Influência do grau de redução do óxido de grafeno eletroquimicamente reduzido nas suas propriedades eletroquímicas

MAIUÍ NAGAO LINDQQUER DE CAMARGO

INFLUÊNCIA DO GRAU DE REDUÇÃO DO ÓXIDO DE

GRAFENO ELETROQUIMICAMENTE REDUZIDO NAS

SUAS PROPRIEDADES ELETROQUÍMICAS

CAMPINAS 2015

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA

MAIUÍ NAGAO LINDQQUER DE CAMARGO

INFLUÊNCIA DO GRAU DE REDUÇÃO DO ÓXIDO DE GRAFENO ELETROQUIMICAMENTE REDUZIDO NAS SUAS PROPRIEDADES

ELETROQUÍMICAS

ORIENTADOR: PROF. DR. LAURO TATSUO KUBOTA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRA EM QUÍMICA NA ÁREA DE QUÍMICA ANALÍTICA.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR MAIUÍ NAGAO LINDQQUER DE CAMARGO, E ORIENTADA PELO PROF. DR. LAURO TATSUO KUBOTA.

_______________________

Assinatura do Orientador

CAMPINAS 2015

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Influence of the extent of reduction of the electrochemically reduced graphene oxide on its electrochemical properties

Palavras-chave em inglês: Graphene oxide

Electrochemical reduction

Modulation of the extent of reduction NADH

Área de concentração: Química Analítica

Titulação: Mestra em Química na área de Química Analítica

Banca examinadora: Lauro Tatsuo Kubota [Orientador]

Celio Pasquini

Fritz Cavalcante Huguenin Data de defesa: 10-02-2015

“If you are interested in something, no matter what it is, go at it at full speed ahead. Embrace it with both arms, hug it, love it and above all

become passionate about it.”

~ Roald Dahl ~

Dedico este trabalho aos meus amados pais,

Brígida e Luís Henrique, e ao meu

maravilhoso namorado, Murilo, que são

minhas fontes inesgotáveis de amor e apoio.

Ao Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota, pela oportunidade de poder desenvolver esse projeto sob sua competente orientação, pelas inúmeras palavras de incentivo e conversas construtivas, pela confiança em mim depositada, por todo o conhecimento repassado, e por me forçar a sempre buscar as respostas, fazendo com que eu me tornasse uma melhor pesquisadora a cada dia, agradeço imensamente por cada instante dessa jornada.

A todos os integrantes do grupo LEEDS, por esses dois anos de muita amizade, troca de ideias e risos. Tenho certeza que criei laços de amizade com pessoas maravilhosas que vou guardar para sempre. Em especial, quero agradecer do fundo do meu coração as minhas “mums”, Camila e Cecília, e o meu “dad”, Murilo. Vocês me guiaram nessa caminhada e esse trabalho existe por causa da ajuda de vocês, principalmente por todas as discussões dos experimentos e dos resultados obtidos, pela paciência maior que o mundo, apoio, incentivo incondicional mesmo quando eu estava descrente, pela dedicação, por sempre compartilhar comigo os seus conhecimentos, no auxílio na obtenção das imagens de MEV, de microscopia óptica, e também dos espectros de Raman e XPS, e claro, pela amizade. Agradeço ao Ronaldo, não só pela enorme ajuda durante a síntese do óxido de grafeno, mas também por todas as dicas e conselhos, sejam eles científicos ou não. Um grande obrigado a Rúbia, por ser minha companheira de sala, parceira de conversas e por sempre ouvir minhas manhas e me acalmar dizendo que “tudo vai dar certo, Mary”. A todas as minhas amigas e amigos, Emília, Cátia, Gabriela, José Tiago (Seu Zé), Glauco, Victor, Thiaguinho, Alexandre, Fabrício, José Ricardo, Fernando(s), agradeço por cada palavra de vocês, seja de conselho, de conhecimento, de discussões científicas, de amizade, e por serem pessoas tão atenciosas e divertidas, sempre dispostas a ajudar. Ao Dênio e a Viviane, meu agradecimento pelas

Vitória, pelo seu bom humor sempre, e Leandro e Leopoldo, por sempre começarem um ótimo papo sobre Pokémon nas horas de descontração! E finalmente, agradeço ao técnico Humberto por me auxiliar em todos os momentos que eu precisei, mesmo em procedimentos simples como calibrar um pHmetro. Hoje posso dizer com toda certeza que a família LEEDS faz parte de mim e sei que o nosso lema “vem quem guenta!” ficará para sempre!

Aos meus queridos pais, Brígida e Luís Henrique, por sempre acreditarem em mim e por me incentivarem a sempre buscar os meus sonhos, não importando quão distantes eles estivessem, quero agradecer de coração, vocês são os meus exemplos de vida. A todos da minha família, pelo apoio e carinho sempre, vocês são as minhas fortalezas. Em especial, quero agradecer o Tio Chico, responsável por ter me levado à UNICAMP pela primeira vez e me incentivado a fazer o Mestrado no IQ. A todas as minhas amigas, químicas e não-químicas, em especial a Tamiris e Alinne, que sempre me inspiraram e me deram forças para continuar caminhando, deixo aqui meu sincero agradecimento.

Ao meu querido Murilo, pela compreensão e apoio sempre, por me incentivar e fazer com que minha chama de paixão pela ciência continuasse sempre viva, pela imensa paciência com os meus “surtos”, pelas noites viradas discutindo os problemas e as soluções desse projeto e por ser uma parte tão fundamental da minha vida, já não me restam mais palavras para te agradecer o suficiente.

Aos professores membros da banca do exame de qualificação, Prof. Dr. Celio Pasquini e Prof. Dr. Pablo Sebastián Fernández, agradeço pela atenção e pelas valiosas contribuições. Aos professores componentes da banca da defesa de mestrado, Prof. Dr. Fritz Cavalcante Huguenin e Prof. Dr. Celio Pasquini, agradeço

conhecimentos.

A todos os funcionários do Instituto de Química da UNICAMP que, de uma forma ou de outra, auxiliaram para que esse projeto fosse finalizado. Gostaria de agradecer a Izabel, Gabriela e Miguel da secretaria da CPG, por sempre estarem dispostos a esclarecer todas as dúvidas que surgiram durante o programa. E a todos os funcionários tanto da vidraria pelos excelentes serviços prestados, quanto da vigilância, em especial ao Sr. Nestor, por sempre zelarem pela nossa segurança dentro do IQ.

Ao Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano) pela disponibilidade em utilizar o microscópio eletrônico de varredura e XPS. Em especial a Dr. Cristiane A. Silva por todo o auxílio na realização das medidas de XPS.

A todos do laboratório de eletroquímica do Prof. Dr. Fritz Cavalcante Huguenin (FFCLRP – USP), por terem me ensinado e auxiliado durante a minha primeira caminhada no mundo da pesquisa e consequentemente terem facilitado minha jornada na pós-graduação. Muito do que eu sei hoje, eu devo a vocês.

A todos os professores e professoras do Departamento de Química da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, que fizeram parte da minha formação, agradeço por terem me aberto os olhos para o fantástico mundo da Química.

A agência financiadora, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de estudo concedida.

