UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
REDE NORDESTE DE BIOTECNOLOGIA – RENORBIO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
JOSÉ GERARDO CARNEIRO
EFEITO GASTROPROTETOR E PERFIL TOXICOLOGICO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA MARINHA VERDE Caulerpa
mexicana Sonder ex Kützing
JOSÉ GERARDO CARNEIRO
EFEITO GASTROPROTETOR E PERFIL TOXICOLOGICO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA MARINHA VERDE Caulerpa mexicana Sonder ex Kützing
Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-graduação em Biotecnologia – RENORBIO, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia.
Área de concentração: Recursos Naturais Orientadora: Profª Dra. Norma Maria Barros Benevides
JOSÉ GERARDO CARNEIRO
EFEITO GASTROPROTETOR E PERFIL TOXICOLOGICO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA MARINHA VERDE Caulerpa mexicana Sonder ex Kützing
Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-graduação em Biotecnologia – RENORBIO, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia.
Aprovado em: 19 / 12 /2017
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________________ Profa. Dra. Norma Maria Barros Benevides (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________________________ Profa. Dra. Maria Izabel Gallão
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________________________ Profa. Dra. Ana Lúcia Pontes Freitas
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________________________ Profa. Dra. Lissiana Magna Vasconcelos Aguiar
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________________________ Prof. Dr. Manoel Paiva de Araújo Neto
À Deus; À Minha Família; À minha esposa Manuela e Aos meus filhos João Arthur, Francisco e José Pedro;
AGRADECIMENTOS
À Profa. Norma M. B. Benevides, por ter acreditado em minha capacidade, ter me acolhido em seu laboratório e contribuído para a minha formação científica.
Aos Professores membros da Banca Examinadora, por terem atendido ao convite para desempenhar este papel, dispondo de seu tempo e conhecimento para analisar este trabalho e pelas contribuições importantes na melhoria dessa Tese.
Às Profas. Lissiana Vasconcelos (UFC – Sobral) e Daniele Teixeira (Biotecnologia – IFCE/Sobral) por terem me recebido tão gentilmente em seus, respectivos, laboratórios.
Aos meus amigos do Laboratório de Carboidratos e Lectinas (CARBOLEC) com quem tenho o prazer de conviver e que sem a ajuda e dedicação este trabalho não teria acontecido, com carinho especial a Tici Lima e a Ricardo Basto. Com agradecimento especial à Anitta Frota e à Ana Quinderé, agradeço de coração pelas contribuições e pelo apoio constante durante as realizações dos experimentos.
Aos meus amigos do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular que foram companheiros e sempre me ajudaram, em especial ao Ednésio e Antônio Rocha.
Um agradecimento especial aos meus tios Marlene e Paulino e aos meus primos Julio César e Keila, pelo auxilio, apoio e incentivo desde a minha graduação.
Aos meus pais, Francisco das Chagas e Ana Maria Carneiro, por me ensinar o valor da persistência e determinação e pela família maravilhosa que temos.
À minha esposa Manuela e aos meus filhos João Arthur, Francisco e José Pedro por terem suportado minhas ausências e aborrecimentos e pelo apoio, companheirismo e paciência.
Obrigada a todos por tudo!
AGRADECIMENTO ESPECIAL
A Minha Esposa e filhos.
Muitas foram as vezes que seus olhos me buscaram e eu estava ausente; muitas foram as vezes que se buscou de mim um abraço, um beijo e não encontraram; muitas foram as vezes que se buscou atenção e afago, mas eu estava apressado ou atarefado de mais.
Mas, ainda que, eu estivesse tão envolvido com meus próprios caminhos. Saibam que sem vocês, eu não teria chegado até aqui e o quanto me era doloroso deixá-los a cada despedida.
E que, com seus abraços, beijos e sorrisos a cada reencontro, me incentivavam a caminhar, a ter forças para continuar, sempre, sendo alívios de momentos de estresses e decepções, e vendo em seus olhares carinhosos um porto seguro para onde poderia fugir dos meus medos e incertezas.
Junto a vocês compartilhei, neste ciclo de vida que agora se finda, muitas alegrias e frustrações, tornando nossa e não somente minha essa vitória.
Perdoem me pelas ausências e jamais se esqueçam do meu amor por vocês.
RESUMO
Nosso objetivo foi avaliar os efeitos gastroprotetores de PS da alga marinha verde C. mexicana (PS-Cm) em modelos de dano gástrico induzidos pelo etanol em camundongos e seus possíveis efeitos tóxicos. Para se estudar a ação gastroprotetora, grupos de camundongos Swiss machos foram tratados com PS-Cm (2, 20 ou 200 mg/kg, v.o.) e submetidos a lesão gastrica induzidos por etanol absoluto. Avaliou-se, também, o envolvimento das vias endógenas de PG e NO. Os PS-Cm (2, 20 ou 200 mg/kg), quando administrados por via oral, reduziram significativamente o dano gástrico e este efeito foi inibido através do pré-tratamento com indometacina. PS-Cm (200 mg/kg) impediu a redução da GSH e normalizou os níveis elevados de MDA, induzidos pelo etanol. No entanto, os PS-Cm (200 mg/kg) não mostraram efeitos significativos sobre o NO2/NO3 em comparação com o grupo etanol. O
pré-tratamento com L-NAME induziu danos da mucosa gástrica e não inibiu o efeito gastroprotetor de PS-Cm (200 mg/kg). Para avaliar os possiveis efeitos tóxicos, utilizamos os ensaios de toxicidade aguda e de dose repetida (28 dias) com camundongos Swiss, utilizando as diretrizes 420 e 407 da OECD. Os resultados obtidos no ensaio de toxicidade aguda demonstraram que os PS-Cm (400, 600, 800, 1000 mg/kg) não ocasionaram toxicidade evidente. Mas, para a dose de 2000 mg/kg foi evidenciado sinais de toxicidade (piloereção, apatia e perda de peso) e morte (n=3). No ensaio de toxicidade de dose repetida, os animais tratados com PS-Cm (600 mg/kg) não demonstraram sinais de toxicidade. No entanto, os animais tratados com PS-Cm (800 ou 1000 mg/kg) apresentaram sinais de toxicidade e os do grupo (1000 mg/kg) morreram durante o ensaio. Não foi observada diferença significativa em relação ao grupo controle para análises bioquímicas. Na avaliação histopatólogica, lesões foram observadas no rim e no fígado de animais do grupo (800 mg/kg). Os sinais de regeneração foram observados no grupo tratado pós-ensaio. Assim podemos concluir que o efeito gastroprotector de PS-Cm observado se deve ao envolvimento de PG e a redução do estresse oxidativo, com ações independentes do NO. E, que a administração oral única de PS-Cm apresentou um nível de dose letal mediana (DL50) de 1000 mg/kg de peso corporal, sendo classificada na categoria 3 do GHS e que o NOAEL foi determinado como sendo uma dose inferior a 600 mg/kg/dia quando administrada por via oral.
ABSTRACT
Our objective was to evaluate the cases of PS spiders in the green seaweed C. mexicana (PS-Cm) in models of gastric damage induced by ethanol in mice and its toxic effects. By studying the gastroprotective action, groups of male Swiss mice were treated with PS-Cm (2, 20 or 200 mg / kg, v.o.) and subjected to gastric injury induced by absolute ethanol. Also, the case, also, the involvement of the final pathways of PG and NO. PS-Cm (2, 20 or 200 mg / kg), when administered orally, significantly reduced gas and gastric, and are inhibited by pre-treatment with indomethacin. PS-Cm (200 mg / kg) prevented the reduction of GSH and normalized the high levels of MDA, induced by ethanol. However, PS-Cm (200 mg / kg) are not important for NO2 / NO3 compared to the ethanol group. Pretreatment with L-NAME induced gastric mucosal damage and did not inhibit the gastroprotective effect of PS-Cm (200 mg / kg). To evaluate the possible toxic effects, we used the acute and repeated dose (28 days) toxicity assays with Swiss mice using OECD guidelines 420 and 407. The results obtained are not acute toxicity tests, they showed that PS-Cm (400, 600, 800, 1000 mg / kg) did not cause obvious toxicity. But at a dose of 2000 mg / kg for evidence of toxicity (piloerection, apathy and weight loss) and death (n = 3). There is no repeated dose toxicity test, animals treated with Cm (600 mg / kg) showed no signs of toxicity. However, animals treated with PS-Cm (800 or 1000 mg / kg) showed signs of toxicity and the group (1000 mg / kg) died during the test. No significant difference was observed in relation to the control group for biochemical analyzes. In the histopathological evaluation, lesions were observed without border and without animals of the groups (800 mg / kg). Regeneration signals were observed in the post-test treated group. Thus we can conclude that the gastroprotective effect of PS-Cm observed to develop the involvement of PG and a reduction of oxidative stress, with actions independent of NO. And, which is a single oral administration of PS-Cm showed a median lethal dose level (LD50) of 1000 mg / kg body weight, being classified in category 3 GHS and that NOAEL was determined to be a dose lower than 600 mg / kg / day when administered orally.
