FORMULÁRIO PARA INSCRIÇÃO DE PROJETO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA.
Coordenação/Colegiado ao(s) qual(is) será vinculado: BIOMEDICINA Curso (s) : BIOMEDICINA
Nome do projeto: IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS PRESENTES NA CONTAMINAÇÃO DE CULTURAS IN VITRO DE TECIDOS VEGETAIS.
Nome do professor orientador: ALEXANDRE DREFAHL Nome do professor coorientador:
Nome do coordenador(a) do Curso: SIMONE MOREIRA
Para a Fundação Educacional Regional Jaraguaense – FERJ, mantenedora do Centro Universitário - Católica de Santa Catarina em Jaraguá do Sul e em Joinville, encaminhamos anexo, Projeto de Iniciação Científica a ser submetido ao Edital nº .../2018 Programa de Bolsas de Estudo da Educação Superior – UNIEDU, da Secretaria de Estado da Educação de Santa Catarina, e declaramos nosso interesse e prioridade conferida ao desenvolvimento do projeto ora proposto, assim como nosso comprometimento de que serão oferecidas as garantias necessárias para sua adequada execução, incluindo o envolvimento de equipe, utilização criteriosa dos recursos previstos e outras condições específicas definidas no formulário anexo.
__________________, ____ de ___________ de 2018
_____________________________________ _______________________________________
Professor orientador Professor coorientador Alexandre Drefahl
2 – DESCRIÇÃO DO PROJETO
Orientações para organização do texto( projeto): Fonte: Times New Roman ou Arial, 12. Espaçamento entre linhas simples, o texto deverá estar justificado. Todos os autores deverão estar corretamente citados no texto e descritos nas referências.
Título do Projeto:
IDENTIFICAÇÃO DE microrganismoS PRESENTES NA CONTAMINAÇÃO DE CULTURAS IN VITRO DE TECIDOS VEGETAIS.
Tipo de Projeto ( 12 meses ) (X) Apresentado pelo professor;
Resumo do Projeto
A cultura de tecidos vegetais auxilia muitas áreas de atuação da agricultura: silvicultura, agricultura, floricultura, plantas medicinais, transformação genética, entre outras. Esta técnica já é reconhecida como ferramenta indispensável para o agronegócio moderno.
Entretanto, um obstáculo é inevitável à aplicação desta ferramenta: a assepsia do explante vindo do campo e a manipulação asséptica das plântulas durante todo seu ciclo. Em um grande número de casos o material vegetal disponível para propagação está em quantidade reduzida, ou pode ser fornecido por uma única planta matriz selecionada.
Nestes casos toda e qualquer estratégia para eliminação ou até mesmo controle destes microrganismos é válida. Tal estratégia só pode ser traçada quando se conhecem os microrganismos envolvidos. Este é o objetivo deste projeto de pesquisa: identificar os tipos mais comuns de contaminantes biológicos e suas estratégias de controle.
Texto limitado em até 200 palavras
Problematização (Problema de pesquisa)
Um dos maiores problemas da produção em escala comercial é a contaminação do meio nutritivo por fungos e bactérias durante as etapas de propagação in vitro. A contaminação estabelece-se no meio de cultura e/ou material vegetal competindo pelos nutrientes, produzindo substâncias tóxicas e inibindo o desenvolvimento do explante, ocasionando, assim, sua perda. Sem dúvida é o principal tópico quando se fala em eficiência na cultura de tecidos vegetal. É necessário que se conheçam os principais tipos de contaminantes microbiológicos para que se possa traçar uma estratégia de controle, identificando sua fonte. As mais comuns são o próprio tecido vegetal, além dos processos de manipulação e esterilização dos instrumentos. Neste sentido este projeto de pesquisa tem como objetivo identificar os principais contaminantes presentes na cultura de tecidos in vitro, classificando-os quanto à sua fonte mais comum. De posse destas informações gerar um material visual que permita a fácil identificação dos microrganismos envolvidos bem como as correções necessárias no processo para se possam controlar estas fontes de contaminantes.
Texto limitado a 20 linhas
Justificativa (descrever o problema de pesquisa e sua importância científica , tecnológica e sócio- econômico-ambiental para a região )
Um dos princípios básicos para o sucesso da cultura de tecidos é a obtenção e manutenção de culturas assépticas. Isso depende, em parte, de medidas de controle e prevenção da contaminação microbiana (Leifert et al., 1994; Silva et al., 2003). A técnica de cultura de tecidos vegetais, ou micropropagação como também é conhecida, proporciona um ambiente favorável para o crescimento de microrganismos como
bactérias, leveduras e fungos filamentosos (Dantas et al., 2002). Os microrganismos que causam as contaminações competem com os explantes pelos nutrientes do meio de cultura, eliminando no meio metabólitos tóxicos, que podem ocasionar a morte da plântula (Pereira et al., 2003). O protocolo de micropropagação é o resultado da sequência de fases ou etapas, e cada uma depende do sucesso da anterior, portanto é indispensável uma eficiente assepsia dos explantes, meio de cultura e materiais a serem utilizados (George, 1993). O monitoramento das culturas sob o aspecto da contaminação, deve ser constante pois é o principal fator que pode tornar uma cultura inviável economicamente.
