TRIAGEM FITOQUÍMICA BIOMONITORADA COM AVALIAÇÃO DA POTENCIAL ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCEPTIVA DO
EXTRATO ACETÔNICO DOS FRUTOS DE Capsicum baccatum L.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO ESCOLA DE FARMÁCIA
PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
TRIAGEM FITOQUÍMICA BIOMONITORADA COM AVALIAÇÃO DA POTENCIAL ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCEPTIVA DO
EXTRATO ACETÔNICO DOS FRUTOS DE Capsicum baccatum L.
Autora: Juliana Cristina dos Santos Almeida Orientador: Prof. Dr. Tanus Jorge Nagem
Co-orientadora: Profª. Dra. Tânia Toledo de Oliveira
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas – CIPHARMA, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Fármacos e Medicamentos. Linha de pesquisa: Plantas Medicinais
Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br A447t Almeida, Juliana Cristina dos Santos.
Triagem fitoquímica biomonitorada com avaliação da potencial atividade antiinflamatória e antinoceptiva do extrato acetônico dos frutos de Capsicum baccatum L. [manuscrito] / Juliana Cristina dos Santos Almeida. – 2010.
xviii, 104 f.: il. color.; grafs.; tabs.
Orientador: Prof. Dr. Tanus Jorge Nagem.
Co-orientadora: Profa. Dra. Tânia Toledo de Oliveira.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de Farmácia. Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Fármacos e Medicamentos
1. Plantas medicinais - Teses. 2. Pimenta dedo-de-moça - Teses. 3. Atividade antiinflamatória – Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
Juliana Cristina dos Santos Almeida
Triagem fitoquímica biomonitorada com avaliação da potencial atividade antiinflamatória e antinoceptiva do extrato acetônico dos frutos de Capsicum baccatum L.
Dissertação aprovada no dia 19 de Novembro de 2010
Banca Examinadora:
Profa. Dra. Marisa Alves Nogueira Diaz Departamento de Bioquímica – UFV
Profa.Dra. Carla Penido
Departamento de Farmácia – UFOP
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ter me dado essa oportunidade de crescimento e forças para conseguir vencer mais uma etapa da minha vida.
Aos meus pais pelo carinho, incentivo, pela compreensão e oportunidade de poder realizar mais um sonho. Amo vocês!
À minha tia Maria Eunice, exemplo de força e luta, pelo incentivo eterno em tudo que me proponho a fazer.
Aos meus amigos, em especial Érika Freitas, Marcelle Souza, Renata Batista, Sara Elizabeth e Wallace Benjamin por compreenderem tantos momentos de ausência.
À Universidade Federal de Ouro Preto, por me receber nesta ilustre casa. Ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas (CIPHARMA) pela
oportunidade e aprendizado.
Ao meu orientador Prof. Dr. Tanus Jorge Nagem pelo exemplo de luta, perseverança e força. O senhor é realmente uma pessoa especial!
À minha co-orientadora Profª. Dra. Tânia Toledo de Oliveira pelos ensinamentos, pelo incentivo, pela paciência e dedicação.
Aos amigos do Laboratório de Produtos Naturais (LAPPRONA) pela amizade, pelo incentivo e apoio durante o desenvolvimento desse projeto, em especial à Ana Lia Mazzeti,
Jordana Mol, Katiúscia F. Rodrigues e Tamires de Souza Rodrigues.
Aos professores, que muito mais que professores, foram verdadeiros mestres e amigos, Cláudia Martins, Sidney Augusto (Bibo), Gustavo Henrique Barbosa, Orlando David
Henrique, Carlos Eduardo e Rosângela Barbosa. Meus eternos agradecimentos! Aos funcionários Adão, Délio Fernandes Lopes, José Maria Marcelino, Marcelo
À amiga de tantos anos e de todas as horas Rosana Gonçalves Rodrigues-das-Dôres pela amizade, pelo incentivo, pelos aprendizados, pelas risadas e oportunidades. Não tenho
palavras para te agradecer!
Ao Botânico prof. Doutor João Renato Sthemann da Universidade Federal de Minas Gerais pela identificação da espécie.
À professora Ms. Fernanda Duval pelo auxílio na confecção da exsicata. Ao professor Dr. Ricardo Tavares pelas análises estatísticas.
Aos alunos e funcionários do Laboratório Biofármacos da Universidade Federal de Viçosa (UFV), em especial à Idelvânia dos Anjos, Luiz Eduardo, Carlos Eduardo, Marcos e Sílvia
Ribeiro. Seria muito mais difícil sem vocês!
À Lorena e suas amigas de república por tornar os meus dias em Viçosa mais agradáveis e confortáveis.
Aos funcionários do Laboratório de Análises Clínicas do Departamento de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Viçosa (UFV), em especial ao farmacêutico Aécio.
À Eunice, Liliam e Ilza pelo apoio e pelas análises no HPLC.
Aos meus companheiros de turma no mestrado, em especial à Paola, Priscila, Patrícia e Renata pelas risadas e pelos momentos de descontração.
À Alessandra Vidal e Nívea Cristina pela companhia durante o percurso pela estrada Real. Essa amizade é eterna!
À Karina Zanotti e sua família pelos reconfortantes cafés de final de tarde após atravessar o deslumbramento da Estrada Real embaladas ao som de Djavan.
Ao professor Gabriel e Sílvio da Universidade Viçosa (UNIVIÇOSA) pela confecção das lâminas histológicas.
Aos meus alunos do curso de Farmácia da Universidade Presidente Antônio Carlos – UNIPAC – Barbacena por permitirem aprendizado e aprimoramento no dia-a-dia dentro e
fora das salas de aula. Serei eternamente grata!
“É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida passar. É melhor tentar, ainda em vão, que sentar-se fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva caminhar que em dias tristes em casa esconder. Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver...”
RESUMO
ALMEIDA, J.C.S. Avaliação do potencial antiinflamatório de Capsicum baccatum. Dissertação de Mestrado – Escola de Farmácia – Universidade Federal de Ouro Preto. Ouro Preto, 2010.
Palavras-chave: Capsicum, pimenta dedo-de-moça, atividade antinoceptiva e antiinflamatória
As pimentas do gênero Capsicum apresentam várias atividades biológicas, tais como: atividade antioxidante, antiinflamatória, analgésica, dentre outras. Com o objetivo de estudar o potencial antiinflamatório e analgésico da espécie Capsicum baccatum L. foi preparado o extrato acetônico dos frutos verdes da espécie e realizados os seguintes testes: edema de pata induzido por carragenina, contorções abdominais induzidas por ácido acético e análise histológica do músculo plantar dos ratos Wistar após 4h da indução do edema de pata. No teste de edema de pata determinou-se a resposta antiedematogênica do extrato acetônico de
edema no tratamento com 1000mg/Kg de peso. Baseado nos resultados obtidos pode-se concluir que o extrato acetônico dos frutos verdes de Capsicum baccatum L. apresenta atividade antinoceptiva nas doses de 100, 300, 600 e 1000mg/Kg de peso e atividade antiinflamatória na dose de 1000mg/Kg de peso, nos modelos apresentados.
ABSTRACT
ALMEIDA, J.C.S. Avaliação do potencial antiinflamatório de Capsicum baccatum. Dissertação de Mestrado – Escola de Farmácia – Universidade Federal de Ouro Preto. Ouro Preto, 2010.
