CAMPUS
DE
SINOP
INSTITUTO
DE
CIÊNCIAS
AGRÁRIAS
E
AMBIENTAIS
CURSO
DE
AGRONOMIA
FUNGITOXIDADE
DE
EXTRATOS
DE
SECREÇÕES
DE
SAPOS
SOBRE
FITOPATÓGENOS
ISOLADOS
DE
CROTALÁRIA
JULIA
VINCENSI
DONATO
SINOP – MT
Março – 2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
CAMPUS DE SINOP
INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS
CURSO DE AGRONOMIA
FUNGITOXIDADE
DE
EXTRATOS
DE
SECREÇÕES
DE
SAPOS
SOBRE
FITOPATÓGENOS
ISOLADOS
DE
CROTALÁRIA
JULIA VINCENSI DONATO
PROF.ª DR.ª SOLANGE MARIA BONALDO
Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) apresentado ao Curso de Agronomia do ICAA/CUS/UFMT, como parte das exigências para a obtenção do Grau de Bacharel em Agronomia.
SINOP – MT
Março – 2016
Dedicatória
Dedico este trabalho aos meus pais, Ironi Donato e Sandra Donato, por me incentivarem a buscar conhecimento e ir atrás dos meus sonhos. Aos meu irmãos Fernando
Donato e Vitoria Donato, que me apoiaram na decisão de cursar Agronomia. E ao meu namorado Alan Pedro que me acompanhou e ajudou em toda essa etapa.
Agradecimentos
O principal agradecimento será sempre a Deus, que me guia todos os dias, em todos os meus sonhos.
Obrigada Pai, por me ensinar a amar trabalhar e trabalhar por amor, todos os seus ensinamentos estão guardados no meu coração, sempre lembrarei de você até nos pequenos detalhes. Você é um exemplo de homem para mim e tem um coração do tamanho do mundo que ama a todos do seu jeito especial. Mãe, você me deu a oportunidade de estar aqui hoje, e a cada dia que passa admiro mais a mulher incrível que você é, me ensinou que o amor é que nos move, e que o amor é a solução para tudo, você sempre será minha inspiração.
Aos meus irmãos “Mano” e “Toia”, que sempre serão meus protetores, pois fui felizarda de ser a filha do meio. Ter um irmão mais velho, que sempre me deixava participar das brincadeiras de meninos, mas sendo a “café com leite”, e hoje me aconselha no que eu precisar. Ter uma irmã mais nova para brincar de boneca e as vezes brigar um pouco. Os dois são minhas paixões, por mais que as vezes tivéssemos algumas briguinhas, sempre terá aquele momento que as brincadeiras e piadas são mais importantes que qualquer coisa.
Ao meu namorado Alan Pedro, que foi uns dos maiores presentes da graduação, foi meu colega de estudos e de diversão, me deu conselhos e puxões de orelha quando foram necessários e participou de todos os momentos dentro e fora da universidade. Agradeço por todo companheirismo e carinho durante esse tempo, e desejo que sejam para vida toda.
Não poderia esquecer de agradecer a minha orientadora Solange Maria Bonaldo, que além de ser orientadora, é alguém especial para a vida, companheira de festas e conselheira de todos os assuntos. A pessoa que sabe ser exigente da forma mais delicada que já vi, que se faz de durona, mas tem um coração apaixonado e sincero. Quem confiou em mim quando nem eu mesma confiava, serei eternamente grata por me oferecer essa oportunidade de trabalhar com você e poder conhecer a pessoa incrível que tem atrás das opiniões das pessoas.
Agradecer minha segunda família, que conheci na melhor turma de agronomia dessa universidade, com eles passei muitas horas juntos, estudando, comemorando aniversários, comemorando a vida, só porque precisávamos de algum motivo para nos reunirmos e fazer um churrasco. Vou levar amizades muito valiosas, cada uma com suas características, obrigada, Jaqueline Silva, Ana Paula Zaiatz, Anderson Barzotto, Renato Melegari, Ricardo de Toni e Gabriel Pelozo, por serem os melhores colegas e amigos da graduação, e agora da vida. Tiveram também aqueles agregados da grande família, que se tornaram grandes amigos e que quero levar para vida toda, Camila Rocco com sua espontaneidade e
sinceridade em dar conselhos e Lorrayne Oliveira, com sua calma e serenidade até mesmo em momentos tensos.
Aos meus colegas de laboratório, que estavam no dia a dia fazendo companhia, e colaborando para a realização do meu trabalho de todas as formas, Gislaine de Oliveira, Airton Lima, Livia Raasch, Ana Gabriela Verçosa, Wesley Dantas, Mário Colares, Wisney Fontenele, Valdeir Souza, obrigada.
Ao Rinaldo Alexandre por fornecer as fotos dos patógenos
As minhas amigas da escola, que sempre cuidaram da caçula da turma, não poderia ser diferente enquanto estavam longe. Sempre tive quem me protegesse e pudesse me apoiar quando tudo parecia sem rumo, eram elas que me socorriam em meus problemas e que tiravam as dúvidas mais banais, Brunna Gusatti, Rafaele Pelle, Lorena Carvalho, Débora Turra e Isabela Lagemann, obrigada por cada momento juntas, cada brincadeira e conversas sérias. Tenho saudades de quando estávamos perto, mas hoje vejo que nossa amizade amadureceu e é mais forte a cada dia.
E aos amigos que não citei os nomes peço desculpas, pois são muitos, mas sou grata por todas as experiências vividas com vocês, vou leva-las para toda vida, como aprendizado e lembranças felizes.
Ao Professor Gerardo Magela Vieira Júnior, obrigada por me oferecer a oportunidade de trabalhar com os extratos de sapos, e trabalhar em algo tão inovador.
Ao Professor Domingos de Jesus Rodrigues por fornecer os extratos dos sapos para realização do trabalho.
Agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq pela concessão da bolsa PIBIC.
Sumário Dedicatória ... 5 Agradecimentos ... 6 RESUMO ...14 ABSTRACT ...15 1. INTRODUÇÃO ...16 2. REFERENCIAL TEÓRICO ...18 2.1 Crotalaria L. ...18
2.1.1 Crotalaria spectabilis Roth. ...19
2.2 Uso de extratos de secreções glandulares de sapo no controle de fitopatógenos ...20
2.3 Rhaebo guttatus (Schneider, 1799) (Anura: Bufonidae) ...20
2.3.1 Secreções glandulares de Rhaebo guttatus ...21
2.4 Leptodactylus labyrinthicus (Spix, 1824) ...21
2.4.1 Secreções cutâneas de Leptodactylus labyrinthicus ...21
2.5 Fitopatógenos a serem avaliados ...22
2.5.1 Fusarium udum...22
2.5.2 Choanephora infundibulifera ...24
2.5.3 Sclerotium sp. ...26
2.5.4 Curvularia sp. ...27
3. METODOLOGIA ...28
3.1 Obtenção dos Extratos de Secreções Glandulares de Sapos ...28
3.2 Obtenção dos isolados ...28
3.3 Bioensaio de Crescimento Micelial ...28
3.4 Ensaio de esporulação para Fusarium udum, Choanephora infundibulifera e Curvularia sp. ...29
3.5 Contagem de escleródios de Sclerotium sp. ...30
3.6 Bioensaio de Germinação de Esporos para Fusarium udum e Curvularia sp. 30 3.7 Análise estatística ...30
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...31
4.1 Bioensaio de crescimento micelial de fitopatógenos submetidos ao extrato de secreções glandulares S-1 ...31
4.1 Bioensaio de crescimento micelial de fitopatógenos submetidos ao extrato de secreções glandulares S-2 ...36
4.2 Ensaio de esporulação ...42
4.3 Contagem de escleródios de Sclerotium sp. ...43
4.4 Bioensaio de Germinação de esporos de Fusarium udum e Curvularia sp. com extrato de secreções glandulares S-1 ...44
4.5 Bioensaio de Germinação de esporos de Fusarium udum e Curvularia sp. com extrato de secreções glandulares S-2 ...45
5. CONCLUSÕES ...47
6. RECOMENDAÇÕES...47
Lista de Tabelas
Tabela 1. Relação dos peptídeos isolados de Leptodactylus labyrinthicus e suas respectivas atividades biológicas (adaptado de CHAGAS, 2014). ...22 Tabela 2. Esporulação de Fusarium udum, Choanephora infundibulifera e Curvularia sp.
