INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
Correlação entre aneuploidia cromossômica em
espermatozóides e taxa de implantação embrionária
Viviane Paiva Santana
Botucatu – SP 2012
Correlação entre aneuploidia cromossômica em
espermatozóides e taxa de implantação embrionária
Monografia desenvolvida no
Departamento de Genética da
Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto – USP para conclusão do Curso de Ciências
Biomédicas do Instituto de
Biociências de Botucatu, UNESP Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Regina Martelli
Botucatu – SP 2012
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Santana, Viviane Paiva.
Correlação entre aneuploidia cromossômica em espermatozóides e taxa de implantação embrionária / Viviane Paiva Santana – Botucatu : [s.n.], 2012
Trabalho de conclusão de curso (bacharelado - Ciências Biomédicas) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Lúcia Regina Martelli
Capes: 20205007
1. Aneuploidia. 2. Transferência de embriões humanos. 3. Cromossomos humanos – Anomalias. 4. Tecnologia da reprodução humana. 5.
Espermatozóides.
Palavras-chave: Anormalidades cromossômicas; Aneuploidias; Espermatozóides; Infertilidade; Taxa de implantação embrionária.
Dedicatória
À minha avó Joana (in memoriam).
Minha maior heroína, a estrela mais linda, meu anjo da guarda.
“Santo anjo do senhor , meu zeloso guardador, Se a ti me confiou a piedade divina, Sempre me rege, me guarda,
me governa, me ilumina. Amém.”
Agradecimentos
A Deus, acima de tudo por me dar a vida, e com ela todas as oportunidades e realizações. Agradeço pelas pessoas maravilhosas que colocou em meu caminho, presentes inestimáveis que me levaram a ser o que sou hoje.
Aos pacientes que gentilmente aceitaram participar deste projeto, acreditando em sua importância para o estudo da infertilidade masculina.
À minha orientadora, Profa. Dra. Lúcia Regina Martelli, por me receber tão bem e me proporcionar a chance de realizar esse trabalho, acreditando na minha competência e dedicação.
Ao Sílvio Avelino dos Santos, técnico do Laboratório de Citogenética do Departamento de Genética, por todos os ensinamentos preciosos, a atenção e o enorme carinho e amizade. “Nosso pai de Ribeirão” é a melhor expressão para descrever tamanho sentimento.
À Dra. Rosana Maria dos Reis e ao Dr. Rui Alberto Ferriani pelo interesse neste trabalho e por permitir o acesso aos seus pacientes, fazendo com que esse estudo se tornasse realidade.
À FAPESP, pelo auxílio financeiro deste projeto.
À minha supervisora Profa. Dra. Cláudia Rainho, por toda a disponibilidade e atenção a esse estudo. À Profa. Dra. Esther Silveira Ramos, por aceitar prontamente ser minha relatora e por toda a ajuda dada.
A todos docentes e funcionários do bloco C do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP, por todo apoio, carinho e amizade.
À Lucimar Aparecida F. Laureano e Rinaldo Madona Scarparo, técnicos do Laboratório de Citogenética do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, por toda disponibilidade, colaboração e atenção. À Marilda Hatisumi Yamada Dantas e Maria Aparecida Carneiro Vasconcelos, técnicas do Laboratório de Andrologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, por toda a ajuda, carinho e amizade.
Ao Marco Aurélio Prata, por toda a ajuda com as análises estatísticas. Às pós-graduandas, amigas e colegas de trabalho, Juliana Dourado e
Alexandra Galvão, por todo apoio nos momentos mais difíceis, pelo incentivo, por me ajudarem a ter calma e acreditar que tudo daria certo. Obrigada por toda a amizade! Sentirei saudades!
Ao pós-graduando Ciro Silveira e Pereira, pela enorme ajuda, por me ensinar tanto e ser meu maior exemplo de competência. Sem sua enorme dedicação esse estudo não teria acontecido. “Quando crescer quero ser igual a você!” Á Camila Martinelli, por chegar e me sacudir a vida! Não tenho palavras para agradecer tamanha amizade e companheirismo. Pessoas especiais aparecem em nossas vidas na hora certa e com certeza chegam para ficar.
A todos os amigos do Departamento de Genética, pelo grande incentivo, e carinho. Agradecimento em especial a Murilo, por toda a amizade e por proporcionar minhas risadas diárias!
À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, campus Botucatu, por me dar a oportunidade de realizar meu grande sonho em me graduar em uma área tão fascinante.
Ao Prof. Dr. Wellerson Rodrigo Scarano, por despertar em mim o interesse pela pesquisa e sempre estar prontamente à disposição para me ajudar com o que fosse necessário.
Aos meus amigos de faculdade, Bruno, Laura, Louise, Cristiane, Cecília, Muriel, Laís, Natália e Niele, por me proporcionarem os melhores momentos de minha vida universitária. Sinto saudades todos os dias!
À minhas companheiras de república em Botucatu, Cristiane P., Marcela, Aline, Cristiane M. e Carolina, e em Ribeirão, Anielise, Franciele e Larissa, por todos os momentos juntas, deixando meus dias menos solitários.
Aos meus amigos, Maíra, Viviane, Diego e Eric, por todos os conselhos, risadas e grande companheirismo mesmo estando distantes.
A Daniel, por estar ao meu lado nos momentos mais difíceis, me dando forças e sempre me ajudando a crescer. Obrigada por ser tão companheiro e por me proporcionar momentos tão especiais.
Ao meu irmão Alexandre, por torcer por meu sucesso, me apoiar e ser meu melhor amigo sempre.
Aos meus pais Geraldo e Dayse, por me darem atenção, segurança, incentivo e me proporcionarem a realização deste sonho em me tornar uma biomédica. Sofro todos os dias por estar tão distante! Eu os amo incondicionalmente, e sempre agradeço por ter pais tão especiais!