Keywords: Capsicum, chili finger-shaped girl, antinociceptive and antiinflammatory activity
weight. Based on these results we can conclude that the acetone extract of unripe fruits of
Capsicum baccatum L. shows antinociceptive activity at doses of 100, 300, 600 and 1000mg/kg body weight and anti-inflammatory activity in a dose of 1000mg/kg of body
weight in the models presented.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Concentração média de massa fresca, massa seca, cinzas totais e perda de água de frutos maduros de Capsicum baccatum L... 50 Tabela 2 Rendimento dos extratos acetônicos dos frutos de Capsicum baccatum L.
em três diferentes estádios de maturação... 52 Tabela 3 Valores de Rf de capsaicina em extratos em acetona de Capsicum
baccatum em três diferentes estádios de
maturação... 53 Tabela 4 Valores de Rf de timol em extratos acetônicos de Capsicum baccatum L.
em três diferentes estádios de maturação... 55 Tabela 5 Valores de Rf de linalol em extratos acetônicos de Capsicum baccatum L.
em três diferentes estádios de maturação... 55 Tabela 6 Valores de Rf de saponina em extratos em acetona de Capsicum baccatum
L. em três diferentes estádios de maturação... 55 Tabela 7 Valores de Rf de quercetina em extratos em acetona de Capsicum
baccatum L. em três diferentes estádios de maturação... 56 Tabela 8 Concentração média de capsaicina em extratos acetônicos de Capsicum
baccatum L. em três diferentes estádios de maturação... 59 Tabela 9 Concentração média de compostos fenólicos em extratos acetônicos de
Capsicum baccatum L. em três diferentes estádios de maturação... 62 Tabela 10 Parâmetros físico-químicos do xarope contendo extrato acetônico de
Capsicum baccatum L. no estádio imaturo (verde)... 70 Tabela 11 Valores médios e porcentagem de inibição do número de contorções
abdominais (“Writhing) induzido por ácido acético 0,6% em ratos da linhagem Wistar tratados com formulação contendo extrato acetônico dos frutos imaturos de Capsicum baccatum L... 72 Tabela 12 Valores médios do tamanho do edema de pata induzido por carragenina a
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura química da piperina... 03
Figura 2 Estrutura química da capsaicina... 04
Figura 3 Frutos maduros da pimenta Capsicum frutescens L... 06
Figura 4 Frutos maduros da pimenta Capsicum annuum L... 06
Figura 5 Frutos maduros da pimenta Capsicum chinense Jacq... 07
Figura 6 Frutos maduros da pimenta Capsicum pubescens... 07
Figura 7 Flor de Capsicum baccatum... 07
Figura 8 Frutos maduros da pimenta Capsicum baccatum L... 09
Figura 9 Etapas do processo inflamatório... 14
Figura 10 Metabólitos do ácido araquidônico... 16
Figura 11 Frutos de Capsicum baccatum em diferentes estádios de maturação... 24
Figura 12 Rato Wistar macho adulto acondicionado em gaiola... 34
Figura 13 Experimento de contorções abdominais... 35
Figura 14 Experimento de edema de pata induzido por carragenina... 37
Figura 15 Espécie vegetal Capsicum baccatum L... 39
Figura 16 Exsicata de Capsicum baccatum L... 40
Figura 17 Frutos de Capsicum baccatum L... 41
Figura 18 Corte longitudinal do fruto de Capsicum baccatum L... 41
Figura 19 Corte transversal do fruto de Capsicum baccatum L. destacando camadas... 42
Figura 20 Corte transversal do fruto de Capsicum baccatum L. evidenciando a cutina... 42
Figura 21 Corte transversal do fruto de Capsicum baccatum L. evidenciando cristais... 43
Figura 22 Corte paramétrico da epiderme do fruto de Capsicum baccatum L... 43
Figura 23 Corte transversal em frutos de Capsicum baccatum L. evidenciando reação positiva com cloreto férrico... 45 Figura 24 Corte transversal em frutos de Capsicum baccatum L. evidenciando reação positiva com cloreto de alumínio... 46
Figura 25 Corte transversal em frutos de Capsicum baccatum L. evidenciando reação positiva com ácido sulfúrico... 47
Figura 27 Corte transversal em frutos de Capsicum baccatum L. evidenciando reação positiva com reagente de Dragendorf... 48 Figura 28 Corte transversal em frutos de Capsicum baccatum L. evidenciando reação
positiva com ácido tânico 5% e cloreto férrico 3%... 49 Figura 29 Placa cromatográfica do extrato acetônico dos frutos maduros de Capsicum
baccatum L... 53 Figura 30 Espectro de absorção na luz ultravioleta da capsaicina ... 58 Figura 31 Cromatograma do padrão de capsaicina... 58 Figura 32 Espectro de absorção na luz ultravioleta da capsaicina em diferentes
concentrações... 59 Figura 33 Curva de calibração de compostos fenólicos... 62 Figura 34 Atividade antioxidante de extratos acetônicos de frutos de Capsicum baccatum
L. em três diferentes estádios de maturação... 65
Figura 35 Efeito analgésico do xarope contendo extrato dos frutos imaturos de Capsicum baccatum L...
75
Figura 36 Aumento da espessura da pata de ratos Wistar induzido por carragenina... 78 Figura 37 Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo controle salina... 84 Figura 38 Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo controle carragenina a 1%.... 85 Figura 39 Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo tratado com 1000mg/Kg de
extrato acetônico de Capsicum baccatum L... 86
Figura 40 Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo tratado com nimesulida 300mg/Kg...
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
Ac Absorbância do controle At Absorbância do teste a.C. Antes de Cristo ADA Adenosina deaminase ADA1 Adenosina deaminase 1
ADA2 Adenosina deaminase 2
AINES Antiinflamatórios não-esteroidais ANOVA Análise de variância
ASRL Atividade sequestrante de radicais livres ATCC American Type Culture Collection
BHA Butilhidroxianisol
CCD Cromatografia em camada delgada
CEEA Comissão de Ética na Experimentação Animal CIS Comissões Interinstitucionais de Saúde
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CL50 Concentração Letal Média
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
COX Ciclooxigenase
COX-1 Ciclooxigenase-1 COX-2 Ciclooxigenase-2 DL50 Dose letal Média
DMSO Dimetilsulfóxido DPPH 2,2-difenilpicrilidrazila
E% Aumento do tamanho do edema ERO Espécies reativas de oxigênio
HE Hematoxilina-eosina HOCl Ácido hipocloroso
IL-8 Interleucina 8
LAPPRONA Laboratório de Produtos Naturais
LTB Leucotrieno B
MPO Mieloperoxidase
NO Óxido nítrico
PDF Produtos decorrentes da degradação de fibrina PGD2 Prostaglandina D2
PGE2 Prostaglandina E2
PGF2 Prostaglandina F2
pH Potencial hidrogeniônico PGI2 Prostaglandina I2
PGs Prostaglandinas p/v Peso por volume
Rf Fator de retenção Rfs Fatores de retenção SUS Sistema Único de Saúde TNF Fator de necrose tumoral TNF- Fator de necrose tumoral
T0 Tamanho inicial da pata
Tt Tamanho da pata após injeção de salina ou carragenina UFOP Universidade Federal de Ouro Preto
UFJF Universidade Federal de Juiz de Fora UFV Universidade Federal de Viçosa
1. Introdução... 01 2. Revisão da Literatura... 2.1. Família Solanaceae...
05 05 2.2. Gênero Capsicum... 06 2.3. Espécie estudada: Capsicum baccatum... 08 2.4. Processo patológico estudado: inflamação... 10 2.5. Inflamação experimental... 17 2.6. Agentes antiinflamatórios... 18 3. Objetivos... 21 3.1. Objetivo geral... 21 3.2. Objetivos específicos... 21 4. Materiais e métodos... 23 4.1. Coleta do material vegetal... 23 4.2. Caracterização morfo-anatômica dos frutos... 24 4.3. Caracterização histoquímica dos frutos... 24 4.4. Determinação da massa seca, massa fresca, porcentagem de água e teor de cinzas
4.13. Testes de atividade da formulação farmacêutica... 32 4.13.1. Animais usados no teste... 32 4.13.2. Aprovação pelo Comitê de Ética dos experimentos com animais... 33 4.13.3. Teste de contorções abdominais... 34 4.13.4. Teste de edema de pata induzido por carragenina... 35 4.13.4.1. Histologia do edema de pata... 36 4.13.5. Protocolo de anestesia... 37 4.14. Análises estatísticas... 37 5. Resultados e Discussão... 38 5.1. Identificação do material botânico... 38 5.2. Caracterização morfo-anatômica dos frutos... 39 5.3. Caracterização histoquímica dos frutos... 43 5.3.1. Reação de detecção de compostos fenólicos... 43 5.3.2. Reação de detecção de flavonoides... 44 5.3.3. Reação de detecção de lactonas sesquiterpênicas... 45 5.3.4. Reação de detecção de taninos... 46 5.3.5. Reação de detecção de alcalóides... 47 5.3.6. Reação de detecção de mucilagens... 48 5.4. Determinação de massa fresca, massa seca, porcentagem de água e de cinzas
1- INTRODUÇÃO
Diante da perspectiva de se obter novos fármacos para o tratamento das diversas enfermidades que acometem a civilização humana, não pode ser negligenciado o grande arsenal de produtos naturais disponíveis no país que apresenta uma grande diversidade química e uma múltipla função biológica (SIMÕES et al., 2004).