submetida a diferentes concentrações da Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha). ...43 Tabela 3. Esporulação de Fusarium udum e Curvularia sp. submetida a diferentes
concentrações da Substância 2 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha). ...43 Tabela 4. Número de escleródios de Sclerotium sp., submetido a diferentes concentrações
da Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha). ...44 Tabela 5. Número de escleródios de Sclerotium sp., submetido a diferentes concentrações
Lista de Figuras
Figura 1. Macroconídios de Fusarium udum, isolado de Crotalaria spectabilis (FERNANDES, 2016). ...23 Figura 2. Plantas de Crotalaria spectabilis apresentando sintomas de murcha vascular de
Fusarium udum em campo de produção de sementes (BONALDO, 2014). ...24
Figura 3. Área de produção de sementes de C. spectabilis com murcha vascular de
Fusarium udum (Acervo pessoal). ...24
Figura 4. Esporângio (seta vermelha) e conídios (seta amarela) de C. infundibulifera isolada de Crotalaria spectabilis (FERNANDES, 2016). ...25 Figura 5. Inflorescência de Crotalaria spectabilis apresentando sintomas e sinais de
Choanephora infundibulifera em campo de produção de sementes (BONALDO, 2014). ...26 Figura 6. Plantas de Crotalaria spectabilis apresentando sintomas e sinais de Sclerotium sp.
em campo de produção de sementes (DONATO, 2015). ...26 Figura 7. Conídios de Curvularia sp. isolada de Crotalaria spectabilis (FERNANDES, 2016) ...27 Figura 8. Crescimento micelial (cm) in vitro de Choanephora infundibulifera, Fusarium udum,
Sclerotium sp. e Curvularia sp. submetidos a diferentes concentrações da Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott realizado para cada fitopatógeno, ao nível de 5% de probabilidade. (Choanephora infundibulifera CV(%)=6,44; Fusarium udum CV(%)=10,64; Sclerotium sp. CV(%)=7,03; Curvularia sp. CV(%)=13,29). ...31 Figura 9. Porcentagem de inibição do crescimento micelial in vitro de Choanephora
infundibulifera, Fusarium udum, Sclerotium sp. e Curvularia sp. submetidos a diferentes concentrações da Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott realizado para cada fitopatógeno, ao nível de 5% de probabilidade. (Choanephora infundibulifera CV(%)=101,46 Fusarium udum CV(%)=145,7; Sclerotium sp. CV(%)=65,7; Curvularia sp. CV(%)=114,21). ...31 Figura 10. Velocidade do crescimento micelial (cm/dia) in vitro de Choanephora
infundibulifera, Fusarium udum, Sclerotium sp. e Curvularia sp. submetidos a diferentes concentrações da Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott realizado para cada fitopatógeno, ao nível de 5% de probabilidade. (Choanephora
infundibulifera CV(%)=6,4; Fusarium udum CV(%)=12,42; Sclerotium sp. CV(%)=12,42; Curvularia sp. CV(%)=13,31). ...32
Figura 11. Crescimento micelial in vitro de Choanephora infundibulifera submetida a diferentes concentrações da Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha), após 2 dias de incubação. ...33 Figura 12. Crescimento micelial (cm) in vitro de Fusarium udum submetido a diferentes concentrações da Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha), após 6 dias de incubação. ...34 Figura 13. Crescimento micelial de Sclerotium sp. submetido a diferentes concentrações da
Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha), após 3 dias de incubação. ...35 Figura 14. Crescimento micelial (cm) in vitro de Curvularia sp. submetida a diferentes concentrações da Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha), após 4 dias de incubação. ...36 Figura 15. Crescimento micelial (cm) in vitro de Choanephora infundibulifera, Fusarium
udum, Sclerotium sp. e Curvularia sp. submetidos a diferentes concentrações da Substância 2 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott realizado para cada fitopatógeno, ao nível de 5% de probabilidade. (Choanephora infundibulifera CV(%)=12,18; Fusarium udum CV(%)=18,52; Sclerotium sp. CV(%)=12,76; Curvularia sp. CV(%)=8,15). ...38 Figura 16. Porcentagem de inibição in vitro de Choanephora infundibulifera, Fusarium
udum, Sclerotium sp. e Curvularia sp. submetidos a diferentes concentrações da Substância 2 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott realizado para cada fitopatógeno, ao nível de 5% de probabilidade. (Choanephora infundibulifera CV(%)=155,74; Fusarium udum CV(%)=105,86; Sclerotium sp. CV(%)=141,9; Curvularia sp. CV(%)=55,69). ...38
Figura 17. Velocidade do crescimento micelial (cm/dia) in vitro de Choanephora
infundibulifera, Fusarium udum, Sclerotium sp. e Curvularia sp. submetidos a diferentes concentrações da Substância 2 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott realizado para cada fitopatógeno, ao nível de 5% de probabilidade. (Choanephora infundibulifera CV(%)=12,15; Fusarium udum CV(%)=18,32; Sclerotium sp. CV(%)=12,78; Curvularia sp. CV(%)=8,11). ...39 Figura 18. Crescimento micelial (cm) in vitro de Choanephora infundibulifera submetido a
diferentes concentrações da Substância 2 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha), após 2 dias de incubação. ...39
Figura 19. Crescimento micelial (cm) in vitro de Fusarium udum submetido a diferentes concentrações da Substância 2 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha), após 8 dias de incubação. ...40 Figura 20. Crescimento micelial (cm) in vitro de Sclerotium sp. submetido a diferentes concentrações da Substância 2 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha), após 3 dias de incubação. ...41 Figura 21. Crescimento micelial (cm) in vitro de Curvularia sp. submetido a diferentes concentrações da Substância 2 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha), após 3 dias de incubação. ...42 Figura 22. Germinação de esporos de Fusarium udum submetido a diferentes concentrações da Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott, ao nível de 5% de probabilidade. ...45 Figura 23. Germinação de esporos de Curvularia sp. submetido a diferentes concentrações
da Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott, ao nível de 5% de probabilidade. ...45 Figura 24. Inibição da germinação de esporos de Fusarium udum submetido a diferentes
concentrações da Substância 2 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott, ao nível de 5% de probabilidade. ...46 Figura 25. Inibição da germinação de esporos de Curvularia sp. submetido a diferentes
concentrações da Substância 2 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott, ao nível de 5% de probabilidade. ...46
RESUMO
Neste trabalho foram utilizados extratos de secreções glandulares de duas espécies sapos, denominadas Substância 1 (S-1) e Substância 2 (S-2), nas concentrações de 0,1 a 0,5mg/mL. Os fitopatógenos Choanephora infundibulifera, Sclerotium sp., Fusarium udum e Curvularia sp. foram isolados de plantas de crotalária sintomáticas. No teste de crescimento micelial in vitro foram utilizados os tratamentos S-1 e S-2, água destilada (controle negativo) e epoxiconazol + piraclostrobina (0,6L/ha) (controle positivo). Nas placas de Petri (ø 8cm) contendo BDA, foram adicionados quatro discos de papel filtro (ø 6mm) com os tratamentos, e no centro da placa foram adicionados os discos de micélio dos fitopatógenos. Após 48h iniciou-se a avaliação do crescimento micelial, até a colônia atingir 2/3 da placa. Foi realizada a contagem de esporos de C. infundibulifera, F. udum e Curvularia sp. com auxílio de uma Câmara de Neubauer, e a contagem de escleródios de Sclerotium sp., visualmente. No bioensaio de germinação de esporos de F. udum e Curvularia sp., realizado em placas de Elisa, foi adicionado 40µL de suspensão de esporos (5x104conídios/mL) e 40µL dos tratamentos. Após 24h, paralisou-se a geminação com 20µL de azul de metileno. Contou-se 100 esporos por repetição. Nos bioensaios realizados com S-2, a concentração 0,2mg/mL inibiu o crescimento micelial de Sclerotium sp., F. udum e C. infundibulifera, e as concentrações 0,3mg/mL e 0,5mg/mL inibiram, Sclerotium sp. e C. infundibulifera, respectivamente. A S-2 também inibiu a germinação de esporos de F. udum em todas as concentrações e esporos de Curvularia sp. nas concentrações 0,3 a 0,5mg/mL. O tratamento com S-1 inibiu a germinação de esporos de F. udum, nas concentrações 0,4 e 0,5mg/mL. Assim conclui-se que o extrato de secreções glandulares S-2 apresenta ação antifúngica sobre C. infundibulifera, Sclerotium sp., F. udum e Curvularia sp.e S-1apresenta atividade antifúngica sobre F. udum
PALAVRAS-CHAVE: Fusarium udum, Choanephora infundibulifera, Crotalaria spectabilis, extrato de anfíbios, adubo verde.
