UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE: INFECTOLOGIA E MEDICINA TROPICAL
MURILO SOARES COSTA
INVESTIGAÇÃO DO SARS-COV-2 PARA RASTREAMENTO DA COVID-19 POR MEIO DA RT-PCR EM POOL TESTING
BELO HORIZONTE 2022
MURILO SOARES COSTA
INVESTIGAÇÃO DO SARS-CoV-2 PARA RASTREAMENTO DA COVID-19 POR MEIO DA RT-PCR EM POOL TESTING
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto sensu em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical, da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. Área de concentração:
Infectologia e Medicina Tropical.
Linha de pesquisa: Infecções virais: HIV/AIDS, HTLV-I/II e outros vírus.
Orientador: Prof. Dr. Unaí Tupinambás.
BELO HORIZONTE 2022
Bibliotecário responsável: Fabian Rodrigo dos Santos CRB-6/2697 Costa, Murilo Soares.
C837i Investigação do SARS-CoV-2 para rastreamento da COVID-19 por meio da RT-PCR em Pool Testing [recursos eletrônicos]. / Murilo Soares Costa. - - Belo Horizonte: 2022.
130f.: il.
Formato: PDF.
Requisitos do Sistema: Adobe Digital Editions.
Orientador (a): Unaí Tupinambás.
Área de concentração: Infectologia e Medicina Tropical.
Tese (doutorado): Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina.
1. COVID-19. 2. SARS-CoV-2. 3. Coronavirus. 4. Diagnóstico. 5.
Pandemias. 6. Dissertação Acadêmica. I. Tupinambás, Unaí. II.
Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina. III. Título.
NLM: QW 168.5.C8
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE INFECTOLOGIA E MEDICINA TROPICAL ATA DE DEFESA DE TESE
Às 08:30 horas do dia 16 de dezembro de 2022, defesa híbrida na sala 526, 5º andar da Faculdade de Medicina, da Universidade Federal de Minas Gerais, realizou-se a sessão pública para a 214ª defesa de tese de MURILO SOARES COSTA, número de registro 2020712231, graduado no curso de ENFERMAGEM, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em CIÊNCIAS DA SAÚDE. A presidência da sessão coube ao professor UNAÍ TUPINAMBÁS, orientador. Inicialmente, o presidente fez a apresentação da Comissão Examinadora assim constituída: PROFA. LORENZA NOGUEIRA CAMPOS DEZANET (UNIFENAS - CAMPUS BH), PROF. ISRAEL MOLINA ROMERO (FIOCRUZ-CPQRR - MG), PROFA. VIVIANE DE SOUZA ALVES (UFMG), PROFA. MARIA DO CARMO BARROS DE MELO (UFMG), PROF. UNAÍ TUPINAMBÁS – ORIENTADOR (UFMG). Em seguida, o candidato fez a apresentação do trabalho que constitui sua Tese de Doutorado, intitulada: "Investigação do SARS-CoV-2 para rastreamento da COVID-19 por meio da RT-PCR em pool testing. Seguiu-se a arguição pelos examinadores e logo após, a Comissão reuniu-se, sem a presença do candidato e do público e decidiu considerar APROVADA a Tese de Doutorado. O resultado final foi comunicado publicamente ao candidato pelo presidente da Comissão. Nada mais havendo a tratar, o presidente encerrou a sessão e lavrou a presente ata que, depois de lida, se aprovada, será assinada pela Comissão Examinadora.
Belo Horizonte, 16 de dezembro de 2022.
Assinatura dos membros da banca examinadora:
Documento assinado eletronicamente por Lorenza Nogueira Campos Dezanet, Usuária Externa, em 16/12/2022, às 14:27, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020.
Documento assinado eletronicamente por Unai Tupinambas, Professor do Magistério Superior, em 16/12/2022, às 17:28, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020.
Documento assinado eletronicamente por Israel Molina Romero, Usuário Externo, em 16/12/2022, às 19:50, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020.
Documento assinado eletronicamente por Viviane de Souza Alves, Professora do Magistério Superior, em 19/12/2022, às 12:43, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020.
Documento assinado eletronicamente por Maria do Carmo Barros de Melo, Coordenador(a), em 19/12/2022, às 15:33, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 5º do Decreto nº 10.543, de 13 de novembro de 2020.
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Referência: Processo nº 23072.270687/2022-14 SEI nº 1936302
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
REITORA: Profa. Dra. Sandra Regina Goulart Almeida VICE-REITOR: Prof. Dr. Alessandro Fernandes Moreira
PRÓ-REITOR DE PÓS-GRADUAÇÃO: Profa. Dra. Isabela Almeida Pordeus PRÓ-REITOR DE PESQUISA: Prof. Dr. Fernando Marcos dos Reis
FACULDADE DE MEDICINA
DIRETOR: Profa. Dra. Alamanda Kfoury Pereira
VICE-DIRETORA: Profa. Dra. Cristina Gonçalves Alvim
COORDENADOR DO CENTRO DE PÓS-GRADUAÇÃO: Prof. Dr. Tarcizo Afonso Nunes SUBCOORDENADORA DO CENTRO DE PÓS-GRADUAÇÃO: Profa. Dra. Eli Iola Gurgel Andrade
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DA SAÚDE: INFECTOLOGIA E MEDICINA TROPICAL
COORDENADOR: Prof. Dr. Eduardo Antônio Ferraz Coelho VICE-COORDENADOR: Prof. Dr. Vandack Alencar Nobre Junior
MEMBROS DO COLEGIADO
Prof. Daniel Vitor de Vasconcelos Santos Prof. Eduardo Antônio Ferraz Coelho Profa. Maria do Carmo Pereira Nunes Profa. Mariana Costa Duarte
Prof. Unaí Tupinambás
Prof. Vandack Alencar Nobre Júnior
Camila Simões de Freitas – Representante Discente
Dedico essa tese as diversas vidas ceifadas pelo Coronavírus.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por tudo, pelos momentos difíceis que me fizeram valorizar os bons momentos, por me abençoar e permitir estudar na Universidade que tanto sonhei desde novo e por colocar pessoas boas que me ajudaram nesta jornada até aqui.
Aos meus pais que sempre me incentivam, investiram e sonharam junto comigo, vocês são fundamentais em minha vida, sempre terei muito orgulho da minha mãe, Indiária Soares Costa, técnica em enfermagem e do meu pai, Paulo Roberto Teixeira Costa, pintor residencial.
Aos meus familiares que me apoiaram em diversas situações da minha vida; ao meu irmão Danilo Soares Costa, por me inspirar em alguns momentos, farmacêutico e mestre em Biotecnologia pela UFES, aos meus sobrinhos Otávio Augusto Viana Soares e Mateus Viana Soares, por serem minha alegria externada, as minhas avós Ana Anísia Teixeira Costa e Terezinha Gomes do Nascimento, as minhas tias Cleonice Soares, Cleide Soares, Noeme Soares e Elenice Soares por serem verdadeiras tias e dar apoio de diversas formas ao meu irmão e a mim.
Aos meus amigos, que são pessoas que escolhi para serem uma segunda família, e estiveram comigo na alegria e na tristeza, na saúde e na doença; meus amigos de infância:
Thales Souza Liberato e família, Júlio César Campos de Oliveira Stauffer de Andrade e família, Henrique Bernardo de Almeida e família, Felipe Liandro e família, Thales Matos Amaral, Ana Paula Costa Velten e família, Larissa Weberling e família, Markeline Meira e família. Aos amigos da época da graduação: Lilian Luttig Kister Cardoso, Rodrigo Leite dos Santos, Joelma Bohnem e Jaiane Bernardes Falquete.
Agradeço a pessoas que me incentivaram de confiaram no meu potencial quando eu mesmo duvidei, a Dra. Bruna Aguiar e a MSc. Nayra Fernandes, muito obrigado por me incentivarem a tentar o doutorado direto; e incluída neste grupo de incentivo agradeço imensamente a Dra. Nathalia Sernizon por tudo, em especial por todas as dicas, conversas e incentivos.