A pesquisa farmacológica de produtos naturais, principalmente as plantas, tem propiciado um avanço importante para a terapêutica de várias patologias, além de promover ferramentas extremamente úteis para o estudo teórico da fisiologia e da farmacologia (DOHADWALLA, 1985).
O uso de plantas medicinais é tão antigo quanto a civilização. O homem vem buscando na natureza o suprimento para as suas necessidades básicas retirando dela alimentos, abrigo, vestuário, meios de transporte, temperos, perfumes e remédios (NEWMAN et al., 2000).
No Brasil, diretrizes do Ministério da Saúde determinaram prioridades na investigação das plantas medicinais e a implantação da Fitoterapia como prática oficial da medicina, orientando as Comissões Interinstitucionais de Saúde (CIS) a buscarem sua inclusão no Sistema Único de Saúde (SUS). Para que essa inclusão ocorra é essencial que os profissionais da área de saúde conheçam as atividades farmacológicas e a toxicidade das plantas medicinais de cada bioma brasileiro, de acordo com os costumes, tradições e condição sócio-econômica da população (JÚNIOR et al., 2008).
Dentre as diversas patologias tratadas com plantas medicinais podem ser citadas: doenças inflamatórias, diabetes, hipertensão, ansiedade, depressão, problemas circulatórios, dentre outras (SIMÕES et al., 2004).
phlogosis para denominar o termo e a civilização romana utilizou a palavra inflammation, todos com o mesmo propósito, descrever o processo atualmente conhecido como inflamação (ROCHA, 2006).
Em se tratando de um processo complexo, e principalmente devido à sua importância em Patologia, a inflamação tem sido intensamente investigada desde o início da era Cristã, quando Celsus (30 a.C.- 36 d.C.) definiu os quatro sinais principais ou cardeais da inflamação: rubor, calor, tumor e dor. A estes sinais, Galeno, médico da Antiguidade, acrescentou um quinto sinal, a perda da função da parte afetada (BECHARA & SZABÓ, 1989).
Apesar do avanço do conhecimento da anatomia, fisiopatologia e farmacologia da dor e da inflamação, os resultados do tratamento ainda não são satisfatórios. Isso porque o emprego de diversas opções terapêuticas não é capaz de inibir o início e a manutenção do processo inflamatório sem riscos, custo ou efeitos adversos.
Os agentes antiinflamatórios agem no processo de redução da atividade antiinflamatória por inibirem a síntese e liberação de prostaglandinas, atuando em etapas pré-estabelecidas na via do ácido araquidônico (FONSECA et al., 2002).
Atualmente existe um grande arsenal de medicamentos antiinflamatórios disponíveis no mercado, dentre eles podem ser destacados os antiinflamatórios não-esteroidais (AINES), glicocorticoides e os fitoterápicos.
Os antiinflamatórios não-esteroidais constituem uma classe de fármacos antiinflamatórios que atuam na redução do edema, eritema e dano tecidual resultante de processos inflamatórios (FONSECA et al., 2002).
As estatísticas relativas ao mercado de fitoterápicos mostram que o consumo destes produtos no Brasil e no exterior tem aumentado consideravelmente nos últimos tempos (PEREIRA & LOPES, 2006). Muitos produtos padronizados em uso corrente já se mostraram efetivos para o combate de processos inflamatórios, dentre eles podem ser destacados a
Cordia verbenaceae, Echinacea purpurea, Tanacetum vulgare, Arnica montana, Allium sativum, Hamamelis virginiana, dentre outros(CZEPULA, 2006).
A pimenta é, hoje em dia, um dos condimentos mais consumidos no mundo; estima-se que um quarto da população mundial consome pimenta diariamente, seja de forma direta ou através da ingestão de alimentos processados que contenham essa iguaria (SZALASI & BLUMBERG, 1999).
Muitos compostos presentes nos alimentos exercem sobre o organismo funções adicionais a seus efeitos meramente nutritivos ou flavorizantes, e a pimenta não é uma exceção. As pimentas são uma boa fonte dietética de antioxidantes como flavonoides, compostos fenólicos, carotenoides, ácido ascórbico, vitamina A e os capsaicinoides (SAVEGNAGO et al., 2006).
As pimentas são plantas utilizadas na alimentação e produzem a sensação picante e de calor devido aos seus componentes químicos, capazes de estimular as papilas gustativas da boca. Basicamente há dois gêneros de pimentas mais conhecidos, o Piper e o Capsicum
(BONTEMPO, 2007).
O gênero Capsicum compreende cerca de 30 espécies conhecidas. As pimentas do gênero Capsicum são importantes componentes da dieta humana e podem ser consumidas frescas ou secas. Essas plantas sintetizam e acumulam capsaicinoides, um grupo de compostos responsavéis pelo ardor das pimentas. A estrutura característica dos capsaicinoides que determina a propriedade de pungência nas espécies do gênero Capsicum é a presença de uma cadeia amino ligada a um anel vanilil e uma cadeia acila (BARBERO et al., 2008). A concentração dessas substâncias depende do genótipo, maturidade do fruto e condições de cultivo. Os capsaicinoides presentes nessas espécies são: nornorcapsaicina, norcapsaicina, homocapsaicina, nornordihidrocapsaicina, capsaicina, hordihidrocapsaicina, dihidrocapsaicina e homodihidrocapsaicina (MORÁN-BAÑUELOS et al., 2008). O princípio ativo mais importante desse gênero é a capsaicina (Figura 2) (BONTEMPO, 2007).
Figura 2 – Estrutura química da capsaicina
farmacêutica tem promovido o estudo fitoquímico dessas espécies (MORÁN-BAÑUELOS et al., 2008).
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. FAMÍLIA SOLANACEAE
A família Solanaceae é subcosmopolita, ocorrendo em quase todas as regiões do planeta. Nesta família são encontradas cerca de 92 gêneros e mais de 2300 espécies, sendo a maioria de ocorrência nas regiões montanhosas da América do Sul. Na região andina são encontrados treze gêneros endêmicos (HUNZIKER & BARBOZA, 1990).
As espécies dessa família são caracterizadas por um conjunto de caracteres como folhas simples, alternadas, podendo apresentar odor desagradável ao serem amassadas. As flores normalmente são vistosas, bissexuadas, actinomorfa, diclamídeas, cálice pentâmero, gamossépalo, geralmente plicada, reunidas em inflorescências em regra cimosas, corola com 5 pétalas unidas. Os estames geralmente são em número de 5 (4 ou 2 em alguns poucos gêneros), ovário súpero, bicarpelar, bilocular, com muitos óvulos, estilete terminal, carpelos orientados obliquamente EME relação ao eixo da flor, placentação axial, anteras rimosas ou poricidas, disco nectarífero geralmente presente. O fruto pode apresentar formato baciforme ou capsular. Várias espécies arbustivas ou arbóreas são pioneiras, habitando a borda ou clareiras na mata (HUNZIKER & BARBOZA, 1990).
2.2. GÊNERO CAPSICUM
O centro de origem das pimentas são as Américas, destacando-se as regiões tropicais (LUZ, 2007).