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
AINES Antiinflamatórios não-esteróides
Cm-PS Polissacarídeos sulfatados de C. mexicana Cm-SP Sulfated polysaccharides of C. mexicana CL50 Concentração letal 50%
DL50 Dose letal 50% GAG Glicosaminoglicanos
GHS Globally Harmonised System GI Gastro intestinal
GSH Glutationa HCL Ácido cloridico HO-1 Hemoxigenase 1
L-NAME N-nitro-L-arginine methyl ester MDA Malonaldeído
NF-KB Fator nuclear kappa B NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
cNOS Isoforma constitutiva da NOS eNOS Isoforma endotelial da NOS nNOS Isoforma neuronal da NOS iNOS Isoforma induzível da NOS NO2/NO3 Nitrito/Nitrato
NOAEL Nível de Efeito Adverso Sem Observações
OECD Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico PG Prostaglandinas
PGI Prostaciclinas
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 11
2 OBJETIVOS ………... 13
3 REVISÃO DE LITERATURA... 14
3.1 Algas marinhas ...……… 14
3.1.1 Considerações gerais ...……... 14
3.1.2 Aplicações biotecnológicas de algas marinhas ... 15
3.1.3 Polissacarídeos sulfatados ......…... 16
3.1.4 PS de algas marinhas ...………... 17
3.1.5 Atividades biológicas de PS de algas do gênero caulerpa ...…... 18
3.1.6 Ação gastroprotetora de PS de algas marinhas ... 19
3.2 Gastroproteção e mecanismos de defesa da mucosa ... 20
3.2.1 Citoproteção gástrica ......……... 20
3.2.2 Lesão gástrica induzida por etanol ...…... 21
3.2.3 Componentes de defesa da mucosa gástrica ...…... 23
3.2.3.1 Barreira muco-bicarbonato...…... 23
3.2.3.2 Barreira epitelial e renovação celular contínua ... 23
3.2.3.3 Microcirculação da mucosa...…... 24
3.2.3.4 Inervação sensitiva da mucosa e regulação neuro-hormonal ... 25
3.2.3.5 Prostaglandinas...………... 26
3.2.3.6 Óxido nítrico...………... 27
3.2.3.7 Sistema antioxidante ...…………... 28
3.3 Avaliação toxicológica... 29
3.3.1 Considerações gerais ……... 29
3.3.2 Toxicidade oral aguda – DL50 ...……... 30
3.3.3 Estudo de toxicidade oral de dose repetida – 28 dias em roedores ...…... 32
REFERÊNCIAS ... 34
APÊNDICE A – GASTROPROTECTIVE EFFECTS OF SULPHATED POLYSACCHARIDES FROM THE ALGA CAULERPA MEXICANA REDUCING ETHANOL-INDUCED GASTRIC DAMAGE …... 41
APÊNDICE B – ACUTE AND REPEATED DOSES (28 DAYS) ORAL TOXICITY STUDY OF SULPHATED POLYSACCHARIDES ISOLATED FROM GREEN SEAWEEDS CAULERPA MEXICANA REVEAL TOXICOLOGICAL EFFECTS IN MICE ...…………... 51
1 INTRODUÇÃO
Os distúrbios gastrointestinais, atualmente, se apresentam como um importante problema de saúde pública que afeta grande parte da população mundial. O estresse, os transtornos nutricionais, o consumo de álcool, o uso prolongado de fármacos antiinflamatórios não-esteróides (AINES) e os glicocorticóides são seguidos por complicações gástricas, incluindo lesões na parede do estômago, conhecidas como gastrites, lesões agudas e superficiais, ou úlceras, lesões crônicas e mais profundas podendo ocorrer perfuração da parede do estomago (KWIECIEN et al., 2014; ZHU; KAUNITZ, 2008).
O desenvolvimento da lesão de mucosa gástrica é complexo e uma das principais hipóteses aceita trata do resultado do desequilíbrio entre fatores agressivos provocados por agentes endógenos (HCl e pepsina) e/ou exógenos (etanol e AINES) e os mecanismos de proteção. Vários estudos apontam o envolvimento da geração de radicais livres e perturbação na produção de óxido nítrico (NO) (BHATTACHARYYA et al., 2014; PESKAR, 2001; SZABO, 2014).
As algas são parte da dieta oriental tradicional, e são amplamente utilizadas como fitoterápicos no tratamento de várias enfermidades. São ricas em moléculas bioativas com ação em mecanismos bioquímicos e fisiológicos, com amplo potencial de uso medicinal. Sendo que algumas moléculas já desempenham um papel de destaque nas indústrias alimentícia e farmacêutica.
Algas marinhas são fontes de polissacarídeos sulfatados (PS) com grande potencial biotecnológico e muitos já são largamente usados nas indústrias de alimentos, cosméticos e farmacêuticos como ficocolóides, agentes espessantes e gelificantes (CARNEIRO et al., 2014; LEIRO et al., 2007).
fisiopatológicos diversos. Entre essas atividades biológicas podemos citar: anticoagulante (RODRIGUES et al., 2011), antitrombótica (QUINDERÉ et al., 2014), neuroprotetora (SOUZA et al., 2017), antinociceptiva e antiinflamatóra (CARNEIRO et al., 2014; RIBEIRO et al., 2014) e gastroprotetora (DAMASCENO et al., 2013).
Apesar de estudos relatados na literatura de atividades biológicas de PS de algas, os estudos relacionados aos mecanismos de ação do efeito gastroprotetor de PS de algas, ainda são considerados escassos. Alguns desses trabalhos apontam como via de ação gastropotetora a redução do estresse oxidativo, principalmente em lesões induzidos por etanol, mantendo os níveis de GSH elevados e reduzindo a produção de MDA (DAMASCENO et al., 2013; SILVA et al., 2011; SOUSA et al., 2016), assim como diminuição da secreção de citocinas inflamatórias (SHU et al., 2013; RAGHAVENDRAN et al., 2011; JI et al., 2008), modulação da produção de NO com a indução do cNOS e diminuição da ação da iNOS e o envolvimento da via NO/K-ATP (DAMASCENO et al., 2013; SILVA et al., 2011).
Embora os PS já estejam presentes na composição de vários produtos alimentícios e farmacêuticos e tenham demonstrado efeitos biológicos com potencial terapêutico, ainda não existem dados suficientes relacionados à sua segurança de uso regular a curto/longo prazo.
Apesar da existência de alguns relatos na literatura de atividades biológicos de PS obtidos da alga C. mexicana, não existe ainda, um conhecimento toxícológico mais detalhado e específico para os referidos PS (CARNEIRO et al., 2014; MATTA et al., 2011; BITENCOURT et al., 2011).
2 OBJETIVOS Geral:
Investigar a atividade gastroprotetora e analisar o perfil toxicológico dos PS extraídos da alga C. mexicana.
Específicos:
Determinar o efeito gastroprotetor dos PS extraídos da alga C. mexicana (PST) em modelo de lesão gástrica induzida por etanol em camundongos;
Investigar o envolvimento da via da PG e do NO no efeito gastroprotetor dos PST;
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Algas marinhas
3.1.1 Considerações gerais
As macroalgas marinhas são organismos pluricelulares que apresentam estruturas e características bastante variadas, são fotossintetizantes e não possuem tecidos especializados, nem vasos condutores, sendo esta a principal característica responsável pelo agrupamento taxonômico desse grupo heterogênico. Do ponto de vista botânico, são classificadas de acordo com a estrutura física, função e ciclo reprodutivo em 3 principais filos: Phaeophyta (algas pardas), Rhodophyta (algas vermelhas) e Chlorophyta (algas verdes) e suas classificações estão sobre constante revisão à medida que mais evidências genéticas e de ultra-estruturas são conhecidas (VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004; BARSANTI; GUALTIERI, 2006; O’SULLIVAN et al., 2010).
As algas pardas são ricas em pigmentos xantofílicos e fucoxantinas, mascarando outros pigmentos como a clorofila a e c e β-carotenos que são encontrados em menores proporções (VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004). As reservas alimentares de algas marrons normalmente são polissacarídeos complexos e álcoois superiores, tendo a laminarina como o carboidrato principal. Nas paredes celulares são predominantes a celulose e ácido algínico. Nos últimos anos muitos metabólitos bioativos vêm sendo isolados com diferentes atividades farmacológicas (EL GAMAL, 2010).
