Manual de Métodos
Manual de Métodos
de Análise
de Análise
Microbiológica de
Microbiológica de
Alimentos e Água
Alimentos e Água
São Paulo - Livraria Varela Editora
São Paulo - Livraria Varela Editora
2010
2010
Neusely da Silva
Neusely da Silva
Valéria Christina Amstalden Junqueira
Valéria Christina Amstalden Junqueira
Neliane Ferraz de Arruda Silveira
Neliane Ferraz de Arruda Silveira
Marta Hiromi Taniwaki
Marta Hiromi Taniwaki
Rosana Francisco Siqueira dos Santos
Rosana Francisco Siqueira dos Santos
Renato Abeilar Romeiro
Índice
Capítulo 1. Coleta, transporte e estocagem de amostras para análise 1.1. Introdução
Lote
Amostra de lote e unidade de amostra Planos de amostragem de lotes
Unidade analítica 1.2. Material necessário
1.3. Coleta de amostras para análise
1.3.1. Seleção e preparação de frascos para coleta de alimentos acondicionados em embalagens não individuais
1.3.2. Procedimentos para a coleta de alimentos acondicionados em embalagens não individuais 1.3.3. Coleta de alimentos envolvidos em casos de doenças de origem alimentar (DTAs)
1.3.4. Coleta de amostras de água
1.4. Transporte e estocagem de amostras até o momento da análise
1.4.1. Transporte e estocagem de alimentos com baixa atividade de água 1.4.2. Transporte e estocagem de alimentos congelados
1.4.3. Transporte e estocagem de alimentos refrigerados
1.4.4. Transporte e estocagem de alimentos comercialmente estéreis em embalagens herméticas 1.4.5. Transporte e estocagem de amostras de água
1.5. Recepção de amostras para a análise 1.6. Referências
Capítulo 2. Preparação de amostras para análise 2.1. Introdução
2.2. Material necessário
2.3. Homogeneização da amostra e retirada da unidade analítica
2.3.1. Procedimento para a homogeneização e retirada da unidade analítica de produtos líquidos 2.3.2. Procedimento para a homogeneização e retirada da unidade analítica de produtos sólidos ou
líquidos concentrados
2.3.3. Procedimento para a retirada da unidade analítica pela técnica do esfregaço de superfície 2.3.3.1. Amostragem com “swabs”
2.3.3.2. Amostragem com esponjas
2.3.4. Procedimento para a retirada da unidade analítica pela técnica da lavagem superficial 2.3.4.1. Procedimento para a lavagem de carcaças de aves
2.3.4.2. Procedimento para a lavagem de outros alimentos 2.3.4.3. Procedimento para a lavagem de embalagens 2.3.5. Guarda de contra-amostras
2.4. Preparo da 1º diluição da unidade analítica Diluentes para os ensaios de presença/ausência
Diluentes para os ensaios que requeiram tratamento diferenciado da amostra Diluentes para os ensaios gerais de quantificação
Como obter uma diluição inicial 1:10 (10-1) Como obter uma diluição inicial diferente de 1:10
Procedimento para o preparo da primeira diluição de amostras líquidas
Procedimento para o preparo da primeira diluição de amostras sólidas ou líquidos concentrados
Procedimento para o preparo da primeira diluição de amostras obtidas por esfregaço de superfície ou por lavagem superficial
2.5. Diluição decimal seriada da amostra Como obter a 2º diluição (10-2) Como obter as diluições subsequentes 2.6. Referências
Capítulo 3. Técnicas básicas de contagem de microrganismos em placas 3.1. Introdução
3.3. Plaqueamento em superfície (“spread plate”) 3.4. Plaqueamento em gotas (“drop plate”) 3.5. Filtração em membrana
3.6. Contagem das colônias e cálculo dos resultados 3.7. Referências