INFORMAÇÕES PESSOAIS

Nome: Maiuí Nagao Lindqquer de Camargo Naturalidade: Ribeirão Preto/SP

Data de Nascimento: 12/11/1990

FORMAÇÃO ACADÊMICA

 Mestrado em Química (08/2012 – 02/2015)

Título da dissertação: Influência do grau de redução do óxido de grafeno eletroquimicamente reduzido nas suas propriedades eletroquímica Orientador: Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota

Bolsista da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Departamento de Química Analítica – Instituto de Química – Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) – SP

 Graduação em Química Bacharelado (03/2008 – 07/2012)

Departamento de Química – Faculdade de Filosofia, Ciência e Letras de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo (USP) – SP

Participação em projetos de pesquisa

 Iniciação Científica (07/2009 – 07/2012)

Título do projeto: Utilização de nanopartículas de carbono como mediadores em biossensores enzimáticos

Orientador: Prof. Dr. Fritz Cavalcante Huguenin

Bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Departamento de Química – Faculdade de Filosofia, Ciência e Letras de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo (USP) – SP

Artigos publicados/aceitos para publicação

Título: Electrochemical oxidation of glassy carbon leads to a similar

electrochemical response of graphene oxide prepared by Tour or Hummers routes

(publicado)

Autores: Murilo Santhiago, Camila M. Maroneze, Cecília C. C. Silva, Maiuí N. L. de Camargo, Lauro T. Kubota

Revista: ChemElectroChem – DOI: 10.1002/celc.201402387

Título: Effects of self-assembled materials prepared from V2O5 for lithium ion

electroinsertion (publicado)

Autores: Nelson A. Galiote, Maiuí N. L. Camargo, Rodrigo M. Iost, Frank Crespilho, Fritz Huguenin

INFLUÊNCIA DO GRAU DE REDUÇÃO DO ÓXIDO DE GRAFENO ELETROQUIMICAMENTE REDUZIDO NAS SUAS PROPRIEDADES ELETROQUÍMICAS

Este trabalho visa demonstrar como o grau de redução do óxido de grafeno eletroquimicamente reduzido (ERGO) pode ser modulado dependendo das condições experimentais utilizadas para se fazer a redução eletroquímica, e como ele influencia nas propriedades eletroquímicas do material final. Esta influência pôde ser constatada por medidas eletroquímicas, de espectroscopia Raman e de fotoelétrons excitados por raios-X (XPS). Através de experimentos eletroquímicos feitos na presença da sonda de ferri/ferrocianeto de potássio, foi possível demonstrar que os eletrodos de ouro modificados com os ERGOs com maiores graus de redução se comportam eletroquimicamente de maneira similar ao não modificado, e portanto, a redução dos grupos oxigenados da superfície do material é importante para que essa similaridade seja atingida. No entanto, essa sonda não permite monitorar o balanço entre grupos oxidados e reduzidos e para fazer isso, foi escolhida uma sonda

eletroativa sensível aos grupos oxigenados. Análises feitas na presença de β-nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) demonstraram que grupos funcionais

oxigenados essenciais para a oxidação dessa espécie estavam diminuindo na superfície do material com o aumento do grau de redução deste. Os espectros de Raman e de XPS também confirmaram essa informação. Além disso, a capacidade adsortiva do ERGO foi testada utilizando o corante Azul de Meldola. Novamente, o grau de redução do ERGO teve papel fundamental, uma vez que interações π-π ou eletrostáticas podem ser favorecidas entre o ERGO e o corante, dependendo do grau de redução do primeiro, implicando em propriedades distintas dos materiais frente a oxidação de NADH.

INFLUENCE OF THE EXTENT OF REDUCTION OF THE ELECTROCHEMICALLY REDUCED GRAPHENE OXIDE ON ITS ELECTROCHEMICAL PROPERTIES

This work aims to demonstrate how the extent of reduction of the electrochemically reduced graphene oxide (ERGO) can be modulated depending on the experimental conditions used for performing the electrochemical reduction, and how it influences on the electrochemical properties of the final material. This influence can be verified by electrochemical, Raman spectroscopy and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) measurements. By means of electrochemical experiments carried out in the presence of the ferro/ferricyanide probe, it was possible to demonstrate that the gold electrodes modified with the ERGOs with higher extents of reduction behave electrochemically in a similar manner to the non-modified, and therefore, the reduction of the oxygenated groups on the surface of the material is important for this similarity to be reached. However, this probe does not permit the monitoring of the balance between oxidized and reduced groups and to do so, an electroactive probe sensitive to the oxygenated groups was chosen. Analyses done in the presence of β-nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) enabled the conclusion that the oxygenated functional groups essential for the oxidation of this species decreased on the surface of the material with the increase of the extent of reduction. The Raman and XPS spectra also confirmed this information. Apart from this, the adsorptive capacity of the ERGO was tested using the dye Meldola's Blue. Once again, the extent of reduction of the ERGO had a fundamental role, since π-π or electrostatic interactions can be favoured to occur between the ERGO and the dye, depending on the extent of reduction of the former, leading to distinct properties of the materials regarding NADH oxidation.

LISTA DE ABREVIATURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÃO

1.3. Obtenção pelo método da Scotch-tape e por CVD

2. ÓXIDO DE GRAFENO

2.1. Estrutura

2.2. Obtenção pelo método de Hummers 2.3. Aplicações para o óxido de grafeno

3. ÓXIDO DE GRAFENO REDUZIDO

3.1. Estrutura

3.2. Obtenção por redução química, térmica e eletroquímica

4. MODULAÇÃO DO GRAU DE REDUÇÃO DO ERGO

5. MONITORAMENTO VIA ELETROQUÍMICA DO GRAU DE REDUÇÃO DO ERGO

5.1. β-nicotinamida adenina dinucleotídeo 5.2. Oxidação de NADH

xxiii

xxvii

xxix

1

6.1. Azul de Meldola – Estrutura, Aplicações e Detecção de NADH 6.2. Importância das interações eletrostáticas e π-π

OBJETIVOS

1. GERAL

2. ESPECÍFICOS

MATERIAIS, EQUIPAMENTOS E MÉTODOS

1. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS 2. SÍNTESE DO ÓXIDO DE GRAFENO

3. MODIFICAÇÃO DO ELETRODO DE Au E REDUÇÃO ELETROQUÍMICA DO GO

4. ANÁLISE DOS Au-ERGOs EM FERRI/FERROCIANETO 5. ANÁLISE DOS Au-ERGOs EM NADH

6. DETERMINAÇÃO DA ÁREA ELETROATIVA APROXIMADA DE ALGUNS Au-ERGOs

7. ANÁLISE DA ESTABILIDADE DO Au-ERGO*

8. MODIFICAÇÃO DE Au-ERGOs COM AZUL DE MELDOLA 9. OXIDAÇÃO DE NADH UTILIZANDO Au-ERGOs/AM

10. ANÁLISE DA ESTABILIDADE DO Au-ERGO/AM* 11. CONSTRUÇÃO DA CURVA ANALÍTICA

18 20

21

25

PARTE I - CARACTERIZAÇÃO DO ÓXIDO DE GRAFENO ELETROQUIMICAMENTE REDUZIDO

1. CARACTERIZAÇÃO DO GO POR MICROSCOPIA ÓPTICA

2. CARACTERIZAÇÃO DO GO POR MICROSCOPIA

ELETRÔNICA DE VARREDURA 3. ESTUDOS ELETROQUÍMICOS

3.1. Redução do GO via voltametria cíclica 3.1.1. Condições experimentais utilizadas 3.1.2. Caracterização visual

3.1.3. Caracterização dos Au-ERGOs obtidos por voltametria cíclica empregando a sonda ferri/ferro

3.1.4. Caracterização dos Au-ERGOs obtidos por voltametria cíclica empregando a espécie eletroativa NADH

3.2. Redução do GO via cronoamperometria 3.2.1. Condições experimentais utilizadas 3.2.2. Caracterização visual

3.2.3. Caracterização dos Au-ERGOs obtidos por cronoamperometria empregando a sonda ferri/ferro

3.2.4. Caracterização dos Au-ERGOs obtidos por cronoamperometria empregando a espécie eletroativa NADH 3.3. Estudo de variação da velocidade de varredura (ν) utilizando o

Au-ERGO*

3.4. Estudo de Estabilidade do Au-ERGO*

3.5. Determinação da Ae aproximada de alguns Au-ERGOs

37 39 40 41 41 41 43 44 47 52 52 54 54 57 60 62 66

5. ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA DE FOTOELÉTRONS EXCITADOS POR RAIOS-X