As algas verdes têm como principal característica uma grande presença de clorofila a e b, chegando na mesma proporção das plantas superiores (VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004). Representam o grupo mais diversificado dentre todas as algas (morfologia, estrutura e ciclo de vida), compreendendo aproximadamente 17.000 espécies e ocorrendo em diversos ambientes costeiros do mundo.
3.1.2 Aplicações biotecnólogicas de algas marinhas
As algas são utilizadas como alimento pelo homem desde os tempos remotos, aproximadamente 2700 a.C. pelos chineses. Atualmente, são reconhecidas pelo seu elevado valor nutricional e por apresentarem biomoléculas ativas com amplo interesse pelas indústrias farmacêutica e alimentícia (SMIT, 2004; EL GAMAL, 2010). Historicamente, as macroalgas marinhas têm sido utilizadas ao longo do tempo para as mais variadas finalidades, desde fontes de alimento, especialmente na China e no Japão; complemento nutricional (vitaminas e minerais) ou como agentes terapêuticos para tratamento de muitas doenças, até como suplemento na alimentação de animais e fertilizantes na agricultura (SMIT, 2004; EL GAMAL, 2010).
possuir algum valor agregado para a indústria farmacêutica (SMIT, 2004; EL GAMAL, 2010; MAYER; LEHMANN, 2011; PATEL, 2012).
Atualmente, a descoberta de muitos compostos bioativos com propriedades com potenciais biotecnológicos, tais como polissacarídeos, proteínas (lectinas), lipídios, carotenóides, peptídeos, aminoácidos e outras moléculas de macroalgas marinhas tem despertado o interesse crescente nestes organismos, uma vez que as algas são organismos com grande potencial para a bioprospecção de novas substâncias biologicamente ativas (DOS SANTOS et al., 2005; CARDOZO et al., 2007; SOUZA et al., 2017).
Entre as substancias bioativas, as de macroalgas marinhas, com grande potencial biotecnológico e farmacológico, estão os PS. Estes apresentam maior importância para indústria, atingindo significativo valor comercial através de sua utilização em diversos processos que exploram as suas propriedades físico-quimicas, tais como: gelificante, emulsificante, sendo os outros biopolímeros pouco valorizados pela indústria mundial. (JIAO et al., 2011; EL GAMAL, 2010; PATEL, 2012).
3.1.3 Polissacarídeos sulfatados
PS são polímeros aniônicos complexos e heterogêneos formados de unidades repetidas de açúcares carregados negativamente devido à presença de radicais sulfatados. Esses compostos são amplamente encontrados em mamíferos, invertebrados, fungos, plantas e com maior predominância nas algas marinhas (MOURÃO, 2007; AQUINO et al., 2005; COSTA et al., 2010; CARDOZO et al., 2007).
GAG sulfatados mais conhecidos, contém grande massa molecular e estão envolvidos em várias funções fisiológicas, como lubrificação, coagulação, suporte de tecidos e reconhecimento celular (NELSON; COX, 2014).
Nas algas os PS estão amplamente distribuídos nos tecidos, principalmente na parede celular, conferindo a esses organismos proteção, suporte, forma, rigidez e elasticidade aos tecidos neles encontrados (JIAO et al., 2011).
3.1.4 PS de algas marinhas
Os PS são os principais constituintes da matriz extracelular das algas marinhas, conferindo-lhes flexibilidade e propriedades fisiológicas importantes como manutenção e adaptação a ambientes de estresse, funções de regulação iônica, mecânica e osmótica, além de agirem como mecanismo de defesa às respostas ambientais (ANDRADE et al., 2010; AQUINO et al., 2005).
3.1.5 Atividades biológicas de PS de algas do gênero caulerpa
As algas verdes são as menos estudadas quanto à estrutura de suas moléculas e atividades biológicas, o que contradiz com sua importância na cultura humana, pois está presente na alimentação tradicional oriental e em tratamentos empíricos de muitos distúrbios patológicos.
Uma das hipóteses para o baixo interesse é o fato dos PS de algas verdes apresentarem uma maior heterogeneidade estrutural, o que dificulta o entendimento da relação dos PS com sua atividade biológica, principalmente, quando comparados aos PS de algas vermelhas ou pardas (POMIN; MOURÃO, 2008).
Os PS de algas verdes do gênero Caulerpa têm sido relatados como moduladores de uma série de funções biológicas, como visto em estudos de atividades antitumoral (COSTA, L. et al., 2010; JI et al., 2008), antiproliferativa (COSTA, L. et al., 2010), antiviral (GHOSH et al., 2004), anticoagulante (RODRIGUES et al., 2010; COSTA, M. et al., 2012), antitrombótica (RODRIGUES et al., 2011), antioxidante (COSTA, L. et al., 2010; COSTA, M. et al., 2012), antinociceptiva e anti-inflamatória (RODRIGUES et al., 2012; RIBEIRO et al., 2012, CARNEIRO et al., 2014). Apesar da variedade de atividades testadas, estudos demonstrando as relações entre estrutura e função de PS não estão claramente estabelecidos devido às dificuldades com a determinação de suas estruturas (POMIN, 2010; PATEL, 2012).
3.1.6 Ação gastroprotetora de PS de algas marinhas
O uso de algas na alimentação ou como fitoterápico é milenar e difundido em países orientais como China, Filipinas e Japão. Algas são fontes de diversas moléculas bioativas com ação terapêutica e seu emprego empírico continua sendo, uma das formas usuais de se buscar cura e alívio para vários males de conceituação popular, entre eles, distúrbios gastrointestinais. Entre esses bioativos, os polissacarídeos sulfatados vêm ganhando destaque por apresentar uma variedade de atividades biológicas com potencial terapêutico.
Alguns estudos têm sido publicados demonstrando ação gastroprotetora de polissacarídeos sulfatados de algas marinhas, embora ainda sejam escassos. Em modelos experimentais de lesão gástrica os PS tem demonstrado estarem relacionados com a redução do estresse oxidativo, principalmente em lesões induzidas por etanol (DAMASCENO et al., 2013; SILVA et al., 2011; SOUSA et al., 2016), mantendo os níveis de GSH elevados e reduzindo a produção de MDA, com a diminuição de citocinas inflamatórias, inibindo a expressão genica de TNF-α e IL-6 (SHU et al., 2013; RAGHAVENDRAN et al., 2011; JI et al., 2008); aumento dos níveis de NO com a indução do cNOS e diminuição da ação da iNOS e o envolvimento da via NO/K-ATP (DAMASCENO et al., 2013; SILVA et al., 2011).
3.2 Gastroproteção e mecanismos de defesa da mucosa
3.2.1 Citoproteção gástrica
Robert et al. (1979) cunharam o termo Citoproteção para definir a proteção da mucosa gástrica pela ação das prostaglandinas. Os mesmos verificaram que ocorria ação protetora mesmo após a penetração do etanol absoluto na mucosa gástrica. Seus estudos despertaram enorme interesse em estudar os mecanismos de defesa da mucosa gástrica, desvendando os vários níveis de defesa da mucosa e seus principais mecanismos (SZABO, 2014). Os vários níveis de defesa da mucosa podem ser vistos em um sentido estrutural, começando no lúmen e movendo-se para níveis mais profundos do tecido, sendo classificados em três níveis de proteção: pré-epitelial, epitelial ou subepitelial.
A proteção pré-epitelial é a primeira linha de defesa da mucosa gástrica sendo constituída de uma barreira física entre o conteúdo gástrico e a mucosa; formada por uma barreira muco-bicarbonato e composta por muco rico em bicarbonato e fosfolipídios.
A próxima linha de defesa da mucosa é formada por uma camada contínua de células epiteliais da superfície, que secretam muco e bicarbonato e geram PGs, proteínas de choque térmicos, compostos antioxidantes e citocinas protetoras. A presença de fosfolípidios na superfície lumial dá uma característica hidrofóbica, repelindo agentes agressores solúveis em água. Suas junções interligadas fortemente formam uma barreira, prevenindo a difusão de retorno do ácido gástrico e pepsina (LAINE et al., 2008).
bicarbonato e produção de NO, além da remoção de substancias tóxicas; e por último a inervação sensitiva da mucosa contribuindo com a liberação de neurotransmissores que promovem a vasodilatação e o aumento do fluxo sanguíneo na submucosa (LAINE et al., 2008). Além disso, a defesa gástrica envolve mecanismos de neutralização de espécies reativas de oxigênio (ROS), liberação de citocinas, respostas imune inata e adaptativa, e inibição da apoptose.
