm sido realizados por diversos pesquisadores com as principais espécies de Eimeria aviária. Recentemente, estudo sobre a atenuação de E. acervulina foi realizado por Kawazoe et al. (2005) com excelentes resultados.
2 - Justificativa
A avicultura brasileira ocupa excelente posição no cenário internacional. Segundo dados da Associação Brasileira de Produtores e Exportadores de Frangos (ABEF) e da União Brasileira de Avicultura (UBA), o Brasil poderá encerrar o ano de 2008 em segundo lugar no ranking mundial. Contudo, a exemplo de outros países, a coccidiose constitui – se em um dos principais problemas sanitários para a produção avícola. Calcula-se que os gastos mundiais com esta doença, incluindo os prejuízos zootécnicos e a utilização de medicamentos com a finalidade de prevenção e cura cheguem a 800 milhões de dólares por ano segundo Allen & Fetterer, (2002).
Até recentemente, o controle da coccidiose aviária no Brasil era realizado exclusivamente pela utilização de medicamentos anticoccidianos existentes no mercado. Entretanto, esses medicamentos têm se tornado ineficientes no combate aos isolados de Eimeria. Há uma tendência de reduzir e extinguir até 2010 o uso desses medicamentos da criação de frangos de corte na indústria avícola brasileira, com a eliminação gradual desta estratégia (McDougald et al., 1987; Chapman, 1993; Kawazoe & Di Fabio, 1994). Desta forma, criações comerciais de frangos, livres de Eimeria, são extremamente difíceis de serem encontradas (Bigs, 1982; Williams, 1999).
As vacinas vivas virulentas importadas do Canadá e dos Estados Unidos têm sido amplamente utilizadas no Brasil. Contudo, variações antigênicas existentes em isolados de E. maxima e em menor grau em E. acervulina, nas
linhagens de campo, podem atuar como obstáculos importantes para a eficiência de sua utilização. Os isolados das vacinas podem ter menor eficácia na proteção imunológica das aves, em granjas cuja presença de isolados de Eimeria sejam diferentes dessas vacinas (Danforth, 1998; Kawazoe & Manarini, 2001).
Dessa maneira, torna-se cada vez mais necessário e desejável a contribuição científica na busca de outras alternativas como a obtenção devacinas vivas comprovadamente atenuadas, que atuem na proteção das aves contra as eimérias,sem prejudicar o desempenho do animal.
3 - Objetivos
Os objetivos do estudo foram:
1. Obtenção do isolado precoce da Eimeria maxima a partir da geração parental;
2. Comparação da patogenicidade entre o isolado parental e precoce em aves experimentalmente inoculadas.
4 - Material e Métodos
O presente estudo foi desenvolvidono Laboratório de Coccidiose Aviária e no biotério de aves do Departamento de Parasitologia do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
Este experimento está de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal, adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), tendo sido aprovado pela Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEEA) – IB – UNICAMP, protocolo número 1084-1.
AVES: para o desenvolvimento dos experimentos na obtenção e produção de oocistos precoces, foram utilizadas galinhas (Gallus gallus) SPF (Specific Pathogen Free) da linhagem “White Leghorn”, fornecida pela Merial Saúde Animal (Paulínia, SP), de ambos sexos. Com quatro a cinco semanas de idade, três a quatro aves foram alocadas aleatoriamente em gaiolas de metal.
No experimento de patogenicidade foram utilizadas setenta e cinco aves (Gallus gallus) SPF (Specific Pathogen Free) da linhagem “Cobb”, fornecida pela empresa Globo Aves. Aos treze dias de idade as aves foram pesadas e alocadas em gaiolas (cinco aves por gaiola), por um processo de randomização, o qual aproximou as médias dos pesos iniciais das aves em cada gaiola.
As aves foram, desde o nascimento, criadas e mantidas em gaiolas de metal (51 x 40cm) previamente esterilizadas, alimentadas irrestritamente com ração inicial destituída de qualquer medicamento e promotor de crescimento e
água filtrada, nas dependências do biotério de aves do Departamento de Parasitologia, livre de patógenos, com ventilação e temperatura ambiente controladas. O tempo de iluminação foi de 11 horas diárias de luz artificial (controle automático)ligada às 7 horas e desligada às 18 horas.
A ração para todo o experimento foi doada pela empresa Nutron Alimentos localizada na cidade de Campinas (SP).