ABSTRACT
The work was executed using extract of glandular secretions from two species of frogs, named Substance 1 (S-1) and Substance 2 (S-2), in concentrations of 0,1 to 0,5 mg/mL. The plant pathogens, Choanephora infundibulifera, Sclerotium sp, Fusarium udum and Curvularia sp. were isolated from infected plants of crotalaria. In vitro test, the mycelial growth was performed using S-1 and S-2 extracts, distilled water (negative control) and epoxiconazole + pyraclostrobin (positive control). In Petri dishes (ø 8 cm) containing PDA medium, were added four filters of papers disks (6mm) with the treatments, and in the center of the plate were added the mycelium discs of the pathogens. After 48h began the assessment of mycelial growth, until the colony reaches 2/3 of the plate. The counting of spores of F. udum and Curvularia sp. was made with a Neubauer Chamber and the couting of sclerotias of Sclerotium sp., visually. The test of spores germinating of F. udum and Curvularia sp. was performed in ELISA plates, was added 40μL of suspension of spores (5x104 conídias/mL) and 40μL of the treatments. After 24 hours, the germinating was stopped with methylene blue, 20μL. Was counted 100 spores by repetition. In the test with S-2, the concentration 0,2mg/ml inhibited the mycelial growth of Sclerotium sp., F. udum and C. infundibulifera, and concentrations 0,3mg/mL and 0,5 mg/mL inhibited, Sclerotium sp. and C. infundibulifera, respectively.S-2 also, inhibited the germination of spores of F. udum at all concentrations, and spores of Curvularia sp. at concentrations of 0,3 to 0,5mg/ml. The treatment S-1 inhibited the germination of spores of F. udum at concentrations 0,4 and 0,5 mg/mL. It was concluded that, extract of glandular secretions of S-2 shows antifungal activity against C. infundibulifera, Sclerotium sp., Curvularia sp. and F. udum and S-1 shows antifungal activity under F. udum.
KEYWORDS: Fusarium udum, Choanephora infundibulifera, Crotalaria spectabilis, amphibians extract, green manure.
1. INTRODUÇÃO
A adubação verde é uma prática muito utilizada na agricultura atualmente, devido seus diversos benefícios. E a crotalária é uma cultura muito utilizada, por trazer melhorias as propriedades físicas, biológicas e químicas do solo (BRITO et al., 2014), também é caracterizada pelo grande aporte de fitomassa, ciclagem dos nutrientes do solo (WUTKE et al., 2014 apud BRITO et al., 2014) e a fixação de Nitrogênio da atmosfera, através da associação simbióticas com bactérias (NOSOLINE et al., 2010; MERCANTE et al., 2014 apud BRITO et al., 2014).
A contribuição nas características físicas do solo ocorre de forma mais lenta, e é de grande importância principalmente em solos com baixa capacidade de troca catiônica (CTC) e áreas que adotam o sistema de plantio direto, pois possuem grande quantidade de fitomassa, adicionando matéria orgânica ao solo, também proporcionam uma cobertura de proteção contra a erosão, aumentam a aeração, a infiltração e a retenção de água no solo, favorecendo assim o desenvolvimento da microfauna edáfica do solo (BRITO et al., 2014). Além da contribuição para essas propriedades do solo, a utilização de crotalária na rotação de cultura é muito satisfatória no controle de nematoides, pois esta planta é caracterizada como má hospedeira para esse patógeno, fazendo com que não complete seu ciclo e não se reproduza, reduzindo sua população na área infestada (MENDES et al., 2012; WANG et al., 2002).
Por ter várias finalidades a demanda de sementes vem aumentando, e as áreas de produção de sementes também estão expandindo para atender todo o mercado. Porém, a produção de sementes de qualidade, que é uma das características mais importante para o sucesso de qualquer cultura, está sendo prejudicada em algumas regiões devido à ocorrência de fungos patogênicos que, prejudicam a produtividade de sementes e podem torná-las fonte de inóculo de patógenos para áreas não infestadas.
Como existem poucos relatos de ocorrência de doenças na cultura da crotalária no Brasil e no Mundo, ainda não se conhecem quais são os principais patógenos que causam perdas na cultura, nem a forma mais eficaz de controle dos mesmos. No Mato Grosso há a ocorrência de septoriose em Crotalaria spectabilis (MARINGONI et al., 2012), no Paraná foi relatado a ocorrência de Sclerotinea sclerotiorum também em C. spectabilis e outras espécies de crotalária como a C. juncea, C. retusa C. striata são hospedeiras do patógeno (OLIVEIRA et al., 2015).
Conhecer os patógenos e as formas de controle para doenças que eles causam, é de grande importância, pois a crotalária é uma das principais espécies utilizadas para a rotação de culturas e o controle de nematoides no Centro Oeste. Atualmente o controle com defensivo químico é o mais recomendado para vários tipos de fitopatógenos em várias culturas, mas ainda não existem fungicidas registrados para essa cultura, e o uso incorreto
está causando a contaminação do ambiente (FIANCO & CHIES, 2008; FILIZOLA et al., 2002) e criando raças de fungos resistentes as moléculas disponíveis no mercado (PARREIRA et al., 2009).
Em decorrência desses vários problemas causados pelo mau uso de fungicidas, vários estudos vem buscando o controle alternativo utilizam extratos de plantas e óleos essenciais para a descoberta de novas moléculas eficientes no controle de doenças (BRITO, 2009; CARNELOSSI et al., 2009; NASCIMENTO et al., 2008; BORGES, 2013).
No Brasil existe uma diversidade de anuros que produzem diversas substâncias químicas com atividades antimicrobianas, com potencial para serem usadas como protótipos para indústria química. Algumas espécies de anuros do gênero Rhaebo, Rhinella e Leptodactylus possuem substâncias presentes em suas secreções identificadas e testadas para algumas atividades, principalmente relacionado a doenças bacterianas e células tumorais em humanos (MAILHO-FONTANA, 2012; LIBÉRO, 2008; MÁRQUEZ, 2012; DEBIASE et al., 2013; SOUSA et al., 2009, apud CHAGAS, 2014)
A utilização de extratos de veneno de anfíbios na proteção de plantas é inovador, Rocco (2015) utilizou os extratos de secreções glandulares de duas espécies de anfíbios na indução de fitoalexinas em plantas, e observou que os extratos apresentam efeito na produção de fitoalexinas em soja e feijão. Colares (2015) concluiu em seu trabalho que estes extratos de apresentam efeito indutor de fitoalexinas em soja, e que uma das substâncias isoladas de anfíbios e os extratos de secreções apresentaram efeito fungitóxico sobre Phakopsora pachyrihizi. Mochko (2014) também utilizou o extrato de secreções glandulares e observou o efeito fungitóxico na germinação de esporos de Fusarium spp., mostrando potencial para o controle de patógenos; porém esses resultados necessitam de mais estudos para comprovar sua eficácia.
Com o intuito de estudar novas substâncias que auxiliem no controle de patógenos, este trabalho tem como objetivo investigar a capacidade antifúngica de extratos obtidos a partir de secreções glandulares e secreções cutâneas de anfíbiosno controle dos fitopatógenos F. udum, C. infundibulifera, Sclerotium sp. e Curvularia sp. isolados de plantas de crotalária sintomáticas.
2. REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Crotalaria L.
O gênero Crotalaria L. pertence à tribo Crotalarieae (Benth.) Hutch., família Leguminosae. Este gênero é um dos maiores de Leguminosae e o único da tribo com representantes no Brasil, tem mais de 600 espécies originadas da África, Mediterrâneo, Índia, Austrália ou América do Sul e estão concentradas na região dos trópicos e subtrópicos do planeta. Na América existem relatos desde os Estados Unidos até o Uruguai, sendo que o Brasil é um dos maiores centros de diversidade do gênero na América, juntamente com o México (FLORES & MIOTTO, 2005; DEVECCHI, 2012).
As espécies desse gênero se caracterizam pelo porte herbáceo ou arbustivo podendo ter até 3 metros de altura, são perenes ou anuais, tem folhas trifolioladas com folíolos lineares a ovalados, unifolioladas ou simples, a inflorescência apresenta diferentes números de flores geralmente de coloração amarela, podendo existir espécies com flores azuis ou lilases, o legume é inflado e deiscente, com variado número de sementes de formato reniforme, que quando maduro emite um som semelhante ao guizo de uma cascavel (Crotalus sp.) que deu origem ao nome do gênero (PACHECO & SILVA-LÓPEZ, 2010, FLORES & MIOTTO, 2005).
As espécies de Crotalaria se adaptam a diferentes condições ambientais, ocorrendo naturalmente próximo a rios, entorno de matas, campos e cerrados, também são consideradas oportunistas e se desenvolvem nas margens de estradas e podem se tornar invasora de culturas (FLORES & MIOTTO, 2005). Algumas espécies por produzirem alcaloides no período de frutificação são tóxicas e podem causar efeitos pneumotóxicos, nefrotóxicos, cardiotóxicos, teratogênicos e carcinogênicos e levar à morte animais e humanos, quando consumidas (PACHECO & SILVA-LÓPEZ, 2010, JUNIOR et al. 2010).
Algumas espécies do gênero Crotalaria demonstram grande diversidade de substâncias químicas com propriedades farmacológicas e variadas aplicações, alguma das ações dessas substâncias envolvem poder antioxidante, efeitos microbicidas e inibidores da digestão e do crescimento de insetos e larvas. Em sementes de C. pallida foi encontrado um peptídeo catiônico, que inibiu o desenvolvimento de Fusarium oxysporum e de Proteus sp (bactéria Gram-negativa) (PACHECO & SILVA-LÓPEZ, 2010).
Por ser uma leguminosa as espécies de Crotalaria tem capacidade de fixação de nitrogênio da atmosfera, através da associação simbióticas com bactérias (MERCANTE et al., 2014 apud BRITO et al., 2014; NOSOLINE et al., 2010) e grande potencial de produção de fitomassa contribuindo assim para vários benefícios no solo e microfauna. Por estes motivos algumas espécies estão sendo cultivadas como adubo verde, principalmente antes do cultivo de gramíneas, pois disponibilizam o nitrogênio para cultura de sucessão (AMADO
et al., 2002). Esse potencial de produção de fitomassa com rápida liberação de nutrientes também é de grande importância no sistema de plantio direto, principalmente nos solos de região tropical, que devido às condições de temperatura e umidade, dificulta o acúmulo de matéria orgânica no solo, mas que é de grande importância para melhoria das propriedades biológicas, físicas e químicas, aumentando sua fertilidade.
Além da melhoria das propriedades do solo, algumas espécies de Crotalaria são indicadas para controle de nematoides em áreas infestadas. Para o nematoide das lesões radiculares (Pratylenchus brachyurus), principal na região Central do Brasil, as espécies de Crotalaria que apresentam melhores resultados são C. spectabilis, C. ochroleuca e C. breviflora. As espécies C. spectabilis e C. juncea são más hospedeiras de nematoide das galhas (Meloidogyne javanica), o mais importante encontrado no Brasil por causar grandes perdas na agricultura. As fibras de crotalária foram mencionadas nas literaturas sânscritas como matéria prima para os cordões de sacrifícios dos ‘khastrias’ (MEDINA et al., 1961).
2.1.1 Crotalaria spectabilis Roth.
É uma espécie Asiática, cultivada em todo mundo como adubo verde e é encontrada em áreas degradadas ou em cultivo em quase todo país (FLORES, 2004). É uma das espécies de crotalária mais tóxica devido alta produção de monocrotalina, principal alcaloide pirrolizidínico produzido pelo gênero Crotalaria. Este alcaloide apresenta efeito pneumotóxico, nefrotóxico, cardiotóxico, fetotóxico, carcinogênicos, inflamação, hemorragia e fibrose quando ingerido por animais (HONÓRIO JÚNIOR et al., 2010), possui ação nematicida, inibindo a movimentação de Meloidogyne incognita (FASSULIOTIS & SKUCAS, 1969 apud SILVA, 2012).
Charchar (2009) observou que a C. spectabilis causou um declínio na população de Meloidogyne incognita raça 1 no cultivo de cenoura e Schwan (2003) concluiu em seu trabalho que a espécie se comporta como má hospedeira para Heterodera glycines raça 10, apesar do nematoide penetrar nas raízes ele não completa seu ciclo, outros trabalhos mostraram o mesmo comportamento para raça 3 de H. glycines. Em outro trabalho a C. spectabilis também se mostrou eficiente no controle de P. brachyurus (MENDES et al., 2012).
Apesar da sua ampla utilização na adubação verde e no controle de nematoides, existem poucos relatos sobre a ocorrência de doenças nessa cultura, e não se conhece a forma de controle nem os principais patógenos causadores das doenças. No Mato Grosso tem relato da ocorrência de septoriose em C. spectabilis (MARINGONI et al., 2012) e no Paraná há ocorrência de Sclerotinea sclerotiorum na mesma espécie, e ainda, outras espécies de crotalária são hospedeiras do patógeno (OLIVEIRA et al., 2015).
A ocorrência de Fusarium udum já foi comprovada em C. ochroleuca, mas ainda não foi relatada em C. spectabilis. Os outros fitopatógenos, Choanephora infundibulifera, Sclerotium sp. e Curvularia sp., ainda não tem relatos de ocorrência em espécies do gênero Crotalaria.
2.2 Uso de extratos de secreções glandulares de sapo no controle de fitopatógenos
Pesquisas com a utilização de extratos de veneno de sapo no controle de patógenos ainda são raras, mas mostram resultados que ainda devem ser estudados para comprovar sua eficácia (MOCHKO, 2014; COLARES, 2015)..
2.3 Rhaebo guttatus (Schneider, 1799) (Anura: Bufonidae)
Pertence à família Bufonidae, conhecida como a família dos sapos verdadeiros a família Bufonidae possui aproximadamente 586 espécies, com pouco mais de 50 gêneros (FROST, 2016). Os indivíduos dessa família se caracterizam pelas glândulas paratóides protuberantes localizadas ao lado da cabeça, presença de tubérculos na região dorsal além de uma crista óssea, mas existem alguns gêneros de bufonídeos que não apresentam glândulas paratóides e crista óssea (RODRIGUEZ & DUELLMAN, 1994; TOLEDO & JARED, 1995). Alimentam-se de insetos, tem hábito terrestre e quando adultos são encontrados em terrenos alagados que são propícios para sua reprodução (RODRIGUEZ & DUELLMAN, 1994).
As glândulas são classificadas como granulosas ou mucosas sendo que as glândulas granulosas, conhecidas como glândulas de veneno, produzem vários compostos químicos como peptídeos, proteínas, aminas biogênicas, alcaloides, ácidos orgânicos e esteroides, e as glândulas mucosas são compostas basicamente por glicosaminoglicanas e proteoglicanas (DALY et al., 1987; CLARKE, 1997; WANG & WANG, 2011), essas substâncias são utilizadas como mecanismo de defesa (RODRIGUEZ & DUELLMAN, 1994), tendo também atividades antimicrobianas, causando a lise de microrganismos patogênicos como bactérias, protozoários, vírus, leveduras e fungos.