No entanto, a lesão da mucosa pode ocorre sempre que os mecanismos de defesa são prejudicados ou estão sobrecarregados por substâncias nocivas. Isso ocorre regularmente, mas não dá origem a uma perturbação clinicamente importante, devido ao rápido processo de reparação, portanto a manutenção da estrutura da mucosa gástrica, muitas vezes é mantida mesmo após a lesão epitelial (BRZOZOWSKI et al., 2005).
3.2.2 Lesão gástrica induzida por etanol
A mucosa gástrica é continuamente exposta a muitas substâncias e fatores nocivos, e por isso tem um processo contínuo de manutenção de sua integridade estrutural. Assim, resiste a autodigestão por substâncias como o HCl e pepsina, além de evitar danos do tecido gástrico por agentes químicos e biológicos. Esse processo é composto por uma rede complexa entre diversos componentes que norteiam vários mecanismos de defesa celular, principalmente, com envolvimento de PG, NO, e vários outros mediadores (LAINE et al., 2008).
defesa estão prejudicados por algum fator que provoque deficiência em sua manutenção (LAINE et al., 2008; SZABO, 2014; AMANDEEP et al., 2012).
O etanol é um dos agentes agressores mais usados nos ensaios biológicos para estudos de lesão gástrica. Embora, ainda não estejam totalmente elucidados os mecanismos pelos quais o etanol danifica a mucosa gástrica. No entanto se sabe que o etanol penetra na mucosa gástrica causando rompimentos da barreira muco-bicarbonato, esfoliações e danos ao epitélio, hemorragias, erosões, edema, infiltração celular e alterações vasculares. (LAINE et al., 2008; SZABO, 2014).
O etanol em altas concentrações, acima de 50%, é capaz de romper a barreira de muco-bicarbonato, quebrando a hidrofobicidade e diminuindo o efeito tampão do bicarbonato,
causando re-difusão de íons H+. Além disso, o etanol lesa os microvasos e promove redução do fluxo sanguíneo, com vasoconstrição nas artérias da submucosa, estase vascular gástrica, congestão capilar e aumento da permeabilidade vascular, efeitos estes, provocados pela liberação de mediadores como endotelina-1 e histamina, aumentando os riscos de hemorragias e ulcerações (SANTOS; RAO, 2001).
3.2.3 Componentes de defesa da mucosa gástrica
3.2.3.1 Barreira muco-bicarbonato
A primeira linha de defesa da mucosa gástrica é uma barreira física entre o conteúdo gástrico e a mucosa, composta por muco rico em bicarbonato e fosfolipídios. O muco é composto por 95% de água e 5% de mucina revestido por uma camada de fosfolipídeos que possui características tensoativas e fortes propriedades hidrofóbicas. As mucinas são glicoproteínas que se polimerizam e formam um gel estável que reveste toda a superfície da mucosa. Esta camada retém bicarbonato secretado pelas células epiteliais da mucosa para manter um microambiente neutro. A produção de muco é estimulada por gastrina, secretina, prostaglandinas E2 e agentes colinérgicos. A presença de ácido gástrico e a estimulação vagal aumentam a sua liberação para o lúmen (REPETTO; LLESUY, 2002; PELASEYED et al., 2014).
3.2.3.2 Barreira epitelial e renovação celular contínua
A próxima linha de defesa é formada por uma camada contínua de células epiteliais da superfície da mucosa, que secretam muco e bicarbonato e geram PG, proteínas de choque térmico e citocinas envolvidas na proteção e renovação da mucosa. Devido à presença de fosfolipídios em suas superfícies apicais formam uma barreira hidrofóbica, repelindo agentes agressores solúveis em água, como o ácido e pepsina. Suas células são unidas por junções intercomunicantes apertadas de forma a não permitir a difusão de retorno de ácido gástrico e pepsina (MODLIN et al., 2003; LAINE et al., 2008).
uma proliferação bem coordenado e controlado de células progenitoras que permite a substituição de células danificadas ou envelhecidas (MODLIN et al., 2003).
A re-epitelização é um processo essencial porque a barreira epitelial protege continuamente a mucosa contra danos mecânicos e químicos. O maior estímulo para a divisão, migração, proliferação celular e re-epitelização é dado por fatores de crescimento epidérmicos, entre eles podemos citar a PG e gastrina. Esses fatores produzidos localmente ativam a proliferação e migração celular epitelial exercendo uma ação trófica sobre a mucosa gástrica (MODLIN et al., 2003; LAINE et al., 2008).
3.2.3.3 Microcirculação da mucosa
3.2.3.4 Inervação sensitiva da mucosa e regulação neuro-hormonal
Os vasos da mucosa e submucosa são inervados por nervos e neurônios primários sensoriais aferentes que formam um plexo denso. As fibras nervosas acompanham os vasos capilares na lâmina própria e acabam logo abaixo das células epiteliais da mucosa. Essas terminações nervosas são sensíveis ao conteúdo luminal gástrico, assim como, a entrada de ácido na mucosa lesionada. Sendo, portanto, estimuladas e liberando neurotransmissores, tais como, substância P e peptídeos relacionados com o gene da calcitonina, estimulando desta forma a geração de NO; dilatação das arteríolas da submucosa e aumento do fluxo sanguíneo na mucosa (LAINE et al., 2008; TARNAWSKI et al., 1993).
3.2.3.5 Prostaglandinas
As PG são sintetizadas a partir do ácido araquidônico pelas enzimas ciclooxigenases (COX) e seus mecanismos de defesa são abolidos quando são utilizados agentes inibidores da COX como os AINES (AMANDEEP et al., 2012).
A geração contínua de PG é crucial para a manutenção da integridade da mucosa e proteção contra agentes ulcerosos e necrosantes (AMANDEEP et al., 2012). Quase todos os mecanismos de defesa da mucosa gástrica são estimulados ou facilitados pelas PG. As PG inibem a secreção ácida nas células parietais via proteína G inibitória; estimulam a secreção de muco e bicarbonato; aumentam o fluxo sanguíneo e aceleram a restituição epitelial e cicatrização da mucosa; agem sobre a infiltração celular inflamatória, inibindo a migração de leucócitos e a adesão plaquetária (ROBERT et al. 1979; AMANDEEP et al., 2012).
3.2.3.6 Óxido nítrico
O NO é sintetizado a partir de L-arginina através da ação catalítica de um grupo de enzimas, as NO sintases (NOS). Tem sido atribuído ao NO um papel importante na defesa da mucosa gástrica e na patogênese da lesão de mucosa. São conhecidos três tipos de NOS, sendo duas isoformas constitutivas (cNOS): uma endotelial (eNOS) e uma neuronal (nNOS), que estão envolvidas na liberação de NO em condições normais, e uma NOS induzível (iNOS) que não é expressa constitutivamente, sendo liberada em grandes quantidades nas reações inflamatórias (MONCADA et al., 1991).
As cNOS são muito importantes na função normal do trato GI na medida em que a inibição dessas enzimas pode resultar em distúrbios de motilidade GI, diminuição do fluxo sanguíneo e contrubuem para ocorrência de lesões de mucosa, pois a supressão da síntese de NO torna a mucosa gástrica mais suscetível a lesões (AMANDEEP et al., 2012; BILSKI et al., 1994). Por outro lado, a iNOS que produz quantidades relativamente grandes de NO sob determinadas condições patológicas, contribui para disfunção de mecanismos de defesa da mucosa (WHITTLE et al., 1993).
3.2.3.7 Sistema antioxidante
Radicas livres derivados do oxigênio (ROS) estão envolvidas em vários eventos patológicos incluindo úlceras e inflamação gastrointestinal. Seu papel no desenvolvimento da lesão da mucosa gástrica induzida por agentes químicos já é bem conhecido e envolve um aumento do estresse oxidativo e uma diminuição dos mecanismos de defesa antioxidante (YOSHIDA et al., 1995; JONSSON et al., 2007). Os ROS apresentam uma variedade de mecanismos lesivos, dentre eles a peroxidação de lipídeos nas membranas celulares, promovendo alteração na permeabilidade e fluidez da membrana, prejudicando as funções dos receptores, canais iônicos e outras proteínas que fazem parte das membranas (FREEMAN; CRAPO, 1982).
Já está bem documentado que o etanol causa um aumento importante da peroxidação lipídica, determinado através da elevação da concentração de MDA e da diminuição dos níveis de glutationa no tecido gástrico, provocando danos na membrana celular através da coagulação de proteínas, lipídios e ácidos nucléicos. Além de provocar hemorragia e edema pela ativação de NF-kB nas células musculares lisas e endoteliais (JONSSON; PALMBLAD, 2001).