SUMÁRIO RESUMO 9 ABSTRACT 11 I. INTRODUÇÃO 13 I. 1. Aneuploidias cromossômicas 14 I. 2. Estudo Citogenético 18
I. 3. Aneuploidias e Reprodução Assistida 19
I. 4. Cromossomos 9, X e Y 21
II. JUSTIFICATIVA 24
III. OBJETIVOS 26
IV. MATERIAL E MÉTODOS 27
IV. 1. MATERIAL 27
IV. 1. 1. Casuística 27
IV. 1. 2. Amostra 28
IV. 2. MÉTODOS 29
IV. 2. 2. Citogenética Molecular 31
IV. 2. 3. Análise Estatística 32
V. RESULTADOS 33
V. 1. Estudo citogenético convencional 33
V. 2. Estudo citogenético molecular 37
V. 3. Análise dos Espermogramas e Taxas de Implantação 43
VI. DISCUSSÃO 44
VII. CONCLUSÕES 54
VIII. BIBLIOGRAFIA 55
ANEXOS 70
RESUMO
A etiologia da infertilidade está diretamente relacionada a alterações cromossômicas em células germinativas. Entre elas, as aneuploidias, que se destacam como anormalidades cromossômicas mais frequentes da espécie humana, responsáveis por falhas na implantação embrionária, abortos, perdas fetais e nascidos vivos com síndromes malformativas, deficiência mental e atraso no desenvolvimento neuropsicomotor. Homens com cariótipo somático normal podem apresentar diferentes porcentagens de espermatozóides aneuploides, que após fertilização, geram embriões anômalos. O presente estudo teve por objetivo correlacionar a freqüência de aneuploidias cromossômicas em espermatozóides com a taxa de implantação embrionária de casais submetidos a técnicas de reprodução assistida. A metodologia incluiu análise cromossômica por bandamento GTG para definição do cariótipo somático dos pacientes do sexo masculino e estudo citogenético molecular utilizando a técnica de Hibridação In Situ Fluorescente para detecção de aneussomias dos cromossomos 9, X e Y nas células germinativas masculinas. O grupo amostral foi composto por 22 homens inférteis, atendidos no Serviço de Reprodução Humana do Hospital das Clinicas da FMRP-USP. A taxa de implantação embrionária foi determinada por avaliação hormonal em
sangue periférico materno e posterior confirmação ultrassonográfica. Foram detectados dois pacientes com alterações cromossômicas, um com polimorfismo da região heterocromática do braço longo do cromossomo 9 (46,XY,9qh+) e no segundo, presença de satélite no braço curto do cromossomo 22 (46,XY,22ps+). Ambas alterações, comumente diagnosticadas como variantes de normalidade, já foram relacionadas ao fenótipo de infertilidade e à ocorrência de abortamentos. Foram encontradas diferenças significativas entre casais que obtiveram gestação (grupo 1) ou falha de implantação embrionária (grupo 2), com maior frequência de aneussomia e de diploidia do cromossomo 9, assim como de aneuploidia total nos espermatozoides dos pacientes do grupo 2. Nossos resultados sugerem correlação entre aneuploidias e taxas de implantação, visto que o grupo que não obteve sucesso reprodutivo é o mesmo que apresentou as maiores frequências de aneuploidias. Consideramos que a triagem gamética para detecção de aneuploidias poderia ser incluída em protocolo de investigação, a fim de reduzir falhas na implantação embrionária, abortamentos e formação de fetos com anormalidades cromossômicas.
Palavras-chave: Aneuploidia; Infertilidade; Taxa de implantação embrionária; Anormalidades Cromossômicas; Espermatozóides.
ABSTRACT
Infertility is directly related to chromosomal abnormalities in germ cells. Among them, the aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities and responsible for embryo implantation failures, miscarriages, fetal losses and newborns with congenital malformations, mental disability and neuropsychomotor developmental delay. Male patients with normal somatic karyotype may present different rates of aneuploidies in sperm, resulting in abnormal embryos. This study aimed to correlate the frequency of chromosomal aneuploidies in spermatozoa with embryo implantation rate in couples undergoing assisted reproductive techniques. The methodology has included chromosomal analysis by GTG banding and molecular cytogenetic study using
Fluorescent In Situ Hybridization technique for evaluation of
chromosomes 9, X and Y in germ cells of 22 patients referred to the Human Reproduction Service of the Clinical Hospital FMRP-USP. Embryo implantation rates were determined by hormonal evaluation in maternal peripheral blood and ultrasound confirmation. Two patients presented abnormal karyotype, characterized by polymorphism of the heterochromatic region of the long arm of chromosome 9 and a satellite in the short arm of chromosome 22. Both alterations, usually considered variants of normality, have been related to infertility phenotype and
miscarriages. Significant differences were detected between couples who presented pregnancy (group 1) and couples with embryo implantation failure (group 2), with higher frequency of aneusomy and diploidy of chromosome 9, as well as total aneuploidy in sperm of group 2 patients. Our results suggest a correlation between aneuploidy and embryo implantation rates, since the infertile group with reproductive failure has showed higher frequency of aneuploidy. Screening for aneuploidies detection in male germ cells should be included in order to decrease embryo implantation failures, miscarriages and fetuses with chromosomal abnormalities.
Keywords: aneuploidy; infertility; embryo implantation rate; chromosomal abnormalities; spermatozoa.
I. INTRODUÇÃO
A infertilidade atinge aproximadamente 15% dos casais em idade reprodutiva (KRESTER, 1997). Um casal é considerado infértil quando não há ocorrência de gravidez após 12 ciclos de tentativas. Sua etiologia pode ser hormonal, infecciosa, imunológica ou psicológica, secundária a alterações anatômicas ou cirurgias prévias, ou associada a anormalidades nos gametas (UEHARA ET AL, 2001). Em alguns casos, o fator etiológico pode ser reconhecido, porém, na maioria dos casos, a infertilidade é idiopática, e cada vez mais tem sido associada a fatores genéticos (HARTON ET AL, 2012).
O fator masculino pode ser responsável por 30 a 50% dos casos (BOIVIN ET AL., 2007). Na investigação de rotina, a avaliação dos gametas masculinos é realizada por meio do espermograma, teste que avalia a concentração, motilidade e morfologia dos espermatozoides. Recentemente, a Organização Mundial da Saúde (WHO, 2010) reduziu os valores considerados normais de concentração de 20 para 15x106 espermatozoides/ml. Este parâmetro tem sofrido alterações devido ao grande declínio da qualidade espermática observado nos últimos 50 anos. Embora, teoricamente, apenas um espermatozoide seja necessário para fertilizar um oócito, considera-se
que a capacidade de fertilização diminui se a concentração de gametas estiver abaixo de 40 milhões/ml ou se a porcentagem de espermatozoides normais for inferior a 9% (JORGENSEN ET AL, 2012).
Muitos estudos confirmam a correlação entre infertilidade masculina, qualidade do sêmen e alterações cromossômicas (TEMPEST e GRIFFIN, 2004; SARRATE ET AL., 2005). Egozcue e colaboradores (2003) verificaram que a maioria dos gametas com alterações na morfologia e na motilidade apresentava uma alta taxa de anormalidades cromossômicas, acarretando falhas na fertilização, na implantação e no desenvolvimento normal do embrião.
I. 1. Aneuploidias cromossômicas
As aberrações cromossômicas mais encontradas em humanos são as aneuploidias, que consistem em alterações no número de cromossomos, como monossomias, dissomias e trissomias, devido à distribuição cromossômica errônea durante a meiose. Um dos principais mecanismos que levam à aneuploidia é a não-disjunção, incluindo ganho ou perda numa proporção de 1:1 (MÁRQUEZ ET AL., 1996).
As dissomias consistem na presença de duas cópias dos cromossomos provenientes do mesmo genitor, sendo chamada de dissomia uniparental. Pareamentos não-homólogos permitem que células com anormalidades cromossômicas, como translocação ou
inversão, escapem da checagem, resultando em gametas dissômicos, que irão formar indivíduos aneuploides (WONG ET AL., 2008).