Ao prof. Unaí Tupinambás por me acolher e me aceitar como aluno de doutorado mesmo sem me conhecer, obrigado por ser tão humanizado, gentil e excelente orientador, sem o doutor, o meu sonho não seria concretizado.
RESUMO
Da descoberta do coronavírus em 1964 até a contemporaneidade, o diagnóstico laboratorial do vírus é uma importante ferramenta para detecção de novos casos, acompanhamento da série histórica e planejamento de ações de acordo com a incidência da doença. O Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) é o agente infeccioso responsável pela pandemia da doença do coronavírus 2019 (COVID-19), ocorrendo casos assintomáticos infectados, leves, moderados, graves e óbitos. O diagnóstico considerado padrão-ouro para detecção do SARS-CoV-2 é a reação em cadeia pela polimerase acoplada à transcrição reversa em tempo real (RT-qPCR), que ocorre por meio da extração do ácido ribonucleico (RNA) e tem um alto custo monetário. Porém, o método diagnóstico desenvolvido na segunda Guerra Mundial, conhecido como pool testing, visa agrupar mais de duas amostras e utilizar os reagentes como se fossem para uma amostra, caso o pool de amostras for detectável/positiva, deve-se fazer os exames de forma individual para saber qual ou quais amostras foi/foram detectáveis, e caso o pool for não detectável/negativo, todas as amostras estão não detectáveis, causando assim uma otimização em recursos materiais e financeiros. O objetivo geral desta pesquisa foi avaliar o método pool testing na RT-PCR para investigação do SARS-CoV-2 em pacientes com síndrome gripal e em assintomáticos. No método tiveram as amostras coletadas na UPA Centro Sul de casos suspeitos da COVID-19 e em acadêmicos de medicina no período do internato sem sinais e sintomas. As amostras foram analisadas por meio da RT-qPCR por meio do pool testing entre o período de setembro de 2020 a abril de 2021. Entre os resultados, dos 1.358 participantes examinados da UPA por meio de 504 pools com agrupamento de amostras que variou de 3 a 16. Entre os pools 33,7% foram não detectáveis, e no geral 32,62%
das amostras individuais estavam detectáveis para o SARS-CoV-2. Entre os pesquisados 56,7%
eram do sexo feminino, a faixa etária de maior busca pelo exame foi entre 18 a 39 anos, porém que apresentou maios porcentagem de positividade foram pessoas acima de 70 anos, com 48,1%. Já entre os acadêmicos de medicina foram realizados 15 pools com 10 amostras e 1 pool com 4 amostras (total = 154 participantes), sendo todos os pools com resultado não detectável, 54,7% eram do sexo masculino. Desta forma, o pool testing se demonstra o um método exequível e viável para o diagnóstico do SARS-CoV-2, em especial em baixa prevalência, como em casos assintomáticos, leves e moderados, reduzindo custos e otimizando recursos.
Palavras-chaves: COVID-19; SARS-CoV-2; pool testing; diagnóstico; pandemia.
ABSTRACT
From the discovery of the coronavirus in 1964 to the present day, laboratory diagnosis of the virus is an important tool for detecting new cases, monitoring the historical series and planning actions according to the incidence of the disease. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is the infectious agent responsible for coronavirus disease 2019 (COVID-19) and consequently the pandemic, with asymptomatic infected, mild, moderate, severe cases and deaths occurring worldwide. The diagnosis considered the gold standard for the detection of SARS-CoV-2 is the real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR), which occurs through the extraction of ribonucleic acid (RNA) and has a high monetary cost. However, the diagnostic method developed in the Second World War, known as pool testing, aims to group more than two samples and use the reagents as if they were for a sample, if the pool/grouping of samples is detectable/positive, the exams individually to know which samples were/were detectable, and if the pool is undetectable/negative, all samples are undetectable, thus causing an optimization in material and financial resources. The overall objective of this research was to evaluate the expansion of RT-qPCR testing in people for SARS-CoV-2 investigation using pool testing. In the method, samples were collected at the UPA Centro Sul from suspected cases of COVID-19 and from medical students during the internship without signs and symptoms. The samples were analyzed through RT-qPCR through pool testing between the period of September 2020 to April 2021. Among the results, of the 1,358 UPA participants examined through 504 pools with sample grouping ranging from 3 to 16. Among pools 33.7% were undetectable, and overall 32.62% of individual samples were detectable for SARS-CoV-2. Among those surveyed, 56.7% were female, the age group most searched for the test was between 18 and 39 years old, but those who showed the highest percentage of positivity were people over 70 years old, with 48.1%. Among the medical students, 15 pools with 10 samples and 1 pool with 4 samples (total = 154 participants) were performed, with all pools with undetectable results, 54.7% were male. In this way, pool testing proves to be a feasible and viable method for the diagnosis of SARS-CoV-2, especially in low prevalence, such as asymptomatic, mild and moderate cases, reducing costs and optimizing resources.
Keywords: COVID-19; SARS-CoV-2; pool testing; diagnosis; pandemic.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Imagens do coronavírus por meio de microscopia eletrônica retiradas em tempos diferentes
21
Figura 2 – Estrutura do SARS-CoV-2 22
Figure 3 – Organização do genoma dos betacoronavírus 23
Figura 4 – Distribuição do total de casos de covid-19 entre os 20 países com maior número de casos.
24
Figura 5 – Distribuição do total de casos óbitos de covid-19 entre os 20 países com maior número de casos
25
Figura 6 – Distribuição dos novos registros de casos por covid-19 por semana epidemiológica de notificação, Brasil, 2020-22
25
Figura 7 – Distribuição dos novos registros de óbitos por covid-19 por SE de notificação, Brasil, 2020-22
26
Figura 8 – Estratégia de realização da RT-qPCR em pool testing 37
Figure 9: Study eligibility flowchart 45
Figura 10 – Fluxograma para composição da amostra do estudo, composta de estudantes do 9° ao 12° períodos do curso de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, cursando estágios hospitalares obrigatórios, Belo Horizonte, 2021
79
LISTA DE TABELAS E QUADRO
Table 1 – Characteristics of the studies included in the integrative review regarding COVID-19 diagnostics.
47
Table 2 – Main characteristics of the pools by studies included in this review. 50 Tabela 3 – Caracterização do diagnóstico laboratorial, sociodemográfico, clínico,
hábitos durante a pandemia e situação da renda em suspeitos leves e moderados da COVID-19 atendidos na UPA Centro-Sul de Belo Horizonte, 2020-2021 (n=1.358).
62
Tabela 4 – Custos, em reais, dos materiais e reagentes para realização do procedimento adotado no presente estudo, comparado com o procedimento habitual e outros cenários hipotéticos, para a testagem de estudantes do 9° ao 12°
períodos do curso de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, cursando estágios hospitalares obrigatórios, Belo Horizonte, 2021.
85
Quadro 1 – Estimativa de tamanhos ótimos de pools para realização de RT-PCR para SARS-CoV-2 a segundo a prevalência de COVID-19 na comunidade.