Capítulo 4. Técnicas básicas de contagem de microrganismos pelo Número Mais Provável 4.1. Introdução
4.2. Teste de diluição múltipla 4.3. Teste de diluição única 4.4. Cálculo dos resultados 4.5. Referências
Anexo 4.1. Tabelas de NMP
Capítulo 5. Técnicas básicas de detecção da presença/ausência de microrganismos 5.1. Introdução
5.2. Material requerido nas análises 5.3. Procedimento
a) Pré enriquecimento
Composição de amostras a seco b) Enriquecimento seletivo
Composição úmida de amostras em ensaios com duas etapas de enriquecimento c) Plaqueamento diferencial
c.1) Técnica de inoculação por estrias de esgotamento para obter culturas puras d) Seleção de colônias e repique de culturas para confirmação
Técnica de repique de culturas puras a partir de colônias isoladas em placas e) Testes de confirmação
e.1) Coloração de Gram (método de Hucker)
e.2) Coloração de esporos (método de Schaeffer-Fulton) e.3) Coloração de esporos (método de Ashby)
e.4) Montagens úmidas para observação microscópica a fresco 5.4. Referências
Capítulo 6. Contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos e psicrotróficos em placas 6.1. Introdução
6.2. Método de contagem total de aeróbios mesófilos em placas 6.3. Método de contagem total de aeróbios mesófilos em Petrifilm 6.4. Método de contagem total de aeróbios psicrotróficos
6.5. Referências
Capítulo 7. Contagem de bolores e leveduras 7.1. Introdução
7.2. Método de contagem total de bolores e leveduras em placas 7.3. Método de contagem de fungos psicrotróficos
7.4. Método de contagem de bolores termorresistentes
7.5. Métodos de contagem de leveduras resistentes aos conservantes (PRY) 7.6. Métodos de contagem de leveduras osmofílicas
7.7. Referências
Capítulo 8. Contagem de enterobactérias 8.1. Introdução
Taxonomia
Métodos de análise
8.2. Método de contagem em placas de VRBG 8.3. Método do Número Mais Provável (NMP) 8.4. Método do Petrifilm
Capítulo 9. Contagem de coliformes totais, coliformes termotolerantes e Escherichia coli
9.1. Introdução
Definição de coliformes totais
Definição de coliformes termotolerantes
E. coli
Aplicação como indicadores Métodos de análise
9.2. Método do Número Mais Provável (NMP) (coliformes totais/termotolerantes/ E. coliem água e
alimentos)
9.3. Método de plaqueamento em VRB (coliformes totais em alimentos)
9.4. Método do ColiCompleteAOAC 992.30 (Coliformes totais/ E. coliem alimentos) 9.5 Método do Petrifilm(coliformes totais/ E. coliem alimentos)
9.6. Método ISO 7251:2005 (coliformes termotolerantes presuntivo para E. coliem alimentos)
9.7. Método do substrato cromogênico Colilert® AOAC 991.15 (coliformes totais e E. coliem água)
9.8. Referências
Capítulo 10.Staphylococcus aureus
10.1. Introdução
Principais características de S. aureus
Métodos de análise
10.2. Método de contagem direta em placas 10.3. Método do Número Mais Provável (NMP) 10.4. Teste de presença/ausência
10.5. Referências
Capítulo 11. Bacillus cereus
11.1. Introdução Grupo B. cereus B. anthracis B. thuringiensis B. mycoides B. pseudomycoides B. weihenstephanensis
Principais características de B. cereus
Métodos de análise
11.2. Método de contagem direta em placas 11.3. Método do Número Mais Provável (NMP) 11.4. Referências
Capítulo 12. Clostrídios sulfito redutores e Clostridium perfringens
12.1. Introdução
Principais características de C. perfringens