3.3 Avaliação toxicológica
3.3.1 Considerações gerais
A avaliação da toxicidade tem como objetivo conhecer os efeitos nocivos decorrentes das interações de substâncias químicas com o organismo para o estabelecimento de formas seguras para sua utilização, sendo a identificação destes efeitos proveniente de estudos pré-clínicos, clínicos e epidemiológicos (CORRÊA; ZAMBRONE, 2009).
Os vários testes de toxicidade podem ser classificados em in vitro e in vivo, este último em testes de toxicidade aguda ou dose única e os de toxicidade de dose repetida ou contínua, com exposições às substâncias por um determinado período. Os ensaios de toxicidade aguda avaliam os efeitos adversos que ocorrem em um curto período de tempo, após administração única ou múltipla de doses da substância avaliada dentro do período de 24 horas. Os estudos de toxicidade com exposições contínuas de substâncias são utilizados para mimetizar a forma mais comum de exposição humana às exposições repetidas e constituem a etapa inicial para identificação dos efeitos adversos em potencial (CAMPOS; AMARAL, 2009).
3.3.2 Toxicidade oral aguda – DL50
Toxicidade aguda é aquela produzida por um fármaco quando o mesmo é administrado em uma ou mais doses, durante um período que não exceda 24 horas em condições padronizadas. A toxicidade aguda serve de base para o estabelecimento de um regime de doses para as pesquisas com doses repetidas (OECD, 2001).
Nesses ensaios, se busca uma caracterização nociva da relação dose-resposta das substâncias administradas, observando dose e via. Os efeitos observados nos animais são relacionados à quantidade de substância administrada e a via de aplicação e o principal ponto analisado é a morte do animal, observando também qualquer efeito adverso que possa ser atribuído à substância durante o período de avaliação (VALADARES, 2006).
Esses estudos são conduzidos com o propósito de expressar a potência das substâncias em termos da dose letal média (DL50- dose letal 50% - dose que mata 50% dos animais) ou da concentração letal média (CL50 - concentração letal 50% - concentração que mata 50% dos animais) valores estes que apontam a dose, ou intervalo de dose, estimada que cause a morte em 50% dos animais expostos ao produto testado.
a ser conduzidos utilizando apenas um sexo e a dose limite que antes era de 5.000 mg/kg foi reduzida para 2.000 mg/kg (OECD, 2001; VALADARES, 2006).
Em 1992, foi adotada uma nova metodologia para DL50, o Teste da Dose Fixa (OECD 420), a ser utilizada como uma alternativa para diretriz 401 e não com a finalidade de substituí-la. Em 1996, surgiu uma segunda alternativa, o método da Toxicidade Aguda de Classe (OECD 423) e, em 1998, foi adotado o Teste “Up and Down” - UDP (OECD 425). O Teste Toxicidade Aguda de Classe utiliza o conceito de dose fixa, porém o objetivo final seria a mortalidade. O UDP, como o nome sugere, objetiva estimar o valor da DL50 testando sequencialmente animais individuais, sendo dosado e analisado um animal de cada vez, sendo a dose administrada em cada animal ajustada para cima ou para baixo, dependendo do resultado prévio do animal anterior (OECD, 2001; VALADARES, 2006).
3.3.3 Estudo de toxicidade oral de dose repetida – 28 dias em roedores
Neste ensaio, a substância de teste é administrada por via oral diariamente em doses graduadas para vários grupos de animais experimentais, um nível de dose por grupo por um período de 28 dias. Durante o período de administração, os animais são observados quanto a sinais de toxicidade, diariamente. Os animais que morrem ou são eutanizados durante o teste são necropsiados e, no final, os animais sobreviventes são eutanizados e necropsiados. As doses utilizadas na determinação da toxicidade oral com doses repetidas são determinados através de informações obtidas no teste de toxicidade oral aguda (OECD, 2008; VALADARES, 2006).
Um estudo de 28 dias fornece informações sobre os efeitos da exposição oral repetida e pode indicar à necessidade de novos estudos de prazo mais longo, e fornecer informações sobre a seleção de deses para estes estudos. Além de permitir a caracterização da toxicidade da substância testada, fornece uma indicação da relação dose-resposta e a determinação do Nível de Efeito Adverso Sem Observações (NOAEL) (OECD 2008; CAMPOS; AMARAL, 2009).
A diretriz original do teste 407 foi adotada em 1981, revisada em 1995, 1998 e em 2008, para obter uma versão capaz de gerar informações sobre neurotoxicidade, imunotoxicidade e disturbios endócrinos provocadas pelas substâncias teste. Este ensaio utiliza roedores de ambos os sexos, preferencialmente ratos, adultos jovens, com cinco animais por grupo das doses a serem testadas e ainda recomenda-se a utilização de grupos satélite, no grupo controle e no grupo da maior dose testada, que permanecerão em observação por mais 14 dias após o 28º dia, para observação da persistência, reversibilidade ou efeitos posteriores (OECD 2008).
perigos e avaliação de risco, fornecendo informações sobre os possíveis riscos para a saúde que podem surgir de exposição repetida durante um período de tempo relativamente limitado, incluindo efeitos nos sistemas nervoso, imune e endócrino (OECD 2008).
REFERÊNCIAS
ABRAHAM, N. G.; KAPPAS, A. Pharmacological and Clinical Aspects of Heme Oxygenase. Pharmacol Rev,[S.I], v. 60, p. 79–127, 2008.
AMANDEEP, K. et al., Peptic Ulcer : a Review on Etiology and Pathogenesis. Int Res J Pharm, [S.I], v.3, n.6, p.34–8, 2012.
ANDRADE, L.R. et al., Brown algae overproduce cell wall polysaccharides as a protection mechanism against the heavy metal toxicity. Marine Pollution Bulletin, [S.I], v.60, n.9, p.1482-1488, 2010.
AQUINO, R. S. et al., Occurrence of sulfated galactans in marine angiosperms. evolutionary implications. Glycobiology, [S.I], v. 15, n. 1, p. 11-20, 2005.
BARSANTI, L.; GUALTIERI, P. Algae – Anatomy, Biochemistry and Biotechnology. 1ª Ed. Boca Raton: Taylor & Francis Group, LLC, 2006.
BHATTACHARYYA, A. et al., Oxidative Stress: An Essential Factor in the Pathogenesis of Gastrointestinal Mucosal Diseases. Physiological Reviews, [S.I], v.94, n.2, p. 329–354. 2014. BILSKI, J. et al., Role of endogenous nitric oxide in the control of gastric acid
secretion, blood flow and gastrin release in conscious dogs. Regul Pept, [S.I], v.53, p.175–184, 1994.
BITENCOURT, M. A. O. et al., Aqueous and methanolic extracts of caulerpa mexicana suppress cell migration and ear edema induced by inflammatory. Marine Drugs, [S.I], v. 9, p.1332-1345, 2011.
BRZOZOWSKI, T. et al., Role of prostaglandins in gastroprotection and gastric adaptation. J Physiol Pharmacol, [S.I], v. 5, p.33-55, 2005.
CAMPOS, S. V.; AMARAL, L. M. S. Toxicidade sobaguda e subcrônica. In: CORRÊA, C. L.; LEMONICA, I. P.; ZAMBRONE, F. A. D.; CAMARGO, J. L. V. Bases científicas para avaliação da toxicidade de agrotóxicos. São Paulo: ILSI- Brasil-Internacional Life Science Institute do Brasil, cap. 4, p.95-130, 2009.
CARDOZO, K. H. M. et al., Metabolites from algae with economical impact. Comp Biochem Physiol C 367. Toxicol Pharmacol, [S.I], v. 146, p. 60-78, 2007.
CORRÊA, C. L.; BOFF, M. M. Toxicidade Aguda. In: CORRÊA, C. L.; LEMONICA, I. P.; ZAMBRONE, F. A. D.; CAMARGO, J. L. V. Bases científicas para avaliação da
toxicidade de agrotóxicos. São Paulo: ILSI- Brasil-Internacional Life Science Institute do Brasil, cap. 3, p.43-91, 2009.
CORRÊA, C. L.; ZAMBRONE, F. A. D. Introdução. In: CORRÊA, C. L.; LEMONICA, I. P.; ZAMBRONE, F. A. D.; CAMARGO, J. L. V. Bases científicas para avaliação da
toxicidade de agrotóxicos. São Paulo: ILSI- Brasil-Internacional Life Science Institute do Brasil, cap.1, p. 15-23, 2009.
