THAYNAN CUNHA VIEIRA
AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DE NEOPLASIAS MAMÁRIAS INDUZIDAS POR DMBA EM CAMUNDONGOS SWISS SUJEITOS À DIETA HIPERLIPÍDICA E
TRATADOS COM INIBIDOR DE COX-2
Tubarão 2019
AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DE NEOPLASIAS MAMÁRIAS INDUZIDAS POR DMBA EM CAMUNDONGOS SWISS SUJEITOS À DIETA HIPERLIPÍDICA E
TRATADOS COM INIBIDOR DE COX-2
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Medicina Veterinária, da Universidade do Sul de Santa Catarina, como requisito parcial à aprovação na disciplina de Trabalho de Conclusão de Curso II.
Orientadora: Profª. Luisa Lemos Vieira, Msc.
Tubarão 2019
AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DE NEOPLASIAS MAMÁRIAS INDUZIDAS POR DMBA EM CAMUNDONGOS SWISS SUJEITOS À DIETA HIPERLIPÍDICA E
TRATADOS COM INIBIDOR DE COX-2
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado adequado à obtenção de nota parcial para aprovação na Unidade de Aprendizagem Trabalho de Conclusão de Curso II em Medicina Veterinária da Universidade do Sul de Santa Catarina.
Tubarão, 27 de Junho de 2019.
______________________________________________________ Profª. e Orientadora Luisa Lemos Vieira, Msc.
Universidade do Sul de Santa Catarina
______________________________________________________ Profª. Ester Meire Costa Gouveia Blazius, Msc.
Universidade do Sul de Santa Catarina
______________________________________________________ Prof. Carlos Otávio Gonçalves, Msc.
―Uma jornada de mil milhas começa com apenas um simples passo.‖ (Provérbio Chinês).
O presente estudo tem por objetivo relatar através de artigo científico a comparação de duas referências para classificar tumores de mama induzidos por DMBA em camundongos Swiss fêmeas, bem como avaliar e correlacionar a inflamação tecidual nestes tumores de camundongos submetidas à dieta hiperlipídica (DH) e tratadas com etoricoxibe. Neste trabalho, revisaram-se o câncer de mama e os modelos animais, além do papel da dieta rica em lipídios e inflamação tecidual no contexto neoplásico. 52 tumores induzidos por DMBA em camundongos foram classificados histologicamente. Posteriormente, somente os de origem mamária foram analisados quanto ao infiltrado inflamatório e angiogênese. 22/52 (42,31%) tumores de origem mamária foram observados. Destes, foi possível classificar 2 tipos histológicos de acordo com Sass e Dunn, enquanto de acordo com Cassali obteve-se 7 tipos, destacando-se Adenoacantoma e Carcinoma Micropapilar como os mais frequentes, respectivamente. Dentre os carcinomas, observaram-se 3 tipos mais agressivos, presentes significativamente em maior frequência nos grupos com DH, não havendo diferença no grupo tratado com etoricoxibe. Da mesma forma, houve leve aumento da intensidade de infiltrado inflamatório e número de vasos sanguíneos nos grupos DH. Por isso, conclui-se que o DMBA não induziu majoritariamente tumores mamários e a classificação histológica de Cassali se mostrou mais detalhada. Embora o tratamento com Etoricoxibe não tenha diminuído a inflamação, a DH foi capaz de induzir maior grau de malignidade dos tumores.
Palavras-chave: Câncer de Mama. Classificação Histológica. Camundongos. Inflamação.
The present study has as objective to report through a scientific article the comparison of two references to classify DMBA-induced breast tumors in female Swiss mice, as well as to evaluate and correlate the tissue inflammation in these tumors of mice subjected to a high fat diet (DH) and treatment with etoricoxib. In this work, breast cancer and animal models were reviewed, as well as the role of the lipid-rich diet and tissue inflammation in the neoplastic context. 52 tumors induced by DMBA in mice were histologically classified. Subsequently, only those of mammary origin were analyzed for inflammatory infiltrate and angiogenesis. 22/52 (42.31%) tumors of mammary origin were observed. From these, it was possible to classify 2 histological types according to Sass and Dunn, whereas according to Cassali, 7 types were obtained, and Adenoacantoma and Micropapillary Carcinoma were the most frequent type, respectively. Among the carcinomas, there were 3 more aggressive types, present significantly more frequently in the DH groups, and there was no difference in the group treated with etoricoxib. Likewise, there was a slight increase in the intensity of inflammatory infiltrate and number of blood vessels in the DH groups. Therefore, it is concluded that DMBA did not induce mammary tumors in the majority, and the histological classification of Cassali was more detailed. Although treatment with Etoricoxib did not decrease inflammation, the DH was able to induce a greater degree of tumor malignancy.
Figura 1 - Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para 2018 em mulheres. ... 12 Figura 2 - Distribuição e classificação das glândulas mamárias em camundongos. . 14 Figura 3 - Tumor em mama abdominal induzido por DMBA em camundongo, evidenciando aumento de volume em região de glândula mamária abdominal direita e, à direita, nódulo neoplásico correspondente após disseção do subcutâneo. ... 16 Figura 4 - Características da célula tumoral segundo Hanahan e Weinberg (2011). 23 Figura 5 - Papel fundamental dos macrófagos na invasão e intravasamento de células tumorais, por meio da ação de EGF, CSF-1, WASP e N-WASP... 25 Figura 6 - Esquema de divisão dos grupos. ... 30 Figura 7 - Eventos realizados com os camundongos Swiss fêmeas na UFSC. ... 30
Tabela 1 - Similaridade entre tumores mamários caninos e câncer de mama humanos... 17 Tabela 2 - Classificação histológica para neoplasias mamárias caninas. ... 19 Tabela 3 - Classificação histológica de neoplasias mamárias em camundongos. .... 20 Tabela 4 - Ingredientes para formulação de dieta controle e hiperlipídica. ... 29
1 INTRODUÇÃO ... 9
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 11
2.1 CÂNCER DE MAMA ... 11
2.1.1 Roedores como Modelo Experimental para o Câncer de Mama ... 13
2.1.1.1 Modelo de Indução por DMBA em Camundongos ...15
2.1.2 Caninos como Modelo Experimental para o Câncer de Mama ... 16
2.1.3 Classificação Histológica dos Tumores Mamários... 18
2.2 INFLAMAÇÃO E CÂNCER DE MAMA... 22
2.3 INIBIDORES DE COX-2 ... 26 3 MATERIAL E MÉTODOS ... 28 4 RESULTADOS ... 32 5 ARTIGO CIENTÍFICO... 1 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 33 REFERÊNCIAS ... 34 ANEXOS ... 39
ANEXO A – Certificado de Aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais – UFSC... 40
ANEXO B – Certificado de Aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais – UNISUL. ... 42
1 INTRODUÇÃO
O câncer de mama representa a neoplasia mais frequentemente diagnosticada em cadelas. Nas gatas, apesar de não ser o tipo mais diagnosticado, a maioria das neoplasias mamárias são malignas. Em humanos, a estimava para o biênio de 2018-2019 é de que o câncer de mama seja a principal neoplasia a acometer mulheres. Esta grande prevalência proporciona também um alto risco de óbitos por conta das metástases secundárias.
Hábitos alimentares associados a uma dieta hiperlipídica, e possível obesidade, podem ter grande influência no aparecimento de tumores, principalmente mamários, uma vez que o epitélio da mama é envolto por tecido adiposo. O câncer tem sido estudado como um ambiente heterogêneo em que diversas células interagem entre si para a promoção das células neoplásicas e, por isso, a inflamação que ocorre no tecido adiposo, exacerbada por uma dieta hiperlipídica, é responsável por favorecer a chance de ocorrer mutações e proliferação de células mutadas, criar uma região mutagênica pela produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, bem como indução angiogênica, características fundamentais do desenvolvimento do câncer. Diante disso, estudos sugerem o potencial papel terapêutico de inibidores seletivos de COX-2 no contexto das neoplasias.
Carcinógenos ambientais como o DMBA, que é um hidrocarboneto aromático policíclico presente em produtos da combustão (ar poluído, descarga de automóveis, fumaça de cigarro, alimentos grelhados ou defumados) estão entre os principais agentes indutores de câncer de mama, por apresentarem seletividade pelo tecido adiposo.