PARASITOS: para os experimentos foi utilizada a geração parental “Ca” de Eimeria maxima isolada em uma granja “caipira” no Estado de São Paulo, em 2006, sem histórico do uso de medicamentos anticoccidianos e promotores de crescimento. Este isolado é mantido no Laboratório de Coccidiose Aviária do Departamento de Parasitologia, IB, UNICAMP.
O isolamento dos oocistos de E. maxima “Ca” foi realizado a partir de uma amostra mista, contendo as espécies E. acervulina, E. mitis, E. praecox, E. tenella e E. maxima. Desta amostra, foi realizado o isolamento de oocistos de E. maxima por meio de diluições sucessivas com água destilada, em tubos de ensaio. Em seguida, a solução aquosa contendo os oocistos foi pipetada e colocada gota a gota em lâminas de vidro esterilizadas, até que fosse observado ao microscópio óptico comum (aumento de 400x), apenas um (1) oocisto de E. maxima por gota. Estas gotas, contendo os oocistos de E. maxima, foram pipetadas com uma pipeta Pasteur modificada apresentando extremidade curva e fina, com abertura aproximada de 500μm de diâmetro. Esses oocistos foram transferidos para um pequeno frasco de vidro esterilizado de 10ml contendo água destilada.
Terminado este procedimento, os oocistos foram inoculados, via oral, em duas aves sadias, cada dose contendo 10 oocistos.
Nos experimentos foram utilizados oocistos com no máximo oito semanas de armazenamento, período em que é conservada a viabilidade dos mesmos (Long et al., 1976).
4.1 - Obtenção do isolado precoce
A passagem dos oocistos nas aves sadias foi realizada de acordo com o método descrito por Long et al., 1976, abaixo:
As aves sadias, de quatro a cinco semanas de idade,foram inoculadas com cerca de 2 a 30 x 103 oocistos esporulados, contados na câmara de Fuchs-Rosenthal. As fezes foram depositadas em bandeja de metal, forrada com jornal esterilizado (90ºC por 20min) e coletadas a partir de 120 horas após inoculação, de duas em duas horas, até o aparecimento dos primeiros oocistos. Este procedimento prosseguiu com a diminuição progressiva do horário de coleta das fezes e de inoculação conforme a obtenção das gerações mais precoces de oocistos. As inoculações sucessivas dos primeiros oocistos eliminados foram realizadas em aves sadias, para a redução do período pré-patente até a sua estabilização.
Os oocistos foram isolados das fezes utilizando-se o método de flutuação em solução saturada de cloreto de sódio, sendo em seguida esporulados na solução de dicromato de potássio a 2% (K2Cr2O7), oxigênio (O2) e temperatura em
Após esse período, a cultura foi lavada sucessivamente com água destilada e centrifugada a 1.200g por 6 minutos e os oocistos obtidos foram acondicionados em frascos esterilizados, rotulados e mantidos na geladeira a 40 C.
4.2 - Produção de oocistos
Após a obtenção da estabilidade do período pré-patente da eliminação dos oocistos, foram realizadas três produções de oocistos precoces devido ao pequeno número de oocistos eliminados. Nesta parte do experimento foram utilizadas vinte e oito aves, sendo seis inoculadas com a geração parental e vinte e duas aves inoculadas com o isolado precoce “Ca” de E. maxima obtida.
O número de oocistos inoculados por ave sadia foi de 5 x 103 para a geração parental e 2 a 4 x 104 para o isolado precoce.
No quarto dia após a inoculação do isolado precoce, foi realizado o exame de fezes das aves infectadas e posterior coleta das fezes para a realização da cultura dos oocistos (esporulação) segundo método de Long et al., 1976. Para a geração parental foi coletada amostra de fezes do quinto ao sétimo dias após a inoculação nas aves e a obtenção dos oocistos foi realizada da mesma forma que o isolado precoce. A limpeza da cultura foi realizada através de lavagens sucessivas em água destilada e com centrifugação a 1.200g durante 6 minutos. Posteriormente, os oocistos foram armazenados em frascos esterilizados, rotulados adequadamente e acondicionados na geladeira a uma temperatura de 4ºC.
4.3 – Patogenicidade
O estudo de patogenicidade teve como critérios de avaliação: ganho de peso corporal das aves, escores de lesão provocados pelo parasito na mucosa intestinal e contagem do número de oocistos produzidos a partir da data da eliminação. Foram comparados dois isolados de E. maxima “Ca”: parental e precoce.
Nos experimentos de patogenicidade foram utilizados frangos de corte da linhagem Cobb, de sexo masculino. Cada ave recebeu um mililitro de solução aquosa com a dose correspondente de oocistos para cada estudo. A infecção nas aves foi feita oralmente com o auxílio de uma seringa de plástico descartável de um mililitro. Cada ave recebeu uma identificação numérica na perna direita.