COSTA, L. S. et al., Biological activities of sulfated polysaccharides from tropical seaweeds. Biomedicine and Pharmacotherapy, [S.I], v. 64, p. 21-28, 2010.
COSTA, M. S. S. P. et al., Evaluating the possible anticoagulant and antioxidant effects of sulfated polysaccharides from the tropical green alga Caulerpa cupressoides var. flabellate. J Appl Phycol. [S.I], v.24, n.5, p.1159-1167, 2012.
DAMASCENO, S. R. B. et al., Role of the No/KATP pathway in the protective effect of a sulfated-polysaccharide fraction from the algae Hypnea musciformis against ethanol-induced gastric damage in mice. Brazilian Journal of Pharmacognosy, [S.I], v.23, n.2, p.320–328, 2013.
DOS SANTOS, M. D. et al., Plant cell and microalgae culture. In: Modern Biotechnology in Medicinal Chemistry and Industry. Research Signpost, Kerala, India, 2005.
EL GAMAL, A. A. Biological importance of marine algae. Saudi Pharmaceutical Journal, [S.I], v. 18, p. 1–25, 2010.
FESHARAKI, M. et al., Reactive oxygen metabolites and anti-oxidative defenses in aspirin-induced gastric damage in rats: Gastroprotection by Vitamin E. Pathophysiology, [S.I], v. 13, n. 4, p. 237- 243, 2006.
FILARETOVA, L. et al., Gastroprotective role of glucocorticoid hormones. J Pharmacol Sci, [S.I], v.104, p.195–201, 2007.
FREEMAN, B.A., CRAPO, J.D. Biology of disease: free radicals and tissue injury. Lab Invest, [S.I], v.47, n.5, p.412-26, 1982.
GHOSH, P. et al., In vitro anti-herpetic activity of sulfated polysaccharide fractions from Caulerpa racemosa. Phytochemistry, [S.I], v. 65, p. 3151-3157, 2004.
GANNON, B. et al., Mucosal microvascular architecture of the fundus and body of the human stomach. Gastroenterology, [S.I], v.86, p.866– 875, 1984.
GOMES, A. S. et al., Gastroprotective effect of heme-oxygenase 1/biliverdin/CO pathway in ethanol-induced gastric damage in mice. European Journal of Pharmacology, [S.I], v. 642, n. 1, p. 140–145, 2010.
HOLM, M. et al., Acid-induced duodenal mucosal nitric oxide output parallels bicarbonate secretion in the anaesthetized pig. Acta Physiol Scand, [S.I], v. 162, p. 461-468, 1998. HWANG, H. J. et al., The effect of polysaccharide extracted from the marine alga
Capsosiphon fulvescens on ethanol administration. Food and Chemical Toxicology, [S.I], v. 46, n. 8, p. 2653–2657, 2008.
JI, H. et al. Separation of the Polysaccharides in Caulerpa racemosa and their chemical composition and antitumor activity. Journal of Applied Polymer Science, [S.I], v. 110, p. 1435–1440, 2008.
JIAO, G. et al., Chemical structures and bioactivities of sulfated polysaccharides from marine algae. Marine Drugs, [S.I], v. 9, p. 196-223, 2011.
JONSSON, A.S., PALMBLAD, J.E. Effects of ethanol on NF-kappaB activation, production of myeloid growth factors, and adhesive events in human endothelial cells. J Infect Dis, [S.I], v.184, n.6, p.761-769, 2001.
JONSSON, I.M. et al., Ethanol prevents development of destructive arthritis. Proc Natl Acad Sci, [S.I], v.104, n.1, p.258-63, 2007.
KATO, S. et al., Role of nitric oxide in regulation of gastric acid secretion in rats: effects of NO donors and NO synthase inhibitor. Br J Pharmacol, [S.I], v. 123, p. 839-846, 1998. KELECOM, A. Secondary metabolites from marine microorganisms. Acad Bras Cienc, [S.I], v.74, p.151–170. 2002.
KIRKBY, K. A.; ADIN, C. A. Products of heme oxygenase and their potential therapeutic applications. Am J Physiol Renal Physiol, [S.I], v. 290, p. 563–571, 2006
KISHORE, R. et al., Stabilization of tumor necrosis factor alpha mRNA by chronic ethanol: role of A+ U-rich elements and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathway. J Biol Chem, [S.I], v. 9, p. 276, 2001.
KWIECIEN, S. et al., Lipid peroxidation, reactive oxygen species and antioxidative factors in the pathogenesis of gastric mucosal lesions and mechanism of protection against oxidative stress - induced gastric injury. Journal of Physiology and Pharmacology, [S.I], v.65, n.5, p.613–22, 2014.
LAHAYE, M.; ROBIC, A. Structure and functional properties of ulvan, a polysaccharide from green seaweeds. Biomacromol, [S.I], v.8, p.1765-1774, 2007.
LEIRO, J. M. et al., Immunomodulating activities of acidic sulphated polysaccharides obtained from the seaweed Ulva rigida C. Agardh. International Immunopharmacology, [S.I], v.7, n.7, p.879–888, 2007.
MAINES, M. D. The heme oxygenase system: a regulator of second messenger gases. Rev Pharmacol Toxicol, [S.I], v.37, p. 517–554, 1997.
MATTA, C. B. B. et al., Antinociceptive and Anti-Inflammatory Activity from Algae of the Genus Caulerpa. Agents. Mar Drugs, [S.I], v. 9, p. 307-318, 2011.
MAYER, A. M. S.; LEHMANN, V. K. B. Marine pharmacology in 1998: Marine compounds with antibacterial, anticoagulant, antifungal, antiinflammatory, anthelmintic, antiplatelet, antiprotozoal, and antiviral activities; with actions on the cardiovascular, endocrine, immune, and nervous systems; and other miscellaneous mechanisms of action. Pharmacologist. [S.I], v.42, p.62–69, 2011.
MODLIN, I.M. et al., Gastric stem cells: an update. Keio J Med, [S.I], v.52, p.134–137, 2003.
MONCADA, C. et al., Non-NMDA antagonists protect against kainate more than AMPA toxicity in the rat hippocampus. Neurosci Lett, [S.I], v.133, n.2, p.287-90, 1991.
MOURÃO, P. A. A carbohydrate-based mechanism of species recognition in sea urchin fertilization. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, [S.I], v.40, p. 5–17, 2007.
NANJI, A.A. et al., Curcumin prevents alcohol-induced liver disease in rats by inhibiting the expression of NF-kappa B-dependent genes. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, [S.I], v.284, p. G321- G327, 2003.
NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2011. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014.
OECD – ORGANIZATION FOR ECONOMIC COOPERATION AND DEVELOPMENT. Guidelines for the testing of chemicals: Guideline 420 – Acute Oral Toxicity – Fixed Dose Procedure. Paris, 2001.
OECD – ORGANIZATION FOR ECONOMIC COOPERATION AND DEVELOPMENT. Guidelines for the testing of chemicals: Guideline 407 – Repeated dose 28-day oral toxicity study in rodents. Paris, 2008.
O’SULLIVAN, L. et al., Prebiotics from Marine Macroalgae for Human and Animal Health Applications. Mar Drugs, [S.I], v.8, n.7, p. 2038–2064, 2010.
PELASEYED, T. et al., The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system.
Imunological Review, [S.I], v.260, p.8-20, 2014.
PERCIVAL, E.; McDOWELL, R. H. Chemistry and enzimology of marine algal polisaccharides. Academic Press, New York, 1967.
PESKAR, B. M. Role of cyclooxygenase isoforms in gastric mucosal defence. Journal of Physiology, [S.I], v.95, p.3–9, 2001.
POMIN, V. H. Structural and functi onal insights into sulfated galactans: a systematic review. Glycoconj J, [S.I], v. 27, p. 1-12, 2010.
POMIN, V.H.; MOURÃO, P. A S. Structure, biology, evolution, and medical importance of sulfated fucans and galactans. Glycobiology, [S.I], v. 18, n. 12, p. 1016–1027, 2008.
QUINDERÉ, A. L. G. et al., Is the antithrombotic effect of sulfated galactans independent of serpin? Journal of Thrombosis and Haemostasis, [S.I], v.12, p.43–53, 2014.
RAGHAVENDRAN, H. R. B. et al., Immunomodulatory activity of fucoidan against aspirin-induced gastric mucosal damage in rats. International Immunopharmacology, [S.I], v. 11, n. 2, p. 157–163, 2011.
REPETTO, M. G.; LLESUY, S. L. Antioxidant properties of natural compounds used in popular medicine for gastric ulcers. Braz J Med Biol Res, [S.I], v. 35, n. 5, p.523-534, 2002. RIBEIRO, N. A. et al., Sulfated polysaccharides isolated from the green seaweed Caulerpa racemosa plays antinociceptive and anti-inflammatory activities in a way dependent on HO-1 pathway activation. Inflammation Research, [S.I], v.63, n.7, p.569–580, 2014.