78
LISTA DE SIGLAS ACE2 Enzima Conversora de Angiotensina 2 cDNA Ácido Desoxirribonucleico complementar CECOVID Centro Especializado em COVID-19
COVID-19 Coronavirus disease 2019 ou Doença pelo coronavírus 2019
Ct Cycle threshold
CT-Vacinas Centro de Tecnologia de Vacinas DNA Ácido Desoxirribonucleico
E Envelope
EMBASE Excerpta Medica database
EPI Equipamentos de proteção individual HIV Vírus da Imunodeficiência Humana IC Intervalo de confiança
ICTV Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
LILACS Literatura Latino- Americana e do Caribe em Ciências da Saúde M Glicoproteína de membrana
MEDLINE Medical Literature Analysis and Retrieval System Online MERS-CoV Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus
MG Minas Gerais
mL Mililitro
nm Nanômetros
OMS Organização Mundial da Saúde ORF Quadro de Leitura Aberto
PR Paraná
RBD Domínio de ligação ao receptor
RdRp Gene da polimerase de RNA dependente da RNA
RS Rio Grande do Sul
RNA Ácido ribonucleico
RT-PCR/
RT-qPCR
Real time reverse transcription polymerase chain reaction ou Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em tempo real
S Spike ou proteína de pico
SARS-CoV Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus SARS-CoV-2 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido UFMG Universidade Federal de Minas Gerais
UPA Unidade de Pronto Atendimento 2019-nCov Novo Coronavírus 2019
α Alfa
β Beta
γ Gama
δ Delta
SUMÁRIO
1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS...13
2 INTRODUÇÃO...17
3 REVISÃO DA LITERATURA...20
3.1 CLASSIFICAÇÃO E ESTRUTURA DO CORONAVÍRUS...20
3.2 EPIDEMIOLOGIA DA COVID-19...24
3.3 TESTES DIAGNÓSTICOS...27
3.3.1 Pool testing...29
4 OBJETIVOS...30
4.1 OBJETIVO GERAL...30
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...30
5 MATERIAL E MÉTODOS...31
5.1 ASPECTOS ÉTICOS...31
5.2 DELINEAMENTO E POPULAÇÃO DO ESTUDO...31
5.3 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO...31
5.4 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO...32
5.5 AMOSTRAGEM...32
5.6 COLETA DE DADOS...33
5.7 DESCRIÇÃO DO POOL TESTING...35
5.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA...38
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO...39
6.1 ARTIGO 1...39
6.2 ARTIGO 2...59
6.3 ARTIGO 3...72
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS...87
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...89
APÊNDICE A...98
APÊNDICE B...100
APÊNDICE C...102
APÊNDICE D...112
APÊNDICE E...118
APÊNDICE F...123
1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS
Na história, a sociedade já foi acometida por inúmeras doenças infecciosas, algumas ocorrendo em um determinado limite geográfico, caracterizando um surto, entretanto em outras situações ocorreram casos globalmente, manifestando uma pandemia.
Em uma dessas emergências sanitárias mundial está a detecção de casos da doença pelo coronavírus 2019 (COVID-19), os primeiros relatos são de dezembro de 2019. Foi necessário compreender a história natural da doença e propor medidas de combate e controle da infecção;
acompanhando os números de casos leves, moderados, graves e óbitos proveniente desta moléstia.
Aumentar a testagem da população contribuiria para o controle da pandemia. Em contrapartida, o exame padrão-ouro para diagnóstico da COVID-19 é o teste molecular, isto é, a transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR).
Esse método diagnóstico tem um custo elevado, em especial em países em desenvolvimento, por esse motivo, houve a proposta de processar as amostras em agrupamento ou pool testing, o que justificou a realização dessa pesquisa, sendo um estudo inédito na América do Sul.
O interesse em pesquisar sobre a COVID-19 ocorreu no início da pandemia, pois eu era professor de uma faculdade privada do Espirito Santo e ministrei alguns treinamentos gratuitos sobre paramentação e desparamentação de equipamentos de proteção individual (EPI), devido a isso fui convidado para trabalhar no Núcleo de Educação Permanente do Hospital Estadual Roberto Arnizaut Silvares; porém vi a oportunidade de tentar o doutorado para aprender um pouco mais sobre esta doença infecciosas contemporânea. Além de já ter coordenado o
programa municipal de controle e combate à hanseníase e tuberculose de São Mateus/ES e lecionar a disciplina Enfermagem nos Cuidados às Doenças Infecciosas e Parasitárias.
Este trabalho está inserido na linha da pesquisa infecções virais: HIV/AIDS, HTLV-I/II e outros vírus do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais.
Durante o período do doutorado dados parciais foram apresentados no:
• 6º Encontro de Pesquisa do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:
Infectologia e Medicina Tropical;
• 7º Encontro de Pesquisa do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:
Infectologia e Medicina Tropical;
• 8º Encontro de Pesquisa do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:
Infectologia e Medicina Tropical;
• 1º Congresso Virtual de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde;
Houve a aprovação até o momento de três artigos tratando diretamente o tema pesquisado, os dois primeiros artigos abaixo estão nos resultados e o último nos apêndices:
COSTA, M. S.; GUIMARAES, N. S.; ANDRADE, A. B.; VAZ-TOSTES, L. P.;
OLIVEIRA, R. B.; SIMOES, M. S.; GELAPE, G. O.; ALVES, C. C. R. L.; MACHADO, E.
L.; FONSECA, F. G.; TEIXEIRA, S. M. R.; SATO, H. I.; TAKAHASHI, R. H. C.;
TUPINAMBAS, U.. Detection of SARS-CoV-2 through pool testing for COVID-19: an integrative review. SOCIEDADE BRASILEIRA DE MEDICINA TROPICAL. REVISTA, v.
54, p. e0276-2021, 2021.
GUIMARAES, N. S.; COSTA, M. S.; MACHADO, E. L.; SATO, H. I.; AMARAL, E. C.
M. E.; ARIVABENE, R. G.; LOURENCO, K. L.; TUPINAMBÁS, UNAÍ; FONSECA, F. G.;
TAKAHASHI, R. H. C.; TEIXEIRA, S. M. R.; ALVES, C. C. R. L.. Autocoleta de swab nasofaríngeo e teste molecular em pool testing como estratégias para detecção de coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2): viabilidade em estudantes de medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, 2021. EPIDEMIOLOGIA E SERVICOS DE SAUDE, 2022.
COSTA, MURILO S.; SATO, HUGO I.; ROCHA, RAISSA P.; CARVALHO, ALEX F.; GUIMARÃES, NATHALIA S.; MACHADO, ELAINE L.; ALVES, CLAUDIA R. L.;
TEIXEIRA, SANTUZA M. R.; TAKAHASHI, RICARDO H. C.; TUPINAMBÁS, UNAÍ; DA FONSECA, FLÁVIO G.. Adjusting the Cut-Off and Maximum Pool Size in RT qPCR Pool Testing for SARS-CoV-2. Viruses-Basel, v. 13, p. 557, 2021.
Além de outros artigos foram submetidos ou publicados que abordam a temática e estão nos apêndices:
COSTA, M. S.; GELAPE, G. O.; ANDRADE, A. B.; VAZ-TOSTES, L. P.; SIMÕES, M. S.; OLIVEIRA, R. B.; GUIMARÃES, N. S.; TUPINAMBÁS, U.. COVID-19 reinfection between doses of vaccination: Case Report. Iniciação Científica CESUMAR, v. 23, n. 2, p. 185- 189, 2021. DOI: 10.17765/2176-9192.2021v23n2e10400
SATO, Hugo Itaru Sato; COSTA, Murilo Soares; TAKAHASHI, Ricardo Hiroshi Caldeira; LOURENÇO, Karine Lima; GUIMARÃES, Nathalia Sernizon; ALVES, Claudia Regina Lindgren; MACHADO, Elaine Leandro; TUPINAMBÁS, Unaí; FONSECA, Flávio Guimarães da; TEIXEIRA, Santuza Maria Ribeiro. Description of RT-qPCR in pooled samples (pool testing) for diagnosis of COVID-19. Submetido a revista Einstein.
Além de artigos que foram escritos que serão resubmetidos, sendo que o primeiro consta nos resultados e outro se encontra no apêndice desta tese:
COSTA, Murilo Soares; GUIMARÃES, Nathalia Sernizon; BAHIA, Ana Paula Corrêa Oliveira; VENTURA, Lucas Haniel de Araújo; SATO, Hugo Itaru; ANDRADE, André Barbosa de; VAZ-TOSTES, Luiza Passini; OLIVEIRA, Rhuan Braga; SIMÕES, Madara da Silva; GELAPE, Gabriel de Oliveira; FARIA, Ana Maria Caetano; ALVES, Claudia Regina Lindgren; MACHADO, Elaine Leandro; FONSECA, Flávio Guimarães da; TEIXEIRA, Santuza Maria Ribeiro; TAKAHASHI, Ricardo Hiroshi Caldeira; TUPINAMBÁS, Unaí.