PARTE II - EMPREGO DO ÓXIDO DE GRAFENO ELETROQUIMICAMENTE REDUZIDO COMO PLATAFORMA PARA IMOBILIZAÇÃO DE AZUL DE MELDOLA

1. IMOBILIZAÇÃO DE AZUL DE MELDOLA SOBRE Au-ERGO 2. ESTUDO DA ESTABILIDADE DO Au-ERGO/AM*

3. CURVA ANALÍTICA

CONCLUSÕES GERAIS

1. CONCLUSÕES DA PARTE I – CARACTERIZAÇÃO DO

ÓXIDO DE GRAFENO ELETROQUIMICAMENTE

REDUZIDO

2. CONCLUSÕES DA PARTE II - EMPREGO DO ÓXIDO DE GRAFENO ELETROQUIMICAMENTE REDUZIDO COMO PLATAFORMA PARA IMOBILIZAÇÃO DE AZUL DE MELDOLA

PERSPECTIVAS

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

89

97

101

Ae área eletroativa

Ag/AgCl eletrodo de referência de Ag/AgCl em KCl saturado

AM Azul de Meldola

Au eletrodo de ouro policristalino sem modificação

Au-ERGO eletrodo de ouro policristalino modificado com óxido de grafeno eletroquimicamente reduzido

Au-ERGO* eletrodo de ouro policristalino modificado com óxido de grafeno eletroquimicamente reduzido por cronoamperometria (–1,5 V por 20 s)

Au-ERGO** eletrodo de ouro policristalino modificado com óxido de grafeno eletroquimicamente reduzido por cronoamperometria (–1,5 V por 100 s)

Au-ERGO/AM eletrodo de ouro policristalino modificado com azul de meldola imobilizado sobre óxido de grafeno eletroquimicamente reduzido

Au-ERGO/AM* Au-ERGO/AM que apresentou a melhor sensibilidade frente à

NADH (obtido por cronoamperometria a –1,5 V por 60 s, utilizando a solução de 40 µmol/L de AM para realizar a imobilização deste)

Au-GO eletrodo de ouro policristalino modificado com óxido de grafeno

C* concentração da espécie

cm centímetro

C–C ligação simples entre dois átomos de carbono

C=C ligação dupla entre dois átomos de carbono

C–O ligação simples entre um átomo de carbono e um de oxigênio

C=O ligação dupla entre um átomo de carbono e um de oxigênio

CRGO óxido de grafeno quimicamente reduzido

CVD deposição química em fase vapor

D coeficiente de difusão da espécie

2D sistemas bidimensionais

3D sistemas tridimensionais

E potencial

ΔEp separação entre os potenciais de pico anódico e catódico

ERGO óxido de grafeno eletroquimicamente reduzido

eV elétron volt

ferri/ferro ferricianeto/ferrocianeto de potássio

g grama

GFOs grupos funcionais oxigenados

ip corrente de pico

ipa corrente de pico anódica

ipc corrente de pico catódica

ipaAM ipa do AM

Δi ipa do voltamograma na presença de NADH – ipa do voltamograma

na ausência de NADH

ID/IG razão das intensidades das bandas D e G do espectro Raman

L litro log logaritmo MΩ megaohm mA miliampere mg/mL miligrama/mililitro mmol/L milimol/litro mol/L mol/litro mV milivolt mV/s milivolt/segundo

n número de elétrons envolvidos em uma reação redox

NADH β-nicotinamida adenina dinucleotídeo

Q quinona

QH2 hidroquinona

Rtc resistência a transferência de carga

rpm rotação por minuto

s segundo

sp2 _{hibridização sp}2

sp3 hibridização sp3

Si/SiO2 lâmina de silício com uma camada de SiO2 (300 nm)

t tempo

TRGO óxido de grafeno termicamente reduzido

µA microampere µL microlitro µm micrometro µmol/L micromol/litro V volt ν velocidade de varredura

ν1/2 _{raiz quadrada da velocidade de varredura}

Tabela 1:Resumo dos valores de ipa, ipc e ΔEp encontrados para o Au e para

cada Au-ERGO obtido por voltametria cíclica utilizando as diferentes faixas de potencial: a) de 0 V até –1,1 V; b) de 0 V até –1,3 V; c) e de 0 V até –1,5 V.

Tabela 2: Valores da área eletroativa aproximada obtidos para cada

Au-ERGO da Figura 29.

Tabela 3: Resumo dos valores de Δi eipaAM obtidos a partir da Figura 32.

46

70

Figura 1: a) Estrutura idealizada de uma folha de grafeno; b) Ilustração de folhas de grafeno empacotando por meio de forças intermoleculares. [12] Figura 2: Ilustração do método da Scotch-tape para obtenção de grafeno a partir de grafite. a) Um pedaço de fita Scotch é colocado sobre grafite; b) ao retirar a fita, ocorre a clivagem de algumas camadas de grafite; c) essas camadas são transferidas para um substrato de interesse ao pressionar a fita contra este; d) retira-se a fita e uma fina camada de grafite fica aderida no substrato; ao se pressionar e retirar uma parte não utilizada da fita contra o substrato por consecutivas vezes, cada vez mais é feita a exfoliação do grafite até chegar ao grafeno. [19]

Figura 3: Exemplos de alguns modelos propostos ao longo dos anos para elucidar a estrutura do GO. (Modificado de [28] e [33])

Figura 4: Ilustração dos estágios que ocorrem durante a oxidação de grafite até a consequente formação de óxido de grafeno, juntamente com as respectivas imagens de microscopia óptica de cada etapa. (Modificado de [29])

Figura 5: Ilustração de algumas etapas partindo do grafite até chegar ao óxido de grafeno reduzido. [33].

Figura 6: Reação de oxirredução do NADH/NAD+ [58].

Figura 7: Reação entre um grupo quinona e NADH, gerando hidroquinona e NAD+_{. Somente a parte eletroativa do NADH/NAD}+ _{está demonstrada e}

o grupo R. [69] 3 5 7 9 13 15 16

QH2 e consequente restauração do grupo Q na superfície do eletrodo. [69]

Figura 9: Fórmula estrutural do corante Azul de Meldola. (Modificado de [71]).

Figura 10: Ilustração das etapas que ocorrem durante a oxidação de NADH por meio do mediador AM, imobilizado na superfície do eletrodo. (Modificado de [80])

Figura 11: Imagens de microscopia óptica da superfície de um substrato de Si/SiO2 modificado com GO em diferentes regiões, a) na borda

(amplificação 10x) e b) no centro do filme (amplificação 100x).

Figura 12: Micrografias do GO depositado sobre telas de transmissão de cobre, no modo de iluminação a) de campo escuro e b) de campo claro. Figura 13: a) Voltamogramas do primeiro ciclo de voltametria cíclica obtidas em diferentes faixas de potencial: de 0 V até –1,1 V (–), de 0 V até –1,3 V (–), e de 0 V até –1,5 V (–), durante a redução voltamétrica de

Au-GO para Au-ERGO; b) voltamogramas obtidos na faixa de potencial de

0 V até –1,5 V durante 12 ciclos, destacando-se o primeiro (–) e o último (–).

Figura 14: Fotografias da superfície de alguns dos Au-ERGOs obtidos por reduções voltamétricas, tiradas com máquina digital.

Figura 15: Voltamogramas cíclicos obtidos na presença de ferri/ferro para os Au-ERGOs gerados pelo tratamento voltamétrico na faixa de potencial de 0 V até –1,1 V (–), de 0 V até –1,3 V (–), e de 0 V até –1,5 V (–), após

a) 1 ciclo, b) 2 ciclos, c) 7 ciclos e d) 12 ciclos. O comportamento do 18 19 39 40 42 43 44

todas.

Figura 16: Voltametrias cíclicas obtidas na presença (–) e na ausência (–) de 1 mmol/L de NADH, para a) Au-ERGO, b) Au-GO e c) Au.

Figura 17: Voltametrias cíclicas obtidas na ausência (–) e na presença (colorido) de 1 mmol/L de NADH do a) Au-ERGO gerado com dois ciclos de 0 V até –1,1 V (n=3); b) Au-ERGO gerado com dois ciclos de 0 V até –1,3 V (n=5); e c) Au-ERGO gerado com dois ciclos de 0 V até –1,5 V (n=3). Figura 18: Gráfico de barras com as correntes de oxidação (e respectivos

desvios padrões) obtidas na oxidação de 1 mmol/L de NADH pelos

Au-ERGOs obtidos pela redução de 0 V até –1,5 V, com 1 ciclo (–), 2 ciclos (–), 7 ciclos (–) e 12 ciclos (–).