Os experimentos foram realizados em triplicata, divididos em cinco grupos de quinze aves, sendo cinco aves alocadas em cada gaiola de metal esterilizada (Figura 2):
Grupo I: aves infectadas com 1 x 103 oocistos da geração parental de E. maxima “Ca” para a contagem dos oocistos;
Grupo II: aves infectadas com 1 x 103 oocistos do isolado precoce de E. maxima “Ca” para a contagem dos oocistos;
Grupo III: aves infectadas com 1 x 105 oocistos da geração parental de E. maxima “Ca” para observação dos escores de lesão e ganho de peso; Grupo IV: aves infectadas com 1 x 105 oocistos do isolado precoce de E. maxima “Ca” para observação dos escores de lesão e ganho de peso; Grupo V: aves sadias (controle negativo).
A pesagem das aves foi realizada antes da alocação em gaiolas (décimo terceiro dia de vida), três e sete dias após a inoculação. As aves foram pesadas individualmente, obtendo-se o valor do ganho de peso individual das aves pela diferença nas pesagens do sétimo e terceiro dias e foi realizada a média dos pesos corporais das aves por gaiola e posterior análise estatística.
Para a contagem total de oocistos, foram coletadas as fezes depositadas sobre uma bandeja forrada com papel esterilizado instalada na base das gaiolas, a partir do quarto dia após a inoculação, diariamente, até o final da eliminação dos oocistos, em cada gaiola. As fezes foram homogeneizadas com água filtrada em um homogeneizador elétrico. Retirou-se um mililitro da amostra que foi colocada em tubo de ensaio. A amostra foi diluída dez vezes com solução saturada de cloreto de sódio (NaCl) e após homogeneização dessa solução, uma alíquota do líquido foi colocada na câmara de Mc Master para a contagem dos oocistos, segundo o método descrito por Long et al., 1976. A contagem final foi calculada a partir do fator que determina o número de oocistos por mililitro de conteúdo fecal.
As aves foram sacrificadas por meio do deslocamento cervical e necropsiadas em seguida.
O escore de lesão foi realizado no sétimo dia após inoculação das aves, segundo o método de Johnson & Reid (1970) que consiste na atribuição de graus (1 a 4) às lesões observadas na mucosa intestinal da região mediana do intestino delgado e do duodeno. No presente experimento osescores foram adaptados com graus intermediários, isto é, meio grau (0,5) e um grau e meio (1,5) devido a lesões intermediárias verificadas na mucosa intestinal das aves. As características para cada nível do escore de lesão são apresentadas no Quadro 3.
Quadro 3 . Características do escore de lesão para Eimeria maxima Escore Características
0 0,5
Nenhuma lesão macroscópica.
Petéquias quase imperceptíveis na mucosa do intestino médio. Ausência de muco alaranjado e sem engrossamento da parede intestinal.
1
1,5
Pequenas petéquias na serosa do intestino médio. Pode haver pequena quantidade de muco alaranjado, sem engrossamento do intestino.
Discreto engrossamento da parede intestinal. Muco alaranjado discreto.
2 Superfície serosa com numerosas petéquias vermelhas. Intestino pode conter muco alaranjado. Engrossamento da parede intestinal. Congestão localizada no intestino médio.
3 Engrossamento da parede intestinal. Conteúdo intestinal com manchas de sangue e muco. Congestão generalizada no intestino médio. Superfície mucosa áspera.
4 Numerosos tampões de sangue e sangue digerido. Odor pútrido. Parede intestinal bastante engrossada.
Fonte: Johnson & Reid, 1970 (adaptado).
4.4 – Análise Estatística
Foram realizadas análises de variância (ANOVA) para a verificação da patogenicidade dos isolado precoce e parental, utilizando o teste múltiplo de Duncan, através do Sistema SAS, versão software 2008. O grau de significância foi de 5%, ou seja, os valores foram considerados estatisticamente significantes quando P<0,05.
Figura 2: Distribuição dos grupos de aves. A: Controle Negativo. B: Aves infectadas com o isolado precoce. C: Aves infectadas com a geração parental.
5 - Resultados
5.1 - Obtenção de oocistos precoces de E. maxima “Ca”
A obtenção de oocistos precoces atingiu a geração F23 da amostra E. maxima “Ca” com um período pré-patente final de 88h30min. Esses resultados encontram-se na Figura 3 e na Tabela 1.