As monossomias, presença de apenas um cromossomo do par, ocorre apenas em cromossomos sexuais (cariótipo 45,X, característico da síndrome de Ullrich-Turner), visto que em autossomos tem efeito letal. Vários estudos investigaram a origem do único cromossomo sexual presente, sendo estimado que 70-80% dos indivíduos monossômicos apresentam o X derivado da mãe, com perda dos cromossomos X ou Y paterno durante a meiose (JACOBS, 1992). Já algumas trissomias, como a do 21, do 18 e do cromossomo 13, são compatíveis com a vida, resultando em nascimento de crianças portadoras das síndromes de Down, Edwards e Patau, respectivamente. A origem paterna é responsável por 0 a 30% das trissomias autossômicas e de 50 a 100% das trissomias dos cromossomos sexuais (HASSOLD E HUNT, 2001).
A grande maioria das demais trissomias e monossomias autossômicas são letais durante o período embrionário ou fetal, sendo que os indivíduos sobreviventes apresentam mosaicismo cromossômico. Mosaicismo é a presença de duas ou mais linhagens diferentes de células que são originadas pela não disjunção dos cromossomos em um zigoto. O mosaicismo inicia-se a partir das três primeiras clivagens e sua freqüência vai aumentando conforme os blastômeros vão sofrendo
divisões. Afeta diretamente a fase de desenvolvimento do blastocisto, período no qual deveria ocorrer a implantação no útero materno (MANTZOURATOU e DELHANTY, 2011). Estudos mostram que embriões formados com gametas que possuem erros meióticos são mais susceptíveis a serem completamente aneuplóides, enquanto que os embriões com erros mitóticos têm maior probabilidade de serem mosaico (RABINOWITZ ET AL., 2012).
As aneuploidias podem ser detectadas em 10 a 30% de todos os óvulos fertilizados, em 35% dos abortos, 4% dos natimortos e 0,3% dos nascidos vivos (HASSOLD ET AL., 1996; MANTZOURATOU e DELHANTY, 2011).
O aparecimento das anomalias cromossômicas ocorre, em alguns casos, desde a formação dos gametas. A espermatogênese inicia-se na puberdade, sendo que nos testículos, as células progridem da prófase da metáfase I até a meiose II, formando quatro espermatozóides. O sucesso na segregação dos homólogos depende, dentre outras coisas, da manutenção das ligações físicas entre os homólogos até a anáfase I, ligação essa chamada de quiasma ou ponto de recombinação. Os quiasmas são cruciais para ligar os homólogos durante a primeira divisão meiótica. Alterações na recombinação estão associadas com erros na segregação durante a meiose I. Alterações
cromossômicas estruturais que reduzem ou impedem a recombinação são um dos fatores relacionados ao aumento da taxa de erros na disjunção (HASSOLD e HUNT, 2001). Sendo assim, quanto maior o número de pontos de recombinação dos homólogos, maior a chance de sucesso na segregação.
Holmes e Martin (1993) verificaram que homens com cariótipo normal poderiam apresentar espermatozóides com alterações morfológicas ou na motilidade. A origem dessas anormalidades depende do tipo específico de cromossomo que se encontra alterado, mas na maioria das vezes podem ser originadas de erros meióticos (SARRATE ET AL., 2005). Esses erros podem ser associados com mutações em genes específicos, envolvidos na recombinação e reparação do DNA (BAARENDS ET AL., 2001), ou alterações nos cinetócoros e microtúbulos (PRESTON, 1996), levando a uma não disjunção dos cromossomos devido a erros na recombinação (EGOZCUE ET AL., 2000). Posteriormente, os mesmos autores afirmaram que os erros cromossômicos poderiam ser associados à idade materna avançada e a fatores ambientais, incluindo radiação, contraceptivos orais e tratamentos de infertilidade, determinados anticorpos, consumo de álcool, diabetes materna, consangüinidade e presença de certos tipos de polimorfismos. A idade paterna também pode estar relacionada com
o aumento da freqüência de anormalidades cromossômicas em espermatozóides (SARRATE ET AL., 2010).
I. 2. Estudo Citogenético
Neste projeto, propusemos a utilização de técnicas de citogenética molecular para a avaliação cromossômica em espermatozóides e técnicas de citogenética clássica para determinação do cariótipo somático. De acordo com a literatura, um dos primeiros testes genéticos indicados para pacientes com infertilidade idiopática é a análise do cariótipo. Em estudo recente de revisão, anormalidades cromossômicas foram detectadas em 5% dos pacientes inférteis, sendo que a prevalência aumentou para 13% entre os pacientes azoospérmicos (MASSART ET AL, 2012).
As técnicas de bandamento cromossômico seriam as únicas capazes de detectar simultaneamente erros estruturais e numéricos em todos os cromossomos nos espermatozóides humanos. Porém atualmente não têm sido utilizadas, pois permitem a análise de um número limitado de células, ocorrendo grande perda e fragmentação cromossômica por artefato, além de ser bastante laboriosa, exigindo grande consumo de tempo o que a torna inadequada para o diagnóstico preciso (EGOZCUE ET AL., 1997).
A hibridação in situ por fluorescência (FISH) tem sido amplamente utilizada na detecção de alterações cromossômicas em espermatozóides de homens inférteis com cariótipo normal e alterado (JUCHNIUK DE VOZZI ET AL., 2009). A técnica consiste em ligar uma sonda de DNA marcada com moléculas fluorescentes à região cromossômica de interesse. Esta técnica pode ser aplicada a cromossomos metafásicos, núcleos interfásicos e fibras de cromatina. Trata-se de método indireto, pois são contados os sinais fluorescentes emitidos pelas sondas ligadas aos cromossomos ou regiões cromossômicas. Porém, permite avaliar um grande número de células (milhares) em curto espaço de tempo e distinguir os diferentes tipos de anomalias cromossômicas, dependendo do ensaio estabelecido. Além disso, permite diferenciar entre diploidia e dissomia, e para o cromossomo sexual, estabelecer se houve não-disjunção na meiose I ou II (WILLIAMS ET AL., 1993).
I. 3. Aneuploidias e Reprodução Assistida
Relatos da literatura mostram que a freqüência de aneuploidia em espermatozóides está diretamente relacionada a repetidas falhas na implantação (RIF) em pacientes submetidos a ciclos de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) (BURRELLO ET AL., 2003, NICOPOULLOS ET AL., 2008). Casais são diagnosticados com
RIF após três ou mais tentativas fracassadas de fertilização in vitro, ou falhas após a transferência de dez embriões de boa qualidade. Embora nem todos os casos de RIF sejam secundários a alterações embrionárias, a maioria está associada a aberrações cromossômicas numéricas (RUBIO ET AL., 2005).
Quando há baixa qualidade do sêmen, a taxa de anormalidades cromossômicas encontra-se bastante alta e pode afetar o sucesso de técnicas de fertilização (VAN DYK ET AL., 2000). Shi e Martin (2000) descreveram que, na espermatogênese normal, 5-10% dos espermatozóides são aneuploides. Muitos estudos relatam um aumento três vezes maior de aneuploidias em homens inférteis, e esse aumento tem sido relacionado com todos os fenótipos de infertilidade, incluindo oligozoospermia, astenozoospermia e teratozoospermia (HARTON ET AL, 2012).