Existem treze espécies no gênero Rhaebo, R. andinophrynoides, R. atelopoides, R. blombergi, R. caeruleostictus, R. colomai, R. ecuadorensis, R. glaberrimus, R. haematiticus, R. hypomelas, R. lynchi, R. nasicus, R. olallai e R. guttatus. O gênero Rhaebo é frequentemente encontrado na região amazônica, ocorrendo desde o Equador, Colômbia, Venezuela, Peru, Honduras e Bolívia até as Guianas (FROST, 2016; MAILHO-FONTANA 2012).
A espécie R. guttatus (sinonímia Bufo guttatus) faz parte do grupo de espécies basais da América do Sul, e ocorre principalmente na região norte do Brasil (FROST, 2016; MAILHO-FONTANA 2012), encontrado na serapilheira, associado a áreas florestadas e
matas de galeria (AMPHIBIAWEB, 2016). Jared et al. (2011) constataram que o mecanismo de defesa dessa espécie contraria a característica de passividade das outras espécies de bufonídeos, pois R. guttatus esguicha voluntariamente seu veneno contra seus predadores. A capacidade de esguichar o veneno está ligada a uma característica anatômica dessa espécie, a glândula paratóide de R. guttatus é aderida à escápula, e o movimento de abaixar a cintura escapular e inflar os pulmões possibilita ao sapo esguichar o veneno (JARED et al., 2011). Os compostos químicos presentes nas secreções das glândulas de R. guttatus são proteínas, aminas biogênicas e esteroides (MAILHO-FONTANA 2012).
2.3.1 Secreções glandulares de Rhaebo guttatus
De acordo com as análises feitas por Mailho-Fontana (2012) na secreção de R. guttatus foi encontrado o esteroide resinobufagina e em maior intensidade a serotonina e seus derivados (dehidrobufotenina e N-metil-serotonina). Esses compostos químicos apresentam atividades biológicas diversas como convulsionantes, vasoconstritoras, colinégicas, alucinógenas e antimicrobianas (BLAIR, 1972). As aminas biogênicas presentes na secreção de sapos, possuem atividade microbianas contra bactérias e fungos, indicando que são usadas como mecanismo de defesa, segundo Habermehl & Preusser, (1970) citado por Macfoy et al. (2005). Outra substância presente no veneno de R. guttatus são os esteroides: colesterol, campesterol, sitosterol (DEBIASE et al., 2014) e principalmente o bufodienolídeo (DEBIASE et al., 2013).
2.4 Leptodactylus labyrinthicus (Spix, 1824)
Pertence à família Leptodactylidae com 200 espécies agrupadas em três subfamílias (Leiuperinae, Paratelmatobiinae e Leptodactylinae), a rã-pimenta como é conhecida, pertence ao gênero Leptodactylus com 74 espécies descritas, da subfamília Leptodactylinae. A espécie é encontrada na caatinga e cerrado da região central e sudeste do país, também está presente na região sul, na Argentina, Bolívia e no leste do Paraguai. Ocorre na água ou em solo, perto de lâminas de água, os ovos são encontrados em ninhos de espuma as margens de poças de água (FROST, 2016; HEYER et al., 2008).
São rãs de grande porte e variam de 20 a 215 mm de tamanho, possuem costelas ossificadas livres, vértebras procélicas e ausência de cartilagem e de dentes. A carne é utilizada para consumo humano, e tem potencial econômico (GORDO & CAMPOS, 2005). A dieta se caracteriza como oportunista e abundância das espécies no ambiente, também há relatos da prática batracofágica (RODRIGUES & FERREIRA, 2004).
2.4.1 Secreções cutâneas de Leptodactylus labyrinthicus
Com estudos feitos com as secreções cutâneas da rã pimenta até o momento, foram isolados quatro peptídeos, que apresentam atividades antimicrobianas sobre bactérias
gram-negativas e gram-positivas e alguns tem atividade antitumoral. Os peptídeos isolados foram a pentadactilina, fallaxina (LIBÉRO, 2008), leptoglicina (SOUSA et al., 2009 apud CHAGAS, 2014) e um análogo da pentadactilina, denominado G16OCP1 (MÁRQUEZ, 2012) (Tabela 1).
Tabela 1. Relação dos peptídeos isolados de Leptodactylus labyrinthicus e suas respectivas atividades biológicas (adaptado de CHAGAS, 2014).
Peptídeos Atividade Biológica
Pentadactilina Atividade antitumoral sobre células
tumorais humanas;
Atividade antimicrobiana sobre algumas Bactérias Gram-negativas e Gram-positivas;
Atividade antimicrobiana sobre Candida albicans;
Atividade hemolítica muito baixa.
Fallaxina Atividade antitumoral sobre células
tumorais humanas;
Atividade antimicrobiana sobre algumas Bactérias Gram-negativas e Gram-positivas;
Fraca atividade hemolítica.
G16OCP1 Atividade antimicrobiana sobre
algumas Bactérias Gram-negativas e Gram-positivas;
Sem atividade hemolítica.
Leptoglicina Atividade antimicrobiana sobre
algumas Bactérias Gram-negativas; Sem atividade hemolítica.
2.5 Fitopatógenos a serem avaliados
Os fitopatógenos avaliados foram, Fusarium udum, Choanephora infundibulifera, Sclerotium sp. e Curvularia sp. isolados de plantas de C. spectabilis.
2.5.1 Fusarium udum
O gênero Fusarium pertence à Ordem Hypocreales, do Filo Ascomycota, são carcterizados pela produçao de ascosporos, esporos sexuais, que se formam dentro de ascos. Os esporos assexuados macroconídios e microconídios ajudam a diferenciar as diferentes espécies de Fusarium. Os macroconídios possuem formato fusiforme, septados, geralmente quatro vezes maiores que os microconídios e originam-se a partir de conidióforos emergentes de esporodóquios (Figura 1). Os microconídios podem ser uni ou
bicelulados, ovalados, e são formados nas extremidades de microconidióforos, além dessa característica algumas espécies também produzem clamidósporos a partir das hifas. Essa estrutura tem formato globoso a oval, parede espessa, citoplasma condensado, parede lisa ou rugosa e são formados nas hifas de maneira intercalar ou terminal (AMORIM et al., 2011).
Figura 1. Macroconídios de Fusarium udum, isolado de Crotalaria spectabilis (FERNANDES, 2016).
Os fungos do gênero são patogênicos a uma grande variedade de hospedeiros, causando murchas vasculares, mas algumas espécies são patógenos específicos de determinadas plantas e certas raças são capazes de infectar uma cultivar específica da espécie de hospedeiro, também atacam sementes em condições de clima favorável ao desenvolvimentro do patógeno (MICHEREFF et al., 2005). Por estarem presentes no solo, geralmente atacam as raízes e sistema vascular de plantas.
O Fusarium udum apresenta grande variação nas suas características culturais e morfológicas (KARIMI et al. 2012). É uma espécie de grande importância para a cultura do feijão guandu na Índia, África do leste e Malawi, pois causa murcha nas plantas e as perdas no campo chegam a 50%, ocorre também em Bangladesh, Grenada, Indonésia, Ilhas Maurícias, Mynmar, Nepal, Nevis, Venezuela, Trinidad e Tobago. Por ser um patógeno que ocorre no solo, o fungo entra através do sistema vascular da planta ou por feridas, e leva a clorose progressiva das folhas e ramos, afetando todo o sistema vascular da planta, na parte interna do caule é possivel observar listras pretas que resultam em manchas marrons na superfície externa do caule (KARIMI et al., 2012). O patógeno também causa murcha vascular em Crotalaria (MELO, 2014; ARMSTRONG & ARMSTRONG, 1950) (Figuras 2 e 3).
Figura 2. Plantas de Crotalaria spectabilis apresentando sintomas de murcha vascular de Fusarium udum em campo de produção de sementes (BONALDO, 2014).
Figura 3. Área de produção de sementes de C. spectabilis com murcha vascular de Fusarium udum
(Acervo pessoal).
2.5.2 Choanephora infundibulifera
Classificado no Filo: Zygomycota, Classe: Mucoromycota, Ordem: Mucolares, Família: Choanephoraceae, Gênero: Choanephora (MycoBank, 2016). Tem como características da colônia, micélio branco e extenso, crescendo rapidamente em meio de cultura. Conidióforos grandes, largos e ramificados no ápice, sendo que cada ramificação possui um esporângio. Os conídios são unicelulares, de coloração marrom a arroxeada e com formato elipsoide (Figura 4) (BARNET & HUNTER, 1998).