Investigação do SARS-CoV-2 por meio da RT-PCR em pool testing em indivíduos com suspeitos leves ou moderados da COVID-19.
COSTA, Murilo S.; ALVES, Claudia R.L.; FONSECA,Flávio G.; SATO, Hugo I.;
ROCHA, Raissa P.; CARVALHO, Alex F.; LOURENÇO, Karine L.; GUIMARÃES, Nathalia S.; MACHADO, Elaine L.; TEIXEIRA, Santuza M.R.; TUPINAMBÁS, Unai; TAKAHASHI, Ricardo H.C.. Face mask use and viral load in patients with mild symptoms of COVID-19
2 INTRODUÇÃO
Um dos marcos históricos do segundo milênio é o surgimento ou reaparecimento de doenças infecciosas e parasitárias (SILVA; 2003). Em uma era com maior avanço na ciência e tecnologia já registrado na humanidade, também relata a falha no controle e combate às moléstias infecciosas.
O impacto da alteração do clima interfere nos seres vivos e contribui com o pensamento da evolução das espécies (OGDEN, GACHON; 2019), em que os seres mais fortes se adaptam e sobrevivem, e desta maneira, o mundo já vivenciou de forma paralela a ocorrência de mutações de agente etiológico já conhecidos (como gonorreia e etc.), superbactérias (provenientes também do uso indiscriminado de antibióticos) (DAVIES, DAVIES; 2010) e sempre há um microrganismo emergente (como por exemplo do gênero Orthopoxvirus) ou reemergente (como o ebola, zika, chikungunya, choqueluche, sarampo e outros) causando um alerta sanitário global deixando um sobreaviso tênue para um decreto de uma pandemia (EL- SAYED, KAMEL; 2020).
Mesmo com o avanço da tecnologia, ainda não erradicamos algumas doenças como tuberculose, hanseníase, malária, leishmanioses, sífilis e a transmissão do vírus da imunodeficiência humana (HIV), por exemplo e enfrentamos novas doenças.
Entre os agentes etiológicos de importância sanitária está a descoberta do coronavírus que ocorreu em 1965 (TYRRELL, BYNOE; 1965) na Inglaterra. A nomenclatura do vírus ocorreu devido às estruturas externas (os spikes) das células serem consideradas parecidas como uma coroa (ALMEIDA, TYRRELL; 1967).
Da identificação do vírus até os dias atuais, a humanidade descobriu que ele tem quatro
subgrupos em sua família: alfa (α), beta (β), gama (γ) e delta (δ), sendo que a β infecta humanos.
Ao longo do tempo já foram registrados casos devidos o coronavírus, em 2002 por meio do Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV), em 2012 por meio do Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) e a partir do final de 2019, iniciado na província de Wuhan na China, apareceram os primeiros casos de uma pneumonia atípica que foram comunicados a Organização Mundial da Saúde (OMS) (WHO, 2022)
Ao investigar o agente infeccioso descobriu-se que se tratava de um novo coronavírus, nomeado como Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) causador da coronavirus disease 2019 ou doença pelo coronavírus 2019, em português, comumente chamada de COVID-19. Em 11 de março de 2020 a OMS decretou a pandemia da COVID-19 (FENG et al, 2020; SHEREEN et al, 2020; WHO, 2022).
Em dois anos da pandemia da COVID-19 foram relatados mais de 500 milhões de casos identificados e aproximadamente 6,5 milhões de óbitos em todo mundo. No Brasil já foram notificados aproximadamente 40 milhões de casos e aproximadamente 700 mil mortos devido esta moléstia infecciosa (JHU, 2022; WHO, 2022).
A principal forma detecção de novos casos é teste laboratorial, uma ferramenta essencial para o diagnóstico de novas infecções, principalmente em meio a uma pandemia, com isso, o exame padrão-ouro para detecção do SARS-CoV-2 é a real time reverse transcription polymerase chain reaction ou a reação em cadeia polimerase de transcrição reversa em tempo real (RT-qPCR), este exame tem um alto preço no mercado (BEECHING; FLETCHER;
BEADSWORTH, 2020; YELIN et al, 2020), sendo este um fator limitante ao acesso deste exame a toda população, implicando diretamente na vigilância epidemiológica no que se refere a (sub ou não) notificação.
Em contrapartida, uma ideia criada por Robert Dorfman na 2ª Guerra Mundial para investigação de sífilis em soldados é uma estratégia que pode ser aplicada também para os testes que visam a detecção do SARS-CoV-2 por meio da RT-qPCR. Chamada de pool testing, também conhecido como pool, pooled, pooling, group test, testing ou samples; cuja ideia é agrupar uma quantidade de amostras e processá-las utilizando um reagente, caso o pool seja negativo ou não detectável é considerado que todas as amostras que estão no pool sejam não detectáveis/negativas, porém se o pool for positivo/detectável é feito a análise de forma individual para descobrir qual ou quais amostras apresentaram o agente etiológico em questão (DORFMAN, 1943).
O número de amostras por pool irá variar de acordo com prevalência, quando a prevalência estiver alta, deve-se colocar menos amostras por pool, quando estiver baixa pode aumentar o número de amostras por pool (DORFMAN, 1943, MALLAPATY, 2020).
Mediante a situação sanitária mundial, levanta-se a problemática sobre como realizar o diagnóstico laboratorial padrão-ouro com menor custo e maior oferta para investigação de novos casos de COVID-19; pressupõe que o pool testing pode corroborar na otimização da RT- qPCR e oferecer mais testes para casos sintomáticos e assintomáticos.
O presente estudo, avaliou a utilização do pool testing por meio da RT-qPCR como estratégia para detecção do SARS-CoV-2 em casos sintomáticos e assintomáticos, demonstrando a relevância dessa pesquisa devido a ocorrência de casos e mortes, fundamentado em ampliar a oferta do exame padrão-ouro a comunidade, supondo que este método pode contribuir em populações com limitações de recursos financeiros.
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 CLASSIFICAÇÃO E ESTRUTURA DO CORONAVÍRUS
Os coronavírus pertencem a família Coronaviridae inseridos na ordem Nidovirales, subdivididos em quatro subgrupos. A taxonomia dada foi influenciada pelos spikes. São formados por uma fita simples de ácido ribonucleico (RNA) e tem o trato respiratório como porta entrada no organismo humano. Seu diâmetro varia entre 65 a 125 nanômetros (nm), apresentando internamente uma proteína de núcleocapsídeo no RNA, sendo que o tamanho pode variar entre 26 a 32 kbs de comprimento (SHEREEN et al, 2020).
Este vírus foi descoberto 1965 e inicialmente foi nomeado como vírus respiratório humano B814 (TYRRELL, BYNOE; 1965), as primeiras imagens dele foram publicadas somente 1967, demostrado na figura 1a (ALMEIDA, TYRRELL; 1967), ao lado está uma imagem (figura 1b) do mesmo vírus publicado pelo National Institutes of Health em 2020.
Da descoberta do coronavírus até o início do milênio 2000 não foram relatados casos exacerbados, porém em 2002 a população chinesa da província de Guangdong relatou um aumento dos casos da síndrome respiratória aguda grave proveniente por um coronavírus, pertencente do subgrupo dos β coronavírus e foi nomeado como SARS-CoV. Estes pacientes infectados apresentaram sintomas característicos de uma pneumonia com lesão alveolar difusa, o que levava a uma síndrome do desconforto respiratório agudo (PEIRIS, GUAN, YUEN, 2004;
PYRC, BERKHOUT, VAN DER HOEK, 2007). Dados epidemiológicos da época mostram que ocorreram mais de 8.000 infectados e 776 mortes em todo mundo (PEIRIS, GUAN, YUEN, 2004).