A oligozoospermia é caracterizada como baixa concentração espermática no ejaculado masculino, sendo transitória ou permanente. A OMS considera como oligozoospérmicos, os homens com concentração espermática abaixo de 15 milhões/ml. Já a ausência total de espermatozoides é denominada azoospermia. Astenozoospermia é a redução ou ausência de motilidade nos gametas masculinos, apresentando uma motilidade menor do que 58%. Teratozoospermia
refere-se a alterações morfológicas encontradas nos espermatozoides (WHO, 2010).
Anormalidades morfológicas, como macrocefalia, astenozoospermia e globozoospermia têm sido relacionadas a altas taxas de aneuploidia (VIALARD ET AL, 2008). Uma dosagem desequilibrada de cromossomos geralmente resulta em inviabilidade do embrião, sendo, na maioria dos seres vivos, rara a presença de não-disjunção durante a meiose. É estimado que mais de 60% das concepções são aneuplóides, sendo que, na grande maioria, evoluem para abortos espontâneos (HASSOLD ET AL, 1993).
I. 4. Cromossomos 9, X e Y
Segundo Hassold e colaboradores (1996), as aneuploidias dos cromossomos sexuais são duas vezes mais frequentes do que as autossômicas, porque os cromossomos X e Y são considerados mais suscetíveis à não-disjunção na meiose masculina, por apresentarem apenas um quiasma durante a meiose I.
Heterocromatina é a região cromossômica inativa, que se apresenta bastante compactada, e tem a replicação mais tardia durante as divisões celulares (GERSEN e KEAGLE, 2005), sendo encontrada em cerca de 20% do genoma humano (PIECZARKA e MATTEVI, 1998). Existem dois tipos de heterocromatina: a heterocromatina constitutiva,
que são seqüências repetitivas de bases nitrogenadas localizadas na região do centrômero e na parte distal do cromossomo Y e a heterocromatina facultativa, que consiste em regiões no genoma inativas epigeneticamente em períodos específicos do ciclo celular, como por exemplo o cromossomo X de todas as células femininas que é aleatoriamente inativado (GERSEN e KEAGLE, 2005).
A variação existente nas regiões de heterocromatina entre os indivíduos é chamada de heteromorfismo, e é considerada um tipo de polimorfismo. Os polimorfismos são variações genéticas não previamente existentes, que alcançam uma freqüência de pelo menos 1 % na população. Estudos evidenciaram uma taxa de 1,9% de heteromorfismo em pacientes que sofreram abortos espontâneos e 6,25% em pacientes inférteis (MARTELLI ET AL, 2001; CAGLAYAN, 2010). De acordo com Rodriguez e colaboradores (2011), a heterocromatina conteria regiões genômicas relacionadas à fertilidade e viabilidade dos embriões.
A heterocromatina constitutiva apresenta mais polimorfismos nos cromossomos 1, 9, 16 e Y, mas como não há genes transcritos nessas áreas, não ocorreriam alterações fenotípicas aparentes (GERSEN e KEAGLE, 2005). No entanto, essas regiões estão altamente relacionadas com a regulação da recombinação, formação do complexo
sinaptonêmico, ancoragem de proteínas e estruturas específicas como coesinas e cinetócoro, sendo importantes para a manutenção do centrômero e correta segregação meiótica e mitótica (PIECZARKA e MATTEVI, 1998), que determinam o aparecimento das aneuploidias.
O maior grau de heteromorfismo é encontrado no cromossomo 9, principalmente na região da constrição secundária. Isso ocorre devido a recombinações meióticas desiguais envolvendo as sequencias repetitivas presentes na região de heterocromatina. Além disso, o heteromorfismo também pode se originar devido a permutas desiguais envolvendo sequencias eucromáticas tanto no braço curto, quanto no longo (PARK ET AL, 1998).
A investigação de aneuploidias e suas conseqüências sob a fertilidade masculina é de extrema importância, a fim de evitar altas taxas de falhas na implantação e desenvolvimento anômalo do embrião. Como os cromossomos 9, X e Y são os mais suscetíveis à falhas na disjunção e apresentam maior probabilidade de ocorrência de aneuploidias, nosso objetivo foi detectar a freqüência de aneuploidias nesses pares cromossômicos, relacionando-a com as falhas de implantação embrionária.
II. JUSTIFICATIVA
Espermatozóides aneuplóides têm impacto sobre o sucesso das técnicas de reprodução assistida, visto que após ocorrer fertilização, determinam os primeiros estágios de desenvolvimento do embrião, sendo responsáveis por baixas taxas de implantação embrionária e predispondo a abortamentos no primeiro trimestre, com conseqüente baixa taxa de gravidez (BURRELLO ET AL., 2003). A implantação de embriões aneuplóides, quando ocorre, é lenta ou anormal (MACKLON ET AL., 2002). Falhas recorrentes de implantação são também associadas à alta taxa de aneuploidias em oócitos, e em apenas 40% dos casos estão relacionadas com anormalidades uterinas e/ou baixa qualidade do sêmen (URMAN ET AL., 2005).
Relatos da literatura sugerem que o heteromorfismo cromossômico aumenta o risco de embriões aneuploides, já que uma maior região de heterocromatina pode acarretar erros no pareamento e disjunção cromossômica (NIELSEN ET AL., 1974). Pieczarka e Mattevi (1998) determinaram que os cromossomos que mais apresentam heterocromatina são o 9 e o Y, e que, os cromossomos sexuais são os mais suscetíveis a sofrerem disjunção incorreta devido a sua morfologia. Sendo assim, consideramos que o estudo dos cromossomos 9, X e Y é importante para a detecção de aneuploidias e seus efeitos sobre a
fertilidade. Propomos realizar análise citogenética convencional para determinação do cariótipo somático dos pacientes e análise citogenética molecular destes pares cromossômicos em amostra de esperma, visando correlacionar a freqüência de aneuploidias cromossômicas à taxa de implantação embrionária em casais inférteis.
III. OBJETIVOS
O objetivo principal deste projeto foi correlacionar a freqüência de aneuploidias dos cromossomos 9, X e Y em células germinativas masculinas com a taxa de implantação embrionária em casais inférteis submetidos a técnicas de reprodução assistida.
Objetivos Específicos
Definição do diagnóstico citogenético dos homens inférteis, sendo o cariótipo somático obtido por análise cromossômica pela técnica de bandeamento GTG.
Definição do diagnóstico citogenético molecular das aneuploidias dos cromossomos 9, X e Y em células germinativas masculinas, por meio da técnica de FISH em espermatozoides.
Investigar correlação entre aneuploidias cromossômicas em espermatozoides e taxa de implantação embrionária em casais inférteis.
IV. MATERIAL E MÉTODOS
IV. 1. MATERIAL IV. 1. 1. Casuística
Foram investigados 22 casais com diagnóstico de infertilidade, encaminhados ao Ambulatório de Infertilidade (AEST) do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina (HC-FMRP) da Universidade de São Paulo. Após protocolo de investigação, foram selecionados os casais com infertilidade por fator masculino ou infertilidade sem causa aparente.
Os pacientes foram informados e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido aprovado pelo CEP (HCRP n° 5465/2008) referente à participação no projeto (Apêndice).