A mais recente descrição taxonômica das pimentas, segundo BOSLAND & VOTAVA (1999) é:
Reino: Plantae
Divisão: Magnoliophyta Classe: Magnoliopsida Ordem: Solanales Família: Solanaceae Gênero: Capsicum
Ainda não existe um consenso do número de espécies classificadas de acordo com o nível de domesticação. Mas quando se relata o número de espécies domesticadas existe um consenso de serem cinco: Capsicum frutescens L. (Figura 3), Capsicum annuum L. (Figura 4), Capsicum chinense Jacq. (Figura 5), Capsicum baccatum L. e Capsicum pubescens Ruiz & Pav. (Figura 6) (REIFSCHNEIDER, 2000).
Figura 3 – Frutos maduros de Capsicum frutescens L.
As diversas espécies e variedades de pimentas podem ser diferenciadas por características morfológicas dos frutos e, principalmente das flores (MOREIRA et. al., 2006). O gênero Capsicum tem sido segregado pela cor de suas corolas em dois grandes grupos: branco e púrpura. A espécie Capsicum baccatum apresenta corola branca e anteras amarelas (Figura 7), enquanto a espécie Capsicum pubescens possui corola púrpura e anteras púrpuras ou violetas. Além dessas características, as principais espécies domesticadas do gênero podem ser identificadas pela posição da flor e do pedicelo, presença ou ausência de manchas nos lobos das pétalas e margem do cálice (CARVALHO et al., 2003). Com relação ao sistema reprodutivo, as espécies domesticadas de Capsicum apresentam-se autógamas, de forma geral.
Figura 5 – Frutos maduros de Capsicum chinense Jacq.
Fonte: http://www.cnph.embrapa.br/capsicum/especies.htm Fonte: http://www.cnph.embrapa.br/capsicum/especies.htmFigura 6 – Frutos maduros de Capsicum pubescens
Figura 7 – Flor de Capsicum baccatum: corola com coloração branca
e anteras amarelas
Uma característica exclusiva do gênero Capsicum, é a pungência atribuída à presença de capsaicinoides. Tais compostos acumulam-se na superfície da placenta e são liberados quando o fruto sofre qualquer dano físico (CARVALHO et al., 2003).
2.3. ESPÉCIE ESTUDADA: Capsicum baccatum L.
A pimenta dedo-de-moça pertence à espécie Capsicum baccatum e é cultivada principalmente nos estados de São Paulo, Rio Grande do Sul e Goiás. Os frutos apresentam suave pungência e são consumidos frescos, na forma de molhos, conservas e desidratados em flocos com a semente (pimenta calabresa) (EMBRAPA, 2008).
O nome baccatum significa “em forma de baga”. Originária da Bolívia ou Peru e, de acordo com evidências arqueológicas, foi provavelmente domesticada no Peru por volta de 2500 a.C. O tamanho do fruto aumentou e gradualmente tornaram-se perenes e ficavam nas plantas até o seu total amadurecimento.
A espécie Capsicum baccatum é geralmente distinta das outras espécies pelas manchas amarelas ou marrons na corola de suas flores e pelas anteras amarelas. Essa espécie é cultivada na Argentina, Colômbia, Equador, Peru, Bolívia e Brasil. Na América do Norte seu crescimento é limitado e na Califórnia é conhecida sob o nome de Mild-Italian e em Nevada como Chileno.
Figura 8 – Frutos maduros da pimenta Capsicum baccatum L.
Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador
2.4. PROCESSO PATOLÓGICO: INFLAMAÇÃO
A inflamação caracteriza-se por um fenômeno complexo, dinâmico e multimediado, diferindo de espécie para espécie, na mesma espécie de um tecido para o outro e também no mesmo tecido, de acordo com o tipo de trauma ou estímulo (FERREIRA & VANE, 2002).
Pode ser definida como a reação do tecido vivo vascularizado à injúria local. A injúria representa um sem número de agressões de natureza diversa: química, fisiológica ou biológica (BECHARA & SZABÓ, 1989).
O processo inflamatório desenvolvido por um organismo consiste na resposta a um trauma, tendo como principal característica a de se manifestar de maneira esteriotipada, independente da natureza do agente agressor. A inflamação apresenta alterações morfofuncionais da microcirculação na área lesada envolvendo células, tecidos, vasos sanguíneos e linfáticos. A intensidade ou a persistência da injúria, características do órgão ou tecido atingido e a capacidade de reação do organismo vão desencadear as reações características do processo inflamatório (PEGORARO, 1994).
A inflamação tem como finalidade localizar o agente agressor, diluir, neutralizar, conforme a severidade, a duração e a natureza da agressão, desde seroso, catarral, purulento, fibrinoso até hemorrágico (DAVID et al, 2001).
Os componentes básicos de um processo inflamatório consistem em eventos celulares e humorais interdependentes que culminam com a reparação do tecido e a restauração da função. Tais componentes podem ser apresentados da seguinte forma: 1) estímulo lesivo ou trauma; 2) dano celular ou migração celular; 3) liberação e ativação de mediadores; 4) resposta tecidual; 5) reparo (SILVA et al., 2002).
(leucócitos circulantes) e macrófagos (realizam a fagocitose e liberam de espécies reativas do oxigênio) (MANTOVANI et al., 2007).
Os neutrófilos são granulócitos típicos da fase aguda da inflamação, com alto poder de diapedese, rápida velocidade de migração e a capacidade de provocar necrose tecidual pela liberação de suas enzimas lisossômicas. O rolamento de leucócitos é favorecido pela ação de selectinas, enquanto a adesão firme ao endotélio é proporcionado por integrinas (SCHWARTZ, 2007).
A resposta inflamatória envolve vários eventos celulares e a liberação de inúmeras substâncias químicas como enzimas e mediadores químicos, destacando-se: o óxido nítrico (SANCHAYITA; ABRAHAM, 2006; SCHMID-SCHÖBEIN, 2006; MARIOTTO et al., 2004; TSUCHIYA et al., 2007), a mieloperoxidase (ARATANI, 2006; ARATANI et al., 2006; KLEBANOFF, 2005; WINTERBOURN et al., 2006; HANSSON et al., 2006) e a adenosina-deaminase (ZAVIALO & ENGSTRÖM, 2005), além das citocinas (MANDERSCHEID et al., 2004; SCHMID-SCHÖBEIN, 2006) e quemocinas (SPEYER et al., 2004; SCHMID-SCHÖBEIN, 2006).
A enzima mieloperoxidase (MPO) é sintetizada principalmente por neutrófilos e células precursoras de monócitos e catalisa a produção de um metabólito com importante atividade microbicida, o ácido hipocloroso (HOCl). Esta enzima está intimamente relacionada com a proteção do hospedeiro (WINTERBOURN et al., 2006).
A adenosina–deaminase (ADA), outra enzima envolvida na inflamação, está envolvida no processo de catalisação da reação de desaminação da adenosina e 2-desoxiadenosina em inosina e desoxinosina, respectivamente. Estudos in vivo demonstraram a presença de pelo menos duas isoenzimas (ADA1 e ADA2), liberadas principalmente por macrófagos e
O óxido nítrico (NO) é outro mediador químico extremamente importante no processo inflamatório. O óxido nítrico é um gás incolor e estável, moderadamente solúvel em água, sua meia-vida é curta e é a molécula de secreção celular de mamíferos com menor peso molecular. A L-arginina e a L-citrulina são moléculas utilizadas por inúmeras células para produzir o óxido nítrico. O NO está envolvido com vários fenômenos como: vasorrelaxamento dependente do endotélio, citotoxicidade mediada por macrófagos, inibição da ativação, adesão e agregação plaquetária, relaxamento do corpo cavernoso peniano humano, regulação da pressão sanguínea basal, depressão sináptica a longo prazo, potencialização da transmissão sináptica a longo prazo, microcirculação medular e glomerular e prevenção de piloroespasmo em estenose pilórica hipertrófica infantil (CERQUEIRA & YOSHIDA, 2002).
Citocinas são substâncias pertencentes a uma família de peptídeos sintetizada por monócitos e linfócitos, cujas principais são a interleucina 1 (IL-1), o fator de necrose tumoral (TNF) (MONTENEGRO & FRANCO, 1996) e as quemocinas, como interleucina-8 (IL-8) em humanos e quemocina para neutrófilos, em camundongos (MANDERSCHEID et al., 2004).