O período pré-patente inicial foi de 124h30min (geração parental) e após 23 passagens sucessivas dos primeiros oocistos em aves, este foi diminuído lenta e gradualmente para 88h30min na geração F23, estabilizando nas gerações F24 e F25, com uma diminuição total de 36 horas no ciclo de vida de E. maxima “Ca”.
Nas gerações F2, F5 e F7 ocorreu um aumento do período pré-patente em relação ao período anterior. Nas gerações F2 e F3, F8 e F9 o período estabilizou-se em 124 e 121 horas, respectivamente.
Observando-se os dados da Tabela 1, verificou-se um período pré-patente máximo na geração F7 (125h). O decréscimo no período pré-patente de cada passagem dos oocistos precoces foi irregular, sendo que nas gerações F7 para a F8 e F18 para a F19 ocorreram os maiores decréscimos, ou seja, de 4 horas.
Na geração F17 não foi possível a identificação do período pré-patente na primeira passagem, portanto repetiu-se mais uma vez a amostra para a obtenção do período, no qual observou-se 105 horas.
A Figura 3 apresenta o gráfico em que se pode notar a queda progressiva no número de horas do período pré-patente, após passagens sucessivas dos primeiros oocistos nas aves.
87 92 97 102 107 112 117 122 127 F F2 F4 F6 F8 F10 F12 F14 F16 F18 F20 F22 F24 Gerações
Período pré-patente (horas)
Tabela 1. Obtenção de oocistos precoces de E. maxima “Ca” através de passagens sucessivas em aves experimentalmente inoculadas.
GERAÇÃO Nº de oocistos
inoculados x 103
Data da inoculação Período Pré-Patente
Parental – F 5 09/03/06 124h30min F1 5 19/04/06 123h30min F2 5 18/05/06 124h F3 5 23/06/06 124h F4 5 21/07/06 123h F5 8 10/08/06 124h30min F6 8 24/08/06 123h F7 8 28/09/06 125h F8 8 19/10/06 121h F9 8 09/11/06 121h F10 8 07/12/06 120h F11 10 07/02/07 119h F12 15 09/03/07 116h F13 15 09/05/07 113h30min F14 20 23/05/07 111h F15 20 13/06/07 108h F16 20 05/07/07 106h F17 20 19/07/07 - F17 25 26/07/07 105h F18 24 23/08/07 103h F19 30 06/09/07 99h F20 16 04/10/07 95h30min F21 15 18/10/07 92h30min F22 23,750 01/11/07 89h F23 30 09/11/07 88h30min F24 16,250 22/11/07 88h30min F25 18 30/11/07 88h30min
F: amostra parental de E. maxima “Ca”; F1: oocistos de 1ª geração; F2: oocistos de 2ª geração; F3: oocistos de 3ª geração; F4: oocistos de 4ª geração; F5: oocistos de 5ª geração; F6: oocistos de 6ª geração; F7: oocistos de 7ª geração; F8: oocistos de 8ª geração; F9: oocistos de 9ª geração; F10: oocistos de 10ª geração; F11: oocistos de 11ª geração; F12: oocistos de 12ª geração; F13: oocistos de 13ª geração; F14: oocistos de 14ª geração; F15: oocistos de 15ª geração; F16: oocistos de 16ª geração; F17: oocistos de 17ª geração; F18: oocistos de 18ª geração; F19: oocistos de 19ª geração; F20: oocistos de 20ª geração; F21: oocistos de 21ª geração; F22: oocistos de 22ª geração; F23: oocistos de 23ª geração; F24: oocistos de 24ª geração; F25: oocistos de 25ª geração.
5.2 - Estudo Comparativo da Patogenicidade entre as Amostras Parental e Precoce de E. maxima “Ca”
Observou-se que as aves infectadas com o isolado precoce não mostraram sinais clínicos da doença, enquanto as aves infectadas com a geração parental demonstraram apatia e redução na ingestão de alimento. Além disso, no sexto dia após a infecção, três aves vieram a óbito não sendo possível realizar o escore de lesão.
Na Tabela 2 encontram-se os valores do resultado comparativo da patogenicidade entre a geração parental e o isolado precoce de E. maxima “Ca”, inoculadas em aves sadias.
5.2.1 - Ganho de Peso Corporal
Nos grupos de aves infectadas com a geração parental houve perda de peso ao passo que nos grupos infectados com o isolado precoce e no controle negativo (aves sadias) ocorreu ganho de peso, porém, no isolado precoce do parasito foi em menor porcentagem do que nas aves sadias.