Figura 4. Esporângio (seta vermelha) e conídios (seta amarela) de C. infundibulifera isolada de Crotalaria spectabilis (FERNANDES, 2016).
Os fungos deste gênero são considerados fitopatógenos de cucurbitáceas, atacam principalmente, flores e frutos, também existem espécies saprófitas (BARNET & HUNTER, 1998). Desenvolvem-se em regiões de clima quente e úmido. No Mato Grosso a C. cucurbitarum (Berk. & Ver.) Thaxt. tem causado grandes prejuízos na produção de abóbora por causa podridão na fase de florescimento da cultura, também atacam melancia, pepino e melão. O patógeno se instala na planta através da corola das flores murchas ou ferimentos atacando as plantas fisiologicamente debilitadas (SILVA et al., 2011).
A espécie de C. infundibulifera foi relatada na Coreia ocorrendo em Hibisco chinês (Hibiscus rosa-sinensis L.), o sintoma inicial foi a formação de manchas avermelhadas na ponta das flores que evoluíram para a flor inteira, as manchas se tornaram marrons e aquosas (PARK et al., 2014). No Brasil ainda não há relatos de doenças causadas por essa espécie mas no Rio Grande do Sul, a C. infundibulifera e C. cucurbitarum foram encontradas em sementes de feijão-miúdo, podendo causar perdas severas quando em condições de clima favorável ao desenvolvimento do patógeno (SALLIS et al., 2001).
A ocorrência de doença causada por C. infundibulifera, em C. spectabilis ainda não foi relatada (Figura 5), porém é de grande preocupação em áreas de produção de sementes, pois ela coloniza rapidamente a inflorescência da cultura, impedindo a formação de sementes. Ainda não se conhece a forma de controle para a doença, e também não existem produtos químicos registrados para cultura.
Figura 5. Inflorescência de Crotalaria spectabilis apresentando sintomas e sinais de Choanephora infundibulifera em campo de produção de sementes (BONALDO, 2014).
2.5.3 Sclerotium sp.
O gênero Sclerotium pertence ao Filo Basidiomycota e está presente principalmente no solo. Caracterizam-se por formar um micélio de coloração branca e textura cotonosa com hifas vegetativas espessas, ramificadas, formam escleródios esféricos ou irregulares de coloração marrom escuro a preto. A temperatura pode influenciar tanto a morfologia micelial como na produção de escleródios (KOKUB, 2007; SOUSA, 2012).
O fungo é um importante fitopatógeno habitante de solo, sendo responsável por murcha e tombamento de plântulas, podridão de raízes e do colo (Figura 6). Apresenta extensa gama de hospedeiros, cerca de 500 espécies botânicas, incluindo dicotiledôneas e monocotiledôneas, distribuindo-se em todas as regiões agrícolas, com predominância nas zonas tropical e subtropical, onde predominam condições de alta umidade e temperatura elevada (AYCOCK, 1966 apud SERRA & SILVA, 2005; PUNJA & JENKINS, 1984 apud SERRA & SILVA, 2005; PUNJA, 1985 apud SERRA & SILVA, 2005; PUNJA & RAHE, 1992 apud SERRA & SILVA, 2005; SOUSA, 2012).
Figura 6. Plantas de Crotalaria spectabilis apresentando sintomas e sinais de Sclerotium sp. em
2.5.4 Curvularia sp.
O gênero é classificado taxonomicamente como do Reino: Fungi, Filo: Ascomycota, Sub filo: Pezizomycotina, Classe: Dothideomycetes, Subclasse: Pleosporomycetidae, Ordem: Pleosporales, Família: Pleosporaceae (MycoBank, 2016).
Existem 128 espécies no gênero Curvularia, possuem característica de colônias marrons, cinza ou pretas, com aparência aveludada ou cotonosa. Conidióforos macronematosos, mononematosos, de coloração marrom, retos ou curvos, frequentemente geniculados tendo os conídios apicais ou em novos pontos de crescimento. Conídios solitários, geralmente curvos, clavados, elipsoidal, amplamente fusiforme, obovoide ou piriforme com 3 ou mais septos transversais, de coloração pálida a marrom escuro e geralmente as células centrais são mais escuras e alongadas, por isso são curvos, raramente são eretos, com septos rígidos, e com hilo truncado ou protuberante (Figura 7) (ELLIS, 1971 apud FERREIRA, 2010; BARNET & HUNTER, 1998).
Figura 7. Conídios de Curvularia sp. isolada de Crotalaria spectabilis (FERNANDES, 2016)
Devido à variedade morfológica do gênero Curvularia, as espécies foram agrupadas em três grupos que se diferenciam pela forma dos conídios e número de septos, ‘geniculata’, com a espécie-tipo C. geniculata (Tracy & Earle) Boedijn, ‘lunata’, com a espécie-tipo C. luneta (Tracy & Earle) Boedijn e ‘maculans’, com a espécie-tipo C. maculans (Brancroft) Boedijn (COBERTTA, 1964 apud LIMA & FURTADO, 2007).
São espécies parasitas ou saprófitas (BARNET & HUNTER, 1998), mas também existem espécies fitopatogênicas, que causam doenças em plantas (COSTA, 2007; FERREIRA, 2010), principalmente em gramíneas e em regiões de clima tropical e subtropical (SIVANESAN, 1987 apud FERREIRA, 2010), algumas espécies podem causar doenças em animais (HERRÁEZ & DUNSTAN, 2001), incluindo humanos, sendo agentes de pneumonia, endocardite, onicomicoses, sinusites alérgicas e alergias broncopulmonar (MACMILLAN et al., 1987; CARTER & BOUDREAUX, 2004). Ainda não existem relatos da
sua ocorrência como fitopatógeno em espécies de crotalária até o momento, portanto não se conhece a forma de controle a ser adotada para a doença.
3. METODOLOGIA
3.1 Obtenção dos Extratos de Secreções Glandulares de Sapos
Os animais foram capturados pela equipe de biólogos da Universidade Federal de Mato Grosso (campus Sinop), sob a coordenação do Prof. Dr. Domingos de Jesus Rodrigues (IBAMA, SISBIO: Número 30034-1), os quais fizeram parte do processo de extração do material secretado pelas glândulas do anfíbio. Para obtenção do extrato de secreções de glândulas, o material coletado foi submetido à secagem em estufa a 40 °C, moído e extraído três vezes com metanol. O material foi evaporado em evaporador rotativo e ressuspenso em água esterilizada nas concentrações estudadas.
3.2 Obtenção dos isolados
Os isolados de F. udum, C. infundibulifera, Sclerotium sp. e Curvularia sp., foram isolados de plantas de C. spectabilis sintomáticas, repicados para meios de cultura Batata Dextrose Agar (BDA) e incubados em câmara BOD a 25 ± 2ºC por dez dias.
3.3 Bioensaio de Crescimento Micelial
A atividade antifúngica dos extrato de secreções glandulares, Substância 1 (S-1) e Substância 2 (S-2) em F. udum, C. infundibulifera, Sclerotium sp. e Curvularia sp., foram avaliadas através do teste de disco-difusão em meio BDA, de acordo com a metodologia descrita por Brambilla et al. (2012), com adaptações. Discos de papel filtro esterilizados de 6 mm de diâmetro foram embebidos nos extratos de secreções de glândulas de sapos nas concentrações de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 e 0,5 mg/mL e quatro discos foram dispostos equidistantes em cada placa de Petri (8 cm), contendo BDA de acordo com cada concentração. Logo após, um disco de micélio com 8 mm de diâmetro foi colocado no centro da placa. Posteriormente, as placas foram identificadas, lacradas com papel filme e incubadas em câmara BOD, escuro a 25 ± 2ºC. No controle negativo foi utilizado água esterilizada e no positivo epoxiconazol + piraclostrobina (0,6L/ha). Foram realizadas cinco repetições para cada tratamento. O crescimento micelial foi medido 48 horas após adicionar o disco de micélio no centro da placa, até um tratamento completar 2/3 da placa.