O fator de necrose tumoral (TNF- ) liberado no local da inflamação promove a liberação de outros mediadores químicos e a ativação celular ocasionando na expressão de moléculas de adesão no endotélio e nos leucócitos (SEELY et al., 2003).
A interleucina (IL- ), liberada por macrófagos, atua próximo à célula onde foi liberada e possui atividade pró ou antiinflamatória. Promove sua ação através da ativação da liberação de TNF- pelos macrófagos, células endoteliais, linfócitos e fibroblastos e IL-6 por macrófagos e células hepáticas (HIETBRINK et al., 2006).
As quemocinas ligam-se a receptores com sete domínios transmembranares (C-X-CR1 e C-X-CR2) (DI CIOCCIO et al., 2004) e fazem a quimiotaxia de neutrófilos.
crônica, quando o estímulo lesivo ou modificado permanece por períodos relativamente longos, desencadeando grande proliferação celular, que não raramente levará a lesão funcional do órgão afetado (GARCIA LEME, 1979).
Figura 9 – Etapas do processo inflamatório: estímulo, aumento da permeabilidade vascular,
formação do edema e recrutamento de leucócitos . Fonte: Castardo, 2007.
A histamina e a serotonina, aminas vasoativas, são liberadas dos mastócitos e das plaquetas. A histamina é o primeiro mediador a atuar na inflamação aguda promovendo aumento da permeabilidade vascular e uma contração do endotélio venular com alargamento de junções celulares interendoteliais. A serotonina corresponde a um segundo mediador pré formado que possui ações semelhantes as da histamina (COTRAN et al., 1996).
O ácido araquidônico é uma substância precursora para várias moléculas, dentre elas: prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos e leucotrienos. As prostaglandinas originadas da conversão do ácido araquidônico agem como importantes substâncias vasodilatadoras. A liberação do ácido araquidônico ocorre pela estimulação específica de receptores da superfície celular promovendo a subseqüente ativação de fosfolipases A2 (CARVALHO et al., 1990) (Figura 10).
Prostanois, dentre eles as prostaglandinas e tromboxano A2, são produzidos pela via da ciclooxigenase e leucotrienos são produzidos pela via da 5-lipoxigenase, ambas iniciadas com a ação da fosfolipase A2 (YOSHIKAI, 2001) (Figura 10).
Dois tipos de COX são relatados: ciclooxigenase-1 1) e ciclooxigenase-2 (COX-2). A COX-1 é uma enzima constitucional presente em muitos tecidos e está envolvida na homeostase tecidual. A COX-2 é induzida em células inflamatórias e é considerada como sendo a enzima que produz os mediadores da inflamação da classe dos prostanois (FONSECA
et al., 2002).
As prostaglandinas constituem uma família complexa de derivados de ácidos graxos, sintetizadas por quase todas as células de mamíferos. Possuem efeitos intracelulares importantes em condições fisiológicas e patológicas (FONSECA et al., 2002). As prostaglandinas produzidas pela via da ciclooxigenase incluem prostaglandina E2 (PGE2),
prostaglandina D2 (PGD2), prostaglandina F2 (PGF2 ), prostaglandina I2 (PGI2) (COTRAN et al., 1996) (Figura 10).
Figura 10 – Geração dos metabólitos do ácido araquidônico e seus papéis na inflamação. Fonte:
Castardo, 2007.
A inflamação crônica é proveniente da ação de agentes infecciosos persistentes, exposição prolongada a agentes lesivos ou como manifestação de doença auto-imune. Esse tipo de inflamação manifesta-se de forma lenta, menos agressiva, de duração prolongada e muitas vezes, assintomática.
Na inflamação crônica é característica a infiltração de células mononucleares (linfócitos, plasmócitos e macrófagos) no tecido, destruição tecidual e fibrose.
As inflamações, tanto aguda como crônica, geram alterações teciduais e sistêmicas. As alterações teciduais principais são: inflamação serosa, fibrinosa, purulenta e úlcera. Os efeitos sistêmicos podem ser salientados como a produção de mediadores químicos, radicais livres de oxigênio e constituintes lisossômicos.
muitas outras doenças menores estimulam um processo inflamatório no organismo como resposta a traumas físicos ou alergias (FRANCO et al., 2007).
2.5. INFLAMAÇÃO EXPERIMENTAL
O estudo da reação inflamatória e o desenvolvimento de novas terapias e drogas sempre dependeram de modelos animais apropriados (DREUX, 2005).
Do ponto de vista laboratorial existem diversos métodos experimentais empregados na investigação do processo inflamatório. Estes modelos são bastante variáveis e analisam alguns aspectos do processo inflamatório, dentre os quais podemos citar (DREUX, 2005):
- os fenômenos vasculares precoces: dilatação, alterações de fluxo, dinâmica circulatória; - as alterações da permeabilidade vascular;
- o desenvolvimento de edemas;
- a pesquisa de fatores quimiotáticos e seu mecanismo; - os processos fagocitários;
- a análise química e farmacológica de exsudatos inflamatórios e perfusatos de áreas inflamadas, para a detecção de substâncias ativas (mediadores e enzimas);
- as alterações no sistema linfático: composição e fluxo da linfa; - os fenômenos dolorosos, sua produção e mecanismos;
- as alterações morfológicas globais, a natureza das células presentes, a extensão do infiltrado celular, a lesão final;
- os processos cicatriciais.
Neste trabalho, optou-se pelo modelo experimental de edema de pata induzido por carragenina, uma vez que essa técnica é de fácil execução e é considerado um bom modelo para avaliar o mecanismo de ação de plantas ou fármacos que possuem propriedades antiinflamatórias.
2.6. AGENTES ANTIINFLAMATÓRIOS
Os agentes antiinflamatórios são fármacos que atuam no processo de redução da inflamação inibindo a síntese e liberação de prostaglandinas (FONSECA et al., 2002). Várias substâncias são utilizadas como drogas antiinflamatórias, podendo ser citados os glicocorticoides, antiinflamatórios não-esteroidais (AINES) e fitoterápicos.
Os glicocorticoides têm sido considerados como agentes inibidores da produção de prostaglandinas, pela ação inibitória que exercem sobre a fosfolipase A2, liberando
lipocortina-1 (mediador proteico antiinflamatório). O resultado final da ação desses antiinflamatórios é a parcial ou total inibição da síntese e liberação dos mediadores pró-inflamatórios, através do sequestro do substrato fosfolipídico e/ou da inibição direta da enzima (FONSECA et al., 2002).
Os AINES inibem a conversão do ácido araquidônico em endoperóxidos cíclicos instáveis intermediários (prostaglandinas e prostaciclinas) envolvidos no processo inflamatório e na sensibilização das vias dolorosas centrais e periféricas catalisadas pela ciclooxigenase (FONSECA, 2007). Portanto, promovem sua ação antiinflamatória através da inibição da enzima ciclooxigenase (FONSECA et al., 2002).
medicamentos sintéticos, entretanto, o alto custo destes fármacos e os efeitos adversos apresentados contribuíram para o ressurgimento da fitoterapia.
Uma das primeiras substâncias utilizada como antiinflamatório, a salina, é um derivado glicosídico desenvolvido a partir de várias espécies de Salix e Populus que deu origem a vários derivados conhecidos como salicilatos. Desses salicilatos, o ácido salicílico merece destaque porque através de sua acetilação consegue-se o ácido acetilsalicílico, popularmente conhecido como aspirina. Este fármaco apresenta efeito inibidor não-seletivo das duas isoformas da COX, de inibição irreversível (FURST & MUNSTER, 2003).
Várias espécies de plantas medicinais têm sido empregadas como agentes antiinflamatórios, dentre elas: garra do diabo (Harpagophytum procumbens D.C.), agoniada (Plumeria bancifolia), malva (Sida cordifolia), salgueiro branco (Salix alba L.) e a erva baleeira (Cordiaverbenacea).