O exame histopatológico é uma ferramenta valiosa para predizer o comportamento biológico dos tumores e a classificação destes contribui para o entendimento da dinâmica tumoral. Contudo, poucas são as fontes acessíveis e atualizadas de informações para se conhecer os tipos histológicos das neoplasias mamárias induzidas quimicamente em modelos murinos, espécies amplamente utilizadas nos centros de pesquisa.
Por isso, o presente estudo tem por objetivo comparar a validade de duas classificações histológicas para neoplasias mamárias murinas induzidas por DMBA, bem como avaliar a inflamação tecidual nos tumores mamários de camundongos
fêmeas submetidas à dieta hiperlipídica e tratadas com etoricoxibe, correlacionando com as classificações histológicas dos tumores.
Devido a poucos estudos que validem a classificação histológica de tumores mamários em camundongos, correlacionando com a inflamação tecidual neste trabalho, torna-se de suma importância os resultados desta pesquisa para o entendimento da morfologia tumoral.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CÂNCER DE MAMA
O câncer pode ser entendido como um conjunto de doenças que causam alterações nas células normais de um indivíduo, alterações estas, que foram atualizadas por Hanahan e Weinberg (2011). Segundo os autores, os tumores deixaram de ser entendidos como uma massa de células cancerosas que se proliferam. Ao invés disso, passaram a ser estudados como um tecido complexo, composto por múltiplos e distintos tipos celulares, os quais participam de um ambiente heterogêneo, caracterizando o microambiente tumoral responsável pelo desenvolvimento de neoplasias.
Dentre as neoplasias, os tumores de glândulas mamárias são o tipo mais frequente nas cadelas, representando cerca de 50 a 70% de todos as neoplasias nessa espécie, estimando-se o surgimento de 3 milhões de novos casos no mundo a cada ano, proporcionando alto risco de óbitos por conta de metástases secundárias a essa neoplasia. Em contrapartida, nas gatas, enquadra-se como o terceiro tipo mais diagnosticado, sendo secundário aos tumores de pele e aos do sistema hematopoiético. Contudo, 80% das neoplasias mamárias em gatas são malignas, de alto potencial metastático e, muitas vezes, fatal (DE NARDI; FERREIRA; ASSUNÇÃO, 2017; TEDARDI et al., 2017).
Em humanos, o câncer de mama foi considerado a segunda causa de morte por câncer em regiões mais desenvolvidas no ano de 2012, após o câncer de pulmão (FERLAY et al., 2015). Mais recentemente, o Instituto Nacional do Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA, 2017) divulgou que, para cada ano do biênio 2018 – 2019, estimam-se cerca de 59.700 novos casos de câncer de mama na população feminina, ocupando o primeiro lugar das neoplasias mais frequentes em mulheres no Brasil (Figura 1).
Figura 1 - Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para 2018 em mulheres.
Fonte: Adaptado de INCA, 2017.
Dados publicados no Danish Veterinary Cancer Registry entre 2005 e 2008, demonstram que de todas as neoplasias caninas diagnosticadas, 28% eram do sistema reprodutivo de fêmeas incluindo glândulas mamárias. Ainda neste levantamento, separando por sexo, 51% das neoplasias mais frequentemente diagnosticadas em cadelas eram mamárias (BRONDEN et al., 2010). Em outro estudo realizado por De Nardi et al. (2002) no Hospital Veterinário da Universidade Federal do Paraná, observou-se que as neoplasias mamárias acometeram 45,6% das fêmeas caninas e que, destas, 68,4% eram lesões malignas.
Quanto aos fatores de risco para o câncer de mama em cadelas, Tedardi et al. (2017) e Nunes, Campos e Bertagnolli (2017) apontam a estimulação estrogênica, o emprego de contraceptivos, a alimentação rica em gorduras e o aumento da expectativa de vida como as principais causas. No estudo epidemiológico de De Nardi et al. (2002), 48,02% das fêmeas com tumor de mama haviam sido tratadas previamente com hormônios anticoncepcionais, 52,63% não eram alimentadas somente com rações balanceadas e 68,4% possuíam idades entre 7 e 12 anos.
Em mulheres, a idade da primeira menstruação, idade no primeiro filho, tempo de amamentação, idade da menopausa, sobrepeso, histórico familiar, uso de álcool, uso de contraceptivos orais e terapia hormonal para menopausa, foram apontados como os principais fatores etiológicos do desenvolvimento de câncer de mama (BARNARD; BOEKE; TAMIMI, 2015).
Estudos têm mostrado que mudanças no estilo de vida de mulheres podem prevenir de 25 – 30% a ocorrência de câncer de mama e que uma dieta não saudável, juntamente com a obesidade, pode ter grande influência no aparecimento de tumores (DANAEI et al., 2005).
Somado a isso, tem-se a alta prevalência de obesidade em cães (25 – 52%) em países desenvolvidos, onde o estilo de vida, dieta e diminuição de exercícios podem contribuir para o ganho de peso nestes animais (PIANTEDOSI et al., 2016). Lim et al. (2015) constataram que tanto o sobrepeso quanto a obesidade em fêmeas caninas foram associados a uma idade mais jovem de acometimento por tumores mamários e à invasão pelo sistema linfático.
2.1.1 Roedores como Modelo Experimental para o Câncer de Mama
O principal objetivo das ciências biomédicas permeia o desenvolvimento de terapias efetivas contra o câncer. Diante disso, o estudo de modelos animais possibilita o entendimento das complexas interações entre as células tumorais e o seu ambiente, em que a progressão tumoral e a metástase podem ser promovidas e moduladas (PANTALEÃO; LUCHS, 2010).
Roedores vêm sendo utilizados há tempos para estudos de tumorigênese, principalmente camundongos, em virtude de serem pequenos, se reproduzirem rapidamente, podendo ser modificados geneticamente com facilidade, e serem baratos. Somado a isso, a curta gestação e expectativa de vida dos camundongos permitem uma criação rápida de grande número de indivíduos e, consequentemente, a viabilidade de execução de vários experimentos em período relativamente curto (DE JONG; MAINA, 2010).
Segundo Avanzo (2008), a glândula mamária em modelos experimentais apresenta-se como um alvo extremamente seletivo, sendo que o conhecimento desta estrutura alvo, do carcinógeno e da interação de ambos é extremamente importante para se justificar o desenvolvimento do tumor. Sendo assim, cabe ressaltar que camundongos possuem cinco pares de glândulas mamárias, alojadas na camada adiposa subcutânea, esquematizadas na Figura 2.
Figura 2 - Distribuição e classificação das glândulas mamárias em camundongos.
Fonte: Adaptado de HUMMEL; RICHARDSON; FEKETE, 1966.
Hann e Balmain (2001) também salientam o fato de que as linhagens de camundongos compartilham similaridades genéticas e fisiológicas com os humanos, o que permite uma grande oportunidade de estudar doenças humanas nestes modelos. Os autores ainda elencam critérios de um modelo tumoral murino ―ideal‖, como critérios biológicos (capacidade de evidenciar a progressão tumoral e análise de eventos genéticos e biológicos associado a essas transições; origem e progressão tumoral; tumores histológico e patologicamente semelhantes aos de humanos; metastatização; e propriedades específicas de células tumorais), genéticos (mutações múltiplas em genes específicos; alterações cromossomais; alterações específicas em uma ou mais vias celulares conhecidas no câncer humano; e expressão gênica semelhante), etiológicos (exposição aos mesmos fatores ambientais de indução tumoral conhecidos em humanos) e terapêuticos (susceptível a testes de novas terapias; preditividade a resultados de ensaios clínicos em humanos).
Embora não haja nenhum modelo que responda a todos estes critérios, os modelos existentes, de modo isolado ou combinado, mimetizam com precisão uma ou mais características de um tipo específico de câncer humano (HANN;
BALMAIN, 2001). Essa lacuna entre o ideal e realidade pode ser explicada pelo fato de que, mesmo que camundongos e humanos possuam cerca de 95% de igualdade genética, a similaridade entre as espécies não prevê que seus respectivos fenótipos sejam muito diferentes (DE JONG; MAINA, 2010).