Figura 19: Cronoamperogramas obtidos a –1,5 V para se fazer a redução de Au-GO durante: 1 s (–); 5 s (–); 10 s (–); 20 s (–); 30 s (–); 45 s (–); e 60 s (–).

Figura 20: Fotografias da superfície de alguns dos Au-ERGOs obtidos por reduções cronoamperométricas e também da superfície do Au-GO.

Figura 21: Voltamogramas cíclicos obtidos na presença de ferri/ferro para cada Au-ERGO originado pela redução cronoamperométrica em tempos

diferentes: 1 s (–); 2 s (–); 5 s (–); 10 s (–); 20 s (–); 30 s (–); 45 s (–); 60 s (–); e 100 s (–). Au = (–)

Figura 22: Gráfico com as informações obtidas a partir da Figura 21 para cada Au-ERGO produzido por cronoamperometria em diferentes tempos.

48 50 51 53 54 55 56

oxidação, e de ΔEp (- - -) encontrados para o Au na presença de ferri/ferro. Figura 23: Voltametrias cíclicas obtidas na ausência (–) e na presença (–)

de 1 mmol/L de NADH, para o Au-ERGO reduzido por 20 s, a –1,5 V. Figura 24: Gráfico de barras construído a partir da corrente anódica obtida na oxidação de 1 mmol/L de NADH pelos Au-ERGOs preparados pela redução cronoamperométrica, mantendo o potencial fixo em –1,5 V por 1 s (–); 5 s (–); 10 s (–); 20 s (–); 30 s (–); 45 s (–); e 60 s (–).

Figura 25: a) Voltamogramas obtidos na presença da sonda ferri/ferro para

o Au-ERGO* variando a velocidade de varredura entre 1 e 100 mV/s. b) Gráfico das correntes de pico de oxidação ( | ) e de redução ( | ) em

função das velocidades de varredura (–) e de suas raízes quadradas (–). O gráfico inserido mostra a regressão linear dos pontos. c) Gráfico do logaritmo das correntes de pico de oxidação em função do logaritmo da velocidade de varredura ( ) e sua respectiva regressão linear (–).

Figura 26: Gráfico das correntes de pico de oxidação (círculos) e redução (quadrados) de voltamogramas obtidos com o Au-ERGO* na presença de uma solução de ferri/ferro após executar ensaios para analisar sua estabilidade frente a alguns procedimentos comuns de manuseio do eletrodo após o tratamento cronoamperométrico de redução (–); após o levantamento/imersão no eletrólito (–); após imersão e agitação mecânica em H2O deionizada por 30 s (–); após esguichar H2O deionizada diretamente

no Au-ERGO* por meio de uma pisseta (–); e após secar a superfície com fluxo de nitrogênio (–).

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feito 2 (–); 52 (–); 102 (–); 152 (–); e 202 (–) ciclos na presença da sonda ferri/ferro. b) Gráfico da resposta relativa da ipa considerando o valor obtido

para o 2º ciclo como 100 % (n=3).

Figura 28: Estudo de variação da velocidade de varredura (10 a 100 mV/s), na presença de ferri/ferro, o (A) eletrodo de ouro sem modificação; e os

Au-ERGOs fabricados por (B) voltametria cíclica a) de 0 até –1,1 V

(1 ciclo); b)de 0 até –1,5 V (1 ciclo); e c) de 0 até –1,5 V (12 ciclos); e por (C) cronoamperometria aplicando um potencial fixo de –1,5 V por a) 1 s; b) 20 s; e c) 60 s.

Figura 29: Voltamogramas obtidos na presença de ferri/ferro para

Au-ERGOs obtidos por a) voltametria cíclica de 0 até –1,1 V (1 ciclo) (–);

de 0 até –1,5 V (1 ciclo) (–); e de 0 até –1,5 V (12 ciclos) (–); e por b) cronoamperometria aplicando um potencial fixo de –1,5 V por 1 s (–);

20 s (–); e 60 s (–). Au (–) (ν = 30 mV/s)

Figura 30: a) Espectros de espectroscopia Raman, em ordem de cima para baixo: do Au-GO (–); do Au-ERGO obtido com cronoamperometria por 1 s

a –1,5 V, (–); do Au-ERGO obtido com voltametria cíclica de 0 V até –1,5 V por 1 ciclo (–); do Au-ERGO*, obtido com cronoamperometria por

20 s a –1,5 V, (–); e do Au-ERGO obtido com voltametria cíclica de 0 V até –1,5 V por 12 ciclos (–). Os gráficos inseridos mostram uma amplificação da região de intensidade máxima das bandas. b) Respectivos voltamogramas cíclicos de cada um dos eletrodos modificados da Fig. 30a), na presença da sonda ferri/ferro.

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68

respectivos ajustes e porcentagens dos grupos químicos do a) Au-GO, b) Au-ERGO* e c) Au-ERGO**.

Figura 32: Voltamogramas obtidos na ausência (–) e na presença (–) de 1 mmol/L de NADH utilizando o Au-ERGO/AM originado por a) 1 s e AM = 10 µmol/L; b) 60 s e AM = 10 µmol/L; c) 1 s e AM = 40 µmol/L; e d) 60 s e AM = 40 µmol/L.

Figura 33: a) Perfil voltamétrico para alguns ciclos realizados durante o experimento de estabilidade do Au-ERGO/AM* frente a diversos ciclos ao longo de 8 dias. No primeiro dia foram realizados 100 ciclos e nos seguintes 7 dias, 50 ciclos. b) Gráfico da resposta relativa da ipa considerando o valor

obtido para o 5º ciclo como 100 %.

Figura 34: a) Cronoamperogramas (feitos mantendo o potencial fixo em

–96 mV) obtidos na ausência (–) e na presença de 130 µmol/L (–); 246 µmol/L (–); 362 µmol/L (–); 500 µmol/L (–); 791 µmol/L (–); e 1000 µmol/L (–) de NADH. b) Curva analítica construída com os valores de i da Figura 34a), e sua respectiva regressão linear (–).

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84

1. GRAFENO

1.1. Estrutura

O grafeno é um material a base de carbono que tem sido bastante estudado e utilizado em diversas áreas dentro da Química e da Física, principalmente na Eletroquímica [1-8]. A estrutura cristalina idealizada do grafeno é completamente bidimensional (2D) e compreende uma única camada de átomos de carbono com hibridização sp2_{, ligados covalentemente para formar uma estrutura plana hexagonal}

que pode ser vista como sendo uma enorme “molécula” aromática policíclica [9-11], tal como ilustrado na Figura 1a). Sendo assim, é possível perceber que outros materiais também a base de carbono, mas com diferentes dimensionalidades, possuem o grafeno em sua estrutura [4,10-12], por exemplo, o grafite, que é um material tridimensional (3D), consiste em diversas folhas de grafeno empacotadas umas sobre as outras (Figura 1b)), mantidas unidas através de forças de van der Waals [12].

Figura 1: a) Estrutura idealizada de uma folha de grafeno; b) Ilustração de folhas de grafeno empacotando por meio de forças intermoleculares. [12]

1.2. Propriedades

A estrutura do grafeno é responsável pelas suas propriedades, tais como alta flexibilidade, elevada condutividade elétrica e térmica, impermeabilidade a gases, transparência óptica e elevada área superficial [1,9], entre outras. Devido a essas características, o grafeno se tornou um material promissor para ser aplicado nas áreas de eletroquímica (sensores, biossensores e geração/armazenamento de energia) [5,13-14], eletrônica (transístores, aparelhos flexíveis e telas touch screen) [9,15-16], fotônica (fotodetectores, moduladores ópticos) [16-17] e até no processo de produção de materiais como tintas, em que ele agirá como uma barreira para evitar corrosões [9,15-16].