A avaliação foi realizada, através da média de duas medidas em sentidos perpendiculares, do diâmetro das colônias, em cm, até que em um dos tratamentos o fungo atingisse 2/3 da placa. Após a coleta das medidas em centímetros das ortogonais (x e y) obteve-se o crescimento micelial a partir da fórmula:
𝑪𝑴 =𝑿 + 𝒀 𝟐 − 𝑫 Em que:
CM = crescimento micelial
X = crescimento do fungo na horizontal (cm) Y = crescimento do fungo na vertical (cm) D = diâmetro furador de rolha (cm)
Os resultados do crescimento micelial obtidos foram utilizados de base para os cálculos de inibição do crescimento micelial. Para os cálculos de inibição do crescimento micelial adotou-se a metodologia descrita por Yoshimura et al. (2004). Os resultados foram dados em porcentagem de inibição do crescimento micelial, em relação à testemunha, que consistiu na seguinte fórmula:
𝑰 = 𝟏𝟎𝟎 −𝟏𝟎𝟎 ∗ 𝑭 𝑻 Em que:
I = Porcentagem de inibição (%);
F = Diâmetro médio das colônias no último dia de crescimento micelial do fungo na presença do tratamento (cm);
T = Diâmetro médio da colônia testemunha (cm).
Também foi calculado o índice de velocidade do crescimento micelial conforme a fórmula descrita por Oliveira (1991):
𝑰𝑽𝑪𝑴 =∑(𝑫 − 𝑫𝒂) 𝑵 Sendo:
IVCM = Índice de velocidade de crescimento micelial (cm); D = Diâmetro médio atual da colônia (cm);
Da = Diâmetro médio da colônia do dia anterior (cm); N = Número de dias após a inoculação.
3.4 Ensaio de esporulação para Fusarium udum, Choanephora infundibulifera e Curvularia sp.
Após avaliar a ação antifúngica de S-1 e S-2 no crescimento micelial de F. udum, C. infundibulifera e Curvularia sp., a suspensão de conídios foi obtida através da deposição de 10 mL de água destilada esterilizada, sobre a superfície das placas com micélio fúngico utilizadas no item anterior, seguido da raspagem das colônias com auxílio da alça de Drigalski. Após a raspagem, foi realizada a filtragem em camada dupla de gaze e obtenção
da suspensão de conídios. A suspensão foi colocada em câmara de Neubauer para posterior contagem do número de conídios por mL. Os resultados da esporulação obtidos foram utilizados de base para os cálculos de inibição da esporulação adaptando-se a metodologia descrita por Yoshimura et al. (2004).
3.5 Contagem de escleródios de Sclerotium sp.
Após avaliar a ação antifúngica de S-1 e S-2 no crescimento micelial de Sclerotium sp. as placas ficaram em fotoperíodo por 20 dias. A contagem de escleródios foi realizada visualmente.
3.6 Bioensaio de Germinação de Esporos para Fusarium udum e Curvularia sp.
As suspensões de esporos de F. udum e Curvularia sp. foram obtidas a partir de colônias puras cultivadas por dez dias em meio BDA. Para a obtenção da suspensão de esporos foi realizada a metodologia descrita no item 3.4 e com o auxílio de uma câmara de Neubauer a suspensão foi ajustada para 5 x 104 conídios/mL.
A avaliação do efeito dos extrato de secreções glandulares S-1 e S-2 na germinação de esporos foi realizado em placas de teste Elisa, adicionando-se 40µL de tratamento e 40µL da suspensão de esporos (5 x 104 conídios/mL) em cada orifício da placa. No controle negativo foi utilizado água destilada e no positivo epoxiconazol + piraclostrobina (0,6L/ha). As placas foram incubadas em câmara BOD, escuro a 25 ± 2ºC por 24 horas, a paralização da germinação foi realizada com adição de 20µL de azul de metileno. Contou-se 100 esporos por repetição, totalizando 800 esporos por tratamento. Foram considerados como esporos germinados aqueles que apresentaram qualquer indício de emissão do tubo germinativo.
3.7 Análise estatística
O resultados foram submetidos a análise de variância, e as médias comparadas pelo teste Skott Knott a 5%, utilizando-se o programa SISVAR 5.6 (FERREIRA, 2011).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Bioensaio de crescimento micelial de fitopatógenos submetidos ao extrato de secreções glandulares S-1
Nos bioensaios de crescimento micelial in vitro de C. infundibulifera, F. udum, Sclerotium sp. e Curvularia sp. submetidos ao tratamento com S-1 (Figuras 11 a 14) não houve a inibição do crescimento micelial em nenhuma das concentrações testadas, apenas o tratamento controle positivo (Epoxiconazol + Piraclostrobina, 0,6L/ha) inibiu o crescimento micelial dos patógenos (Figuras 8 a 10).
Figura 8. Crescimento micelial (cm) in vitro de Choanephora infundibulifera, Fusarium udum, Sclerotium sp. e Curvularia sp. submetidos a diferentes concentrações da Substância 1 e
Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott realizado para cada fitopatógeno, ao nível de 5% de probabilidade. (Choanephora infundibulifera CV(%)=6,44; Fusarium udum CV(%)=10,64;
Sclerotium sp. CV(%)=7,03; Curvularia sp. CV(%)=13,29).
Figura 9. Porcentagem de inibição do crescimento micelial in vitro de Choanephora infundibulifera, Fusarium udum, Sclerotium sp. e Curvularia sp. submetidos a diferentes concentrações da
Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott realizado para cada fitopatógeno, ao nível de 5% de probabilidade. (Choanephora infundibulifera CV(%)=101,46 Fusarium udum CV(%)=145,7;
Sclerotium sp. CV(%)=65,7; Curvularia sp. CV(%)=114,21). a b b b b b b a b b b b b b a b b b b b b a b b b b b b 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Fungicida Água destilada 0,1 mg/mL 0,2 mg/mL 0,3 mg/mL 0,4 mg/mL 0,5 mg/mL Cr es c im en to m ic el ial ( c m ) Tratamentos
C. infundibulifera F. udum Sclerotium sp. Curvularia sp.
b a a a a a b a a a a a b a a a a a b a a a a a 0 10 20 30 40 50 60 70 Fungicida 0,1 mg/mL 0,2 mg/mL 0,3 mg/mL 0,4 mg/mL 0,5 mg/mL Ini bi ç ao de c res c im en to (%) Tratamentos
Figura 10. Velocidade do crescimento micelial (cm/dia) in vitro de Choanephora infundibulifera, Fusarium udum, Sclerotium sp. e Curvularia sp. submetidos a diferentes concentrações da
Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott realizado para cada fitopatógeno, ao nível de 5% de probabilidade. (Choanephora infundibulifera CV(%)=6,4; Fusarium udum CV(%)=12,42;
Sclerotium sp. CV(%)=12,42; Curvularia sp. CV(%)=13,31). a b b b b b b a b b b b b b a b b b b b b a b b b b b b 0 1 2 3 4 5 Fungicida Água destilada 0,1 mg/mL 0,2 mg/mL 0,3 mg/mL 0,4 mg/mL 0,5 mg/mL V el oc ida de de c res c im en to m ic el ial (c m /di a) Tratamentos
Figura 11. Crescimento micelial in vitro de Choanephora infundibulifera submetida a diferentes
Figura 12. Crescimento micelial (cm) in vitro de Fusarium udum submetido a diferentes
Figura 13. Crescimento micelial de Sclerotium sp. submetido a diferentes concentrações da
Figura 14. Crescimento micelial (cm) in vitro de Curvularia sp. submetida a diferentes concentrações
da Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha), após 4 dias de incubação.