Todavia, ainda que com estes paradigmas, o estudo destes modelos animais no câncer possibilitou a maioria do conhecimento acerca da biologia tumoral adquiridos até o momento, promovendo informações únicas. Além disso, modelos murinos são métodos poderosos para elucidar o entendimento de mecanismos de progressão e metástase tumorais, bem como permitir indiretamente o desenvolvimento de drogas específicas para pacientes com câncer (DE JONG; MAINA, 2010; KIM; BAEK, 2010).
2.1.1.1 Modelo de Indução por DMBA em Camundongos
Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, como o 7,12-dimetilbenzatraceno (DMBA), são considerados químicos ambientais, como produtos da combustão, que geralmente são encontrados no ar poluído, descarga de automóveis, fumaça de cigarro, diesel e alimentos grelhados ou defumados (BRODY; RUDEL, 2003; GAMMON et al., 2002).
Por meio de estudos, observou-se que o DMBA é rapidamente absorvido no trato intestinal e tende a se acumular em tecido adiposo, o que confere à glândula mamária ser alvo de tropismo para o DMBA (AVANZO, 2008; NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1982). Além disso, esta molécula possui alta seletividade pelos ductos mamários, sofrendo oscilações hormonais e formando predominantemente tumores mamários (Figura 3). Para isso, é necessário que seja administrado pela via oral, uma vez que o DMBA requer ativação metabólica (RUSSO; RUSSO, 1996; THOMPSON; SINGH, 2000).
Conforme estabelecido por Cheng et al. (1988a) e Cheng et al. (1988b), o metabólito carcinogênico do DMBA, DMBA-3,4-diol-1,2-epóxido, é capaz de se ligar ao DNA celular e formar adutos de DNA, induzindo mutações que são o primeiro passo para o desenvolvimento de tumores. Currier et al. (2005) completa que o desenvolvimento do tumor induzido pelo DMBA pode estar relacionado às vias de controle do crescimento celular e às vias antiapoptóticas.
Figura 3 - Tumor em mama abdominal induzido por DMBA em camundongo, evidenciando aumento de volume em região de glândula mamária abdominal direita e, à direita, nódulo neoplásico correspondente após disseção do subcutâneo.
Fonte: Rosângela Mayer Gonçalves, 2018.
Curiosamente, o efeito do DMBA sobre células de tumores mamários de equinos (mais resistentes a neoplasias mamárias) e caninos (mais susceptíveis) cultivadas in vitro, permitiu identificar que ambas as espécies sofreram danos ao DNA, mas que somente as células de equinos progrediram para a morte celular, enquanto as de caninos repararam o dano ao DNA. Com estes resultados preliminares, os autores propuseram um modelo hipotético em que a apoptose contribuiria para a baixa incidência de câncer de mama observada em certas espécies de mamíferos, pois a eliminação de células com dano no DNA reduziria o risco de uma possível iniciação tumoral devido a mutações nessas células (LEDET et al., 2018).
2.1.2 Caninos como Modelo Experimental para o Câncer de Mama
Nas últimas décadas vem-se destacando a atenção para o fato da convivência entre cães e seres humanos estar cada vez mais interligada, muito provavelmente relacionada a mudanças na estrutura familiar, o que faz estes animais tornarem-se membro da família em certos casos (TEDARDI et al., 2017).
Por essa razão, cães dividem o mesmo ambiente que humanos e acabam expostos a fatores ambientais de carcinogênese comum a ambas as espécies (VAIL; MACEWEN, 2000), o que o torna um modelo de estudo para o câncer em humanos.
Queiroga et al. (2011), em sua revisão bibliográfica sobre a semelhança entre tumores de mama de cadelas e humanos, comparam aspectos como
incidência e fatores de risco, características histológicas, curso clínico da doença e marcadores moleculares. A comparação destes aspectos os permite concluir a similaridade entre as espécies e a grande oportunidade de materiais biológicos de tumores de mama em cadelas para pesquisa de novos marcadores moleculares para detecção precoce, bem como uma caracterização bioquímica mais completa dos tumores e desenvolvimento de melhores estratégias terapêuticas.
Em síntese, Abdelmegeed e Mohammed (2018) também reafirmam a utilização de modelos caninos de tumor mamário para a compreensão da carcinogênese humana, como uma alternativa e/ou complementariedade de estudos, comparando a semelhança de ambas as espécies (Tabela 1).
Tabela 1 - Similaridade entre tumores mamários caninos e câncer de mama humanos.
(continua) Características
Similares Humanos Cães
Ocorrência Espontânea Espontânea
Idade de
acometimento Média de idade, 62 anos
Média de idade, 10,5 anos (10,5 anos caninos, equivalente a 65,5 anos em mulheres)
Curso da Doença Idêntica em humanos e
cães Idêntica em humanos e cães
Tamanho do tumor Similar em humanos e
cães Similar em humanos e cães
Estágios clínicos Idêntico em ambas as
espécies Idêntico em ambas as espécies Invasão de
linfonodos
Idêntica em humanos e
cães Idêntica em humanos e cães
Malignidade espontânea mais comum
Neoplasia mamária Neoplasia mamária
Dependência de estrógeno
Longa exposição a
estrógeno aumenta o risco da ocorrência do tumor
Cães inteiros possuem um risco quatro vezes maior de ocorrência de tumor do que cães castrados antes dos 2 anos de idade
Tipo histológico mais
comum Carcinoma ductal invasivo Carcinomas Lesões pré-malignas Prevalente Prevalente
(conclusão) Características
Similares Humanos Cães
Marcadores moleculares
Vários genes foram identificados para desempenhar um papel crítico na carcinogênese dos tumores mamários
Determinaram-se que esses genes possuem papel idêntico na
carcinogênese de tumores mamários caninos
Anormalidades mamográficas
Neoplasias mamárias de cães e humanos possuem
microcalcificações e
macrocalcificações similares
Neoplasias mamárias de cães e humanos possuem
microcalcificações e
macrocalcificações similares
Fonte: ABDELMEGEED; MOHAMMED, 2018 (tradução nossa).
2.1.3 Classificação Histológica dos Tumores Mamários
Dentre as formas de diagnóstico tumorais, o exame histopatológico é uma ferramenta valiosa para predizer comportamento biológico (BOSTOCK, 1986). Somado a isso, fornece informações sobre o padrão de crescimento do tumor, se ele é sólido, tubular ou papiliforme, se é infiltrativo ou possui limites definidos, bem como se apresenta ou não uma cápsula que o delimita e o isola dos tecidos vizinhos (WERNER; WERNER, 2017).
Além disso, o grau de diferenciação das células tumorais, o pleomorfismo nuclear e o número de mitoses presentes dentro do tumor são utilizados na graduação do câncer, sendo indicativos da agressividade da neoplasia (FERREIRA; NAKAGAKI; CASSALI, 2017).
Quanto aos tipos histológicos, utilizam-se na medicina veterinária basicamente três referências para classificar uma neoplasia mamária, como a de Misdorp et al. (1999), Goldschimidt et al. (2011) e Cassali (2017). A classificação histológica proposta por Cassali (2017), após revisada do último consenso de tumor mamário canino em 2013, apresenta a classificação histológica de melhor definição para uso na medicina veterinária (Tabela 2).