Estudos mostram que as pimentas do gênero Capsicum apresentam uma série de efeitos fisiológicos benéficos, mostrando-se excelente alimento nutracêutico, ou seja, é um alimento ou parte de um alimento que proporciona benefícios médicos e de saúde, incluindo a prevenção e/ou tratamento da doença. A pimenta apresenta intensa ação hipocolesterolêmica, antiinflamatória e antioxidante, e que estes efeitos parecem estar relacionados com a presença de capsaicinoides, vitaminas e polifenois (ALVES, 2006).
A pimenta está descrita como um alimento funcional (SURH, 1999) devido às propriedades antioxidante, antiinflamatória, antimutagênica e quimiopreventivo do vaniloide pungente (capsaicina) presente nas pimentas vermelhas (ANJO, 2004). Esta substância mostrou ser potente como inibidora da peroxidação lipídica por radicais livres (SURH, 1999). O gênero Capsicum é rico em compostos fenólicos, ácido ascórbico e capsaicinoides que conferem alto poder oxidante dessas espécies (DEEPA et al. 2006).
passagem de ar pulmonar induzido pela histamina. Adicionalmente, referências indicam que compostos bioativos presentes nos frutos das espécies de Capsicum inibem o crescimento do patógeno gástrico Helicobacter pylori, exercem atividade bactericida, promove ainda inibição da agregação plaquetária, efeito estimulante neural e diurético, além de aumentar a atividade adrenocortical e a produção do cortisol. Topicamente é usada para a alopecia, a neuralgia, a pleurite e a artrite reumatoide. As folhas são usadas como curativo em locais feridos e inflamados ocorrendo, porém, controvérsias na literatura quanto ao uso do fruto em inflamações agudas (BARCELOUX, 2009, PIRES et al., 2004).
Dentre os capsaicinoides, a capsaicina (Figura 2) e a dihidrocapsaicina são as mais abundantes e a primeira é largamente responsável pelas ações terapêuticas desses compostos, tais como: neuropatia diabética, osteoartrite, psoríase, neuralgia pós-herpética, cicatrização de feridas e câncer (WEI & ZHAO, 2008).
A capsaicina é um composto com fórmula molecular C18H27NO3 encontrado nas
sementes e nas membranas dos frutos do gênero Capsicum (GRÉGIO et al., 2008).
Os efeitos médicos da exposição à capsaicina resultam do período inicial de intensa excitação de nervos sensoriais aferentes primários seguido por um período prolongado de relativa resistência a estímulos nociceptivos químicos. Capsaicina reduz a transmissão dos impulsos dolorosos da periferia para o sistema nervoso central por esgotar substância P das fibras nervosas sensoriais de tipo C presentes no local (BUCK & BURKS, 1985). Sabe-se que a substância P serve de intermediária na transmissão dos impulsos dolorosos dos nervos periféricos para a medula espinhal. Assim, mesmo que a causa da dor continue presente, a percepção da dor não chega ao encéfalo.
Fisiologicamente, a capsaicina reduz a vasodilatação, dor e calor limiares, levando a uma diminiuição da sensibilidade à dor (WEINBERG, 1981). Repetidos contatos com capsaicina causa dessensibilização do efeito estimulatório sobre nervos sensoriais
3. OBJETIVOS
3.1. Geral
Avaliar o efeito antiinflamatório de uma formulação que contenha o extrato da espécie
Capsicum baccatum L.no processo inflamatório agudo, utilizando o modelo de edema de pata em ratos, induzido por carragenina.
3.2. Específicos
3.2.1. Identificação botânica do material e depósito de exsicata no Herbário Professor
José Badini da Universidade Federal de Ouro Preto;
3.2.2. Caracterização morfo-anatômica e histoquímica dos frutos de Capsicum baccatum; 3.2.3. Determinação de massa fresca, massa seca, porcentagem de água e teor de cinzas dos frutos de Capsicum baccatum L.;
3.2.4. Obtenção do extrato bruto da espécie Capsicum baccatum L. utilizando solventes orgânicos e seleção da fração desejada;
3.2.5. Realização de screening fitoquímico dos frutos de Capsicum baccatum L. a fim de investigar a presença dos principais metabólitos secundários, evidenciando os principais grupos;
3.2.6. Avaliar a concentração do metabólito capsaicina nos frutos de Capsicum baccatum
L. em três estádios de maturação;
3.2.7. Realizar o bioensaio de letalidade de Artemia salina Leach do extrato orgânico dos frutos de Capsicum baccatum L. a fim de avaliar a toxicidade aguda do extrato orgânico;
3.2.8. Determinar a atividade antioxidante do extrato bruto de Capsicum baccatum L. e sua relação com a concentração de compostos fenólicos;
3.2.10. Avaliar a atividade antiinflamatória in vivo do produto desenvolvido em modelo de edema de pata em ratos;
3.2.11. Avaliar a atividade analgésica in vivo do produto desenvolvido em modelo de contorções abdominais em ratos;
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Coleta do Material Vegetal
A espécie vegetal Capsicum baccatum foi coletada no distrito de Amarantina, município de Ouro Preto, localizado a 23 Km da sede do município. A amostra foi coletada em agosto de 2008. A identificação foi realizada pelo botânico Professor Doutor João Renato Stehmann da Universidade Federal de Minas Gerais e o material testemunho foi depositado no Herbário Professor José Badini da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).
Os frutos da pimenta dedo-de-moça foram coletados em três diferentes estádios de maturação: estádio imaturo (verde), intermediário (alaranjado) e estádio maduro (vermelha) (Figura 11).
Figura 11 – Frutos de Capsicum baccatum em diferentes estádios de maturação. A – frutos imaturos
(verdes) e maduros (vermelhos), B – frutos em estádio intermediário de maturação (alaranjados) e
maduros (vermelhos). Fonte: Arquivo pessoal dos pesquisadores.
4.2. Caracterização morfo-anatômica dos frutos
Os frutos colhidos foram levados para o Laboratório de Produtos Naturais (LAPPRONA) da Universidade Federal de Ouro Preto – MG, sendo selecionados e separados daqueles que apresentavam deformações ou ataques de fungos e insetos.
A contagem de número de sementes por fruto foi realizada com uma amostra de 50 frutos.
Para a descrição da morfologia interna e externa foram utilizados 100 frutos, escolhidos aleatoriamente. As observações, quando necessário, foram feitas com o auxílio de uma lupa. Observou-se nos frutos o tipo, a coloração, textura e consistência do tegumento. As características internas observadas foram o tipo de placentação, pericarpo e o número médio de sementes. O diâmetro e a altura dos frutos foram medidos utilizando uma régua de 30 centímetros de comprimento.
4.3. Caracterização histoquímica dos frutos
GRIFFIN, 1971) para lactonas sesquiterpênicas, vanilina clorídrica (MACE & HOWELL, 1974) para taninos, ácido tânico associado a cloreto férrico (PIZZOLATO & LILLIE, 1973) para mucilagens e azul brilhante de Comassie (FISCHER, 1968) para proteínas. As imagens foram analisadas no Microscópio Leica DM5000B e capturadas em programa Leica Application Suite.
4.4. Determinação de massa fresca, massa seca, porcentagem de água e teor de cinzas totais dos frutos de Capsicum baccatum L.
As análises farmacognósticas foram realizadas segundo as especificações da Farmacopéia Brasileira, IV edição (1988). Após a retirada das sementes e das membranas internas dos frutos, os testes de determinação de água e cinzas totais foram realizados usando-se quatro repetições para cada tratamento.
Para a realização do teste de determinação de água foi utilizada a metodologia de Gravimetria, que consiste em pesar aproximadamente 5,0 gramas do material vegetal fragmentado em pesa-filtro, previamente tarado e dessecado por cerca de 30 minutos a temperatura de 105ºC. O material pesado foi acondicionado em estufa de ventilação forçada da marca TECNAL (modelo TE-394/I), pré aquecida por 30 minutos em temperatura de 105ºC, durante 5 horas. Após o intervalo de 5 horas, o material foi retirado da estufa de ventilação forçada, resfriado em dessecador por 1 hora à temperatura ambiente e pesado. O processo foi repetido até que o material apresentasse peso constante.
contendo as cinzas foram resfriado em dessecador e pesados. Para os cálculos da determinação de água e de cinzas totais, foi utilizado o programa SAEG for Windows 2009. Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA – one way) e teste de média (Tukey) com grau de significância p 0,05, utilizando o programa SAEG for Windows 2009, adaptado ao modelo estudado.