1.3. Obtenção pelo método da Scotch-tape e por CVD

Folhas individuais e de poucas camadas de grafeno foram isoladas pela primeira vez em 2004 por K. Novoselov [18] através de um método de clivagem bastante simples conhecido como “método da Scotch-tape”, onde faz-se a exfoliação mecânica de flocos de grafite. Assim, finas camadas de grafite são extraídas com o auxílio da fita Scotch, mecanismo este demonstrado no esquema da Figura 2, sendo possível a obtenção de folhas de grafeno, que então são transferidas para outros substratos. Desde o isolamento do grafeno, outros materiais 2D, que antes eram considerados termodinamicamente instáveis e impossíveis de existirem nessa dimensionalidade a condições ambiente [19-22] foram obtidos, por exemplo, folhas únicas e bidimensionais de BN, NbSe2 e MoS2 [21]. Sendo assim, é bem provável

que qualquer material 3D que possua estrutura lamelar possa ser exfoliado para a obtenção de suas formas bidimensionais de camada única.

Figura 2: Ilustração do método da Scotch-tape para obtenção de grafeno a partir de grafite. a) Um pedaço de fita Scotch é colocado sobre grafite; b) ao retirar a fita, ocorre a clivagem de algumas camadas de grafite; c) essas camadas são transferidas para um substrato de interesse ao pressionar a fita contra este; d) retira-se a fita e uma fina camada de grafite fica aderida no substrato; ao se pressionar e retirar uma parte não utilizada da fita contra o substrato por consecutivas vezes, cada vez mais é feita a exfoliação do grafite até chegar ao grafeno. [19]

Apesar de possibilitar a obtenção de grafeno de elevada qualidade cristalina, o método da Scotch-tape não permite a fabricação em grande escala e nem o controle de tamanho das folhas. Uma alternativa consiste na utilização do processo de deposição química em fase vapor (CVD, do inglês chemical vapor deposition) para crescer folhas de grafeno sobre um metal de transição que age como substrato catalítico [23-25], comumente níquel ou cobre. Neste método, aquece-se uma fonte de carbono, geralmente gás metano, a temperaturas elevadas (1000°C) e em atmosfera de argônio e hidrogênio. A exposição do substrato catalítico metálico a essa mistura em fluxo faz com que inicie-se o processo de nucleação de “ilhas de grafeno” sobre o substrato. À medida que se aumentam os tamanhos das folhas de grafeno, ocorre a coalescência destas, formando uma grande folha. Assim, é possível a obtenção de folhas de grafeno com dimensões na ordem de polegadas, ou seja, bem maiores do que as obtidas pelo método da Scotch-tape.

No entanto, quando se visa aplicações eletroquímicas, ambas as técnicas de obtenção do grafeno levam a materiais de difícil manipulação e transferência para a superfície do eletrodo. Nesse sentido, o uso de outros nanomateriais a base de grafeno tem recebido bastante atenção dos eletroquímicos, como por exemplo, o óxido de grafeno (GO), que é facilmente disperso em água, facilitando o seu manuseio e transferência para a superfície de interesse [26].

2. ÓXIDO DE GRAFENO

2.1. Estrutura

O óxido de grafeno pode ser visto como sendo uma folha de grafeno com vários grupos funcionais oxigenados (GFOs) ligados covalentemente na sua superfície [27-30], os quais são os responsáveis pela hidrofilicidade do material.

Diferentemente do grafeno, que só foi isolado recentemente, os primeiros estudos relacionados ao GO datam dos anos de 1840 [31], com os trabalhos do cientista alemão Schafhaeutl, que estudou a intercalação e exfoliação das camadas de grafite com moléculas de ácido sulfúrico e nítrico. Em 1859, quando o Prof. Brodie estudava as propriedades do grafite, ele fez a mistura deste com HNO3

fumegante e KClO3 [32]. Com isso, não só ele conseguiu fazer a exfoliação do

grafite, mas também a oxidação química das superfícies, resultando no óxido de grafite e bem provavelmente no óxido de grafeno (o qual não foi caracterizado).

Apesar de vários pesquisadores terem proposto modelos diferentes para elucidar a estrutura do GO, alguns dos quais estão ilustrados na Figura 3, esse assunto

gera debate até hoje, e um dos principais motivos é que diferentes rotas de síntese resultam em GOs não só com diferentes tipos de GFOs, mas também com diferentes proporcionalidades entre eles [28,30]. No entanto, o modelo que é atualmente mais aceito e citado é o que foi proposto por Lerf-Klinowski em 1996, que considera a presença de grupos álcoois e epóxidos, além de grupos carboxilas (não mostrados na ilustração da Figura 3).

Figura 3: Exemplos de alguns modelos propostos ao longo dos anos para elucidar a estrutura do GO. (Modificado de [28] e [33])

2.2. Obtenção pelo método de Hummers

Existem várias rotas de síntese do GO, porém a mais utilizada é o método de

Hummers, que se baseia na reação entre flocos de grafite com uma mistura de

permanganato de potássio (KMnO4) e ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) durante

um longo período de tempo [34]. O H2SO4 auxilia na exfoliação do grafite, atuando

como agente de intercalação nas suas camadas, facilitando a ação do agente oxidante [29]. As equações a seguir (equação 1 e 2) descrevem a formação do Mn2O7, que é

sugerido como sendo o agente oxidante, a partir dos reagentes iniciais [28,35].

KMnO4 + 3 H2SO4  K+ + MnO3+ + H3O+ + 3 HSO4- (1)

MnO3+ + MnO4-  Mn2O7 (2)

Finalmente, ao término da oxidação, a adição de água é feita, levando a separação das camadas e consequente formação das folhas de GO. Após essa etapa, diversas lavagens são feitas para retirar o excesso tanto do agente oxidante, quanto do ácido do meio reacional, e deixar o GO disperso em água, por exemplo. Um esquema ilustrativo das etapas que ocorrem durante a oxidação de grafite até a formação de GO pode ser visualizado na Figura 4.

Figura 4: Ilustração dos estágios que ocorrem durante a oxidação de grafite até a consequente formação de óxido de grafeno, juntamente com as respectivas imagens de microscopia óptica de cada etapa. (Modificado de [29])

2.3. Aplicações para o óxido de grafeno

O GO apresenta a vantagem sobre o grafeno de poder ser quimicamente funcionalizado com facilidade. Por exemplo, grupos epóxidos na superfície do GO são suscetíveis a ataques de substituição nucleofílica por grupos aminas (-NH2),

moléculas orgânicas, polímeros e até biomoléculas que possuem esse grupo funcional [27]. Os objetivos vão desde aumentar a solubilidade do compósito híbrido em algum determinado meio, melhorar a estabilidade e sensibilidade do compósito, até imobilizar grupos fotoativos ou eletroativos de interesse. Uma outra alternativa é fazer a imobilização não-covalente de moléculas aromáticas, por meio da formação de ligações intermoleculares entre estas e a superfície do GO, principalmente interações eletrostáticas, π-π e hidrofóbicas [27].

Além disso, a elevada área superficial do GO abre caminho para a sua funcionalização com nanopartículas metálicas [36] (Pt [37-38], Au [39], Ru [40], Ni [41]) ou de óxidos metálicos (TiO2 [42], ZnO [43], NiO [41], SiO2 [44]). Estes

compósitos GO-nanopartículas podem ser empregados em células a combustível ou baterias de íons lítio, por exemplo. Além dessas nanopartículas, os quantum dots também estão sendo utilizados para fazer a funcionalização do GO e grafeno, visando aplicações fotoeletroquímicas [45-46].

No entanto, a maior desvantagem do GO, principalmente como material para modificação de superfícies de eletrodos, é a sua elevada resistência elétrica. Ao contrário do grafeno, que possui somente carbonos sp2 conjugados em sua estrutura (os elétrons π conjugados são os responsáveis pela condutividade do material), o GO possui a sua superfície repleta de GFOs covalentemente ligados e defeitos na estrutura, que acabam interrompendo a conjugação, fazendo surgir domínios com carbonos sp3 e diminuindo a condutividade elétrica do GO em relação ao grafeno. Com o intuito de se contornar este problema, normalmente é realizada a redução do GO para óxido de grafeno reduzido (RGO) [47].