Figura 1 – Imagens do coronavírus por meio de microscopia eletrônica retiradas em tempos diferentes. a) Imagem tirada por June Almeida e publicada no Journal of General Virology em 1967. b) Imagem publicada no site National Institutes of Health em 2020 (https://www.nih.gov/news-events/nih-research-matters/novel-coronavirus- structure-reveals-targets-vaccines-treatments).
Após uma década depois da ocorrência do SARS-CoV na China, em 2012 outro coronavírus causou uma endemia nos países do Oriente Médio, apresentando sinais e sintomas parecidos, este agente patogênico foi nomeado como MERS-CoV (WANG et al, 2013). A OMS informou que naquele período ocorreram 2.428 casos e 838 mortes (RAHMAN, SARKAR, 2018).
No final de 2019 o mundo novamente ouviu falar de um coronavírus do subgrupo β, novamente na China, porém desta vez na província de Wuhan. Inicialmente foi relada como
uma pneumonia de etiologia desconhecida, ligando o surto a pessoas que passaram pelo mercado de frutos do mar e comércio de animais silvestres vivos de Wuhan; após a descoberta do agente etiológico, o vírus foi nomeado pelos pesquisadores chineses como novo coronavírus 2019 (2019-nCov), porém o Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV) o nomeou como SARS-CoV-2 e a doença como COVID-19 (CUI, LI, SHI, 2019; LAI et al, 2020; WHO, 2020).
O SARS-CoV-2 é envolvido por uma bicamada lipídica com a presença de glicoproteína de envelope (E), proteína de pico ou spike (S) e glicoproteína de membrana (M), além de um núcleocapisídeo no seu RNA, como demonstrado na figura 2 (SHEREEN et al, 2020).
Figura 2 – Estrutura do SARS-CoV-2. Fonte: Shereen et al, 2020.
O SARS-CoV-2 apresentou uma maior taxa de transmissão ao comparado com o SARS- CoV.A transmissão ocorre de humano para humano devido o contato próximo com uma pessoa infectada exposta a tosse, espirros, gotículas respiratórias e/ou aerossóis, após serem inalados podem penetrar o corpo humano por meio dos pulmões (SHEREEN et al, 2020). Os três vírus
(SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2) apresentam alterações entre si, como mostra figura 3.
Figura 3 – Organização do genoma dos betacoronavírus; O genoma do Betacoronavírus para humanos (SARS- CoV-2, SARS-CoV e MERS-CoV) compreende a região 50 não traduzida (50 - UTR), quadro de leitura aberto (ORF) 1a/b (ORF1a/ORF1b) que codifica não estrutural proteínas (NSP) para replicação, proteínas estruturais, incluindo spike (S), envelope (E), membrana (M) e nucleocapsídeo (N), proteínas acessórias (ORF 3, 6, 7a, 7b, 8, 9b e demais) no genoma do SARS-CoV-2 e na região 30 - não traduzida (30 -UTR). O pontilhado sublinhado em vermelho é a proteína que mostra a principal variação entre SARS-CoV-2 e SARS-CoV. O comprimento de nsps e orfs não são desenhados em escala. Fonte: Shereen et al, 2020.
O SARS-CoV-2 tem genes específicos na região ORF1 que codificam proteínas para replicação viral, nucleocapsídeo e formação dos spikes, este último que é responsável de fazer a fixação e entrada do vírus nas células pulmonares. A ligação do domínio de ligação ao receptor (RBD) viabiliza o vírus infectar vários hospedeiros. Em relação aos seres humanos, os coronavírus entram no organismo por meio dos pulmões, através dos pneumócitos tipo 2, ligando na enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2), dentro da célula ocorre a replicação e exocitose do vírus, podendo desta maneira, atingir diversos órgãos e ocasionar diferentes sinais e sintomas (SHEREEN et al, 2020).
3.2 EPIDEMIOLOGIA DA COVID-19
Em dois anos da pandemia da COVID-19 foram relatados mais de 630 milhões de casos identificados e aproximadamente 6,5 milhões de óbitos em todo mundo. No Brasil já foram notificados aproximadamente 40 milhões de casos e aproximadamente 700 mil mortos devido esta moléstia infecciosa (JHU, 2022; WHO, 2022). As figuras a seguir mostram a posição do Brasil em número de casos e óbitos em relação ao mundo (figura 4 e 5) e a série histórica de casos e óbitos (figura 6 e 7).
Figura 4- Distribuição do total de casos de covid-19 entre os 15 países com maior número de casos até 15/10/2022.
Fonte: Boletim Epidemiológico do Ministério da Saúde, 2022.
Figura 5- Distribuição do total de casos óbitos de covid-19 entre os 19 países com maior número de casos até 15/10/2022. Fonte: Boletim Epidemiológico do Ministério da Saúde, 2022.
Figura 6 - Distribuição dos novos registros de casos por covid-19 por semana epidemiológica de notificação até 15/10/2022, Brasil, 2020-22. Fonte: Boletim Epidemiológico do Ministério da Saúde, 2022.
Figura 7 - Distribuição dos novos registros de óbitos por covid-19 por SE de notificação até 15/10/2022, Brasil, 2020-22. Fonte: Boletim Epidemiológico do Ministério da Saúde, 2022.
Uma revisão sistemática mostrou o espectro dos sinais e sintomas da COVID-19 e a sensibilidade e especificidade de cada um (STRUYF et al, 2020). Outra revisão sistemática descreveu os sinais e sintomas mais comuns até julho de 2020, sendo febre (76,70%), tosse (67,76%), diminuição do olfato (40,80%) e paladar (34,52%), dispneia (37,49%), fadiga (29,93%), produção de escarro (17,85%), dor de garganta (16,17%) e dor de cabeça (15,49%) (XIE et al, 2020).
O conhecimento sobre os sinais e sintomas da COVID-19 independe das variantes ou subvariantes do SARS-CoV-2 podem corroborar para solicitação de testes diagnósticos para confirmação da COVID-19 ou refuta para iniciar a busca por um diagnóstico diferencial.
3.3 TESTES DIAGNÓSTICOS
O conhecimento sobre o vírus, em suas diversas facetas, como: estrutura, modo de transmissão, excreção, tempo de resistência sobre a superfície (KAMPF et al, 2020), sequência do RNA (KIM et al, 2020) e outras informações são necessárias para realização de diferentes formas de diagnóstico.
Com a rápida disseminação do SARS-CoV-2 pelo mundo (LI et al, 2020) e no Brasil (CANDIDO et al, 2020), além da continuidade da ocorrência de outras doenças infeciosas, faz-se necessário o correto diagnóstico diferencial para vigilância adequada após o resultado.
Desta maneira, foram utilizados diferentes métodos diagnósticos para o SARS-CoV- 2, como: RT-qPCR, teste quantitativo de anticorpos IgM e IgG, teste rápido imunocromatográfico de sangue ou de secreção nasal, teste rápido de antígeno, teste utilizando a saliva ou material fecal, utilização de radiografia/tomografia do tórax e o diagnóstico clínico (KEVADIYA et al, 2021).
A RT-qPCR é considerada o exame padrão-ouro, como concluído uma meta-análise (KHATAMI et al, 2020), os autores ainda sugerem que todas pessoas sintomáticas deveriam realizar a RT-qPCR. A sensibilidade e especificidade desse exame podem ser alteradas de acordo com o local que foi extraído o RNA, sendo de 96,6% e 100% para Nucleocapsídeos, 96% e 100% para ORF1ab e 95,7% para gene da polimerase de RNA dependente da RNA (RdRp) (MOLLAEI et al, 2020; VOGELS et al, 2020).
As amostras mais estudadas para realização do exame padrão-ouro por meio da extração do RNA foram: coleta de swab da nasofaringe, aspiração de secreção da nasofaringe, swab da orofaringe, escarro, fezes (KHATAMI et al, 2020) sangue, saliva e urina (BÖGER et al, 2020).