Para correlação entre os achados citogenéticos, foi necessário pesquisar os prontuários dos pacientes e de suas esposas para obter informações como: idade do casal, resultado do espermograma, presença de outra doença que possa interferir na análise, resultado de testes hormonais, ultrassonográficos e diagnóstico de gravidez. Essas informações integram a anamnese aplicada para diagnóstico de infertilidade e as informações clínicas foram fornecidas pela profa. dra. Rosana Maria dos Reis, responsável pelo Ambulatório de Infertilidade.
Os resultados obtidos foram disponibilizados no prontuário dos pacientes.
IV. 1. 2. Amostra Sangue periférico
Para o estudo citogenético convencional e determinação do cariótipo somático dos pacientes foram utilizados linfócitos extraídos de sangue periférico por venopunção. Uma amostra de 5ml de sangue de cada paciente foi coletada em tubos Vacutainer® contendo heparina sódica. Todas as amostras, em total de 44, foram processadas no Laboratório de Citogenética Humana do Departamento de Genética da FMRP-USP.
Esperma
Foram analisadas amostras de sêmen de 22 homens, coletadas no Laboratório de Ginecologia Endócrina do HC-FMRP, em colaboração com o prof. dr. Rui Alberto Ferriani, responsável pelo grupo de Reprodução Humana da FMRP-USP. As amostras de esperma foram processadas no Laboratório de Citogenética Molecular Humana do Departamento de Genética da FMRP-USP (bloco C) e utilizadas exclusivamente para esta pesquisa, sendo descartadas segundo o protocolo da OMS.
IV. 2. MÉTODOS
IV. 2. 1. Citogenética Clássica
Técnica de cultura temporária de linfócitos (MOORHEAD et al., 1960 modificada)
As amostras de sangue periférico (500 ul) foram cultivadas em 5 ml de meio RPMI-1640 com L-glutamina, 2% de fitohemaglutinina, 1,2% de estreptomicina/penicilina, e 20% soro bovino fetal em estufa a 37°C por 72 horas. As células foram bloqueadas em metáfase após 71 horas e meia por meio da adição de 250 ul de colchicina a 0,0016%. Após trinta minutos, foi realizada centrifugação a 1000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi retirado e adicionados 5 ml de solução hipotônica (KCL 0,075M) a 37° C, seguido de incubação em banho maria por 10 minutos. Foram então adicionadas 10 gotas de solução Carnoy (3 metanol: 1 ácido acético) para bloquear a ação da solução hipotônica e após homogeneização, realizada centrifugação a 1000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi retirado, iniciando-se a fase de fixação com adição de 5 ml de solução de Carnoy. O material foi homogeneizado e deixado em repouso por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugado a 1000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante removido, repetindo este procedimento mais duas vezes. A suspensão celular foi armazenada em tubos cônicos a -20°C. As células em metáfase obtidas a partir da suspensão celular foram
transferidas para lâminas e coradas por 5 minutos com corante Giemsa (Merck) em tampão fosfato 0,06M pH=6,8 (1:30) para análise citogenética convencional. Uma gota de suspensão celular de cada amostra foi transferida para uma lâmina para obtenção do bandeamento GTG. Esta lâmina foi submetida a um tratamento com solução de tripsina (DIFCO 1:250) diluída a 0,1% em tampão fosfato (0,06 M, pH=6,8) e corada por corante Giemsa (SCHERES, 1972). Foram analisadas 100 metáfases de cada amostra a fim de descartar a hipótese de mosaicismo cromossômico a nível de 3% (HOOK et al., 1977). A análise foi realizada em microscópio Axiophoto (Zeiss), com objetiva PlanApo100X, acoplado a sistema computarizado de análise MetaSystem, utilizando software IKARO para documentação dos resultados.
Coloração DAPI
A técnica de coloração DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindol) foi utilizada para evidenciar possíveis heteromorfismos. As lâminas foram colocadas em solução 0,4xSSC IGEPAL, à temperatura de 72ºC por 10 minutos com agitação. Posteriormente foram imersas em 2xSSC por 5 minutos à temperatura ambiente. Foi então utilizado o contracorante DAPI incluir o nome completo (75ng/ml) diluído em antifade (Vector, CA), na proporção de 1:1.
IV. 2. 2. Citogenética Molecular
Técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH) em Espermatozóides
As amostras de sêmen fresco foram coletadas em frascos estéreis e imediatamente pré-tratadas com solução de 0,01M/0,9% NaCl e centrifugadas a 800 rpm durante 5 minutos por três vezes. As lâminas foram confeccionadas com 5 µl da amostra, secas em temperatura ambiente e desidratadas e fixadas em metanol 80%.
Pré-tratamento dos espermatozóides
O DNA do núcleo dos espermatozóides necessita de tratamento específico para desestabilizar as protaminas e permitir acesso das sondas aos cromossomos. Para a descondensação do núcleo deste gameta foi utilizado o agente redutor 10 mM DTT (dithiothreitol) em 0,1 M Tris, que induz a redução das pontes de dissulfeto e LIS (lithium diidosalicylic acid) para manter a forma oval da cabeça do espermatozóide. As lâminas foram posteriormente mergulhadas em solução 2xSSC e lavadas por 20 minutos em solução de metanol 80% a -20ºC. Após esta etapa, as lâminas permaneceram em temperatura ambiente.
Técnica de FISH
Foram utilizadas as sondas dos cromossomos 9, X e Y (Cytocell,UK), adicionadas às lâminas, cobertas por lamínulas, denaturadas a 75ºC por 5 minutos e posteriormente incubadas no sistema Thermobrite (Abbott Molecular, US), overnight a 37°C. No segundo dia, as lâminas foram banhadas em 0,4XSSC IGEPAL à 72ºC por dois minutos, com agitação, e posteriormente em solução de 2XSSC à temperatura ambiente por cinco minutos. O contracorante utilizado foi o DAPI (75ng/ml) diluído em antifade (Vector, CA).
Para a análise, utilizamos o microscópio de epifluorescência Olympus BX-40 acoplado a sistema computadorizado de análise no Laboratório de Citogenética do HC-FMRP. Pelo menos 1000 espermatozóides para cada sonda cromossômica de cada paciente foram analisados.
IV. 2. 3. Análise Estatística
As análises estatísticas foram feitas utilizando modelos lineares generalizados através do Proc Genmod (SAS, 2003), assumindo uma distribuição de Poisson dos dados. Foram incluídos como variáveis no modelo os grupos que tiveram sucesso de gravidez e aqueles que não obtiveram. Foram considerados como significativos os resultados que apresentaram P<0,05.
V. RESULTADOS
V. 1. Estudo citogenético convencional
A investigação citogenética foi realizada em 22 homens, membros de casais submetidos a técnicas de reprodução assistida.
O diagnóstico citogenético foi normal, com cariótipo 46,XY em 20 pacientes (90,91%). A figura 1 mostra um cariótipo normal para o sexo masculino. Foram detectados dois pacientes do sexo masculino com alterações cromossômicas, consideradas variantes da normalidade. O paciente 4 apresentou polimorfismo da região heterocromática do braço longo do cromossomo 9 e no paciente 6 foi detectada presença de satélite no braço curto do cromossomo 22. As figuras 2 e 3 correspondem aos cariótipos desses pacientes.