ROBERT, A. et al., Cytoprotection by prostaglandins in rats. Prevention of gastric necrosis produced by alcohol, HCl, NaOH, hypertonic NaCl and thermal injury. Gastroenterology, [S.I], v. 77, p. 433-443, 1979.
RODRIGUES, J. A. G. et al., Polissacarídeos sulfatados isolados das clorofíceas Caulerpa racemosa e Caulerpa cupressoides – extração, fracionamento e atividade anticoagulante. Acta Scientiarum Biological Sciences, [S.I], v. 32, n. 2, p. 113-120, 2010.
RODRIGUES, J. A. G. et al., An antithrombin-dependent sulfated polysaccharide isolated from the green alga Caulerpa cupressoides has in vivo anti- and prothrombotic effects. Ciência Rural, [S.I], v.41, n.4, 2011.
RODRIGUES, J. A. G. et al., Antinociceptive and anti-inflammatory activities of a sulfated polysaccharide isolated from the marine green seaweed Caulerpa cupressoides.
Pharmacologgical Reports, [S.I], v. 64, p. 282-292, 2012.
SANTOS, F. A.; RAO, V. S. N. 1,8-Cineol, a food flavoring agent, prevents ethanol-induced gastric injury in rats. Dig Dis Sci, [S.I], v. 46, p. 331-337, 2001.
SHU, M.-H. et al., Anti-inflammatory, gastroprotective and anti-ulcerogenic effects of red algae Gracilaria changii (Gracilariales, Rhodophyta) extract. BMC complementary and alternative medicine, [S.I], v. 13, n. 1, p. 61, 2013.
SILVA, R. O. et al., Sulfated-polysaccharide fraction from red algae Gracilaria caudata protects mice gut against ethanol-induced damage. Mar Drugs, [S.I], v.9, n.11, p. 2188– 2200, 2011.
SMIT, A. J. Medicinal and pharmaceutical uses of seaweed natural products: A review. Journal of Applied Phycology, [S.I], v.16, p.245–262, 2004.
SOUSA, W. M. et al., Sulfated polysaccharide fraction from marine algae Solieria filiformis: Structural characterization, gastroprotective and antioxidant effects. Carbohydrate
Polymers, [S.I], v. 152, p. 140–148, 2016.
SOUZA, R. B. et al., Neuroprotective Effects of Sulphated Agaran from Marine Alga Gracilaria cornea in Rat 6-Hydroxydopamine Parkinson’s Disease Model: Behavioural, Neurochemical and Transcriptional Alterations. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, [S.I], v. 120, n. 2, p. 159–170, 2017.
SZABO, S. Gastric cytoprotection is still relevant. Journal of Gastroenterology and Hepatology, [S.I], v.29, n.S4, p.124–132. 2014.
TANAKA, S. et al., Central vagal activation increases mucous gel thickness and surface cell intracellular pH in rat stomach. Gastroenterology, [S.I], v.122, p.409– 417, 1997.
TARNAWSKI. A. et al., Quality of ulcer healing: evidence for impaired restoration of sensory CGRP nerves in the scar of experimental gastric ulcer. Eur J Gastroenterol and Hepatol, [S.I], S81–S85, 1993.
TAKEUCHI, K. Gastric cytoprotection by prostaglandin E2 and prostacyclin: Relationship to ep1 and ip receptors. Journal of Physiology and Pharmacology, [S.I], v. 65, n. 1, p. 3–14, 2014.
UEDA, K. et al., Adaptive HNE-Nrf2-HO-1 pathway against oxidative stress is associated with acute gastric mucosal lesions. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, [S.I], v.295, n.3, p.G460-9, 2008.
VALADARES, M. C. Acute toxicity evaluation: strategies post “DL50 test era”. Revista Eletrônica de Farmácia, [S.I], v. 3, n.2, p. 93-98, 2006.
VIDOTTI, E. C.; ROLLEMBERG, M. C. Algas: da economia dos ambientes aquáticos à bioremediação e á química analítica. Quim Nov, [S.I], v.27, n.1, p139-145, 2004.
WALLACE, J.L.; GRANGER, D.N. The cellular and molecular basis of gastric mucosal defense. FASEB J, [S.I], v. 10, p. 731–740, 1996.
WHITTLE, B.J. Neuronal and endothelium-derived mediators in the modulation of the gastric microcirculation: integrity in the balance. Br J Pharmacol, [S.I], v. 110, p. 3-17, 1993. YOSHIDA, N. et al., Role of neutrophil-mediated inflammation in aspirin-induced gastric mucosal injury. Dig Dis Sci, [S.I], v.40, n.11, p.2300-4, 1995.
APÊNDICE A –GASTROPROTECTIVE EFFECTS OF SULPHATED POLYSACCHARIDES FROM THE ALGA CAULERPA MEXICANA REDUCING
ETHANOL-INDUCED GASTRIC DAMAGE
Pharmaceuticals 2017, 10, 92; doi:10.3390/ph10040092 www.mdpi.com/journal/pharmaceuticals
Gastroprotective Effects of Sulphated
Polysaccharides from the Alga
Caulerpa mexicana
Reducing Ethanol-Induced Gastric Damage
José Gerardo Carneiro 1,2, Ticiana de Brito Lima Holanda 1, Ana Luíza Gomes Quinderé 1,
Annyta Fernandes Frota 1, Vitória Virgínia Magalhães Soares 1, Rayane Siqueira de Sousa 1,
Manuela Araújo Carneiro 1, Dainesy Santos Martins 3, Antoniella Souza Gomes Duarte 3 and
Norma Maria Barros Benevides 1,*
1 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Federal University of Ceará, s/n Humberto Monte Avenue, Pici Campus, 60455-760 Fortaleza, Brazil; gerardo@ifce.edu.br (J.G.C.);
ticipesca@yahoo.com.br (T.d.B.L.H.); aninhaquindere@gmail.com (A.L.G.Q.); annyta.frota@gmail.com (A.F.F.); vitoriabio8@gmail.com (V.V.M.S.);
gerardoifce@hotmail.com (R.S.d.S.); manuela.carneiro@hotmail.com (M.A.C.)
2 Federal Institute of Education, Science and Technology of Ceará, Armando Sales Louzada Street, 62580-000 Acaraú, Brazil
3 Department of Morphoology, Faculty of Medicine, Federal University of Ceará, s/n Delmiro de Farias Street, Porangabuçu Campus, 60416-030 Fortaleza, Brazil; dainy.santos@gmail.com (D.S.M.);
asouzagomes@yahoo.com.br (A.S.G.D.)
* Correspondence: nmbb@ufc.br; Tel.: +55-85-3366-9402
Received: 11 October 2017; Accepted: 19 November 2017; Published: 21 November 2017
Abstract: The development of the gastric lesion is complex and the result of the imbalance between aggressive and protective factors, involving the generation of free radicals and disturbance in nitric oxide (NO) production. Sulphated polysaccharides (SP), from marine algae, are widely used in biotechnological and pharmaceutical areas. In this study, we evaluated the effects of SP from the green marine alga Caulerpa mexicana (Cm-SP) in ethanol-induced gastric damage models in mice. Cm-SP (2, 20, or 200 mg/kg), administered p.o., significantly reduced gastric damage, and these effects were inhibited through pretreatment with indomethacin. Cm-SP (200 mg/kg) prevented the ethanol-induced decline in glutathione and restored its normal level. Moreover, it was able to normalize the elevated thiobarbituric acid reactive substance levels. However, Cm-SP did not show any significant effects on NO2/NO3 level, when compared to the ethanol group. The pretreatment
with L- NAME induced gastric mucosal damage and did not inhibit the gastroprotective effect of Cm-SP (200 mg/kg). In conclusion, the gastroprotective effects of Cm-SP in mice involve prostaglandins and reduction in the oxidative stress and are independent of NO.
Keywords: marine alga; gastric ulcer; gastroprotection; cytoprotection
1. Introduction
widely used to study gastroprotective effects of new bioactive compounds [1,6].
The discovery of new bioactive compounds with potential pharmaceutical activity, presenting minimal adverse effects, is of great importance. Thus, study groups are currently researching new natural compounds and their wide range of applications. Seaweeds are sources of sulphated polysaccharides, and the chemical structure of these polymers varies according to the species [8–10]. Sulfated polysaccharides (SP) comprise a group of heterogeneous macromolecules (as alginates, agar, agarose, carrageenans, fucoidan, laminaran, ulvan) presenting various biological effects, with biotechnical potential, and already in use in the food, cosmetics, and pharmaceutical industries [8– 11]. Our group has demonstrated various biological activities of SP, such as anticoagulant [12], antithrombotic [13], neuroprotective [14], antinociceptive, and anti-inflammatory [15–18].