Com isso, pesquisadores realizaram uma revisão sistemática e meta-análise (BÖGER et al, 2020) sobre este assunto e demonstraram que o material que apresentou menor sensibilidade foi a urina (0,0% intervalo de confiança -IC: 95% 0,0%-3,7%), já o escarro teve o melhor desempenho encontrado, com 97,2% na sensibilidade, variando o IC 90,3% a 99,7%. A coleta aparentemente mais utilizada nestes estudos foi a de swab ou aspiração de secreção da nasofaringe, que apresentou a sensibilidade de 73,3% (IC 95% 68,1%-78,0%).
Mediante um alerta sanitário global, a pandemia da COVID-19 demonstrou a importância da realização de exames na população, para detecção de novos casos no momento oportuno e/ou precoce, realizando o isolamento social para evitar a disseminação;
Liang e colaboradores (2020) relatam que a mortalidade da COVID-19 está associada ao menor número de testes, bem como a menor eficácia dos governos para sanar este e outros pontos básicos, como melhorar a infraestrutura.
Além disso, a pandemia da COVID-19 mostrou que se faz necessário ter mais e o melhor teste disponível para população, para que se possa ser testado as pessoas antes de terem sinais e sintomas, porém que tiveram contatos com casos positivos confirmados (MANABE; SHARFSTEIN; ARMSTRONG, 2020). Com isso, o pool testing pode ser aplicado para monitorar comunidades para vigilância epidemiológica de forma eficaz (BRAULT; MALLEIN; RUPPRECHT, 2021).
3.3.1 Pool testing
Uma proposta para aumentar a testagem em larga escala da população defendida por alguns autores pode ser o pool testing, uma estratégia para compreender melhor o cenário epidemiológico da pandemia e desta maneira corroborar para criação de políticas públicas voltadas para proteção e recuperação a saúde (BEN-AMI et al, 2020; REILLY, CHOHAN, 2021; ŽILINSKAS, LANČINSKAS, GUARRACINO, 2021).
Este é um método desenvolvido por Robert Dorfman durante a 2ª Guerra Mundial, que visa o agrupamento de amostras para realização dos exames utilizando um reagente como se fosse para uma amostra, naquela ocasião ele visou rastrear casos positivos para Treponema pallidum, o agente etiológico causador da sífilis, e o seu público investigado eram os soldados (DORFMAN, 1943).
Na atualidade o método pool testing é utlizado em alguns bancos de sangue no mundo para detecção de infecções, em especial pelo vírus HIV (McMAHON, et al, 1995) ou para monitorar o tratamento do HIV-1 em locais com recursos limitados (BOOBALAN, DINESHA, GOMATHI, 2019).
No contexto da COVID-19 o pool testing foi utilizado em diferentes estratégias, como pool de saliva (BARAT et al, 2021; KÄSTNER et al, 2022), de testes rápidos (SALCEDO, HARMON e HERRERA, 2021) e para RT-qPCR (COSTA et al, 2021). No caso da realização do pool testing por meio da RT-qPCR para detecção do SARS-CoV-2, uma revisão mostrou que a sensibilidade variou entre 60% a 100% e a especificidade de 95%
a 100% (COSTA et al, 2021).
4 OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GERAL
• Avaliar o método pool testing na RT-qPCR para investigação do SARS-CoV-2 em pacientes com síndrome gripal atendidos na Unidade de Pronto Atendimento (UPA) Centro Sul e em alunos do curso de medicina assintomáticos do 9º ao 12º semestre da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) ambos em Belo Horizonte, Minas Gerais.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Discorrer sobre a utilização do método pool testing na RT-qPCR para rastreamento do SARS-CoV-2 por meio de uma revisão integrativa;
• Testar o método em pessoas sintomáticas atendidas na UPA Centro-Sul por meio do pool testing na RT-qPCR para detecção do SARS-CoV-2;
• Analisar a viabidade da autocoleta e do pool testing em acadêmicos de medicina da UFMG assintomáticos como forma de rastreamento do SARS-CoV-2 antes das práticas clínicas.
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 ASPECTOS ÉTICOS
O projeto de pesquisa “avaliação do diagnóstico da COVID-19 em pacientes com síndromes gripais atendidos nos centros especializados de COVID-19 em Belo Horizonte e do acompanhado por telemonitoramento” foi aprovada pelo Comitê de Ética da UFMG, CAAE- 35074720.3.0000.5149, 23 de junho de 2020.
5.2 DELINEAMENTO E POPULAÇÃO DO ESTUDO
Trata-se de um estudo transversal, realizado no Centro Especializado em COVID-19 (CECOVID) pertencente à UPA Centro-Sul do município de Belo Horizonte durante o período de 10 setembro de 2020 a 19 março de 2021 com pessoas sintomáticas que foram atendidas.
Houve também a autocoleta por acadêmicos de Medicina da UFMG que estavam entre o 9ª ao 12º semestre para investigação da infecção do SARS-CoV-2 em fevereiro de 2021, ambos participantes da pesquisa tiveram seus exames processados por meio do pool testing.
5.3 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Os pacientes que foram examinados previamente pela equipe do CECOVID na UPA que apresentaram sintomas leves ou moderados compatíveis com a suspeita da COVID-19, sendo considerado leves aqueles que apresentaram poucos sinais e sintomas, e moderados
aqueles que apresentaram diversos sinais e sintomas, incluindo dispnéia, porém sem a necessidade do uso de máscara de oxigêncio.
Maiores de 18 anos, que assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (APÊNDICE A), no qual declararam a sua concordância em participar da pesquisa.
Pessoas acima de 60 anos que tenham algum problema cognitivo e que estejam acompanhadas por algum responsável para responder o questionário.
Ser acadêmico do 9º ao 12º período do curso de Medicina da UFMG.
5.4 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Não foram incluídos na testagem os pacientes em cuja avaliação clínica foi descartada a infecção pela COVID-19, bem como os pacientes que apresentaram alguma condição que sugira a contraindicação da coleta de material, a critério do médico que fez o atendimento.
Foram excluídos aqueles que tiveram perdas de amostras biológicas e/ou dados incompletos.
Casos que já tinham diagnóstico confirmado.
Casos graves (pessoas que necessitavam de máscara de oxigênio e internados).
5.5 AMOSTRAGEM
As amostras foram por conveniência, haja visto que a população estava acessível tanto na UPA Centro-Sul como os acadêmicos de medicina da UFMG.
5.6 COLETA DE DADOS
Seguindo os protocolos e fluxogramas do Ministério da Saúde (2020), de 13 de outubro de 2020 a 19 de março de 2021 ocorreu a coleta de dados da pesquisa após os atendimentos médicos e detecção precoce da COVID-19 na UPA 24 horas, visando atender indivíduos com sintomas leves e moderados que apresentaram febre e/ou sintomas respiratórios (tosse, secreção nasal, dificuldade respiratória); foi fornecida uma máscara à pessoa que não tinha e depois era realizada a classificação de risco para a consulta médica.
Na sequência, os pacientes foram convidados para participar da pesquisa, era explicado seus objetivos e por seguinte apresentado o TCLE, em caso de aceitação era recolhido a assinatura no TCLE e deixado uma via com o participante, em seguido era aplicado o questionário (APÊNDICE B).
Posteriormente era coletado a amostra biológica com o swab a ser inserido na nasofaringe por um profissional devidamente paramentado (avental, máscara N95/PFF2 ou equivalente, óculos e/ou proteção facial, gorro e luvas), eram coletadas duas amostras, uma para cada narina, inserindo-o entre aproximadamente a distância entre as narinas e a abertura externa da orelha, depois fazer uma rotação de 360º. Ressalta-se que o material do swab foi de “fibra sintética com haste de plástico” seguindo a recomendação Sociedade Brasileira de Análises Clínicas (2020). Após a coleta foi imergido o swab em tubo estéril contendo 2 a 3 ml de meio de transporte viral.
Após a realização da coleta os swabs eram desprezados no lixo infectante, os materiais biológicos contidos nesse lixo eram incinerados, a destinação desses resíduos biológicos era de responsabilidade da UPA Centro-Sul, conforme rotina operacional.