3. ÓXIDO DE GRAFENO REDUZIDO

3.1. Estrutura

O óxido de grafeno reduzido consiste simplesmente no material que é obtido após se fazer a redução do óxido de grafeno. Em contraste ao GO, o RGO pode ter a sua estrutura de carbonos sp2 conjugados restaurada em grande parte dependendo das condições experimentais aplicadas para realizar a redução, aumentando assim, a sua condutividade eletrônica. Vale ressaltar que por mais que o GO seja reduzido utilizando-se uma ou multitécnicas, até o momento não foi possível se obter uma amostra de RGO que tivesse as propriedades idênticas ao do grafeno, uma vez que sempre restam GFOs residuais e defeitos na folha devido a intensa oxidação durante a exfoliação química do grafite que não são removidos, acarretando assim em diferenças estruturais e eletrônicas [47].

Algumas observações experimentais simples para indicar a transição entre o óxido de grafeno e o óxido de grafeno reduzido são a mudança na coloração do material, de marrom para preto, e o aumento da hidrofobicidade e a consequente agregação das folhas [33,47-48]. Além disso, ocorre um aumento da razão C/O devido a eliminação dos GFOs da superfície das folhas do RGO, e uma diminuição da resistência elétrica do material [33,48].

3.2. Obtenção por redução química, térmica e eletroquímica

O RGO pode ser obtido principalmente pela redução térmica, pela ação de agentes redutores químicos ou redução eletroquímica [37]. O óxido de grafeno quimicamente reduzido (CRGO) é obtido com o uso de agentes redutores conhecidos

da química sintética. Alguns exemplos incluem a hidrazina (N2H4), borohidreto de

sódio (NaBH4), hidroxilamina (NH2OH), ácido iodídrico (HI), hidreto de alumínio e

lítio (LiAlH4), ácido ascórbico, hidroquinonas e uréia, entre outros [33, 49-50].

Já para se obter o óxido de grafeno termicamente reduzido (TRGO), o GO é aquecido a temperaturas bastante elevadas (> 700°C), ou a temperaturas mais baixas (~300°C) na presença de uma atmosfera de nitrogênio ou de argônio [47,51-52]. Dessa maneira, alguns GFOs podem ser eliminados na forma de CO e/ou CO2,

restaurando alguns domínios sp2 nas folhas.

Por último, o óxido de grafeno eletroquimicamente reduzido (ERGO) pode ser obtido pela aplicação de um determinado potencial no GO por meio das técnicas de voltametria ou cronoamperometria sob diferentes condições experimentais [47,53-55]. Estes procedimentos podem ser feitos após a modificação da superfície de um eletrodo com uma certa quantidade de óxido de grafeno ou com este livre na solução do eletrólito [55].

Uma ilustração das etapas mais comuns executadas partindo do grafite até chegar ao óxido de grafeno reduzido está representada na Figura 5.

Figura 5: Ilustração de algumas etapas partindo do grafite até chegar ao óxido de grafeno reduzido. [33].

4. MODULAÇÃO DO GRAU DE REDUÇÃO DO ERGO

Dentre as técnicas de redução do GO, a eletroquímica é a mais utilizada quando se visa aplicações nesta área, já que uma vez reduzido para ERGO, este já estará na superfície do eletrodo, pronto para ser utilizado. Além disso, a redução eletroquímica do GO permite a modulação do grau de redução do material pela escolha de diferentes condições experimentais [56-57], ajustando assim, as suas propriedades visando um melhor desempenho na aplicação do material final. Assim,

por exemplo, a escolha da faixa de potencial e número de ciclos feitos na redução por voltametria cíclica, ou do período de tempo aplicando um determinado potencial durante a redução por cronoamperometria, influencia diretamente nas propriedades químicas e eletroquímicas do material, podendo resultar em um ERGO com maior ou menor grau de redução.

Diferentemente dos métodos de redução química e térmica, a eletroquímica permite, de maneira rápida, uma modulação sutil do grau de redução do ERGO, podendo levar a eliminação de quantidades diferentes de GFOs dependendo do interesse, além de gerar materiais reprodutíveis. Assim, a redução do GO via eletroquímica se destaca entre as outras formas quando a razão da proporção entre os grupos oxidados e reduzidos faz-se necessária.

5. MONITORAMENTO VIA ELETROQUÍMICA DO GRAU DE

REDUÇÃO DO ERGO

O monitoramento da proporção entre os grupos oxidados e reduzidos na superfície do ERGO pode ser feito por experimentos eletroquímicos, utilizando-se uma sonda sensível a presença de alguns GFOs. Por exemplo, a espécie eletroativa β-nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) pode ser utilizada para tais experimentos.

5.1. β-nicotinamida adenina dinucleotídeo

O NADH é um importante cofator enzimático que apresenta um sítio redox em sua estrutura [58]. Além disso, pode-se identificar a presença de dois grupos fosfatos, cada um deles ligado a um nucleotídeo. Um destes nucleotídeos está ligado a uma adenina (base nitrogenada) e o outro a uma nicotinamida, que é a parte eletroativa da molécula. A reação de oxirredução do NADH/NAD+ _(forma

reduzida/oxidada) está demonstrada na Figura 6 a seguir. O reconhecimento e a oxidação de NADH na superfície de eletrodos é bastante importante uma vez que mais de 300 enzimas desidrogenases conhecidas necessitam desse cofator para suas reações redox [59-60].

Figura 6: Reação de oxirredução do NADH/NAD+ _{(Modificado de [58]).}

5.2. Oxidação de NADH

O grafeno, GO e RGO têm sido bastante utilizados na construção de sensores e biossensores eletroquímicos [2,13,27], e nesse sentido, destaca-se o seu uso na

detecção de NADH [60-65]. O uso destes materiais de carbono, além de outros (exemplo: nanotubos de carbono), tem como um dos principais objetivos diminuir o elevado sobrepotencial da reação de oxidação de NADH [61], encontrado quando esta é feita diretamente na superfície de eletrodos de carbono vítreo, ouro, entre outros. Ademais, devido as suas elevadas áreas superficiais, esses materiais podem ser empregados com a finalidade de auxiliar na imobilização de mediadores e catalisadores da oxidação de NADH [60,66-68], como por exemplo, polímeros condutores, corantes, quinonas, etc., por meio de ligações covalentes, interações eletrostáticas, hidrofóbicas, π-π e/ou cátion-π.

É possível verificar que alguns GFOs desempenham papel fundamental na oxidação de NADH, como, por exemplo, é visto ao se fazer uso de quinonas, Q, que se reduzem a hidroquinonas, QH2, ao aceitar dois elétrons e um próton provenientes

do NADH [69]. Esta reação é mostrada na Figura 7, que leva em consideração somente a parte eletroativa do NADH/NAD+ _{e considera R sendo todo o restante}

não-eletroativo.

Figura 7: Reação entre um grupo quinona e NADH, gerando hidroquinona e NAD+_.

Somente a parte eletroativa do NADH/NAD+ _{está demonstrada e o grupo R.}

Uma ilustração esquemática do que ocorre na superfície do eletrodo quando se tem grupos Q imobilizados para fazer a oxidação de NADH está demonstrada na Figura 8. Dessa maneira, pode-se perceber que a oxidação de NADH está limitada pela disponibilidade de grupos Q, ou seja, uma diminuição dessa disponibilidade acarretará em uma diminuição da corrente anódica proveniente da oxidação de NADH.

Figura 8: Oxidação de NADH à NAD+ _{com a redução do mediador Q à QH} 2 e

consequente restauração do grupo Q na superfície do eletrodo. (Modificado de [69]).

Mantendo isso em mente, a utilização do NADH como molécula eletroativa sensível a GFOs, principalmente a Q, se torna uma opção interessante para realizar o monitoramento desses grupos sobre a superfície do ERGO.