De acordo com a análise estatística, no teste múltiplo de Duncan, houve diferença significativa entre o controle negativo, o isolado precoce e a geração parental quanto ao ganho de peso corporal das aves. As diferenças entre os valores médios de ganho de peso por ave infectadas com o isolado precoce e com a geração parental foram estatisticamente significativas. Considerando o ganho de peso das aves sadias como 100%, as aves inoculadas com o isolado precoce
obtiveram ganho de 64,8%, enquanto que as aves infectadas com a geração parental perderam 3,1% de peso.
A Tabela 2 e a Figura 4 mostram a porcentagem do ganho de peso entre a geração parental e o isolado precoce sobre o controle negativo (aves sadias).
Tabela 2: Comparação da patogenicidade entre geração parental, isolado precoce de E. maxima “Ca” e o controle negativo
Critérios
de Avaliação
E. maxima “Ca”
Parental
E. maxima “Ca”
Precoce
Controle
Negativo
(Aves Sadias)
Produção média de oocistos/ ave (x106) 14,5 0,7 ---- Ganho de Peso: = % média sobre o controle negativo = média de peso (em gramas) - 3,1a * -6,9a* 64,8b * 144,3b* 100c* 222,8c* Escore de Lesão (média) 1,7a * 0,8b * ----*Variáveis seguidas de letras diferentes, diferem significativamente no teste múltiplo de Duncan (α = 0,05)
100 64,8 -3,1 -20 10 40 70 100 130 Grupos de aves Ganho de P eso ( % ) Controle Negativo Precoce Parental
Figura 4: Comparação da porcentagem do ganho de peso entre as aves inoculadas com a geração parental e o isolado precoce de E. maxima “Ca” e as aves sadias (controle negativo). Desvio padrão: Controle Negativo: 27,1; Parental: 72,8; Precoce: 30,8.
5.2.2 - Escore de Lesão da Mucosa Intestinal
O resultado para o escore de lesão provocado no duodeno e na região mediana da mucosa do intestino delgado das aves infectadas com a geração parental e o isolado precoce pode ser verificado na Tabela 2 e Figura 5.
Houve diferença estatisticamente significativa entre os valores médios dos escores de lesão produzidas nas amostras parental e precoce. A Figura 6 mostra a comparação entre os intestinos das aves sadias, infectadas com o isolado precoce e a geração parental.
Os graus mais altos de escores de lesão foram apresentados nas aves infectadas com a geração parental (Figura 7-C), cujo maior grau foi 2 e o menor 1, enquanto que as aves infectadas com o isolado precoce (Figura 7-B) apresentaram os graus mais baixos de escores de lesão na mucosa intestinal, sendo o menor 0 (zero) e o maior 1,5, de acordo com o Quadro das características do escore de lesão para E. maxima segundo o método de Johnson & Reid (1970) adaptado. A Figura 7-A apresenta o intestino de uma ave sadia comparada com as mucosas dos intestinos das aves infectadas.
1,7 0,8 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 Parental Precoce
Grupos das aves
V a lo res méd io s d o esco re d e l esão
Figura 5: Comparação dos valores médios do escore de lesão da mucosa intestinal entre as aves infectadas com a geração parental e o isolado precoce de E. maxima “Ca”. Desvio padrão: Parental: 0,38; Precoce: 0,37.
Figura 6: Aspecto macroscópico do duodeno e dos intestinos delgado anterior e médio de uma ave sadia (A) e de aves infectadas com a geração parental (B) e precoce (C) de E. maxima “Ca”, após sete dias de infecção. Observar mucosa anêmica e com muco na geração parental (seta) e mucosa com aspecto normal no isolado precoce e na ave sadia (seta). OBS: caneta com 14 cm de comprimento.
Figura 7: Comparação entre os intestinos das aves necropsiadas: controle negativo não infectado (A); infectadas com isolado precoce (B) e parental (C). Observar muco alaranjado e petéquias na parede intestinal da geração parental (setas) e mucosa normal (seta) no isolado precoce de E. maxima “Ca”.
A
B
C
5. 2.3 - Produção de Oocistos por Ave
Nesta parte do estudo, foi feita a contagem diária dos oocistos de seis gaiolas, sendo três gaiolas inoculadas com a geração parental e três inoculadas com o isolado precoce de E. maxima “Ca” cada uma com cinco aves.
Na Tabela 2 encontram-se os resultados da produção média de oocistos obtidos por ave, desde o início até o final da eliminação dos oocistos, infectadas com a geração parental e o isolado precoce.