Tabela 2 - Classificação histológica para neoplasias mamárias caninas. (continua) Cassali (2017) 1 LESÕES BENIGNAS NÃO NEOPLÁSICAS 1.1 Alterações Inflamatórias 1.2 Alterações Fibrocísticas e Hipotróficas 1.3 Alterações Metaplásicas 1.4 Lesões Epiteliais Proliferativas não Neoplásicas 1.4.1 Hiperplasias epiteliais 1.4.2 Hiperplasias ductais 1.4.3 Hiperplasias lobulares 1.4.4 Adenose 1.4.5 Lesões de células colunares 1.4.5.1 Alteração de células colunares 1.4.5.2 Hiperplasia de células colunares 1.4.5.3 Alterações de células colunares atípicas 2 NEOPLASIAS BENIGNAS 2.1 Adenomas 2.1.1 Adenoma ductal 2.1.2 Adenoma tubular 2.1.3 Adenoma de lactação 2.1.4 Adenomioepitelioma 2.1.5 Adenoma basaloide 2.2 Fibroadenoma
2.3 Tumor Filodes Benigno 2.4 Papiloma Ductal 2.5 Papiloma Esclerosante 2.6 Tumor Misto Benigno
3 NEOPLASIAS
MALIGNAS 3.1 Carcinomas
3.1.1 Carcinoma in situ 3.1.1.1 Carcinoma ductal in situ 3.1.1.2 Carcinoma lobular in situ 3.1.2 Carcinoma em tumor misto 3.1.3 Carcinossarcoma 3.1.4 Adenomioepitelioma maligno 3.1.5 Carcinoma tubular
3.1.6 Carcinoma papilar 3.1.6.1 Carcinoma papilar sólido 3.1.7 Carcinoma sólido 3.1.8 Carcinoma micropapilar invasivo 3.1.9 Carcinoma lobular invasivo 3.1.10 Carcinnoma lobular pleomórfico
(conclusão) 3 NEOPLASIAS MALIGNAS 3.1 Carcinomas 3.1.11 Carcinoma secretor 3.1.12 Carcinoma Mucinoso
3.1.13 Carcinoma rico em lipídios
3.1.14 Carcinoma rico em glicogênio 3.1.15 Carcinoma de células escamosas
3.1.16 Carcinoma de células fusiformes
3.1.17 Carcinoma com diferenciação sebácea 3.1.18 Carcinoma cribiforme 3.1.19 Carcinoma basaloide 3.2 Sarcomas 3.2.1 Filodes maligno 3.2.2 Fibrossarcoma 3.2.3 Osteossarcoma
3.2.4 Sarcoma em tumor misto
3.2.5 Outros sarcomas
3.2.5.1 Condrossarcomas 3.2.5.2 Lipossarcomas 3.2.5.3 Hemangiossarcomas
Fonte: CASSALI, 2017.
Para camundongos, a classificação histológica das neoplasias mamárias concentra-se basicamente nos estudos provenientes de Dunn (1953), sendo mais relevante a última revisão de Sass e Dunn (1979) (Tabela 3).
Tabela 3 - Classificação histológica de neoplasias mamárias em camundongos.
(continua)
1 CARCINOMAS
1.1 Adenocarcinoma tipo A
1.2 Adenocarcinoma tipo B 1.3 Adenocarcinoma tipo C
1.4 Adenocarcinoma tipo Y, tubular, ramificado
1.5 Adenocarcinoma tipo L (lacelike), secretório com brotamento
1.6 Tipo Indiferenciado
1.7 Carcinoma tipo P, responsivo à gravidez
(conclusão) 2 CARCINOMA COM DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS ESCAMOSAS 2.1 Adenoacantoma (carcinoma adenoescamoso)
2.2 Tipo de célula pálida com pontes intercelulares e queratinização celular individual
2.3 Tipo moluscoide, tubular, não-ramificado
3 NEOPLASIAS DE TECIDO CONJUNTIVO
3.1 Carcinossarcoma
3.1.1 Tecido glandular e fibroso 3.1.2 Tecido glandular, fibroso, osteoide e mioepitélio
3.2 Fibrossarcoma
3.3 Hemangioendotelioma
4 LESÕES PRÉ NEOPLÁSICAS
4.1 Placas e tumores organoides
4.2 Nódulos alveolares hiperplásicos
Fonte: SASS; DUNN, 1979.
Caldas et al. (2016) apontam os principais tipos histológicos encontrados em tumores mamários de cadelas, sendo, entre os malignos, carcinoma simples (37,10%), carcinoma complexo (31,45%) e tumor misto maligno (20,16%). Já entre os benignos, a prevalência foi de adenoma complexo (43,82%), tumor misto benigno (29,21%) e adenoma simples (24,72%).
Comparativamente, Carvalho (2016) demonstrou prevalência principalmente de carcinoma ductal invasivo (21,87%), carcinoma tubular (21,87%), carcinoma sólido (15,62%), carcinoma em tumor misto (9,37%) e carcinoma secretório (6,25%). Já Costa Jr, Goiozo e Silva (2016) encontraram 51,5% de carcinoma papilar, 14,7% de carcinoma sólido, 14,7% de carcinoma tubular, 4,4% de carcinoma em tumor misto e 4,4% de carcinoma in situ.
Embora se observem diferenças quanto à prevalência de tumores em cadelas no Brasil, pode-se inferir que as neoplasias epiteliais malignas são as mais comuns.
Em humanos, foi também observado a maior prevalência do tipo epitelial maligno como o principal tipo histológico das neoplasias, demonstrado por Raffo et al. (2017) como carcinoma ductal invasor (57,7%), carcinoma misto (ductal e lobular)
(19,2%), carcinoma mucinoso (11,5%), carcinoma lobular invasor (7,7%) e carcinoma pouco diferenciado (4%).
Já em modelos experimentais, induzidos por DMBA, ratas desenvolveram predominantemente carcinoma ductal (COUTO et al., 2016) e carcinoma tubular (ALMEIDA et al., 2016) e camundongos fêmeas apresentaram adenocarcinomas (AVANZO, 2008), carcinoma escamoso, carcinoma adenoescamoso, carcinoma de células fusiformes, carcinoma tubular e carcinoma papilar (CURRIER et al., 2005). Contudo, poucas são as fontes acessíveis e atualizadas de informações para se conhecer os tipos histológicos das neoplasias mamárias induzidas quimicamente em modelos murinos.
2.2 INFLAMAÇÃO E CÂNCER DE MAMA
A obesidade é associada a um estado inflamatório, no qual se atribui o aumento de ácidos graxos, produção de citocinas inflamatórias e um influxo de células imunes, como macrófagos, que também produzem mediadores inflamatórios (CHARRIÈRE et al., 2003). Isso se dá porque a obesidade altera a biologia do tecido adiposo, que passa a exibir uma inflamação definida por infiltrados de leucócitos, incluindo macrófagos, linfócitos T CD8 e mastócitos (OSBORN; OLEFSKY, 2012).
Em sua última revisão, Hanahan e Weinberg (2011) incluíram quatro novas características das células tumorais e, do total de 10 características adquiridas, encontram-se entre elas a capacidade de promoção da inflamação e indução de angiogênese (Figura 4).
Figura 4 - Características da célula tumoral segundo Hanahan e Weinberg (2011).
Fonte: ZUCCARI et al., 2017.
Segundo Grivennikov, Greten e Karin (2010), a inflamação pode contribuir para várias características inerentes do câncer, por fornecer moléculas bioativas para o microambiente tumoral, o que inclui fatores de crescimento que sustentam a capacidade proliferativa das células, fatores de sobrevivência para evitar a morte celular, fatores pró angiogênicos, modificação de enzimas da matriz extracelular que acabam facilitando a angiogênese, invasão e metástase.
Simplificadamente, as células tumorais aparecem em sítios de inflamação crônica devido à alta regeneração tecidual encontrada na resposta inflamatória, o que favorece a chance de ocorrer mutações e consequente proliferação acentuada de células mutadas. Além disso, há a criação de uma região mutagênica, caracterizada pela produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio pelas células imunes recrutadas, bem como a indução angiogênica (neovascularização) classicamente presente na inflamação e já descrita como uma das características fundamentais do desenvolvimento do câncer (CONDEELIS; POLLARD, 2006; ONUCHIC; CHAMMAS, 2010).
Além disso, o rápido crescimento tumoral predispõe a formação de sítios de necrose no meio do tumor, o que induz ainda mais o recrutamento de células
inflamatórias para o local e contribui para a adaptação do metabolismo energético das células, primeiramente locais, pela falta de oxigênio, conhecido como Efeito Warburg. Essa adaptação celular, em que as células priorizam a formação de lactato pela via da glicólise, pode ser observada posteriormente nas células neoplásicas vizinhas ao local de necrose, mesmo na presença de oxigênio (GRIVENNIKOV; GRETEN; KARIN, 2010; SAKURAI et al., 2008).
No contexto da obesidade, células inflamatórias, como macrófagos, mastócitos, linfócitos e neutrófilos, são recrutadas para o tecido adiposo a fim de fagocitar adipócitos mortos, o que histologicamente é conhecido como infiltrado inflamatório (HOWE et al., 2013). Esse mecanismo é iniciado quando os adipócitos secretam quimiocinas como a proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1) e leucotrieno B4 (LTB4), atraindo monócitos para o tecido adiposo, onde se tornam macrófagos do tecido adiposo (ATM‘s). Por sua vez, estes ATM‘s também secretam suas próprias quimiocinas que atraem ainda mais macrófagos, instalando um processo inflamatório (OLEFSKY; GLASS, 2010).