6. IMOBILIZAÇÃO DE AZUL DE MELDOLA SOBRE O ERGO

6.1. Azul de Meldola – Estrutura, Aplicações e Detecção de NADH

O Azul de Meldola (AM), 7-dimetilamino-1,2-benzofenoxazina, foi sintetizado originalmente pelo pesquisador Raphael Meldola em 1879 [70]. Desde então, o AM se tornou um dos corantes mais conhecidos da classe das moléculas a base de benzofenoxazina, juntamente com o Vermelho do Nilo e Azul do Nilo. Em sua estrutura, pode-se verificar um benzeno fundido a uma fenoxazina na posição angular e um substituinte dimetilamino (região catiônica da molécula). A fórmula estrutural do AM está ilustrada na Figura 9.

Figura 9: Fórmula estrutural do corante Azul de Meldola. (Modificado de [71]).

O AM é utilizado como pigmento na fabricação de tintas, papéis e em indústrias têxteis. Além disso, considerando o campo de desenvolvimento de sensores e biossensores, o AM também é vastamente aplicado como componente para detecção de moléculas de interesse, como por exemplo, glicose [72], piruvato [73], NO [74], glutamato [75], etanol [76] e NADH [77-80].

A detecção eletroquímica e o sensoriamento de NADH por meio do uso de AM imobilizado na superfície de eletrodos consiste na oxidação do NADH por meio da redução do corante, que recebe 2 elétrons e um próton (equação 3); em seguida, o AM perde os elétrons para a superfície do eletrodo (equação 4), regenerando assim, a sua forma oxidada, disponível para reagir com mais uma molécula de NADH [80]. A Figura 10 ilustra esses passos que ocorrem na superfície do eletrodo, considerando AMoxi e AMred como a forma oxidada e a reduzida, respectivamente, do corante.

Figura 10: Ilustração das etapas que ocorrem durante a oxidação de NADH por meio do mediador AM, imobilizado na superfície do eletrodo. (Modificado de [80])

6.2. Importância das interações eletrostáticas e π-π

O AM pode ser imobilizado de diversas formas sobre a superfície de eletrodos, entre elas, por atração eletrostática [81], entrapeado por sol-gel [80], adsorção em sílica gel [79] e em nanotubos de carbono [78]. Dessa forma, as interações eletrostáticas, hidrofóbicas e π-π têm uma importante função na imobilização não-covalente do AM sobre diferentes plataformas na superfície do eletrodo.

Sendo assim, o uso de grafeno, GO ou RGO como plataforma para o ancoramento de moléculas aromáticas, como o AM, se torna uma prática interessante, visto que a elevada área superficial desses nanomateriais de carbono contribui para uma adsorção de elevada quantidade da espécie de interesse. Além disso, no caso do GO ou RGO, a presença de alguns GFOs pode levar ao aparecimento de interações eletrostáticas entre as folhas e o AM, assim como os elétrons π conjugados, principalmente no grafeno e no RGO, são responsáveis pela formação de interações do tipo π-π [82-86]. Dessa maneira, considerando o RGO por exemplo, os tipos e a quantidade de interações intermoleculares que serão formadas entre as folhas e as moléculas de AM dependem diretamente do grau de redução do primeiro. Ou seja, um baixo grau de redução pode favorecer as interações eletrostáticas, ao passo que um elevado grau pode levar ao prevalecimento de interações do tipo π-π.

Dessa forma, a extensão de redução do RGO influencia diretamente na quantidade de AM que poderá ser imobilizado, e isto, por sua vez, reflete nas propriedades do material final, podendo tornar seu desempenho melhor ou não, dependendo da sua aplicação.

1. GERAL

O presente trabalho visa demonstrar como o grau de redução do ERGO pode influenciar em suas propriedades eletroquímicas. Isso é feito através da modulação do seu grau de redução pelo emprego de diferentes condições experimentais de redução e do monitoramento de alguns grupos funcionais oxigenados na superfície desse material por meio do uso de NADH como uma espécie eletroativa sensível a GFOs. Além disso, busca demonstrar como o ERGO pode ser utilizado como plataforma para fazer a imobilização de moléculas aromáticas, visando a construção de sensores para analitos de interesse.

2. ESPECÍFICOS

 Realizar a obtenção de diferentes ERGOs por duas técnicas eletroquímicas de redução de GO, voltametria cíclica e cronoamperometria, sob condições experimentais distintas.

 Realizar a caracterização eletroquímica desses ERGOs.

 Monitorar a proporção entre grupos oxidados e reduzidos e modular esta proporção para originar um material que possui as melhores propriedades para sua aplicação final.

 Demonstrar como o grau de redução do ERGO influencia na imobilização não-covalente de AM.

 Aplicar o ERGO com AM imobilizado na construção de um sensor para NADH.

MATERIAIS, EQUIPAMENTOS

E MÉTODOS

1. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS

Todos os reagentes foram utilizados da maneira que recebidos, sem passarem por processos de purificação. Fosfato de sódio monobásico/dibásico, cloreto de potássio e ácido clorídrico foram adquiridos da Synth – São Paulo/SP – Brasil. Ferricianeto de potássio, ferrocianeto de potássio, permanganato de potássio, ácido

sulfúrico e β-nicotinamida adenina dinucleotídeo foram adquiridos da Sigma-Aldrich – St. Louis/MO – EUA. Os flocos de grafite (Graflake 99580, pureza

de 99,5%) foram adquiridos da Nacional de Grafite – São Paulo/SP – Brasil. O azul de meldola foi adquirido da Acros Organics – New Jersey – USA. Todas as soluções foram preparadas utilizando água deionizada (18,2 MΩ) de um sistema Milli-Q Millipore.

Todos os experimentos eletroquímicos foram realizados utilizando uma célula convencional de três eletrodos, sendo o eletrodo de referência um de Ag/AgCl em KCl saturado; o contra eletrodo um fio de platina; e o eletrodo de trabalho um de ouro policristalino (Au) com área geométrica de 0,071 cm2. As medidas de voltametria cíclica e cronoamperometria foram realizadas utilizando um potenciostato PGSTAT-30 modelo AUTOLAB (Eco Chemie) interfaceado com um computador e controladas pelo programa GPES (4.9). Os espectros Raman foram obtidos utilizando um Raman confocal T64000 (Horibic Scientific), com laser de Argônio (514 nm) e uma objetiva de 100x, em um microscópico óptico Olympus. Os

espectros de XPS foram obtidos em um espectrômetro da Thermo Scientific K-Alpha, com uma fonte monocromatizada de Al Kα com resolução de 0,100 eV e

energia de passagem de 50 eV. As imagens de microscopia óptica dos filmes de GO depositados sobre lâminas de Si/SiO2 (300 nm de espessura) foram obtidas

utilizando-se um microscópio óptico Carl Zeiss, modelo Jenatec. As micrografias foram obtidas utilizando-se um microscópio eletrônico de varredura por emissão de

campo de alta resolução no modo transmissão FEI, modelo Inspect, sendo que as suspensões de GO foram depositadas sobre telas de transmissão de cobre da Ted Pella. Todas as fotografias tiradas das superfícies dos eletrodos modificados foram obtidas com uma câmera digital – Samsung – mantendo-se sempre o mesmo ângulo e a mesma luminosidade para permitir a comparação entre elas.

2. SÍNTESE DE ÓXIDO DE GRAFENO

O óxido de grafeno utilizado neste trabalho foi sintetizado utilizando-se um método baseado no de Hummers [34,87-89] a partir de flocos de grafite. Resumidamente, foi feita uma suspensão de 2 g de flocos de grafite em 1 L de ácido sulfúrico concentrado, 98% (w/w), à temperatura ambiente e sob agitação mecânica. Após 15 minutos, 2 g de permanganato de potássio foram adicionados lentamente à mistura, a qual então, adquiriu coloração esverdeada devido à formação de Mn2O7

(agente oxidante). Para esta etapa, um banho de gelo foi utilizado para garantir que a temperatura se mantivesse abaixo de 30°C. A partir disso, duas porções de 2 g de KMnO4 foram adicionadas diariamente na mistura, pelo período de duas semanas.