No desenvolvimento do ciclo do protozoário, o número de oocistos eliminados nas fezes das aves mostrou um pico de eliminação e posterior diminuição, até atingir a negativação na eliminação dos oocistos das amostras precoce e parental de E. maxima “Ca” (Figura 8).
O pico de oocistos eliminados nas fezes foi observado no sétimo dia pós-infecção nas aves infectadas com o isolado precoce e o nono dia após a inoculação nas infectadas com a geração parental. O número de oocistos foi nulo no décimo quarto dia após inoculação no isolado precoce e no décimo sexto dia na geração parental (Figura 8).
As aves infectadas com a geração parental eliminaram maior número de oocistos do que as infectadas com o isolado precoce. Ao final do experimento o número total de oocistos produzidos pela geração parental chegou a quase vinte vezes o número produzido pelo isolado precoce, significativamente diferentes.
Foi observada diferença entre o aspecto das fezes eliminadas pelas aves durante o experimento. As aves infectadas com a geração parental apresentaram fezes diarréicas com grande quantidade de muco (Figura 9-A). Nas gaiolas com
aves infectadas com o isolado precoce de E. maxima “Ca” as fezes estavam com consistência normal (Figura 9-B).
Os resultados do experimento mostraram uma significativa redução da patogenicidade no isolado precoce quando comparado à geração parental, tendo como critérios de avaliação: ganho de peso corporal, escore de lesão da mucosa intestinal e produção de oocistos pelas aves.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Dias após inoculação
P rodução de ooci s to s ( x10 6 ) PA PR
Figura 8: Eliminação de oocistos de E. maxima “Ca” parental (PA) e precoce (PR) entre o quinto e décimo sexto dia após inoculação em aves sadias.
Figura 9: Fezes eliminadas pelas aves infectadas com a geração parental (A) e precoce (B). Observar (setas) aspecto diarréico das fezes com muco alaranjado eliminadas por aves infectadas com a geração parental (A) e aspecto consistente das fezes eliminadas por aves infectadas com o isolado precoce (B) de E. maxima “Ca”.
A
6 – Discussão
6.1 - Obtenção de oocistos precoces
A obtenção de oocistos precoces de Eimeria sp. varia de acordo com as diferentes espécies e amostras encontradas no ambiente, sendo que os resultados obtidos com o isolado “Ca” de E. maxima no presente trabalho foram melhores do que os observados na literatura e em estudos realizados anteriormente com outros isolados de E. maxima, tendo alcançado e estabilizado o período pré-patente dos primeiros oocistos eliminados de 124h30min para 88h30min, após 25 passagens em aves sadias.
Shirley & Bellatti (1988) realizaram um experimento com um isolado E. maxima, no qual observaram a redução do período pré-patente de 127 horas na geração parental para 117 a 115 horas no isolado precoce, após 12 passagens em aves sadias. Este fato ocorreu devido à redução do ciclo de vida endógeno, isto é, a perda de uma ou mais fases assexuadas do ciclo biológico do parasito (McDonald et al., 1984; McDonald et al., 1986; Shirley & Bedrník, 1997; Shirley, 1989 e 2005). A atenuação em dois isolados de E. maxima (W e MF) levou a obtenção de amostras com redução do período pré-patente de 130 horas (F3) e 131 horas (F) para 107 horas, após 12 passagens (McDonald et al.,1986).
Em estudos realizados com outras espécies, McDonald & Ballingall em 1983, realizaram a atenuação de oocistos de E. mitis resultando na redução do período pré-patente maior do que 20 horas após 14 passagens dos oocistos em
aves sadias. Também, Shirley & Bellatti (1984) observaram que o isolado de E. necatrix com período pré-patente de 138 horas, após as primeiras cinco passagens, mostrou diminuição regular a cada passagem e chegando à geração F15 com um período mínimo entre 115 a 120 horas. Ainda, Shirley et al. (1984) após quinze gerações, conseguiram reduzir o período pré-patente de um isolado de E. praecox de 88 horas na geração parental para 64 a 68 horas após 10 passagens e para 49 horas após 18 passagens dos oocistos em aves sadias.
Em outro trabalho de revisão sobre características de isolados atenuados, observou-se para E. tenella uma redução no período pré-patente de 121 horas para 112 horas, enquanto que em E. acervulina o período pré-patente diminuiu de 97 para 72 horas após 15 a 20 passagens de oocistos em aves sadias (Long & Johnson, 1988).