Os ácidos graxos saturados presentes no tecido adiposo, por sua vez, ativam os receptores Toll-like 4 (TLR4) situados na membrana celular desses ATM‘s, induzindo vias de sinalização como a do fator de transcrição nuclear kappa B (NFκB) e fator de transdução de sinal e ativação de transcrição 3 (STAT 3) (HOWE et al., 2013; ONUCHIC; CHAMMAS, 2010). NFκB é um fator de transcrição responsável por induzir a transcrição de genes pró-inflamatórios incluindo ciclooxigenase-2 (COX-2), interleucina 1 beta (IL-1β) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), associados com a proliferação celular, proteínas antiapoptóticas, inflamação, metástase e angiogênese (HARVEY; LASHINGER; HURSTING, 2011; SHI et al., 2006). Já o STAT 3, promove a sobrevivência de células tumorais na medida que aumenta a proteína anti-apoptótica linfoma de células B extragrande (Bcl-xL) e promove a síntese de citocinas e fatores de crescimento, impedindo a maturação das células dendríticas, o que compromete a atividade das células de linfócitos T citotóxicos (T CD8) e Natural Killers (NK) (LIN; KARIN, 2007).
Uma vez facilitada a criação de células tumorais no tecido inflamado, os ATM‘s passam a se chamar macrófagos associados ao tumor (TAM), os quais passam a secretar o fator de crescimento epidermal (EGF), que por sua vez é captado pela célula tumoral por expressar seu receptor (EGFR), realizando a quimiotaxia até o vaso sanguíneo. Nesse momento, as células tumorais passam a
secretar o fator estimulante de colônias 1 (CSF-1), que atrai macrófagos e os estimula a produzir ainda mais EGF, completando um ciclo parácrino. Esta sinalização entre as células também afeta os reguladores de actina conhecidos como proteínas da síndrome de Wiskott-Aldrich (WASP) e proteínas neuronais da síndrome de Wiskott-Aldrich (N-WASP), acarretando na formação de processos invasores nas células tumorais, com consequente intravasamento dessas células (Figura 5) (CONDEELIS; POLLARD, 2006; WYCKOFF et al., 2007).
Figura 5 - Papel fundamental dos macrófagos na invasão e intravasamento de células tumorais, por meio da ação de EGF, CSF-1, WASP e N-WASP.
Fonte: CONDEELIS; POLLARD, 2006.
Essa alteração de citocinas observada pela interação das células do sistema imunológico com as células neoplásicas no microambiente tumoral (aumento do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), interleucina 10 (IL-10), interleucina 6 (IL-6), COX-2, e redução de interleucina 4 (IL-4), interleucina 12 (IL-12), interferon alfa (IFN-α), e interferon gamma (IFN-𝛾)), também associada à ativação da via STAT 3 que estava presente no tecido adiposo, suprimem a maturação de células dendríticas, prejudicando significativamente a função de apresentação de antígenos ao sistema imunológico que estas células desempenham (JOYCE, 2005).
Conforme demonstrado no estudo de Wyckoff et al. (2007), por meio de microscopia multi-fóton, o intravasamento da grande maioria de células neoplásicas
se dá em associação com macrófagos perivasculares, sustentando a ideia de interação entre estas células. Além disso, Subbaramaiah et al. (2011) demonstraram também que a via de sinalização NFκB e a expressão de COX-2, TNF-α e IL-1β estavam todas aumentadas tanto na glândula mamária quando na gordura visceral de camundongos fêmeas obesas por indução dietética.
Somado a isso, o aumento de fatores angiogênicos induzidos pela inflamação, como VEGF, já foi correlacionado com o grau de malignidade neoplásica e capacidade de metastização, uma vez que a vascularização proporciona oxigenização e nutrientes presentes no sangue para o microambiente tumoral (CARVALHO, 2016).
Em virtude do epitélio da mama ser envolto por tecido adiposo, fica evidente a importância da inflamação observada no tecido adiposo local em relação à patogênese do câncer de mama (HOWE et al., 2013).
2.3 INIBIDORES DE COX-2
Na medida em que a enzima ciclooxigenase-1 (COX-1) é expressa constitutivamente na maioria dos tecidos, mantendo o revestimento gástrico e renal normais, bem como a funcionalidade das plaquetas na corrente sanguínea, sua isoenzima COX-2 é caracterizada como a enzima responsável pela conversão do ácido araquidônico em prostaglandinas durante eventos inflamatórios (KAM; SEE, 2000; SMYTH et al., 2009).
Entre as prostaglandinas derivadas de COX-2, a tipo E2 (PGE2) possui a habilidade de influenciar a resposta imune local no microambiente tumoral, contribuindo para a evasão tumoral e desenvolvimento de metástases (GREENHOUGH et al., 2009).
Este mecanismo se dá em virtude da PGE2 atuar sobre vasos sanguíneos, causando a dilatação e deixando-os mais permeáveis, o que permite o influxo de células inflamatórias e mediadores de citocinas adentrar o local que sofreu algum dano. Além disso, atua juntamente com VEGF para promover a angiogênese (GHOSH, 2003).
A regulação da expressão de COX-2 em tumores mamários in vivo e in vitro de células da linhagem MDA-MB-435 revelou o importante papel de COX-2 na promoção de metástases (ZHANG et al., 2018). Do mesmo modo, também Solanki
et al. (2018) demonstrou a associação entre a expressão de COX-2 e pior prognóstico em carcinomas mamários, como maior tamanho do tumor, linfonodos reativos e invasão linfovascular.
Estudos apontam que a inibição farmacológica ou deleção genética de COX-2 reduz a formação tumoral em modelos experimentais animais de câncer de cólon, mama e pulmão (SMYTH et al., 2009), bem como sugerem o potencial papel terapêutico de inibidores seletivos de COX-2 como antiangiogênicos e antimetastáticos (QUEIROGA et al., 2011; ZHANG et al., 2018).
Etoricoxibe enquadra-se como um exemplo entre os inibidores seletivos de COX-2, exibindo uma maior seletividade para esta enzima em relação à COX-1, quando comparado com rofecoxibe, valdecoxibe e celecoxibe in vitro. Mostrou-se mais pontente e com eficácia dose-dependente similar a outros anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) em modelos animais de inflamação, hiperalgesia, piresia e artrite (BROOKS; KUBLER, 2006; RIENDEAU et al., 2001).
Em modelo animal de câncer de pulmão induzido com DMBA intratraqueal, o tratamento com etoricoxibe obteve resultados significativos na redução da incidência tumoral e das lesões (NADDA et al., 2012). Contudo, este inibidor de COX-2 ainda não foi descrito no contexto de neoplasias mamárias, o que o torna uma potencial droga antitumorigênica em estudos prospectivos.
3 MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi uma parceria entre pesquisadores, sendo parte de um Projeto de Doutorado que está sendo realizado na Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC pela doutoranda Rosângela Mayer Gonçalves, sob orientação do Prof. Dr. Alfeu Zanotto Filho, aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Santa Catarina, sob o protocolo nº 9334240518 (ANEXO A), e pelo CEUA da Universidade do Sul de Santa Catarina, sob protocolo nº 18.045.5.05.IV (ANEXO B).
Para a execução deste projeto foram utilizadas amostras de tumores emblocados em parafina. Estes tumores foram induzidos por DMBA em camundongos fêmeas submetidas à dieta hiperlipídica e tratadas com etoricoxibe.
ANIMAIS
Os experimentos animais foram conduzidos de acordo com os princípios éticos para o uso de animais de experimentação preconizados no ARRIVE guidelines (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines). Os animais foram mantidos em ambiente com temperatura e ventilação controladas, cama de maravalha autoclavada, temperatura constante de 22±1 ºC, ciclo de 12 h claro/escuro e alimentados com ração controle preparada conforme as necessidades nutricionais básicas, ou ração preparada para dieta hiperlipídica e água à vontade.
PROTOCOLO PARA DIETA HIPERLIPÍDICA
Camundongos Swiss fêmeas com 40 dias foram divididas em 2 grupos, em que um permaneceu com a dieta controle preparada conforme necessidades nutricionais básicas e o outro recebeu uma dieta hiperlipídica (suplementada com açúcar e gordura animal) (Tabela 4), as quais foram preparadas e ofertadas aos animais semanalmente até o fim do experimento.