Clostrídios sulfito redutores a 46ºC
Métodos de análise de C. perfringensem alimentos
Métodos de análise de clostrídios sulfito redutores a 46ºC em alimentos
Métodos de análise de esporos de clostrídios sulfito redutores e C. perfringensem água
12.2. Método de plaqueamento direto (C. perfringensem alimentos)
12.3. Teste de presença/ausência (C. perfringensem alimentos)
12.4. Método de contagem em placas (clostrídios sulfito redutores a 46ºC em alimentos) 12.5. Método ISO 6461-1:1986 (esporos de clostrídios sulfito redutores em água)
12.6. Método CETESB:1993 (esporos deC. perfringensem água)
12.7. Referências
Capítulo 13. Contagem de enterococos 13.1. Introdução
Importância em alimentos Métodos de análise
13.3. Método do Número Mais Provável (NMP) (enterococos em alimentos) 13.4. Método da membrana filtrante (enterococos em água)
13.5. Referências
Capítulo 14 Contagem de bactérias láticas 14.1. Introdução Leuconostoc Pediococcus Streptocccus Lactobacillus Enterococcus Lactococcus Carnobacterium Vagococcus Tetragenococcus Weissella Oenococcus Métodos de análise
14.2. Método de contagem em placas
14.3. Método do Número Mais Provável (NMP) 14.4. Referências Capítulo 15.Campylobacter 15.1. Introdução Taxonomia Patogenicidade Métodos de análise
15.2. Método de presença/ausência ISO 10272-1 (2006) 15.3. Referências
Capítulo 16.Cronobacter
16.1. Introdução Taxonomia
Características nutricionais e de crescimento Epidemiologia
Ecologia
Padrão do Codex Alimentarius paraCronobacter sp em fórmulas infantis
Métodos de análise
16.2. Método de presença/ausência ISO/TS 22964 (2006) 16.3. Referências
Capítulo 17. Escherichia coliO157:H7
17.1. Introdução Sorotipagem Patogenicidade
Sorotipos STEC mais envolvidos em surtos
E. coliO157:H7 em alimentos
Taxonomia
Métodos de detecção 17.2. Método BAM/FDA 17.3. Referências
Capítulo 18. Listeria monocytogenes
18.1. Introdução Taxonomia Patogenicidade Métodos de análise
18.2. Método BAM/FDA (2003)
18.3. Método MLG/FSIS/USDA (2009)
18.4. Método APHA de plaqueamento direto (2001) 18.5. Método ISO 11290-2:1998 Amendment 1:2004 18.6. Método ISO 11290-1:1996 Amendment 1:2004 18.7 Referências
Capítulo 19.Salmonella
19.1. Introdução
Classificação taxonômica deSalmonella
Classificação sorológica de Salmonella
Características bioquímicas de Salmonella
Epidemiologia
Métodos tradicionais de análise de Salmonella
Métodos alternativos de análise de Salmonella
Composição de amostras para a análise 19.2. Método ISO 6579: 2002 Amendment 1: 2007 19.3 Método BAM/FDA (2007)
19.4. Método MLG/FSIS/USDA (2008) 19.5. Referências
Capítulo 20. Vibrios patogênicos 20.1. Introdução Taxonomia Epidemiologia V. cholerae V. parahaemolyticus V. vulnificus Métodos de análise
20.2. Método APHA/BAM/FDA (presença/ausência de Vibrio cholerae)
20.3. Método APHA/BAM/FDA (NMP deVibrio parahaemolyticus eVibrio vulnificus)
20.4. Referências
Capítulo 21.Yersinia enterocolitica
21.1. Introdução Taxonomia Epidemiologia Métodos de análise
21.2. Método APHA de detecção 21.3. Referências
Capítulo 22. Contagem de esporos de bactérias 22.1. Introdução
22.1.1. Taxonomia das bactérias esporogênicas importantes em alimentos
Bacillus Clostridium Sporolactobacillus Desulfotomaculum Alicyclobacillus Thermoanaerobacterium Paenibacillus Aneurinibacillus Brevibacillus Virgibacillus Geobacillus