A atenuação de um outro isolado precoce de E. necatrix foi realizada por Montes et al. (1998) que conseguiram reduzir o período pré-patente de 148 horas na geração parental para 114 horas, após 19 passagens dos primeiros oocistos em aves sadias. Ocorreu diminuição de 34 horas no período pré-patente do isolado precoce, resultado semelhante ao obtido nesse estudo com E. maxima “Ca”.
No ano de 2005, foram realizados estudos com uma amostra isolada de E. maxima “L” em que foi observada a diminuição do período pré-patente de 124h30min para 97 horas após 28 passagens dos primeiros oocistos em aves sadias (Kawazoe et al., 2006), confirmando que a obtenção dos oocistos precoces, a partir do isolado de E. maxima “Ca” realizada neste trabalho atingiu um ótimo resultado, conseguindo diminuir o período pré-patente ainda mais.
No trabalho mais recente sobre atenuação de um isolado de E. acervulina, Kawazoe et al. (2005) reduziram o tempo do período pré-patente, de 96 para 83 horas, após 25 passagens dos primeiros oocistos em aves sadias. Neste caso, apesar da diferença relativamente pequena entre as gerações parental e precoce, estudos histopatológicos e de patogenia comprovaram a atenuação deste isolado. Nos isolados precoces caracterizados por um ciclo de vida mais abreviado do que a parental, a geração de meronte ou esquizonte que precede a gametogonia é cada vez menor em tamanho, com a produção de poucos merozoítos. Esta perda de estágios assexuados tem demonstrado ser a base para a atenuação (Jeffers, 1975; McDonald et al., 1982). Outros fatores podem estar envolvidos na variação da redução do período pré-patente das amostras estudadas como: a patogenicidade causada no hospedeiro e a presença de alguns vírus dentro dos parasitos (Nuss, 1992).
6.2 - Patogenicidade
Para a comprovação na diminuição da patogenicidade entre as gerações parental e precoce da amostra isolada de E. maxima “Ca” foi realizado um estudo comparativo em aves experimentalmente inoculadas. O isolado precoce de E. maxima “Ca” quando comparado à respectiva geração parental apresentou: menor número de oocistos eliminados, ganho de peso significativo e escore de lesão com menor grau.
A determinação das doses de infecção neste experimento foi adotada com base em estudos anteriormente realizados no Laboratório de Coccidiose Aviária
do Departamento de Parasitologia do Instituto de Biologia da UNICAMP e nos protocolos encontrados na literatura científica. Importante salientar que a observação da patogenicidade com doses altas de oocistos na infecção de aves determina a real atenuação da virulência. Outro aspecto importante é a utilização de diferentes doses, de acordo com a espécie da Eimeria estudada. Não é recomendável utilizar doses altas de oocistos em aves, nos casos de estudos com espécies mais patogênicas como E. tenella e E. necatrix, pois poderiam matar as aves infectadas antes do término do experimento. Em espécies como E. maxima, uma dose de 1 x 105, apesar de ser considerada uma dose alta, causa morbidade mas não mortalidade nas aves infectadas. Estudos realizados por diversos autores comprovam esta hipótese.
Estudo comparativo sobre a patogenicidade das gerações parental e precoce foi realizado por McDonald et al. (1986) em dois isolados precoces de E. maxima (WP5 e WP14), em experimentos separados, onde grupos de aves que receberam 5 x 103 oocistos do isolado W (parental) tiveram perda de peso mais significativa do que aquelas que receberam a mesma dose de oocistos de WP5 (oocistos precoces de 5ª geração). Entretanto, o ganho de peso médio do último grupo foi menor do que o do controle. Uma dose de 2 x 104 oocistos de WP5 foi menos patogênica do que uma dose de 5 x 103 de oocistos da geração parental. Onze dias após inoculação com 5 x 103 oocistos de WP14 (oocistos precoces de décima quarta geração), não houve diferença significativa entre as médias de pesos dos grupos infectados e não infectados (controle negativo). Uma dose de 2 x 104 oocistos de WP14 foi consideravelmente menos patogênica do que uma dose de 5 x 103 oocistos da geração W (parental). Os dados desses experimentos
indicaram que a seleção para a precocidade resultou em perda significante de virulência (McDonald et al., 1986), o que também ocorreu neste estudo com E. maxima “Ca”.
Um estudo sobre patogenicidade de seis isolados atenuados por seleção de oocistos precoces de Eimeria spp, mostrou que o isolado de E. maxima reduziu o período pré-patente de 121 horas para 106 (Long & Johnson, 1988). Com uma dose de 5 x 103 oocistos desse isolado precoce, o ganho de peso diminuiu 8,8% quando comparado com uma diminuição de 57% em aves inoculadas com geração parental. Em nosso estudo com E. maxima “Ca” as aves infectadas com o isolado precoce obtiveram 64,8% de ganho de peso e as inoculadas com a geração parental -3,1%, ou seja, perdendo peso.