Tabela 4 - Ingredientes para formulação de dieta controle e hiperlipídica.
Ingredientes
MIX Óleo de Soja Açúcar Amido Gordura Animal
Dieta Controle 380 g 20 ml 80 g 520 g -
Dieta High Fat 380 g 20 ml 140 g 110 g 350 g
Fonte: Elaboração dos Autores, 2018.
Para o preparo de 5kg de MIX eram utilizados: 0,045g de CuSO4 (equivalente a 18mg de Cobre); 0,54g de FeSO4 (equivalente a 0,2mg de Ferro); 7,6g de MgCl2 (equivalente a 2g de Magnésio); 0,58g de MnCl2 (equivalente a 250mg de Manganês); 0,24g de ZnSO4 (equivalente a 100mg de Zinco); 0,002mg de KI (equivalente a 1,5mg de Iodo); 250g de celulose microcristalina; 9g de L-cistina (ou L-cisteína); 700g de maltodextrina; mix de minerais (2mg de Cromo; 1mg de Selênio); mix de vitaminas (5g de colina; 2mg de ácido fólico; 38mg de niacina; 14mg de ácido Pantotênico; 10mg de piridoxina; 5,8mg de riboflavina; 7,5mg de tiamina; 7900UI de vitamina A; 0,1mg de vitamina B12; 1250UI de vitamina D3; 58UI de vitamina E). O MIX era preparado, acondicionado em frasco fechado e protegido da luz, a fim de evitar oxidação das vitaminas.
INDUÇÃO DE TUMOR DE MAMA POR DMBA
Transcorridos 10 dias após o início do fornecimento das rações para os dois grupos, todos os camundongos Swiss fêmeas receberam a administração de 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA) (1 mg/animal, Sigma, EUA), para indução dos tumores. O carcinógeno foi dissolvido em óleo de soja e administrado por gavagem 1 vez por semana durante 5 semanas. Os animais em que o tumor alcançou mais de 10% do peso corporal foram eutanasiados. Demais animais foram eutanasiados 37 semanas após indução do tumor com DMBA.
TRATAMENTO COM INIBIDOR DE COX-2
Após 10 dias da última administração de DMBA, o grupo que estava recebendo a dieta controle foi dividido em dois, da mesma forma se aplicou ao grupo que estava recebendo a dieta hiperlipídica. Dessa maneira, um grupo de cada dieta passou a receber tratamento com etoricoxibe (5 mg/kg), enquanto o outro grupo de
cada dieta recebeu apenas veículo. Os grupos tratados com etoricoxibe receberam doses diárias do fármaco diluído em veículo (NaCl 0,9%) por via oral (gavagem), ao passo que o grupo controle recebeu apenas o veículo (NaCl 0,9%), ambos até o fim do experimento.
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Os grupos foram dispostos conforme segue na Figura 6.
Figura 6 - Esquema de divisão dos grupos.
Legenda: DMBA=7,12-dimetilbenzatraceno; DC=dieta controle; DH=dieta hiperlipídica; S/E=sem etoricoxibe; C/E=com etoricoxibe.
Fonte: Elaboração dos Autores, 2018.
A sequência dos eventos realizados com os animais, até a obtenção das amostras biológicas para este estudo, pode ser observada na Figura 7.
Figura 7 - Eventos realizados com os camundongos Swiss fêmeas na UFSC.
Fonte: Elaboração dos Autores, 2018.
ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
Após eutanásia dos animais, com 228 dias (37 semanas após indução com DMBA), todos os tumores observados macroscopicamente foram coletados e imediatamente fixados em paraformaldeído 4%, passaram por processamento em xilol e álcool e posteriormente foram emblocados em parafina.
As lâminas histológicas foram preparadas na Universidade Federal de Santa Catarina e coradas em Hematoxilina e Eosina conforme protocolo padrão da universidade e scanneadas em equipamento ZEISS Axio Scan.Z1. Em seguida, as lâminas digitalizadas foram encaminhadas ao Hospital Universitário - UFSC, Laboratório de Patologia Comparada – Universidade Federal de Minas Gerais e Unisul para avaliação histológica por três avaliadores (triplo-cego), dentre eles, dois patologistas médicos veterinários e um patologista humano. A avaliação consistiu nos parâmetros de infiltrado inflamatório, angiogênese e classificação histológica das neoplasias por meio do programa de leitura de lâminas ZEN blue - Zeiss.
As neoplasias mamárias foram classificadas de acordo com a classificação histológica proposta por Sass e Dunn (1979) e comparadas com a classificação utilizada na medicina veterinária padronizada por Cassali (2017).
Para avaliar o infiltrado inflamatório, selecionou-se um campo mais representativo de cada tumor, em objetiva de 50x, e analisou-se a proporção de infiltrado de células mononucleares no campo para classificar a densidade em baixa (até 25% do campo acometido de inflamação), moderada (25% - 75% de acometimento do campo) ou alta (acima de 75% de acometimento).
Quanto ao parâmetro de angiogênese nas neoplasias mamárias, realizou-se contagem média de vasos encontrados em oito focos mais reprerealizou-sentativos de cada tumor, utilizando a soma total para fornecimento do resultado.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a análise estatística, realizou-se o teste ANOVA de 2 vias com pós teste de Bonferroni para a avaliação da intensidade de infiltrado inflamatório. Em relação ao parâmetro de angiogênese, utilizou-se ANOVA de 1 via com pós teste de Turkey. Já para as demais avaliações, realizou-se análise descritiva dos dados para a determinação da frequência. Para tanto, foram considerados estatisticamente significativos os dados em que p<0,05 ou frequência ≥55% e utilizado o Software Graphpad Prism
4 RESULTADOS
Os resultados serão apresentados em formato de artigo científico, de acordo com as normas da revista Veterinary Pathology (ANEXO C).
1
5 ARTIGO CIENTÍFICO
HISTOPATOLOGIA DE NEOPLASIAS MAMÁRIAS MURINAS INDUZIDAS POR DMBA ASSOCIADAS À DIETA HIPERLIPÍDICA E TRATAMENTO COM
ETORICOXIBE
Histopathology of Murine Mammary Neoplasms Induced by DMBA associated to High Fat Diet and Treatment with Etoricoxibe
Thaynan C. Vieira, Rosângela M. Gonçalves, Alfeu Zanotto-Filho, Geovanni D. Cassali, Daniella Vieira, Luisa L. Vieira
Universidade do Sul de Santa Catarina (TCV, LLV)
Universidade Federal de Santa Catarina (RMG, AZF, DV) Universidade Federal de Minas Gerais (GDC)
Rua Luiz Pedro de Oliveira, 1679, Humaitá de Cima, Tubarão, Santa Catarina, Brasil, 88708-130. +55 48 99622-5269. thaynan07@gmail.com
2
Resumo
Uma alimentação rica em gorduras e o sobrepeso predispõem à obesidade, que está associada a um estado inflamatório e contribui para o crescimento tumoral com o aumento da expressão da enzima COX-2, sendo a utilização de inibidores dessa enzima, como etoricoxibe, eficaz em terapias antiangiogênicas e antimetastáticas. O exame histopatológico é utilizado para entender o comportamento biológico dos tumores. Entretanto, poucas são as fontes acessíveis e atualizadas para se
classificar uma neoplasia mamária de camundongos. Assim, 52 tumores induzidos por DMBA em camundongos Swiss fêmeas sujeitas à Dieta Hiperlipídica e tratadas com etoricoxibe foram classificados histologicamente. Posteriormente, somente os de origem mamária foram analisados quanto ao infiltrado inflamatório e
angiogênese. De 52 tumores desenvolvidos nos camundongos, 22/52 eram de origem mamária (42,31%). Destes, foi possível classificar 2/3 tipos histológicos de acordo com Sass e Dunn, destacando-se o adenoacantoma com maior frequência, enquanto de acordo com Cassali obteve-se 7 tipos, destacando-se Carcinoma Micropapilar. Dentre os carcinomas, observaram-se 3 tipos mais agressivos, presentes significativamente em maior frequência nos grupos com Dieta
Hiperlipídica, não havendo diferença no grupo tratado com etoricoxibe. Da mesma forma, houve leve aumento da intensidade de infiltrado inflamatório e número de vasos sanguíneos no mesmo grupo, embora não tenha sido significativo. Conclui-se que o DMBA não induziu majoritariamente tumores mamários e a classificação histológica de Cassali se mostrou mais detalhada. Embora o tratamento com Etoricoxibe não tenha diminuído a inflamação, a Dieta Hiperlipídica foi capaz de induzir maior grau de malignidade dos tumores.