4.5. Preparo dos extratos
Os extratos orgânicos de Capsicum baccatum L. foram confeccionados de acordo com a metodologia de Perucka et. al. (2000). Os frutos foram selecionados, higienizados, particionados, as sementes retiradas e as placentas maceradas com o solvente orgânico acetona.
Os frutos foram extraídos em três estádios diferentes de maturação: imaturo (verde), intermediário (alaranjado) e maduro (vermelho).
A metodologia de extração utilizada foi a maceração exaustiva, por um período de 7 dias. Os extratos obtidos foram filtrados e concentrados em evaporador rotativo (BÜCHI R-114) a 40ºC. Depois de concentrados os extratos foram secos e os solventes deixados evaporar à temperatura ambiente.
4.6. Estudo Fitoquímico dos extratos
A pesquisa de alguns metabólitos secundários foi realizada através da metodologia de cromatografia em camada delgada (CCD), dentre eles as classes: alcaloides, flavonoides, terpenos e triterpenos, pela metodologia adaptada de Wagner (1984).
2mg/100µL. Todos os extratos foram eluídos com quatro repetições para cada estádio de maturação.
A detecção de terpenos e triterpenos consistiu em eluir os extratos acetônicos em clorofórmio:etanol:ácido acético (94:5:1) e utilizar como revelador vanilina sulfúrica. Os padrões usados para a pesquisa de terpenos e triterpenos foram timol, saponina e linalol (SIGMA ALDRICH) aplicados na concentração de 2mg/100µL. Todos os extratos foram eluídos com quatro repetições para cada estádio de maturação.
A detecção de flavonoides foi realizada eluindo os extratos acetônicos em acetato de etila:ácido fórmico:ácido acético:água (20:2:2:6) e as placas foram reveladas com vanilina sulfúrica. O padrão usado para a pesquisa de flavonoides foi a quercetina aplicada na concentração de 2mg/100µL. Todos os extratos foram eluídos com quatro repetições para cada estádio de maturação.
4.7. Quantificação dos constituintes fenólicos totais
4.8. Atividade antioxidante
A medida da atividade antioxidante foi realizada pelo método fotocolorimétrico in vitro
do radical livre estável 2,2-difenilpicrilidrazila (DPPH) adquirido da SIGMA ALDRICH (lote S43654-357), segundo adaptação da metodologia de Vicentino et al. (2007). O método consiste em utilizar 2,5 mL de soluções de amostras dos extratos nas concentrações de 5, 10, 25, 50, 125 e 250 µg/mL e adicionar 1 mL de uma solução de DPPH a 0,3 mM em etanol. A solução de DPPH em etanol é utilizada como controle negativo, o etanol como branco e como controle positivo o butilhidroxianisol (BHA) adquirido da SYNTH (lote: 105904), que possui alta capacidade antioxidante. Após trinta minutos da adição do DPPH, leituras das amostras foram feitas a 518 nm no espectrofotômetro FEMTO 800 XI. A atividade sequestrante de radicais livres (ASRL) foi expressa em porcentagem em comparação ao controle, butilhidroxianisol(BHA), nas mesmas diluições das amostras, segundo a equação:
%ASRL = Ac – At x 100
Ac
Onde, Ac: absorbância do controle e At: absorbância teste (amostra)
4.9. Quantificação de capsaicina nos extratos orgânicos obtidos dos frutos de Capsicum baccatum em três estádios diferentes de maturação
A capsaicina foi quantificada pela adaptação do método de Perucka et.al. (2000). O método consiste em utilizar a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para a determinação da quantidade de capsaicina presente em extratos orgânicos de Capsicum. Primeiramente o método foi validado de acordo com as normas da Resolução nº 899 (29/05/2003), “Guia para a Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos” da ANVISA (BRASIL, 2003), que consiste em determinar a especificidade, linearidade, robustez, limite de quantificação, precisão e exatidão de uma metodologia analítica. Após a validação do procedimento, a capsaicina foi quantificada em extratos orgânicos (acetônicos) dos frutos de
Capsicum baccatum L. em três diferentes estádios de maturação, a fim de verificar em qual estádio de desenvolvimento do fruto esse capsaicinoide encontra-se em maior concentração. O cálculo da concentração desse capsaicinoide nos extratos foi realizado pela construção da curva padrão com diferentes concentrações (10, 25, 50, 100, 200, 400 e 500 µg/mL) do padrão de capsaicina (SIGMA ALDRICH, lote: 045K7031) Os ensaios foram realizados utilizando-se quatro replicatas. Através da curva padrão foi calculada a reta da curva para os cálculos de concentração. Os cálculos foram realizados através de regressão linear simples empregando-se o programa Excel for Windows 2007.
4.10. Teste antifúngico
Os ensaios foram realizados com o extrato bruto acetônico imaturo (verde) dos frutos de
Capsicum baccatum em concentrações que variaram de 1µg/mL a 512µg/mL. Os antifúngicos azólicos cetoconazol e fluconazol solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO) foram utilizados como padrões positivos nas concentrações que variaram de 0,0625 µg/mL a 32 µg/mL e 0,125 µg/mL a 64 µg/mL, respectivamente. As quatro espécies de Candida usadas para o teste foram cepas adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC), sendo determinadas como: Candida albicans (ATCC18804), Candida tropicalis (ATCC750),
Candida parapsilosis (ATCC22019) e Candida krusei (ATCC6258).
Para a obtenção do inócuo, as cepas foram repicadas em meio de cultura Ágar Sabouraud dextrose e incubadas a 35ºC em estufa bacteriológica por 24h.
Para assegurar a reprodutibilidade dos ensaios, a quantidade de inócuo foi padronizada pela comparação visual dos inócuos em salina e da escala 0,5 McFarland. Com uma agulha de platina esterilizada, transferiram-se culturas de 24 h de leveduras para tubos contendo 2 mL de solução de cloreto de sódio a 0,85%. Segundo os critérios do CLSI, foram efetuadas diluições sucessivas em tubo no caldo RPMI 1640, obtendo-se uma quantidade final de inóculo de 1,2 x 103 UFC/mL.
Com a utilização de uma agulha de platina esterilizada, foram transferidas culturas de 24 h das leveduras cultivadas em ágar Sabouraud dextrose para o meio de cultura líquido RPMI 1640. Foram utilizadas microplacas com 96 orifícios e cada orifício recebeu o inóculo, o meio de cultura e as soluções dos extratos diluídos, de tal forma que o volume final fosse de 100 µL. Para o controle da metodologia foram realizados os controles: esterilidade do caldo RPMI 1640, inóculo, o qual apresentou crescimento total devido à ausência do controle positivo, esterilidade dos extratos brutos, bem como dos padrões positivos e negativos.
4.11. Determinação da bioletalidade frente a Artemia salina
O bioensaio com Artemia salina foi baseado na técnica descrita por Meyer et.al.(1982). Neste ensaio biológico foram utilizadas larvas de Artemia salina Leach, obtidas a partir da incubação de cerca de 20mg do extrato bruto de Capsicum baccatum L.de todas as amostras, nas quais foram solubilizados em 2mL de solvente apropriado e dessa solução amostras de 5, 50 e 500 µL foram transferidas, em quatro repetições, para frascos de 5 mL. Após a remoção total do solvente, uma solução salina (0,38g/L, 5mL) foi adicionada a cada um dos frascos resultando em concentrações finais de 10, 100 e 1000 µg/mL, respectivamente. Os cistos de
A. salina (20mg) foram incubadas sob luz artificial por 48 horas para que as larvas (metanáuplios) eclodissem. Sete grupos de 10 a 13 metanáuplios foram expostos a diferentes concentrações (50µm/mL a 1000µg/mL) dos extratos em acetona de Capsicum baccatum L. O primeiro grupo recebeu solução salina, três grupos receberam diferentes concentrações dos extratos e um grupo recebeu o lapachol, que funcionou como controle positivo. As amostras foram submetidas à luz artificial durante 24 horas, sendo contabilizadas após esse período as larvas vivas e as larvas mortas. Cada ensaio foi realizado quatro vezes. Os dados foram analisados através do método de Probit (FINNEY, 1962).