22.2. Métodos de contagem de esporos de termófilos aeróbios totais e “flat sour”
22.3. Métodos de detecção de esporos de termófilos anaeróbios não-produtores de H2S (T.
22.4. Métodos de contagem de esporos de termófilos anaeróbios produtores de H2S ( D. nigrificans)
22.5. Métodos de contagem de esporos de mesófilos aeróbios 22.6. Métodos de contagem de esporos de mesófilos anaeróbios 22.7. Métodos APHA para detecção ou contagem de Alicyclobacillus
22.8. Método IFU 12:2007 para detecção e contagem de Alicyclobacillus
22.9. Referências
Capítulo 23. Esterilidade comercial ou causa da deterioração 23.1. Introdução
23.1.1. Parâmetros de avaliação da resistência térmica dos microrganismos Curva de sobrevivência e tempo de redução decimal (valor D) Número de reduções decimais
Curva de destruição térmica e coeficiente de temperatura (valor z) 23.1.2. Valores D e z de microrganismos de importância em alimentos
Células vegetativas
Esporos de bolores termorresistentes Esporos de bactérias
23.1.3. Dimensionamento de processos térmicos
23.1.4. Deterioração microbiana de alimentos enlatados Subprocessamento
Vazamento
Deterioração por termófilos estritos
Multiplicação microbiana antes do tratamento térmico Causas não microbianas de deterioração
23.2. Teste de esterilidade comercial e determinação da causa da deterioração de alimentos de baixa acidez 23.3. Teste de esterilidade comercial e determinação da causa da deterioração de alimentos ácidos
23.4. Referências
Capitulo 24. Pseudomonasspp
24.1. Introdução
PseudomonasMigula 1894
ShewanellaMac Donell &Colwell 1986
JanthinobacteriumDe Leyet al. 1978 emend. Lincoln et al. 1999 StenotrophomonasPalleroni & Bradbury 1993
Métodos de análise
24.2. Contagem dePseudomonas aeruginosaem água – método dos tubos múltiplos
24.3. Contagem dePseudomonasspp em carne e produtos cárneos - método ISO 13720:1995
24.4. Contagem dePseudomonasspp em leite e produtos lácteos - método ISO 11059:2009
24.5. Referências
Capítulo 25. Preparação de material de laboratório para análises microbiológicas 25.1. Descontaminação e descarte de resíduos contaminados
25.2. Lavagem
25.3. Acondicionamento 25.4. Esterilização
25.5. Preparo de vidraria nova
25.6. Controle de qualidade do material 25.7. Referências
Capítulo 26. Cuidados na preparação de meios de cultura e reagentes para análises microbiológicas 26.1. Introdução
26.1.1. Ingredientes utilizados na formulação de meios de cultura 26.1.1.1. Água para o preparo de meios e reagentes 26.1.1.2. Fontes de nutrientes em meios de cultura 26.1.1.3. Agentes seletivos
26.1.1.4. Agentes diferenciais 26.1.1.5. Agentes redutores 26.1.1.6. Agentes tamponantes
26.1.1.7. Substratos cromogênicos e fluorogênicos 26.1.1.8. Ágar
26.1.2. Classificação dos meios de cultura
26.2. Procedimento para a preparação de meios de cultura
26.2.1. Armazenamento dos insumos para preparo de meios de cultura 26.2.2. Pesagem e rehidratação
26.2.3. Dissolução e dispersão
26.2.4. Verificação e ajuste do pH antes da esterilização 26.2.5. Distribuição
26.2.6. Esterilização pelo calor úmido 26.2.7. Esterilização por filtração
26.2.8. Verificação do pH depois da esterilização
26.2.9. Preparação dos suplementos para meios de cultura
26.2.10. Estocagem dos meios esterilizados até o momento do uso 26.2.11. Preparação dos meios no momento do uso
26.3. Referências
Anexo 1. Preparo ede meios e reagentes para as análises Anexo 2
2A. Resolução RDC No 12 de 02 de janeiro de 2001 da ANVISA (Regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos)
2B. Resolução RDC Nº 275 de 22 de setembro de 2005 da ANVISA (Regulamento técnico de características microbiológicas para água mineral natural e água natural)
2C. Portaria N.º 518 de 25 de março de 2004 do Ministério da Saúde (Controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade)
Apresentação
Esse manual foi preparado com métodos padronizados e aceitos em âmbito nacional e internacional,
publicados no
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods(APHA, 4
aEdição, 2001),
Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater(APHA, 21
aedição,
2005),
Standard Methods for the Examination of Dairy Products(APHA, 17
aedição, 2004),
Official Methods of Analysis of AOAC International(AOAC, 18
aedição, 2005),
Bacteriological Analytical Manual(FDA, atualizado por capítulos, online),
Microbiology Laboratory Guidebook(FSIS/USDA, atualizado por capítulos, online),
Fungi and Food Spoilage(Pitt & Hocking, 2009) e
últimas edições das normas ISO.