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Palavras-chave: Camundongos, Classificação Histológica, Dieta Hiperlipídica,
DMBA, Etoricoxibe, Inflamação, Neoplasia Mamária.
Abstract
A high fat diet (DH) and overweight predispose to obesity, which is associated with an inflammatory state and contributes to tumor growth with increased expression of the COX-2 enzyme, that the use of inhibitors of this enzyme, such as etoricoxib, is effective in antiangiogenic and antimetastatic therapies. Histopathological
examination is used to understand the biological behavior of tumors. However, there are few accessible and updated sources for classifying a mice mammary neoplasm. Thus, 52 tumors induced by DMBA in female Swiss mice submitted to DH and treated with etoricoxib were histologically classified. Subsequently, only those of mammary origin were analyzed for inflammatory infiltrate and angiogenesis. 22/52 tumors of mammary origin (42,31%) were observed. Of these, it was possible to classify 2/3 histological types according to Sass and Dunn, whereas according to Cassali, 7 types were found, with Adenoacanthoma and Micropapillary Carcinoma as the most frequent in each of the references, respectively. Among the carcinomas, there were 3 more aggressive types, present significantly more frequently in the groups with DH, and there was no difference in the group treated with etoricoxib. Likewise, there was a slight increase in the intensity of inflammatory infiltrate and number of blood vessels in the DH group, although it was not significant. Therefore, it was concluded that DMBA did not induce mammary tumors in most cases, and the Cassali`s histological classification was more detailed. Although treatment with Etoricoxib did not decrease inflammation, the DH was able to induce a greater degree of tumor malignancy.
4
Keywords: Breast Neoplasm, DMBA, Etoricoxibe, High Fat Diet, Histological
Classification, Inflammation, Mice.
Os tumores de glândulas mamárias, dentre as neoplasias, enquadram-se como o tipo mais frequente nas cadelas e mulheres, estimando-se o surgimento de 3
milhões de novos casos no mundo a cada ano para caninos e cerca de 60 mil casos de câncer de mama na população de mulheres brasileiras para cada ano do biênio 2018-2019.16,21
Esta alta prevalência pode ser destacada pelos fatores de risco observados em cadelas, como o emprego de contraceptivos esteroidais e a alimentação rica em gorduras.19,23 Para mulheres, sobrepeso e uso de contraceptivos esteroidais também foram alguns dos fatores apontados como etiológicos no desenvolvimento de câncer de mama.4
A alimentação rica em gorduras e o sobrepeso predispõem à obesidade, associada a um estado inflamatório, no qual se atribui o aumento de ácidos graxos, produção de citocinas inflamatórias e um influxo de células imunes.10 Essa inflamação
contribui para o crescimento tumoral por fornecer moléculas bioativas para o microambiente, o que inclui fatores de crescimento que sustentam a capacidade proliferativa das células, fatores de sobrevivência para evitar a morte celular, fatores pró angiogênicos e remodulação de enzimas da matriz extracelular, que acabam facilitando a angiogênese, invasão e metástase.14
A inflamação induzida pela obesidade está associada à alta expressão da enzima Cicloxigenase 2 (COX-2), a qual vem sendo utilizada como biomarcador nos
tumores mamários.18 Nesse sentido, estudos apontam que a inibição farmacológica ou deleção genética de COX-2 reduz a formação tumoral em modelos experimentais
5
animais de câncer de cólon, mama e pulmão, bem como sugerem o potencial papel terapêutico de inibidores seletivos de COX-2 como antiangiogênicos e
antimetastáticos.25,28,30
Além disso, o exame histopatológico dos tumores é uma ferramenta valiosa para predizer o comportamento biológico, sendo a classificação histológica proposta por Cassali, em 2017, uma das classificações de melhor definição para uso na medicina veterinária. Em contrapartida, para camundongos, a classificação histológica
concentra-se basicamente na última revisão de Sass e Dunn, em 1979, o que tornam poucas as fontes acessíveis e atualizadas para se conhecer os tipos histológicos das neoplasias mamárias induzidas quimicamente em modelos murinos.9,27
Carcinógenos ambientais como o 7,12-dimetilbenzatraceno (DMBA), que é um hidrocarboneto aromático policíclico presente em produtos da combustão (ar poluído, descarga de automóveis, fumaça de cigarro, alimentos grelhados ou defumados) estão entre os principais agentes indutores de câncer de mama em modelos animais de experimentação, por apresentarem seletividade pelo tecido adiposo e a mama estar em volta por um.3,5,13
Nesse sentido, este estudo tem por objetivo comparar a validade de duas classificações histológicas para neoplasias mamárias, bem como avaliar a inflamação tecidual nos tumores mamários de camundongos Swiss fêmeas
submetidas à dieta hiperlipídica e tratadas com etoricoxibe, correlacionando com as classificações histológicas dos tumores mamários induzidos por DMBA.
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Materiais e Métodos
Neste estudo foram inclusas 52 amostras de tumores emblocados em parafina, provenientes de 21 camundongos fêmeas Swiss induzidos DMBA. Para isso, este trabalho recebeu aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Santa Catarina e da Universidade do Sul de Santa Catarina, sob
protocolos nº 9334240518 e 18.045.5.05.IV, respectivamente.
Os experimentos animais foram conduzidos de acordo com os princípios éticos para o uso de animais de experimentação preconizados no ARRIVE guidelines. Estas fêmeas Swiss, com 40 dias de vida, foram distribuídas em quatro grupos, que incluíam dois grupos com administração de dieta hiperlipídica (DH) (suplementada com gordura animal e açúcar) e dois com dieta controle (DC), ambos com
fornecimento a vontade até o fim do experimento. Após dez dias do início do fornecimento da alimentação para os grupos, todos os animais receberam
administração semanal, durante cinco semanas, de DMBA (Sigma, USA) dissolvido em óleo de soja na dose de 1mg/animal, por via oral (gavagem). Transcorridos dez dias da última administração de DMBA, um grupo de cada tipo de dieta passou a receber tratamento com etoricoxibe (C/E) diluído em veículo (NaCl 0,9%) na dose de 5mg/kg, por via oral (gavagem), diariamente, até o fim do experimento, enquanto o outro grupo de cada dieta (S/E), somente veículo. Todos os animais foram
eutanasiados após 37 semanas da última administração de DMBA e os tumores observados macroscopicamente foram coletados e imediatamente fixados em paraformaldeído 4%.
As amostras foram embebidas em parafina, cortadas as secções em 5µm e posteriormente coradas com Hematoxilina e Eosina (HE). As lâminas histológicas foram scanneadas em equipamento ZEISS Axio Scan.Z1 e, em seguida, as lâminas
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digitalizadas foram encaminhadas ao Hospital Universitário – Universidade Federal de Santa Catarina, Laboratório de Patologia Comparada – Universidade Federal de Minas Gerais e Universidade do Sul de Santa Catarina para avaliação histológica por três avaliadores (triplo-cego), dentre eles, dois patologistas médicos veterinários e um patologista humano. Todos os tumores foram classificados histologicamente, mas somente os de origem mamária foram avaliados quanto ao infiltrado
inflamatório e angiogênese por meio do programa ZEN blue - Zeiss.
As neoplasias mamárias dos camundongos foram classificadas de acordo com a classificação histológica proposta por Sass e Dunn (1979) e comparada com a classificação utilizada na medicina veterinária padronizada por Cassali (2017).
Para avaliar o infiltrado inflamatório, selecionou-se um campo mais representativo de cada tumor, em objetiva de 50x, e analisou-se a proporção de infiltrado de células mononucleares no campo para classificar a densidade em baixa (até 25% do campo acometido de inflamação), moderada (25% - 75% de acometimento do campo) ou alta (acima de 75% de acometimento).
Quanto ao parâmetro de angiogênese nas neoplasias mamárias, realizou-se
contagem de vasos encontrados em oito focos mais representativos de cada tumor, utilizando a soma total para fornecimento do resultado.