4.1 Bioensaio de crescimento micelial de fitopatógenos submetidos ao extrato de secreções glandulares S-2
No bioensaio de crescimento micelial in vitro de C. infundibulifera submetido ao tratamento com S-2 (Figura 18), as concentrações 0,2 e 0,5 mg/mL apresentaram efeito sobre o crescimento micelial (Figuras 15 e 16) e na velocidade de crescimento micelial (Figura 17). Entretanto, o tratamento controle positivo foi 50% mais eficiente por ser uma substância pura. Como os extratos são compostos por várias substâncias químicas, é possível que nos tratamentos com o extrato, substâncias variadas estejam apresentando efeito sobre a C. infundibulifera em cada concentração. Partindo dessa ideia, é possível que na concentração 0,2 mg/mL haja um composto inibindo o crescimento micelial, mas com o aumento da concentração do extrato ocorra um sinergismo negativo sobre esse composto diminuindo sua ação, e possivelmente na concentração 0,5 mg/mL outro composto químico
que necessite de concentrações maiores para expressar sua ação, esteja agindo sobre o patógeno.
No bioensaio de crescimento micelial in vitro de F. udum submetido a S-2 (Figura 19), a concentração 0,2 mg/mL apresentou o mesmo comportamento que o tratamento com Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha) inibindo o crescimento micelial do patógeno, porém o fungicida apresentou uma inibição menor que 50% sobre F. udum, se mostrando pouco eficiente na inibição do crescimento micelial desse patógeno (Figuras 15 e 16). As outras concentrações de S-2 não apresentaram efeito sobre o crescimento micelial, mesmo nas maiores concentrações, provavelmente esteja ocorrendo um sinergismo negativo entre os compostos presentes no extrato. Portanto, devem-se realizar novas pesquisas buscando identificar isoladamente as substâncias que apresentam ação fungitóxica sobre F. udum para se obter maior eficiência no controle do patógeno. No índice que avalia a velocidade do crescimento micelial, também foi possível observar o mesmo comportamento apresentado na inibição do crescimento micelial, a concentração 0,2 mg/mL e o controle positivo apresentaram efeito sobre o fungo (Figura 17).
No bioensaio com Sclerotium sp. o tratamento S-2 (Figura 20), nas concentrações 0,2 e 0,3 mg/mL apresentaram diferença estatística das outras concentrações inibindo o crescimento micelial, também diferiram do tratamento com Epoxiconazol + Piraclostrobina (Figuras 15 a 17). Por ser um extrato bruto, pode estar ocorrendo uma interação entre os diferentes compostos químicos presentes no extrato. Seriam necessários realizar mais trabalhos utilizando as diferentes concentrações do extrato S-2, entre 0,2 e 0,3 mg/mL para conhecer a concentração mais eficiente no crescimento micelial do patógeno.
No bioensaio de crescimento micelial in vitro de Curvularia sp. submetido a S-2 (Figura 21), não houve a inibição do crescimento micelial em nenhuma das concentrações testadas, apenas no tratamento controle positivo (Figuras 15 a 17).
Figura 15. Crescimento micelial (cm) in vitro de Choanephora infundibulifera, Fusarium udum, Sclerotium sp. e Curvularia sp. submetidos a diferentes concentrações da Substância 2 e
Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott realizado para cada fitopatógeno, ao nível de 5% de probabilidade. (Choanephora infundibulifera CV(%)=12,18; Fusarium udum CV(%)=18,52;
Sclerotium sp. CV(%)=12,76; Curvularia sp. CV(%)=8,15).
Figura 16. Porcentagem de inibição in vitro de Choanephora infundibulifera, Fusarium udum, Sclerotium sp. e Curvularia sp. submetidos a diferentes concentrações da Substância 2 e
Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott realizado para cada fitopatógeno, ao nível de 5% de probabilidade. (Choanephora infundibulifera CV(%)=155,74; Fusarium udum CV(%)=105,86;
Sclerotium sp. CV(%)=141,9; Curvularia sp. CV(%)=55,69). a c c b c c b a b b a b b b a c c b b c c a b b b b b b 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Fungicida Água destilada 0,1 mg/mL 0,2 mg/mL 0,3 mg/mL 0,4 mg/mL 0,5 mg/mL Cr es c im en to m ic el ial ( c m ) Tratamentos
C. infundibulifera F. udum Sclerotium sp. Curvularia sp.
c a b a a b b a b a a a c a b b a a b a a a a a 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Fungicida 0,1 mg/mL 0,2 mg/mL 0,3 mg/mL 0,4 mg/mL 0,5 mg/mL Ini bi ç ão do c res c im en to m ic el ial (%) Tratamentos
Figura 17. Velocidade do crescimento micelial (cm/dia) in vitro de Choanephora infundibulifera, Fusarium udum, Sclerotium sp. e Curvularia sp. submetidos a diferentes concentrações da
Substância 2 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (Fungicida, 0,6L/ha). Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott realizado para cada fitopatógeno, ao nível de 5% de probabilidade. (Choanephora infundibulifera CV(%)=12,15; Fusarium udum CV(%)=18,32;
Sclerotium sp. CV(%)=12,78; Curvularia sp. CV(%)=8,11).
Figura 18. Crescimento micelial (cm) in vitro de Choanephora infundibulifera submetido a diferentes
concentrações da Substância 2 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha), após 2 dias de incubação. a c c b c c b a a b b a b b b c c b b c c a b b b b b b 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Fungicida Água destilada 0,1 mg/mL 0,2 mg/mL 0,3 mg/mL 0,4 mg/mL 0,5 mg/mL V el oc ida de de c res c im en to m ic el ial ( c m /di a) Tratamentos
Figura 19. Crescimento micelial (cm) in vitro de Fusarium udum submetido a diferentes
Figura 20. Crescimento micelial (cm) in vitro de Sclerotium sp. submetido a diferentes concentrações
Figura 21. Crescimento micelial (cm) in vitro de Curvularia sp. submetido a diferentes concentrações
da Substância 2 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha), após 3 dias de incubação.
4.2 Ensaio de esporulação
Como é possível observar na Tabela 2, nos ensaios de esporulação de F. udum, C. infundibulifera e Curvularia sp., S-1 não inibiu a formação de esporos dos fitopatógenos, e ainda estimulou a formação de esporos de F. udum nas concentrações 0,1 e 0,4 mg/mL. No ensaio com Curvularia sp. o tratamento controle positivo estimulou a formação de esporos. (Tabela 2).
Tabela 2. Esporulação de Fusarium udum, Choanephora infundibulifera e Curvularia sp. submetida a
diferentes concentrações da Substância 1 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha).
Tratamentos Número de esporos /mL
Fusarium udum Choanephora
infundibulifera Curvularia sp. Epoxiconazol+Piraclostrobina 0 b 0 a 150.000 a Água destilada 0 b 20.000 a 20.000 b 0,1 mg/mL 30.000 a 0 a 60.000 b 0,2 mg/mL 0 b 0 a 0 b 0,3 mg/mL 0 b 0 a 30.000 b 0,4 mg/mL 20.000 a 0 a 30.000 b 0,5 mg/mL 0 b 10.000 a 30.000 b
Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott, ao nível de 5% de probabilidade.
Nos ensaios S-2 sobre os fitopatógenos F. udum e Curvularia sp., a concentração 0,2 mg/mL estimulou a formação de esporos de F. udum, e as concentrações 0,1, 0,2 e 0,4 mg/mL estimularam a formação de esporos de Curvularia sp. (Tabela 3). No ensaio com C. infundibulifera não houve a formação de esporos em nenhum tratamento.
Tabela 3. Esporulação de Fusarium udum e Curvularia sp. submetida a diferentes concentrações da
Substância 2 e Epoxiconazol + Piraclostrobina (0,6L/ha).
Tratamentos Número de esporos /mL
Fusarium udum Curvularia sp.
Epoxiconazol+Piraclostrobina 1390.000 a 300.000 a Água destilada 540.000 a 110.000 a 0,1 mg/mL 450.000 a 440.000 b 0,2 mg/mL 3370.000 b 430.000 b 0,3 mg/mL 370.000 a 250.000 a 0,4 mg/mL 340.000 a 500.000 b 0,5 mg/mL 260.000 a 240.000 a
Médias com mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Scott-Knott, ao nível de 5% de probabilidade.
4.3 Contagem de escleródios de Sclerotium sp.
Na contagem de escleródios de Sclerotium sp. os tratamentos S-1 não apresentaram efeito fungitóxico na formação dos escleródios, não diferindo estatisticamente dos tratamentos controle (Tabela 4).