4.12. Desenvolvimento da formulação fitoterápica
A extração de capsaicina do xarope, para sua quantificação na formulação, foi realizada de acordo com a metodologia adaptada da Farmacopeia Japonesa – 14ª edição (2001) e consistiu em acrescentar a 0,5mL de xarope contendo o extrato de Capsicum baccatum, 30mL de metanol e agitar durante 15 minutos. Centrifugar durante 30 minutos e separar o sobrenadante. Acrescentar ao resíduo 10mL de metanol, agitar durante 5 minutos e centrifugar por 15 minutos. Repetir esse processo até que o líquido sobrenadante complete 50mL, sendo essa solução usada para teste.
Para a determinação da capsaicina no xarope foi utilizada a metodologia de Perucka et.al. (2000) adaptada, conforme citado na página 30.
4.13. Testes de atividade farmacológica da formulação farmacêutica
Para avaliar as atividades analgésica e antiinflamatória do xarope de Capsicum baccatum foram realizados dois testes farmacológicos: teste de contorções abdominais com ácido acético e teste de edema de pata induzido por carragenina.
4.13.1. Animais utilizados nos testes
Foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar, adultos, pesando entre 150 e 250g, acondicionados em gaiolas individuais de polietileno convencionais (Figura 12), em condições de temperatura controlada (22ºC a 28ºC), ciclo de luz controlado (período de luz de 6:00h às 18:00h) e receberam água e ração ad libitum. As gaiolas ficaram acondicionadas na área experimental do Laboratório de Biofármacos na Universidade Federal de Viçosa (UFV).
grupo 4 (tratado com formulação na concentração 300mg/Kg de peso), grupo 5 (tratado com formulação na concentração 600mg/Kg de peso), grupo 6 (tratado com formulação na concentração de 1000mg/Kg de peso) e grupo 7 (controle tratado com medicamento referência – Nimesulida 300mg/Kg de peso).
Figura 12 – Rato Wistar macho adulto acondicionado em gaiola individual de polietileno. Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador
4.13.2. Aprovação pelo Comitê de Ética
4.13.3. Teste de contorções abdominais
O teste de contorções abdominais foi realizado de acordo com a metodologia de Kosper
et.al., 1959. O xarope de Capsicum baccatum foi administrado por gavagem, uma hora antes da aplicação intraperitonal da solução de ácido acético 0,6% em salina (Figura 13). As doses administradas foram de 100mg/Kg, 300mg/Kg, 600mg/Kg e 1000 mg/Kg de peso do rato (n=6). Uma hora após o tratamento foram administrados 10mL/Kg de peso do rato de ácido acético 0,6% em salina por via intraperitoneal em cada rato, e o número de contorções contado entre 10 e 30 minutos após este procedimento. O grupo não tratado recebeu 0,5mL de salina, o grupo controle recebeu 0,5mL de base do xarope. A nimesulida (fármaco referência) foi solubilizada em propilenoglicol, sendo administrado por gavagem na concentração de 300mg/Kg de peso do rato. Cinco minutos depois da administração da solução de ácido acético (0,6% em salina), a contagem do número de “Writhings” (contorções abdominais) foi determinada para cada grupo, permitindo calcular a porcentagem de inibição para cada dose (SOARES, 2006).
Figura 13 – Experimento de contorções abdominais. A- Administração por gavagem do xarope de Capsicum baccatum. B- Administração intraperitonial de solução de ácido acético 0,6% em salina.
Fonte: Arquivo pessoal dos pesquisadores.
4.13.4.Teste de edema de pata induzido por carragenina
O edema de pata foi induzido pela administração subplantar de 0.1 mL de uma solução a 1% de carragenina (p/v) diluída em solução salina 0.9% na pata direita traseira de cada rato. Foi feita a administração de salina (cloreto de sódio 0,9%) na pata esquerda traseira de cada animal para ser utilizada como controle (Figura 14). Uma hora antes da injeção da carragenina, o primeiro grupo recebeu nimesulida na dosagem de (300mg/Kg de peso) por via oral, droga antiinflamatória não esteroidal, utilizada como padrão do teste. Os grupos experimentais, também uma hora antes da administração da carragenina, receberam o xarope de Capsicumbaccatum L. nas concentrações de 100, 300, 600 e 1000 mg/Kg de peso (Figura 14). A espessura da inflamação foi mensurada imediatamente e em intervalos de 1, 2, 3 e 4 h após a administração da carragenina com o auxílio de um paquímetro digital 150mm Profissional Western (Dai et al., 2002; Kweifio-Okai, 1991; Nkeh et al., 2003; Inverno et al., 1962; Jovem et al., 2005). O edema produzido nas patas de cada animal foi determinado pela diferença entre as medidas das patas direita e esquerda (MOREIRA, 2008).
O aumento percentual das patas foi calculado através da expressão: E(%) = Tf – To x 100
To
Onde: E(%) = aumento percentual do tamanho da pata To = tamanho inicial da pata
Tt = tamanho da pata após injeção de salina ou carragenina
Figura 14 – Experimento de edema de pata induzido por carragenina. A- Administração por gavagem do xarope de Capsicum baccatum L. B- Administração subplantar de carragenina.
C – Medição do edema de pata com auxílio de paquímetro. Fonte: Arquivo pessoal dos pesquisadores.
4.13.4.1. Histologia do edema de pata
A análise histológica foi realizada para confirmar o efeito antiinflamatório da formulação-teste desenvolvida com o extrato dos frutos verdes de Capsicum baccatum L.
Para o estudo histológico do edema de pata foram realizadas biópsias das patas dos animais dos grupos controle e dos grupos tratados. Ao término da 4ª hora do experimento de edema de pata induzido por carragenina, os animais foram sacrificados, o músculo plantar foi retirado para análise histológica e os fragmentos dos tecidos foram fixados, durante 48 horas, em solução de formol neutro tamponado (pH 7,2) a 10%. Após fixação, os fragmentos foram desidratados em soluções alcoólicas crescentes (70%, 80%, 90% e 100%). Posteriormente, foram diafanizados em xilol e incluídos em parafina. Cortes histológicos seriados de 4µm de espessura foram realizados em micrótomo de rotação e corados em hematoxilina-eosina (HE).
As lâminas foram analisadas com auxílio de luz binocular (Leica DM5000B). As leituras das lâminas foram realizadas em três animais diferentes para cada grupo analisado e as lesões microscópicas foram descritas de forma qualitativa, de acordo com a sua manifestação. As imagens foram capturadas com auxílio do programa Leica Application Suite.
4.13.5. Protocolo de anestesia
Para a realização da coleta das patas traseiras dos animais, os mesmos foram anestesiados com 0,05 mL de cloridrato de Xilazina mais 0,05 mL de Ketamina (10mg/Kg) injetados intraperitonialmente para a dissecação muscular e exposição do tórax. Após a coleta de sangue e a retirada das patas posteriores, os animais, ainda anestesiados, foram eutanaziados por exsanguinação ou por injeção intracardíaca de cloreto de potássio, quando necessário.
4.14. Análises estatísticas
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Identificação do material botânico
As plantas medicinais tem sido uma rica fonte para a obtenção de moléculas obtidas com ação terapêutica. Para a obtenção dessas moléculas, vários passos são requeridos, começando com a identificação correta e sistemática do material vegetal utilizado (identificação botânica).
Para o desenvolvimento desse trabalho, a espécie utilizada foi Capsicum baccatum L. (Figura 15) e o material testemunho foi depositado no Herbário Professor José Badini da Universidade Federal de Ouro Preto sob a denominação: OUPR 23178 (figura 16).
Figura 15 – Capsicum baccatum L. A – folhas e frutos. B – flor. C – fruto maduro.
Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