Para a análise estatística, realizou-se o teste ANOVA de 2 vias com pós teste de Bonferroni para a avaliação da intensidade de infiltrado inflamatório. Em relação ao parâmetro de angiogênese, utilizou-se ANOVA de 1 via com pós teste de Turkey. Já para as demais avaliações, realizou-se análise descritiva dos dados para a
determinação da frequência. Para tanto, foram considerados estatisticamente significativos os dados em que p<0,05 ou frequência ≥55%/≤45% e utilizado o Software Graphpad Prism para obtenção dos gráficos.
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Resultados
Dos 52 tumores induzidos quimicamente por DMBA, somente 22/52 tumores (42,31%) eram de origem mamária, conforme observado na Fig. 1.
42.31% Mamária 57.69% Outras origens
Fig. 1
Dentre os tumores classificados como de outras origens, que não a mamária, destacam-se 23/30 casos de linfoma (77%), seguido de outros tumores não-neoplásicos ou benignos, ilustrados na Fig.2.
9 Linf om a Teci do M uscu lar Tric oepi telio ma Não Inva sivo Inco nclu sivo Pap ilom a 0 5 10 15 20 25 n ú m e ro d e t u m o re s
Fig. 2
Dentro dos grupos, foi possível observar significativamente a indução majoritária de tumores de outras origens nos grupos DC S/E (4/4) e DH S/E (19/24 – 79%), bem como o pronunciamento de tumores mamários no grupo DC C/E (11/12 – 92%), segundo a Fig. 3.
10
DC S/E DC C/E DH S/E DH C/E
0 5 10 15 20 n ú m e ro d e t u m o re s Mamária Outras origens
Fig. 3
Em relação à classificação histológica proposta por Sass e Dunn, a maioria dos tumores mamários (20/22) foram classificados como Adenoacantoma (90,9%)
conforme Fig. 4, enquanto pela classificação de Cassali foi possível identificar outros tipos histológicos, com predominância do Carcinoma Micropapilar, segundo Fig. 5.
Adenoacantoma CCE sem classificação 0 5 10 15 20 n ú m e ro d e t u m o re s
Fig. 4
11 Car cino ma Mic ropa pila r Car cino ssar com a CC E Car cino ma em Tum or M isto Car cino ma Lobu lar in S itu Car cino ma Pap ilar Car cino ma Duc tal I n S itu 0 1 2 3 4 5 n ú m e ro d e t u m o re s
Fig. 5
Dos 20 tumores classificados como adenoacantoma segundo a classificação
proposta por Sass e Dunn, observou-se mais de um tipo histológico desses mesmos tumores quando comparados com a classificação proposta por Cassali, conforme mostra a Tabela 1 e Figuras 6-12.
12
Tendo por base a classificação histológica dos tumores mamários de Cassali, dentre os carcinomas mais agressivos observados neste estudo, destacam-se o Carcinoma Micropapilar, Carcinossarcoma e Carcinoma de Células Escamosas (CCE). Estes tumores foram observados com frequência significativamente menor no grupo DC
13
C/E (5/11 - 45%) e significativamente maior no grupo DH S/E (5/5), como mostra a Fig. 13.
DC C/E DH S/E DH C/E
0 1 2 3 4 5 6 n ú m e ro d e t u m o re s Carcinomas Carcinomas mais agressivos
Fig. 13
Com relação ao infiltrado inflamatório, não houve diferença significativa entre os grupos. Como pode ser observado na Fig. 14, apenas nos grupos DH foi possível observar infiltrado inflamatório intenso.
DC C/E DH S/E DH C/E
0 1 2 3 4 5 n ú m e ro d e t u m o re s Discreto Moderado Intenso
Fig. 14
14
Para o parâmetro de angiogênese, a Fig. 15 mostra que houve um número total de vasos por tumor levemente mais pronunciado nos grupos DH em relação ao DC. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos.
DC C/E DH S/E DH C/E 0 10 20 30 40 50 n ú m e ro t o ta l d e v a s o s p o r tu m o r
Fig. 15
DiscussãoCom o objetivo de classificar os tumores extraídos destes camundongos fêmeas, os quais foram induzidos com o carcinógeno DMBA, observou-se que menos da
metade desses tumores eram de origem mamária, seguido de linfoma,
principalmente. Utilizando dose semelhante à desta pesquisa para o carcinógeno, um estudo com 18 camundongos mostrou que 38,9% destes desenvolveram câncer de mama, sendo que outros 16,67% dos animais desenvolveram tumores no tecido linfoide e 5,56%, no trato digestivo.24 Observa-se que o carcinógeno não é
específico para o desenvolvimento somente de câncer de mama, podendo
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trabalho. Isso pode ser explicado porque apesar de o DMBA ter tropismo pelo tecido adiposo quando administrado pela via oral, este requer uma ativação metabólica para ser absorvido no trato gastrointestinal.3,26 Sendo assim, o metabólito
carcinógeno pode ficar livre para atuar formando adutos de DNA em células que estiverem susceptíveis, além das adiposas.11,12
Com relação ao aparecimento de tumores mamários e os de outras origens entre grupos, observou-se que os animais do grupo DC S/E não desenvolveram nenhum tumor de mama, sendo excluído este grupo das análises subsequentes.
Estudos têm demonstrado a crescente utilização de neoplasias mamárias caninas como modelo de estudo para o câncer de mama humano, bem com a dificuldade de fontes atualizadas para a classificação de tumores mamários em
camundongos.1,6,20,25–27 Sugeriu-se então a classificação utilizada atualmente na Medicina Veterinária para comparar com a classificação de 1979 própria de camundongos para os tumores de mama deste estudo. Com isso, foi possível observar que o emprego da referência de Sass e Dunn para os tumores não se mostrou tão detalhada quando comparada com a referência de Cassali.9,27 Com a classificação de Sass e Dunn foi possível identificar 2 tipos histológicos, enquanto que com a classificação de Cassali obtiveram-se 7 tipos histológicos diferentes.
Na tentativa de melhorar a classificação de Sass e Dunn, o Encontro de Annapolis em 2000 sugeriu alterações em alguns tipos histológicos propostos em 1979, contudo, a literatura para classificação histológica de neoplasias mamárias em camundongos ainda se encontra escassa.6 Mais recentemente, foi observado a relação dos tipos histológicos e assinaturas gênicas do tumores mamários de camundongos com a semelhança entre o câncer de mama humano, contudo,
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somente foram descritos histologicamente o tipo escamoso, de transição epitélio mesenquimal, microacinar, papilar, sólido e adenomioepiteliona.15 Dessa maneira, a utilização de referências atualizadas oriundas da Medicina Veterinária torna-se de grande valia para o estudo morfológico dos tecidos neoplásicos em camundongos, detalhando subtipos importantes de carcinomas para o prognóstico tumoral.
Com esses subtipos observados, destacam-se o Carcinoma Micropapilar,
Carcinossarcoma e o CCE como sendo os mais agressivos dentre os carcinomas encontrados neste trabalho.
Em relação ao Carcinoma Micropapilar, esta agressividade se deve à sua natureza linfotrófica e metatastática, bem como a um comportamento clínico agressivo observado em cadelas e mulheres e a uma menor sobrevida global e livre de doença.8,22 De maneira semelhante, o Carcinossarcoma mostra-se também de pior prognóstico e menor sobrevida quando comparado aos outros carcinomas, com crescimento rápido e metástases linfogênicas, além de rápida chance de recidiva tumoral.2,8 Já o CCE mamário, o qual raramente é observado, deve ser diferenciado daquele de origem da pele e é caracterizado por apresentar uma alta infiltração no tecido mamário e induzir invasão linfática.8
Foi possível observar que a Dieta Hiperlipídica teve relação com estes tipos
histológicos mais agressivos, visto que todos os tumores mamários do grupo DH S/E desenvolveram um destes três carcinomas (100%) e o grupo DH C/E desenvolveu metade dos tumores com estes tipos histológicos também. Em contrapartida, no grupo DC C/E há menos da metade dos tumores com o diagnóstico destes tipos de carcinoma, representando desta forma diferença significativa.
Isso pode ser explicado pelo alto grau metastático desses tumores e a capacidade que a inflamação no microambiente tumoral, exacerbada por uma dieta hiperlipídica,