Caulerpa mexicana Sonder ex Kützing is a marine green alga of the Cauleparceae family, which is widely encountered along the coast of Brazil. SP obtained from this alga species have presented antinociceptive and anti-inflammatory effects in a model of ulcerative colitis [19], in oedema caused by histamine and neutrophils migration [18]. However, no study has described the effects of SP from
C. mexicanain in gastric lesions models. In the present study, we investigated the effects of SP from the green seaweed C. mexicana on ethanol-induced gastric damage in mice and the involvement of endogenous prostaglandins (PG) and NO pathway.
2. Results
2.1. Effect of Cm-SP on Ethanol-Induced Gastric Damage
Oral administration of ethanol absolute (0.2 mL) induced gastric mucosal damage in mice (24.57 ± 2.23 mm2). Administration of Cm-SP (2, 20 or 200 mg/kg, p.o.) reduced, in a dose-dependent
manner, the gastric damage by 49% (12.41 ± 1.71 mm2), 87% (3.09 ± 0.82 mm2) and 92% (2.03 ± 0.54
mm2), respectively, when compared with the ethanol group (p < 0.05). Moreover, the groups that
received Cm-SP (20 and 200 mg/kg) did not show any significant difference when compared to the control group saline. The treatment with indomethacin reversed the gastroprotective effects that are promoted by Cm-SP (200 mg/kg). Furthermore, the pretreatment with L-NAME induced gastric mucosal damage (29.12 ± 3.48) and did not inhibit the gastroprotective effect of Cm-SP (200 mg/kg; 85%; 4.34 ± 0.93) (Figure 1).
Administration of ethanol causes mucosal epithelium damage with disrupted glandular structure, oedema of submucosa, and excessive inflammatory infiltrate (Figure 2).
Figure 2. Histological evaluation of the ethanol-induced gastric damage in mice. (A) Control stomach: intact gastric epithelium with organized glandular structure and normal submucosa could be seen; (B–E) ethanol-induced damage; (B) mice pre-treated with vehicle: * indicates damaged mucosal epithelium with disrupted glandular structure and arrow depicts oedema of submucosa and inflammatory infiltrate of mucosa; (C) Cm-SP 2 mg/kg; (D) Cm-SP 20 mg/kg; (E) Cm-SP 200 mg/kg. (C–E) depict a recovery in mucosa epithelium and reorganized glandular structure, as well as improvement of oedema by Cm-SP. (H&E staining; magnification 100×).
However, the administration of Cm-SP (2, 20, and 200 mg/kg) maintained the integrity of the mucosa with uninjured epithelium and organized glandular structure, as well as an improvement of oedema of submucosa and of inflammatory infiltrate, suggesting that Cm-SP exerts a gastroprotective effect. Histological analyses showed that Cm-SP (200 mg/kg) decreased hemorrhagic lesion, oedema, and erosion (loss of epithelial cell architecture), induced by ethanol (Table 1).
Table 1. Protective effect of Cm-SP in ethanol-induced microscopic gastric damage.
Experimental Group (N = 6)
Hemorrhagic Lesion (Score 0–4)
Oedema (Score 0–4)
Erosion (Loss of Cell Architecture)
(Score 0–3)
Cell Infiltrate (Score 0–3)
Total (Scores 14)
Saline 0 0 0 0 0
Ethanol 4 (3–4) A 2 (2–4)A 2.5 (2–3)A 2 (2–3) A 10.5 (9–14) A
Cm-SP (2 mg/kg) 1 (0–1) B 2 (0–3) 1 (0–2) 0 (0–1) B 4 (0–7)
Cm-SP (20 mg/kg) 0 (0–1) B 0 (0–3) 0 (0–3) 0 (0–2) 0 (0–9)
Cm-SP (200 kg/mg) 0 (0–0) B 0 (0–2) B 0 (0–1) B 0 (0–2) 0 (0–5) B
Values denote median with minimum and maximum, respectively. Test of Kruskal-Wallis. A p < 0.05 vs. group
Saline; B p < 0.05 vs. group Ethanol.
2.3. Effect of Cm-SP on Malondialdehyde (MDA), Glutathione (GSH), and NO2/NO3 Levels
Administration of ethanol decreased GSH levels (20.96 ± 1.87), and elevated lipid peroxidation (TBARS content) (391.42 ± 23.06) in gastric tissues when compared to the saline group. Cm-SP (200 mg/kg) prevented the ethanol-induced decline in GSH content and restored its normal level (38.26 ± 0.57). Moreover, Cm-SP (200 mg/kg) normalized the elevated TBARS levels (153.3 ± 8.28). However, the administration of Cm-SP (200 mg/kg) did not show any significant effects on NO2/NO3 level, as
Experimental Groups MDA GSH NO2/NO3
Saline 152.30 ± 9.91 31.81 ± 8.48 16.05 ± 3.24
Ethanol 391.42 ± 23.06 A 20.96 ± 1.87 A 28.02 ± 2.74 A Cm-SP (200 mg/kg) 153.30 ± 8.28 B 38.26 ± 0.57 B 23.14 ± 3.52
L-NAME 541.60 ± 49.02 19.28 ± 3.74 7.52 ± 1.68
L-NAME + Cm-SP (200 mg/kg) 383.0 ± 23.97 C 32.35 ± 1.56 C 8.66 ± 1.62 Data are expressed as the mean ± SEM (n = 6). ANOVA and Newman-Keuls test. Ap < 0.05 vs. group Saline; Bp < 0.05 vs. group Ethanol; Cp < 0.05 vs. group L-NAME.
3. Discussion
The gastric mucosa is continuously exposed to noxious agents and the maintenance of its integrity is ensured by a complex defense system, involving mucus and bicarbonate secretions, modulation of pH, gastric microcirculation, antioxidant factors, PG generation, NO and H2S release,
and HO-1 pathway induction [5,6,20–22]. The pathogenesis of ethanol-induced gastric damage involves direct necrotizing action, mitigation of defensive factors, such as the secretion of bicarbonate and production of mucus, depletion of antioxidant defense, increased oxidative stress, such as free radicals formation and lipid peroxidation, and changes in permeability of mitochondrial membrane prior the increased cell death by apoptosis [1,6,23].
Studies have shown that SP that is extracted from seaweeds exhibit a potential therapeutic effect for several diseases, mainly gastrointestinal tract disorders [9,11,24]. However, studies correlating the gastroprotective action of this polysaccharide are scarce in the literature. Recently, our research group showed that SP enzymatically extracted from the green alga C. mexicana, characterized as a mixture rich in sulphated galactan, have presented interesting anti-inflammatory actions with involvement the HO-1 pathway, reduced oedema that is caused by histamine, and inhibited inflammatory cell infiltrate [18].
The administration of absolute ethanol caused macroscopic and microscopic mucosa gastric damage characterized by intense hemorrhage, loss of epithelial structure, oedema of submucosa, and inflammatory infiltrate. The results of the present study showed that Cm-SP (20 and 200 mg/kg, p.o.) presented gastroprotective activities, reducing the gastric damage in 87% and 92% of Cm-SP, respectively, when compared with the ethanol group (p < 0.05). Furthermore, there was the preservation the integrity of the structure of the epithelium, reduction of oedema of submucosa, and the inhibition of inflammatory cell infiltrate, as verified by histopathological analysis. This data corroborate previous studies on the gastroprotective effects of other SP extracted from marine algae in experimental models of ethanol-induced gastric damage [25–28].
Several studies show that PG play important roles in modulating the gastric mucosal integrity, mainly against the damaging actions of ethanol. PG are produced from the arachidonic acid by two isozymes of COX, and are main mediators of the inflammatory process [4,7,29]. PG have been implicated in the regulation of various functions of defense gastric mucosal after barrier disruption, including decreased acid secretion, mucus production, mucin release, increased bicarbonate secretion, and mucosal blood flow [4,5,7,22,29,30]. NO is another important mediator of gastric mucosal integrity maintenance. NO’s role has been extensively studied, especially by the use of chemical inhibitors, such as L-NAME. A variety of substances dependent on the NO pathway possess cytoprotective actions [21,31]. Therefore, the inhibition of NO synthesis exacerbates gastric mucosal damage induced by ethanol [21]. However, several studies have shown the gastroprotective action of substances without the involvement of the NO pathway [20,32].