A suspensão final foi centrifugada (1800 rpm) e lavada diversas vezes para retirar o excesso de ácido e agente oxidante. Após a primeira etapa de centrifugação, o sobrenadante foi retirado e o precipitado foi redisperso em água deionizada e novamente centrifugado. Essa etapa foi repetida 3 vezes. Posteriormente, o GO foi lavado três vezes com HCl (5% v/v) e novamente três vezes com água deionizada. Finalizado o processo de centrifugação, o GO foi então estocado no escuro, à temperatura ambiente, em água deionizada. Um volume conhecido da suspensão de GO foi colocado na estufa a 70°C por três dias para fazer a evaporação do solvente. Após seco, o material foi pesado para se fazer um cálculo aproximado da

concentração do GO sintetizado e disperso em água, que foi de aproximadamente, 5,9 mg/mL.

3. MODIFICAÇÃO DO ELETRODO DE Au E REDUÇÃO

ELETROQUÍMICA DO GO

Inicialmente, para se fazer a limpeza do eletrodo de ouro, este foi polido com alumina de granulação 1,0, 0,5 e 0,3 µm, enxaguado e deixado no ultrassom com água deionizada por 5 minutos. Após essa etapa, foi realizada uma medida de voltametria cíclica (de –0,1 V até 0,55 V) com este eletrodo em meio a uma solução de ferricianeto/ferrocianeto de potássio (2,5 mmol/L) em KCl (0,1 mol/L) para garantir que sua superfície estivesse limpa e reprodutível. O eletrodo limpo foi imediatamente utilizado para as etapas seguintes.

Uma diluição da suspensão estoque de GO (5,9 mg/mL) foi feita de modo a obter uma de concentração 0,12 mg/mL, com coloração amarela/marrom bem clara. Desta nova suspensão, foram transferidos 7 µL para a superfície do eletrodo de ouro (de tal forma que a área deste estivesse sendo completamente recoberta), que foi então deixado secar a temperatura ambiente por 1 hora. Após essa etapa, o eletrodo de ouro modificado com GO (Au-GO) foi submetido à redução eletroquímica por dois métodos, voltamétrico e cronoamperométrico, dando origem à diferentes

Au-ERGOs (eletrodo de ouro modificado com ERGO). Para ambos os casos, a

redução foi feita em tampão fosfato (0,1 mol/L), pH 8, na ausência de oxigênio dissolvido.

A técnica de voltametria cíclica foi escolhida para se fazer a redução por

(de 0 V até –1,1 V; 0 V até –1,3 V; e 0 V até –1,5 V) e diferentes números de ciclos foram analisados (1, 2, 7 e 12 ciclos). Todos os voltamogramas foram obtidos com a mesma velocidade de varredura, que foi de 50 mV/s. Para a redução feita por cronoamperometria, o potencial foi fixado em –1,5 V e variou-se o tempo de redução: 1 s, 2 s, 5 s, 10 s, 20 s, 30 s, 45 s, 60 s e 100 s.

4. ANÁLISE DOS Au-ERGOs EM FERRI/FERROCIANETO DE

POTÁSSIO

Cada um dos Au-ERGOs obtidos pelas diferentes técnicas e condições experimentais foi analisado por voltametria cíclica (de –0,1 V até 0,55 V) em meio da mesma solução de ferricianeto/ferrocianeto de potássio (ferri/ferro) utilizada no item 3. Todos os voltamogramas cíclicos foram obtidos com a mesma velocidade de varredura, de 30 mV/s.

5. ANÁLISE DOS Au-ERGOs EM NADH

Cada um dos Au-ERGOs obtidos pelas diferentes técnicas e condições experimentais foi analisado por voltametria cíclica (de –0,5 V até 0,2 V) em meio de tampão fosfato (0,1 mol/L), pH 7,4, na ausência de oxigênio dissolvido. Todos os voltamogramas foram obtidos com a mesma velocidade de varredura, que foi de 10 mV/s. Para todas as análises, uma solução de 1 mmol/L de NADH foi preparada também em tampão fosfato (0,1 mol/L), pH 7,4, na ausência de oxigênio dissolvido, e utilizada em seguida.

6. DETERMINAÇÃO

DA

ÁREA

ELETROATIVA

APROXIMADA DE ALGUNS Au-ERGOs

Alguns Au-ERGOs obtidos tanto pela redução voltamétrica de GO quanto pela cronoamperométrica foram analisados por meio de voltametria cíclica (de 0 V até 0,55 V) na presença de uma solução de ferri/ferro recém-preparada (5 mmol/L) em KCl (1 mol/L), variando-se a velocidade de varredura de 10 mV/s até 100 mV/s, com o intuito de se fazer um cálculo da área eletroativa aproximada destes materiais.

7. ANÁLISE DA ESTABILIDADE DO Au-ERGO*

A estabilidade do Au-ERGO* foi determinada por meio de voltametria cíclica (de –0,1 V até 0,55 V) em meio da mesma solução de ferri/ferro utilizada no item 3, visando duas análises: frente a diferentes tipos de manuseio do eletrodo (especificados ao longo do texto no Capítulo IV) e frente a diversos números de ciclos. Todos os voltamogramas foram obtidos com a mesma velocidade de varredura, que foi de 30 mV/s.

8. MODIFICAÇÃO DE Au-ERGOs COM AZUL DE MELDOLA

Inicialmente, a superfície dos eletrodos de Au foram limpas e modificadas com GO da mesma maneira que a descrita no item 3. A redução do GO via cronoamperometria foi selecionada para a obtenção dos ERGOs utilizados nessa parte do trabalho. O potencial foi fixado em –1,5 V e variou-se o tempo de redução: 1 s, 20 s e 60 s. Cada um destes Au-ERGOs obtidos foram deixados em contato com soluções recém-preparadas de azul de meldola (10 mol/L, 20 mol/L e 40mol/L)

por 15 minutos sem agitação, resultando em diferentes tipos de Au-ERGO/AM. Após esse tempo, os eletrodos foram lavados em água deionizada por imersão e agitação manual por 1 minuto para a remoção de moléculas do corante fracamente adsorvidas e utilizados logo em seguida.

9. OXIDAÇÃO DE NADH UTILIZANDO Au-ERGOs/AM

Os Au-ERGOs/AM obtidos no item 7 foram submetidos a análises de voltametria cíclica (de –0,5 V até 0,2 V) na presença de NADH (1 mmol/L) em meio de tampão fosfato (0,1 mol/L), pH 7,4, na ausência de oxigênio dissolvido. Todos os voltamogramas foram obtidos com a mesma velocidade de varredura, que foi de 10 mV/s. Os resultados foram analisados tanto em questão de sensibilidade quanto de eficiência de cada sistema nessas condições.

10. ANÁLISE DA ESTABILIDADE DO Au-ERGO/AM*

A condição experimental que gerou o Au-ERGO/AM considerado o mais sensível foi escolhida e assim foram realizados testes de estabilidade frente a diversos números de ciclos ao longo de 8 dias (maiores informações serão dadas no texto do Capítulo IV – Parte II). Nesse caso, o Au-ERGO/AM foi submetido a análises por

meio de voltametria cíclica (de –0,5 V até 0,2 V) em meio de tampão fosfato (0,1 mol/L), pH 7,4, na ausência de oxigênio dissolvido. Todos os voltamogramas

11.

CONSTRUÇÃO DA CURVA ANALÍTICA

Uma curva analítica preliminar foi construída utilizando novamente o

Au-ERGO/AM considerado o mais sensível para a detecção de NADH. Foram

escolhidas diferentes concentrações deste analito dentro da faixa de 130 µmol/L até 1000 µmol/L. Utilizou-se um eletrodo com uma nova modificação para cada concentração diferente de NADH em meio de tampão fosfato (0,1 mol/L), pH 7,4, na ausência de oxigênio dissolvido. Todas as análises foram feitas por cronoamperometria, mantendo o potencial fixo em –96 mV por 120 s, obtendo-se assim, uma corrente constante.

PARTE I

CARACTERIZAÇÃO DO ÓXIDO DE GRAFENO

ELETROQUIMICAMENTE REDUZIDO