As imagens dos demais cariótipos encontram-se relacionadas no Apêndice.
Figura 1: Cariótipo 46,XY normal correspondente ao paciente 17, por técnica de bandamento GTG.
Figura 2: Cariótipo 46,XY,9qh+ correspondente ao paciente 4, por técnica de bandamento GTG.
Figura 3: Cariótipo 46,XY,22ps+ correspondente ao paciente 6, por técnica de bandamento GTG.
A técnica de coloração DAPI foi utilizada para caracterização da região heterocromática do cromossomo 9 no paciente 4, como mostra a figura 4.
Figura 4: Metáfase do paciente 4 corada com DAPI (Vector, CA). A seta vermelha evidencia o polimorfismo da região heterocromática do braço longo (9qh+) e a seta verde corresponde ao cromossomo 9 normal .
V. 2. Estudo citogenético molecular
A técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH) em espermatozoides foi realizada em 13 dos 22 homens participantes do estudo.
A figura 5 mostra marcações correspondentes às regiões específicas dos cromossomos 9, X e Y após a realização da técnica de FISH, compatível com normalidade. O sinal vermelho corresponde à região centromérica do cromossomo X, o sinal verde corresponde à região de heterocromatina do cromossomo Y e o sinal amarelo, as regiões centromérica e heterocromática do cromossomo 9.
Figura 5: Espermatozóides submetidos a técnica de FISH utilizando sondas (Cytocell,UK) para os cromossomos X (sinal vermelho), Y (sinal verde) e 9 (sinal amarelo gerado pela combinação de sondas verdes e vermelhas). a) Espermatozoides apresentando um cromossomo X, e um 9 (sondas Cytocell, UK) b) Espermatozoide contendo um cromossomo Y e um cromossomo 9.
A figura 6a evidencia aneuploidia dos cromossomos sexuais e a figura 6b mostra diploidia, com dois sinais correspondentes ao cromossomo 9, um sinal correspondente ao cromossomo X e um sinal correspondente ao cromossomo Y.
Figura 6: Espermatozóides submetidos a técnica de FISH utilizando sondas (Cytocell,UK) para os cromossomos X (sinal vermelho), Y (sinal verde) e 9 (sinal amarelo gerado pela combinação de sondas verdes e vermelhas). a) Espermatozoide apresentando um cromossomo Y, um X e um 9 (sondas Cytocell, UK) b) Espermatozoide diploide, contendo duas cópias do cromossomo 9, uma do X e uma do Y.
As Tabelas 1 e 2 contêm os resultados obtidos após análise da hibridação em espermatozoides, incluindo as médias de cada grupo e os desvios padrões.
Tabela 4: Número de espermatozoides normais, com dissomias e diploidias identificadas por técnica de FISH utilizando sondas dos cromossomos 9, X e Y.
Frequência de Dissomias e Diploidias
X9 Y9 XY XX YY 99 XY99 XX99 YY99 Aneuploidia Total Total
Gravidez + 1 493 496 3 1 0 1 1 1 1 5 997 5 500 503 1 2 0 1 1 0 0 4 1008 7 532 476 7 1 0 3 1 0 0 11 1020 13 503 510 3 1 1 1 1 0 0 6 1020 17 512 487 3 0 1 2 3 0 0 6 1008 22 516 491 3 0 0 1 1 0 0 4 1012 Média 509,333 493,833 3,333 0,833 0,333 1,500 1,333 0,167 0,167 6,000 1010,833 Desvio Padrão 13,852 12,024 1,966 0,753 0,516 0,837 0,816 0,408 0,408 2,608 8,681 Gravidez - 2 537 454 4 2 1 4 6 0 0 11 1008 3 480 535 2 1 1 2 1 0 0 6 1028 14 522 479 3 0 1 1 3 0 0 5 1009 16 516 516 2 0 1 5 2 0 0 8 1042 19 466 507 9 3 2 7 6 0 0 21 1000 20 527 466 3 0 0 3 1 0 2 6 1002 21 533 474 10 2 0 4 5 0 0 16 1044 Média 511,571 490,143 4,714 1,143 0,857 3,714 3,429 0,000 0,286 10,429 1019,000 Desvio Padrão 27,525 29,549 3,352 1,215 0,690 1,976 2,225 0,000 0,756 6,024 18,735
Tabela 5: Porcentagem de espermatozoides normais, com dissomias e diploidias identificadas por técnica de FISH utilizando sondas dos cromossomos 9, X e Y.
Frequência de Dissomias e Diploidias (em %)
X9 Y9 XY XX YY 99 XY99 XX99 YY99 Aneuploidia Total Total
Gravidez + 1 49,448 49,749 0,301 0,100 0,000 0,100 0,100 0,100 0,100 0,502 100 5 49,603 49,901 0,099 0,198 0,000 0,099 0,099 0,000 0,000 0,397 100 7 52,157 46,667 0,686 0,098 0,000 0,294 0,098 0,000 0,000 1,176 100 13 49,314 50,000 0,294 0,098 0,098 0,098 0,098 0,000 0,000 0,588 100 17 50,794 48,313 0,298 0,000 0,099 0,198 0,298 0,000 0,000 0,893 100 22 50,988 48,518 0,296 0,000 0,000 0,099 0,099 0,000 0,000 0,395 100 Média 50,387 48,854 0,330 0,082 0,033 0,148 0,132 0,016 0,016 0,594 100 Desvio Padrão 1,123 1,296 0,192 0,075 0,051 0,082 0,081 0,041 0,041 0,254 0,000 Gravidez - 2 53,274 45,040 0,397 0,198 0,099 0,397 0,595 0,000 0,000 1,091 100,00 3 46,693 52,043 0,195 0,097 0,097 0,195 0,097 0,000 0,000 0,584 100,00 14 51,734 47,473 0,297 0,000 0,099 0,099 0,297 0,000 0,000 0,793 100,00 16 49,520 49,520 0,192 0,000 0,096 0,480 0,192 0,000 0,000 0,768 100,00 19 46,600 50,700 0,900 0,300 0,200 0,700 0,600 0,000 0,000 2,700 100,00 20 52,595 46,507 0,299 0,000 0,000 0,299 0,100 0,000 0,200 0,599 100,00 21 51,054 45,402 0,958 0,192 0,000 0,383 0,479 0,000 0,000 1,533 100,00 Média 50,203 48,100 0,463 0,112 0,084 0,365 0,336 0,000 0,028 1,023 100 Desvio Padrão 2,708 2,705 0,327 0,120 0,069 0,196 0,221 0,000 0,075 0,597 0
Comparando-se as freqüências de espermatozóides com dissomias, as taxas encontradas de gametas portando os dois cromossomos sexuais foram 0,33% + 0,19 no grupo que obteve sucesso na gravidez e de 0,46% + 0,33 no grupo que não engravidou. Não
observamos diferença estatisticamente significante entre eles (P=0,2158). Nos que possuíam duas cópias do cromossomo X foram encontradas as taxas de 0,08% + 0.07 e 0,11% + 0,12 nos mesmos grupos, não obtendo diferença significativa (P=0,5757). Quando comparados aqueles que possuíam duas cópias do cromossomo Y, os valores encontrados foram 0,03% + 0,05 para os que engravidaram e 0,08% + 0,07 para aqueles que não tiveram sucesso, resultados também
não significativos (P= 0,2170).