As amostras eram duplamente etiquetadas, uma etiqueta era com nome completo, sendo a mesma utilizada na admissão do paciente na UPA Centro-Sul e a outra etiqueta constava o código da pesquisa, onde era anotado em uma planilha as mesmas informações, além de números de telefone e data; uma cópia dela era encaminhado para o laboratório.
Estas amostras foram conservadas entre 4º a 8ºC em uma geladeira com um termômetro digital na UPA Centro-Sul e encaminhadas para o laboratório em uma caixa térmica com placas de gelo reutilizável que foram posteriormente limpas e desinfetadas, seguindo protocolo estipulado (RIO DE JANEIRO, 2020). O material coletado era encaminhado ao laboratório do Centro de Tecnologia de Vacinas (CT-Vacinas) da UFMG por meio de um veículo da Prefeitura de Belo Horizonte.
Os questionários foram tabulados em uma planilha e foi gerado um banco de dados, já os resultados laboratoriais foram inseridos em outra planilha, um segundo banco de dados.
Ambos os bancos tiveram 20% dos resultados auditados de forma aleatória, foi utilizado um site de sorteio de números para conferência das informações, as discrepâncias foram sanadas.
Os resultados da RT-qPCR foram enviados para os participantes via WhatsApp®.
Para os acadêmicos de Medicina da UFMG foi enviado um e-mail com convite para participarem da pesquisa, além do TCLE e o questionário online, foi utilizado a autocoleta como método para adquirir o material biológico, as amostras foram também duplamente etiquetadas, armazenadas em um recipiente refrigerado e encaminhado para o CT-Vacinas; os resultados foram enviados via WhatsApp®.
5.7 DESCRIÇÃO DO POOL TESTING
O procedimento de coleta dos swabs nasofaríngeos de casos suspeitos de infecção pelo SARS-CoV-2 foi realizado por profissionais paramentados, treinados e materiais estéreis para coleta. Em seguida, o swab de cada paciente foi imerso em tubo contendo 1 mL de solução de inativação e transporte viral (CARVALHO et al, 2021) e o mesmo prosseguiu para processamento e análise no laboratório dentro de 18 horas.
Dentro de uma estrutura de laboratório com nível de biossegurança 2, um técnico previamente treinado efetuou a preparação dos pools para realização da RT-qPCR, que consistiu na adição de 50 microlitros de cada amostra em microtubos de 1,5 mL. O restante da amostra foi estocado adequadamente para posterior análise ou não, dependendo do resultado do teste em pool. O número de amostras por pool foi determinado pela estimativa da prevalência da COVID-19 na população em estudo, variando de 3 a 16 amostras por pool. Após homogeneização, o processo de extração de RNA e RT-qPCR ocorre normalmente, como se fosse realizado em somente uma única amostra, levando em conta que o volume máximo de amostra a ser processada utilizando uma coluna de extração de RNA é de 140 microlitros.
Para extração e purificação do RNA utilizou-se o protocolo descrito no kit “QIAamp Viral RNA Mini Kit” da empresa QIAGEN (Alemanha). Após a síntese do ácido desoxirribunocleico complementar (cDNA), as PCRs foram realizadas com uma sonda para o gene endógeno da RNase P humana e o gene (E) que codifica o envelope viral, utilizando o termociclador em tempo real QuantStudio 5, seguindo o protocolo de Charité para quantificação (CORMAN et al, 2021).
Nos casos em que o resultado do pool era detectável para RNA viral, realizou-se processamento individual das amostras presentes naquele agrupamento, utilizando 140 microlitros para extração do RNA de cada amostra. Quando o resultado do pool foi não detectável, interpretou-se da seguinte forma: todas as amostras presentes no agrupamento consideradas como tendo resultado não-detectável para RNA viral e, dessa forma, não foi necessário testá-las de modo individual como apresentado pela Figura 8.
Em agrupamentos com resultados inconclusivos devido à ausência de amplificação do gene endógeno era necessário a remontagem do pool. Para resultados com uma pequena quantidade de RNA viral inicial, ficando com valores de Ct próximos ao limiar de detecção do método (o limite de detecção ou ponto de corte ou cut-off podem oscilar de acordo com os kits de insumos utilizados em cada laboratório, devido a diferenças como a eficiência enzimática, o rendimento e qualidade do RNA extraído) realizou-se o processamento individual daquelas amostras que compuseram o determinado pool.
Os pontos de corte dos testes foram definidos como determinado anteriormente (COSTA et al, 2021), estabelecendo o limite de 32 amostras por pool, sendo que este é o limite garantido a sensibilidade e especifidade. Após análise dos resultados, as amostras que foram autorizadas foram estocadas a -80ºC na solução de inativação e transporte. As amostras de RNA purificado foram também estocadas em ultrafreezeres a -80ºC.
A obtenção e liberação dos resultados foi realizada em no máximo 72h após a chegada das amostras ao laboratório. A Figura 8 apresenta a estratégia de realização da RT-qPCR em pool testing.
Figura 8 – Estratégia de realização da RT-qPCR em pool testing. Fonte: Autor
5.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As variáveis presentes estudadas foram: pool detectáveis, resultado individual, idade, sexo, etnia, e informações relacionadas a saúde do paciente (sintomas e comorbidades).
Em todas as etapas descritas a seguir foram necessárias a utilização do software R.
Primeiramente, foi feita a limpeza e adequação dos dados coletados pela pesquisa, isso envolveu a checagem manual de cada variável para avaliar se havia incongruências. Todas as incongruências encontradas foram corrigidas, onde a correção não foi possível os dados foram descartados.
Foram utilizados recursos gráficos para a análise do perfil sociodemográfico e clínico dos pacientes, bem como para a análise da proporção e distribuição de pacientes detectáveis para SARS-CoV-2.
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
ARTIGO 1 - Detection of SARS-CoV-2 through pool testing for COVID-19: an integrative review
Murilo Soares Costa1, Nathalia Sernizon Guimarães1, André Barbosa de Andrade2, Luiza Passini Vaz-Tostes2, Rhuan Braga Oliveira2, Madara da Silva Simões2, Gabriel de Oliveira Gelape2, Claudia Regina Lindgren Alves3, Elaine Leandro Machado4, Flávio Guimarães da Fonseca5, Santuza Maria Ribeiro Teixeira5, Hugo Itaru Sato5, Ricardo Hiroshi Caldeira Takahashi6 and Unaí Tupinambás1,7
1. Universidade Federal de Minas Gerais, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:
Infectologia e Medicina Tropical, Belo Horizonte, MG, Brasil.
2. Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina, Belo Horizonte, MG, Brasil.
3. Universidade Federal de Minas Gerais, Departamento de Pediatria, Belo Horizonte, MG, Brasil.
4. Universidade Federal de Minas Gerais, Departamento de Medicina Preventiva e Social, Belo Horizonte, MG, Brasil.
5. Universidade Federal de Minas Gerais, Centro de Tecnologia de Vacinas, Belo Horizonte, MG, Brasil.
6. Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Matemática, Belo Horizonte, MG, Brasil.
7. Universidade Federal de Minas Gerais, Departamento de Clínica Médica, Belo Horizonte, MG, Brasil.
Abstract
Introduction: The pool testing technique optimizes the number of tests performed and reduces the delivery time of results, which is an interesting strategy for the health crisis caused by the COVID-19 pandemic. This integrative review investigated studies in which pool testing was carried out for epidemiological or screening purposes to analyze its clinical or cost effectiveness and assessed the applicability of this method in high-, middle-, and low-income countries.
Methods: This integrative review used primary studies published in the MEDLINE, EMBASE, Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciências da Saúde (LILACS), and Cochrane Library databases. Results: A total of 435 studies were identified: 35.3% were carried out in Asia, 29.4% in Europe, 29.4% in North America, and 5.9% in Oceania. Conclusions: This review suggests that pool testing in the general population may be a useful surveillance strategy to detect new variants of SARS-CoV-2 and to evaluate the period of immunogenicity and global immunity from vaccines.