A geração parental de E. maxima “Ca” apresentou, assim como no estudo de Long & Johnson (1988), lesões intestinais mais severas do que o isolado precoce. Nas outras espécies de eimérias estudadas, a redução na patogenicidade dos isolados precoces variou em relação às gerações parentais nos dois parâmetros avaliados (Long & Johnson, 1988). Perda de peso após a inoculação de oocistos parentais foi, particularmente, severa com E. maxima e E. necatrix e menos severa com E. praecox. Portanto, nossos resultados obtidos com o isolado precoce de E. maxima “Ca” são concordantes com aqueles mostrados por Long & Johnson (1988), uma vez que o isolado precoce apresentou resultados satisfatórios e contundentes para a diminuição dos danos gerados às aves.
Estudos sobre a patogenicidade de parasitos precoces e parentais de E. mitis foram realizados por McDonald & Ballingall (1983), os quais determinaram o ganho de peso corpóreo das aves infectadas em relação às aves sadias (controle
negativo). No primeiro experimento, foram inoculados oocistos precoces com período pré-patente de 77h (HP) e parentais (H) de E. mitis. A média de peso obtido pelo grupo infectado com isolado precoce HP foi intermediária entre o grupo controle e do grupo infectado com isolado H. No décimo dia após a infecção a média de peso do grupo inoculado com HP (precoce) foi significativamente mais alta do que a do grupo inoculado H, mas também significativamente mais baixa do que a do grupo controle. No segundo experimento, foram inoculados no lugar dos oocistos precoces (HP) com 77h, oocistos precoces com 72h. Neste caso a média de ganho de peso do grupo que recebeu isolado precoce (HP) não foi significativamente diferente daquela do grupo controle, enquanto o grupo que recebeu isolado H ganhou significativamente menos peso do que cada um dos outro grupos. Isto demonstra que o isolado HP 72h é menos patogênico do que o isolado HP 77h. Esses mesmos autores verificaram a patogenicidade do isolado atenuado de E. acervulina, com 72 e 62 horas de período pré-patente onde, para o primeiro isolado, com inoculação de 1 x 106 oocistos, houve significante perda de peso ao passo que para o segundo isolado, com o mesmo número de oocistos inoculados, o ganho de peso foi similar ao das aves sadias.
Características patogênicas de isolados precoces (HP) de E. brunetti também foram avaliadas em um outro estudo. A média de pesos das aves que receberam oocistos precoces foi significativamente maior do que a obtida pelas aves que receberam geração parental (H). A atenuação da virulência das gerações precoces foi associada com o aumento de seleção para oocistos precoces e foi maior para E. brunetti HP26. O ganho de peso das aves inoculadas com HP26 não diferiu do ganho de peso das aves sadias (controle negativo).
Infecções com isolados precoces, especialmente HP15 e HP22, causaram poucas lesões no intestino das aves (Shirley et al., 1986). Esses dados estão próximos aos apresentados do isolado precoce de E. maxima “Ca” que mostrou ganho de peso corpóreo significativamente maior do que as aves inoculadas com a geração parental.
Os estudos sobre a patogenicidade entre amostras precoces e parentais das espécies de Eimeria aviária têm demonstrado que, quanto mais precoces forem os oocistos eliminados, menor a patogenicidade dos isolados precoces em relação às respectivas gerações parentais. No entanto, o grau de atenuação tem diferido de acordo com o isolado e a espécie estudada, conforme demonstrado pelos autores acima citados e em experimentos realizados no Laboratório de Coccidiose Aviária da UNICAMP.
Alguns autores têm verificado que a redução na produção de oocistos de eimeria seja devido à diminuição da geração assexuada do ciclo biológico, fato que tem sido comprovado através de estudos histológicos do ciclo de desenvolvimento das gerações precoces. McDonald & Jeffers (1976) mostraram que ocorreu a eliminação da segunda geração de esquizogonia para a atenuação de um isolado precoce de E. tenella. Segundo Shirley & Bedrník (1997) os isolados atenuados possuem caracteristicamente seus ciclos assexuados diminuídos em dois ciclos.
McDonald et al. (1982) conferiram a depleção da quarta geração de esquizogonia em E. acervulina enquanto Shirley et al. (1984) verificaram a depleção da quarta geração de esquizogonia em E. praecox ao passo que para E.