O texto oferece um material de conteúdo profundo, moderno e atualizado, mas apresentado de
forma didática, com figuras e esquemas que facilitam a compreensão. Nessa quarta edição o
conteúdo foi ampliado para atender também à análise de água. Vários métodos foram revistos e
atualizados, novos métodos foram introduzidos e um novo capítulo para
Pseudomonasspp foi
criado. Abaixo seguem as alterações dessa edição, em comparação com a edição anterior.
Capítulo 1 – Coleta, transporte e estocagem de amostras para análise
Item 1.4.2 (revisado)
. A temperatura recomendada pela ISO 7218:2007 para a estocagem de
alimentos congelados passa para menor do que 15ºC negativos.
Item 1.4.3 (revisado)
. A temperatura recomendada pela ISO 7218:2007 para transporte e
estocagem de alimentos refrigerados passa para entre um e 8
oC no transporte e 3+2ºC na estocagem,
com intervalo máximo de 36h entre a coleta e a análise.
item 1.4.4 (revisado)
. A temperatura máxima aceita pela ISO 7218:2007 no transporte de produtos
comercialmente estéreis, à temperatura ambiente, é de 40ºC.
Capítulo 2 – Preparação de amostras para análise
Item 2.3.4.1 (revisado)
. O procedimento de lavagem de carcaças de aves foi adotado pela ISO
17604 (amendment 1:2009).
Item 2.3.5 (revisado)
. Algumas considerações sobre a guarda de conta amostras, segundo a nova
edição da ISO 7218:2007.
Capítulo 3 – Técnicas básicas de contagem de microrganismos em placas
Item 3.2.2.b. (revisado)
. A nota b3 traz a exigência da nova edição da ISO 7218:2007 quanto ao
número mínimo de diluições requerido na contagem em placas.
Item 3.3.2.b. (revisado)
. A nota b5 traz a exigência da nova edição da ISO 7218:2007 quanto ao
número mínimo de diluições requerido na contagem em placas.
Item 3.7 (novo)
. Contagem de colônias e cálculo dos resultados da contagem em placas segundo
nova edição da ISO 7218:2007.
Capítulo 4 – Técnicas básicas de contagem de microrganismos pelo NMP
Anexo 4.1 (revisado)
. Foram incluídas duas novas tabelas de NMP para cálculo dos resultados do
teste de diluição única: uma para a distribuição de cinco alíquotas de 20g ou ml e uma para a
distribuição de cinco alíquotas de 10g ou ml.
Capítulo 7 – Bolores e leveduras
Item 7.1 (ampliado)
. A introdução foi complementada com informações sobre leveduras
resistentes aos conservantes (preservative resistant yeasts – PRY) e leveduras osmofílicas.
Item 7.5 (novo)
. Métodos de contagem de leveduras resistentes aos conservantes (PRY), da 3
oEdição do
Fungi and Food Spoilage(Pitt & Hocking, 2009) e 4
oEdição do
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods(APHA, 2001).
Item 7.6 (novo)
. Método de contagem de leveduras osmofílicas, da 4
oEdição do
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods(APHA, 2001).
Capítulo 9 – Contagem de coliformes totais – termotolerantes e
E. coliItem 9.6 (novo). Método ISO 7251:2005 para contagem de coliformes termotolerantes presuntiva para E. coli