Já em relação aos espermatozóides com duas cópias do cromossomo 9, as diferenças se apresentaram significativas (P=0,0127), sendo que as taxas encontradas foram 0,15% + 0,08 no grupo com sucesso na gravidez e 0,36% + 0,20 nos que não engravidaram. Os espermatozóides diplóides (XY99) também apresentaram uma diferença significativa (P=0,0136), visto que as freqüências encontradas entre os grupos foram 0,13% + 0,08 e 0,34% + 0,22. Entre os demais grupos (XX99 e YY99) não foram observados valores significativos (P=0,2137 e
A média de aneuploidias totais no grupo que não obteve gravidez foi de 1,02% + 0,60, maior do que os 0,59% + 0,25 encontrados entre aqueles com sucesso nas técnicas de reprodução assistida, valores que também apresentam diferença significativa (P=0,0054).
V. 3. Análise dos Espermogramas e Taxas de Implantação As Tabelas 3 e 4 dos anexos trazem os valores obtidos nos exames de espermograma dos 22 homens avaliados no serviço de Reprodução Assistida do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP. Esses pacientes foram divididos em dois grupos, de acordo com a concentração espermática.
Para posterior comparação, foram coletados os dados referentes às taxas de fertilização e implantação após a técnica de reprodução assistida das esposas desses pacientes, apresentados na Tabela 5 do anexo.
VI. DISCUSSÃO
Aproximadamente 8,1% de todas as gravidezes clinicamente reconhecidas apresentam algum tipo de anormalidade cromossômica numérica (~ 7%) ou estrutural (~ 1%) (TEMPLADO ET AL, 2005). A frequência de anomalias cromossômicas é de aproximadamente 50% em abortos espontâneos, 6% em natimortos e 1% em nascidos vivos (JACOBS, 1992). Adicionalmente, pacientes inférteis que procuram serviços de Reprodução Humana são considerados um grupo de risco do ponto de vista genético, por apresentarem baixa qualidade espermática, considerada indicativo de alterações cromossômicas.
É bem reconhecido que homens inférteis têm de 8 a 10 vezes maior prevalência de anomalias cromossômicas que os férteis, sendo que frequentemente não apresentam outras características fenotípicas. Em uma revisão de 11 estudos envolvendo 9766 pacientes oligo e azoospérmicos, as anomalias autossômicas e sexuais foram encontradas em 4,2 e 1,5% dos homens, respectivamente, em comparação com 0,14 e 0,25% detectadas no grupo controle (MCLACHLAN e O’BRYAN, 2010).
Em nosso estudo, dos 22 homens inférteis analisados, dois apresentaram cariótipo alterado confirmado pela técnica de bandeamento GTG (9,09%). Dos casos positivos encontrados, um
paciente apresentou polimorfismo caracterizado por satélite no braço curto do cromossomo 22 em todas as metáfases analisadas (cariótipo 46, XY, 22ps+). As variações polimórficas são conhecidas por ocorrer na população em geral, incluindo diferentes tamanhos dos blocos de heterocromatina, satélite ou regiões de sequência de repetição e inversões (SHAFFER ET AL, 2009).
Nenhuma função específica tem sido associada com os segmentos de satélite (ps+), no entanto, os resultados obtidos por Chopade e colaboradores (2012) sugerem que tais variações no cromossomo 22 podem estar relacionadas com abortamentos espontâneos. Isso ocorreria devido à alteração tornar o feto suscetível a translocações, responsáveis por consequente perda fetal. Resultados semelhantes foram encontrados por Purandare e colaboradores (2011), que evidenciaram tal alteração em 14,04% dos pacientes, todos apresentando má história obstétrica, com abortamentos no primeiro trimestre gestacional (62,5%).
Essa alteração cromossômica ou variante da normalidade também já foi relacionada com casos de oligozoospermia e azoospermia. No estudo de Christofolini e colaboradores (2012), foram encontrados seis pacientes com baixa qualidade espermática relacionada ao cariótipo 22ps+. O aumento das taxas de polimorfismos
cromossômicos tem sido relacionado à infertilidade masculina, sendo demonstrado que pode afetar a formação dos espermatozoides. Isso ocorre possivelmente devido a essas variações heterocromáticas levarem ao silenciamento de genes que são normalmente expressos nas regiões afetadas, relacionados à espermatogênese e a fertilidade masculina (MINOCHERHOMJI ET AL, 2009).
O paciente 4 apresentou polimorfismo da região heterocromática do braço longo do cromossomo 9 em todas as metáfases analisadas. Essa região também é relacionada com casos de perdas fetais e baixa qualidade espermática. Yakin e colaboradores (2005) analisaram 210 homens inférteis e encontraram variações heterocromáticas em 10,9% deles, sendo que 60,9% desses pacientes apresentavam polimorfismo no cromossomo 9. A alta frequência de variantes cromossômicas em homens inférteis reforça a hipótese de que os polimorfismos de regiões heterocromáticas podem desestabilizar o emparelhamento de cromossomos e causar interrupção da meiose, resultando em infertilidade (LISSITSINA ET AL, 2003).
Uma pesquisa anterior realizada em nosso laboratório identificou o polimorfismo da região heterocromática do cromossomo 9 em 9,1% da amostra, sugerindo associação entre a variante da normalidade e a ocorrência de abortamentos espontâneos (MARTINS,
2000). Falhas reprodutivas nesses indivíduos podem ser explicadas pela diminuição quantitativa da espermatogênese, aumento do risco de não-disjunção meiótica em outros pares de cromossomos e alterações em algumas sínteses de RNA durante a meiose que resultariam em distúrbios metabólicos durante a formação dos gametas, causando malformações fetais (BOUÉ ET AL, 1975).
Em relação ao tratamento por técnica de reprodução assistida, nenhum dos dois pacientes com heteromorfismo cromossômico obteve sucesso, não ocorrendo gestação durante este ciclo. Nossos resultados são concordantes com Yakin e colaboradores (2005), que sugeriram que a expectativa de um resultado positivo em técnicas de reprodução assistida é menor para os homens com polimorfismo de heterocromatina, pois este grupo apresentou maiores taxas de falhas de implantação e menores taxas de gravidez.
A aplicação das técnicas avançadas de reprodução assistida, como a injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) é uma alternativa para casais inférteis para contornar a infertilidade masculina. Com o uso desta técnica, mesmo homens com baixos parâmetros seminais podem ter seus espermatozoides utilizados com sucesso para fertilização. A utilização de ICSI tem gerado preocupação sobre os riscos potenciais associados a esta técnica, pois algumas das anomalias
genéticas observadas em crianças nascidas após ICSI podem ser derivadas de predisposição presente em um dos pais (KREMER ET AL, 1997). Com base no aumento da incidência de anomalias cromossômicas em homens inférteis, a análise citogenética é amplamente recomendada para o casal submetido à ICSI, a fim de evitar que essas alterações sejam transmitidas para a próxima geração. Deste modo, é recomendado incluir o cariótipo como exame de rotina em homens inférteis com graves defeitos de espermatogênese, sem etiologia definida.