Keywords: COVID-19. SARS-CoV-2. Pool testing. Diagnosis. Pandemic.
INTRODUCTION
As of the beginning of 2021, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV- 2) has been responsible for more than 3.5 million deaths and 165 million cases worldwide.
These numbers placed the disease caused by SARS-CoV-2, coronavirus disease 2019 (COVID- 19), as the most critical public health crisis in the last 100 years1. Approximately 80% of
infections are mild or asymptomatic cases, although these individuals are still contagious and contribute to viral transmission2. When the disease occurs without severe symptoms, people are less likely to recognize it and are therefore less likely to seek medical help, thus impairing prompt diagnosis, contact screening, and disease control. Symptomatic infections, as well as a substantial number of mild or asymptomatic infections, may go undetected in some countries.
Moreover, confirmed case counts are biased owing to incomplete testing and low test sensitivity.
Accurate estimates of the burden of SARS-CoV-2 infections are critical for understanding the course of the pandemic and informing the public health response3.
To understand the real epidemiological profile, incidence rate, prevalence, virulence, and lethality of the virus, it is necessary to test as many people as possible4. Cases are classified as asymptomatic5, symptomatic respiratory, flu-like syndrome, or severe acute respiratory syndrome6, based on clinical assessments complemented by laboratory tests.
Tests to detect viral antigens, such as immunochromatography and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are currently used to detect infected individuals. Nevertheless, real-time reverse- transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) to detect viral ribonucleic acid (RNA) continues to be the most widely used diagnostic test and is the gold standard for confirming COVID-19. Tests to detect viral antigens or RNA rely on nasopharyngeal swabs or, in some cases, on bronchiolar secretions. These are usually collected in viral transport media and immediately forwarded to a diagnostic laboratory7.
Considering the importance of increasing the number of tests to detect SARS-CoV-2 in the population, a suitable alternative is to perform RT-PCR, which uses the pool testing strategy developed by Dorfman8,9. Pool testing is a method of grouping several samples to be analyzed
together. A second test on individual samples must be performed if a positive sample is present in the pool. If no positive result is detected in the pool, all samples are considered non- detectable10,11. The number of samples per pool can vary according to the prevalence of infection (Supplementary Table 1)12-14.
Pool testing is currently a suitable strategy for coping with the COVID-19 pandemic. More than ever, it is necessary to expand access to COVID-19 diagnostic tests and to identify presymptomatic and asymptomatic individuals who contribute silently to the fast dissemination and maintenance of the pandemic15. Increased testing has also become essential as a tool to reduce the rapid dissemination of the virus and an increase in mutant variants, which are a growing threat worldwide16. This method can reduce the costs for health systems and increase testing scalability. It is known that the countries that were best able to control the pandemic were those that carried out mass tests in their populations. Therefore, pool testing has become an alternative method for mass testing. Pooling samples enables a rapid increase in screening capacity, which is essential to inform public health actions and to control the spread of COVID-1917.
Given the current importance of this topic, this study sought to review research that applied pool testing as a diagnostic method for SARS-CoV-2 in order to investigate the scenarios in which these investigations were carried out (epidemiological or screening, clinical analysis or cost- effectiveness analysis) and the applicability of this method in high-, middle-, and low-income countries.
METHODS Search databases
This integrative review is based on primary studies published between March 1, 2020 and January 24, 2021 in the Medical Literature Analysis and Retrieval System Online (MEDLINE), Excerpta Medica database (EMBASE), Literatura Latino- Americana e do Caribe em Ciências da Saúde (LILACS), and Cochrane Library databases, as well as a search conducted for gray- literature articles through a manual search for references of selected articles or through Google Scholar (active search for local articles in references of found studies, sites, pre-prints, or conference annals). The search was not limited by the language of publication or by studies from high-, middle-, or low-income countries. To identify the references, a sensitive search was conducted.
This study included studies whose outcome variables were determined by the diagnoses reached using the pooling test. Variables of interest were the pooling test, comparisons between the pooling test and RT-PCR, and positivity profiles measured by direct methods. Observational (cross-sectional, case-control, cohort, and case studies), interventional (randomized controlled trials), or cost-effectiveness studies were included. Systematic reviews, meta- analyses, narrative reviews, and integrative reviews were excluded.
Screening criteria
Titles and abstracts of studies retrieved using the search strategy and those from additional sources were screened separately by two authors to identify studies that potentially met the inclusion criteria outlined above. The full texts of these potentially eligible studies were retrieved and independently assessed for eligibility by two review authors. Disagreements between reviewers on the eligibility of the studies were resolved through discussion with a third
review author.
Data extraction
Two authors evaluated articles retrieved independently during eligibility searches using Mendeley Reference Manager (Mendeley, London, United Kingdom). Data extraction was performed using a standardized and pre-tested form for Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA) to build an evidence-tuning worksheet.
The variables extracted from the articles were authors’ names, affiliations, journals, countries of the studies, population, number of pools performed, number of samples per pool, number of detectable pools, percentage of detectable pools, percentage of individual detection within the detectable pools, type of information about the study/article, study category, and disclosure.
RESULTS
This study identified 425 articles from databases and 10 in the gray literature by a manual search for references of selected articles and through Google Scholar. Of the studies related to searching indexed databases, 367 studies were excluded by reading the titles and abstracts, leaving 58 studies for a full evaluation. During the evaluation of the texts, 12 studies were excluded because they did not apply pool testing to the studied population, 7 were excluded as pre-prints, and 22 were excluded for expressing an opinion on the subject without presenting numerical data. Thus, 17 studies were part of our sample, with 7 articles derived from the databases and 10 studies obtained from the gray literature. An overview of the selection process is presented in Figure 9.
FIGURE 9: Study eligibility flowchart
Characteristics of studies
Table 1 summarizes the characteristics of the 17 individual studies published in 2020 (94.1%) and 2021 (5.9%) included in this integrative review. Of the studies included, 35.3%
(n=6) were carried out in Asia, 29.4% (n=5) in Europe, 29.4% (n=5) in North America, and 5.9%
(n=1) in Oceania (Table 1).
The articles were published in journals with impact factors ranging from 1.705 (24) to 21.770 (26), with 70.6% (n=12) presented in journals with an impact factor greater than 2.000.
In terms of study format, 41.2% (n=7) of the studies were original articles, 23.5% (n=4) were brief reports, 23.5% (n=4) were letters, 5.9% (n=1) were opinions, and 5.9% (n=1) were special
articles. Pool testing was evaluated using cross-sectional studies (diagnostic accuracy) in 82.3%
(n=14) of studies, as a case-control study in 11.8% (n=2) of studies, and as a case report in 5.9%
(n=1) of studies. Regarding the institutions in which the studies were conducted, 76.4% (n=13) were carried out in universities, 17.4% (n=3) in research institutes, and 5.9% (n=1) in hospitals (Table 1).
Regarding the evaluated population, 29.4% (n=5) of studies evaluated samples taken from the general population, 23.5% (n=4) from health professionals, 23.5% (n=4) from asymptomatic patients, 11.8% (n=2) from patients with mild symptoms, and 11.8% (n=2) from hospitalized patients (Table 1).The 17 studies in this review were published between 2020 and 2021 in heterogeneous populations in 8 countries. The number of individual samples per pool ranged from 2 to 50 (number of samples per pool) with between 1 and 7,175 pool tests. The total number of individual samples in this review was 217,348, with between 10 and 59,476 samples per study. The positive pools and positive samples showed varied results, as shown in Table 2.
DISCUSSION
The objective of this review was to identify studies that applied the pool test as a diagnostic method for SARS-CoV-2 and to describe the research scenarios. We found studies from four different continents. Although RT-PCR is considered the gold standard for the diagnosis of COVID-19, it is an expensive test when performed individually, which can have an impact on a country’s capacity to offer this test to the general population when following the epidemiology and/or natural history of the disease. Thus, due to the limited availability of test kits and their high cost, wider testing using the PCR method presents a challenge in coping with COVID-