Além disso, muitas das alterações encontradas nos descendentes de casais que passaram pelas técnicas de reprodução assistida surgem de novo, sem alteração cromossômica dos pais (VAN OPSTAL ET AL, 1997). Estudos anteriores com casais submetidos à técnica de ICSI descreveram 95,71% dos homens inférteis com cariótipo normal (MOREL ET AL, 2002), sendo que a maioria dos rearranjos cromossômicos encontrados nos espermatozoides é resultado de erros meióticos durante a gametogênese de pais com cariótipo normal (TEMPLADO ET AL, 2005).
O uso da técnica de FISH em espermatozoides permite a triagem de anormalidades numéricas e estruturais dos cromossomas específicos em um grande número de células. Recentemente, Shi e
Martin (2000) examinaram a frequência e distribuição de aneuploidias em espermatozoides de homens normais analisados por FISH de duas ou três cores. A frequência média de dissomia foi de 0,15% para cada um dos autossomos e 0,26% para os cromossomos sexuais.
Em um estudo realizado anteriormente em nosso laboratório detectamos uma frequência de 0,58% de dissomias dos cromossomos 9, X e Y em indivíduos considerados férteis (JUCHNIUK DE VOZZI, 2010). Em nosso projeto, comparando indivíduos inférteis que tiveram sucesso ou não na tentativa de engravidar, encontramos diferenças nas taxas de dissomias entre o grupo que obteve sucesso na implantação, quando comparado a aqueles que não tiveram sucesso. A média de aneuploidias totais no grupo que não obteve gravidez foi de 1,02%, maior do que os 0,59% encontrados entre aqueles com sucesso nas técnicas de reprodução assistida, valores que apresentam diferença significativa (P=0,0054).
As consequencias da aneuploidia espermática determinando infertilidade, assim como seus efeitos sobre os resultados obtidos por técnicas de reprodução assistida permanecem desconhecidos. A maioria das aneuploidias encontradas em embriões é predominantemente originada da não-disjunção cromossômica proveniente da mãe (95%) ou possui origem mitótica, com a exceção de
aneuploidias dos cromossomas sexuais, que são de origem paterna em 50% a 100% dos casos (HASSOLD ET AL, 1993). Estudos demonstram que todos os homens têm uma proporção de espermatozoides aneuploides em seu ejaculado, aproximadamente de 3% a 5% (TEMPEST e GRIFFIN, 2004; SHI e MARTIN, 2000). A grande maioria dos estudos relata uma taxa três vezes mais alta nos níveis de aneuploidia de espermatozoides em homens inférteis. Aumentos de aneuploidia espermática têm sido relatados em todos os fenótipos de infertilidade, incluindo oligozoospermia, astenozoospermia e teratozoospermia (HARTON e TEMPEST, 2012).
Falhas recorrentes de implantação também têm sido associadas com aumento da taxa de oócitos aneuploides. Uma triagem genética pré-implantacional em embriões confirmou o aumento da taxa de aneuploidia em casos de falha recorrente de implantação (KAHRAMAN ET AL, 2004). Vialard e colaboradores (2006) sugeriram que a separação cromossômica anômala parece estar envolvida em 48% dos casos de falha recorrente de implantação, após investigação de cinco pares cromossômicos. Em nosso estudo, avaliando os cromossomos 9, X e Y, sugerimos que existe influência das taxas de aneuploidias sobre as taxas de implantação, visto que o grupo que não
obteve sucesso reprodutivo é o mesmo que apresenta as maiores frequências de aneuploidias (1,02%).
A análise da segregação meiótica dos cromossomos sexuais indica que se o erro meiótico ocorreu na meiose I, na qual há a separação dos cromossomos homólogos, pode ser identificada se os dois cromossomos sexuais encontram-se no mesmo espermatozoide, ou na meiose II, na qual ocorre a separação das cromátides irmãs, quando ambas as cópias do mesmo cromossomo são identificadas no mesmo gameta.
Em nosso estudo, apesar de não terem sido diferenças significativas, as taxas de dissomias dos cromossomos sexuais (erros na meiose I) foram as mais altas, em média 0,33% no grupo com resultado positivo em relação a gravidez, enquanto que no grupo que não obteve sucesso a média foi de 0,46%. É durante a meiose I que ocorre o pareamento cromossômico. Os cromossomos sexuais, que possuem menor tamanho do complexo sinaptonêmico e poucos pontos de recombinação, acabam se tornando mais suscetíveis a erros na segregação durante a espermatogênese (SUN ET AL, 2008). Além disso, a maturação dos espermatozoides é mais tolerante a erros de segregação envolvendo cromossomos sexuais em comparação com os autossomos (KIRKPATRICK ET AL, 2008).
Entre os grupos, as médias de dissomias do cromossomo 9 foram as que apresentaram maior variação: 0,36% nos que não engravidaram e 0,15% nos que alcançaram a gestação, tendo variação significativa (P=0,0127). Além disso, outro dado que pudemos observar foi a maior frequência de dissomias encontrada nos pacientes oligozoospérmicos. Esse dado corrobora a hipótese de que esse cromossomo, pelo fato de ser mais suscetível a falhas na segregação cromossômica por possuir um grande bloco de heterocromatina, influencia fortemente a espermatogênese, já que erros na disjunção causam aumento nas taxas de apoptose e malformação espermática, confirmando a relação entre baixos parâmetros seminais e baixas taxas de implantação embrionária.
Também pudemos observar que os indivíduos que não obtiveram gravidez apresentaram aumento significativo (P=0,0136) de diploidias XY99, como descrito anteriormente por nosso grupo de pesquisa em pacientes oligozoospérmicos (JUCHNIUK DE VOZZI ET AL, 2009). Alterações na concentração e morfologia apresentaram também correlação direta com o número de células diplóides, já detectada em pacientes com globozoospermia (DITZEL ET AL, 2005).
Rodrigo et al (2010) sugerem que mesmo um pequeno aumento da frequência de dissomias em espermatozoides é o suficiente
para gerar impactos negativos no tratamento por técnicas de reprodução assistida, resultando na geração de um alto número de embriões com aneuploidias. Nossos resultados sugerem a relação entre falhas recorrentes de implantação com aneuploidias em espermatozoides, mostrando que a triagem gamética para detecção de aneuploidias poderia evitar falhas na implantação embrionária, abortamentos e formação de fetos com anormalidades cromossômicas.
VII. CONCLUSÕES
- As técnicas de citogenética clássica permitiram a definição dos cariótipos dos homens inférteis, tendo sido encontrados dois pacientes com alterações cromossômicas relacionadas ao diagnóstico de infertilidade.
- A utilização das técnicas de citogenética molecular permitiu a detecção de aneuploidias dos cromossomos 9, X e Y em espermatozoides, com resultados significativos evidenciando maiores taxas de aneuploidia em casais em que não houve gestação.
- Sugerimos correlação entre taxas de aneuploidias e taxas de implantação, visto que o grupo que não obteve sucesso reprodutivo apresentou maiores frequências de aneuploidias cromossômicas.
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