Como a micropropagação tem sido uma ferramenta de difusão de novas cultivares principalmente para a agricultura familiar, o sucesso desta técnica traz benefícios potenciais aos pequenos agricultores. Por meio das biofábricas passam a ter acesso a novas variedades melhores e mais produtivas, que de outra forma não chegariam ou tardariam a estar disponíveis em suas propriedades.
Texto limitado a 20 linhas
Objetivo Geral: ( Onde estamos....Onde queremos chegar.)
Este trabalho tem o objetivo de criar uma cartilha ilustrada para a identificação facilitada dos principais microrganismos contaminantes da cultura de tecidos vegetais in vitro.
Texto limitado a 05 linhas
Objetivos específicos ( Etapas que devem ser cumpridas para se atingir o objetivo geral.)
Levantamento bibliográfico sobre o tema, relacionado com a cultura de tecidos vegetais;
Selecionar visualmente os tipos de contaminantes mais frequentes;
Coletar amostras dos contaminantes mais frequentes para isolamento de cultura;
Isolar e crescer as culturas selecionadas;
Identificar os microrganismos isolados a fim de classificá-los, pelo menos, em nível de gênero.
Revisar bibliografia a fim de caracterizar as fontes mais prováveis destes microrganismos;
Elaborar uma cartilha de identificação por critérios visuais dos microrganismos com as informações obtidas;
Elaboração de artigo científico para publicação.
Texto limitado a 15 linhas
Metodologia (Descrição dos procedimentos, instrumentos( questionários, formulários, entrevistas, softwares), técnicas e materiais(equipamentos) a serem utilizados na execução do projeto).
Os experimentos serão conduzidos em parte no laboratórios da Clona-Gen Biotecnologia Vegetal sediada no município de Joinville-SC e no laboratório de microbiologia do Centro Universitário Católica de SC em Joinville.
Seleção do material contaminados
Semanalmente é realizada uma revisão de qualidade nas salas de crescimento da empresa Clona-Gen com o intuito de descartar material vegetal contaminado, seja por fungo, bactéria ou oxidação. Dentre estes frascos rejeitados serão selecionados os fungos e bactérias distintos mais frequentes.
Os frascos selecionados serão classificados quanto à fonte mais provável da contaminação: material vegetal, limpeza dos frascos/tampas, meio de cultura,
instrumentação. Esta classificação é possível pois o padrão de início da contaminação permite que se faça esta inferência.
Registro das características morfológicas
O desenvolvimento das colonias bacterianas e fúngicas crescidas em meio de cultura de MS serão observadas para que sejam registradas a sua forma, tamanho, cor, elevação, bordas. Serão observadas também a quantidade de microrganismos diferentes desenvolvidos em um mesmo frasco. Serão registradas também características do meio de cultura afetado por estes microrganismos tais como turvação, sedimentação (em caso de meios líquidos, película superficial, troca de coloração, alterações no padrão de solidificação.
Isolamento de Culturas
Os diferentes microrganismos identificados, serão isolados em culturas puras para crescimento de colonias individuais. Este cultivo permitirá aumentar a quantidade de material a ser analisado bem como separará os diferentes grupos de organismos a serem identificados. Rotineiramente, os meios de cultura mais utilizado para o isolamento de fungos e bactérias contaminantes tem sido o BDA – Batata dextrose e ágar, o AN – ágar nutriente, respectivamente. Mas diversos outros meios ou formulações, como o 523, Triptic Soy Agar (TSA 10%), Triptic Soy Broth (TSB 5%), ou mesmo formulações mais pobres como o ágar-água podem ser usados para crescimento bacteriano ou fúngico.
Dependendo do tipo de microrganismo que se quer isolar, o meio deve ter determinadas características; normalmente para fungos o pH deve ser mais ácido (entre 5 e 6), enquanto para as bactérias a alcalinidade é mais desejada. Assim dependendo o organismo os meios necessitarão de ajustes.
A forma di reta é a mais comumente utilizada nos trabalhos visando a identificação e o controle de microrganismos contaminantes in vitro. A técnica consiste em isolar os microrganismos logo após a comprovação visual do crescimento do contaminante. Com o auxílio de uma alça ou palito esterilizado, colhe-se uma amostra do material contaminante inoculando-o em um meio de cultura enriquecido (ME), como o ágar nutriente (AN), sendo em seguida colocado para crescer em temperatura de 28°C a 30 °C. Uma vez crescido, esse material poderá ser utilizado para a etapa seguinte, ou seja, de purificação das colônias bacterianas.
Purificação dos contaminantes
Uma vez isolados os contaminantes, o crescimento da colonias em meio de cultura enriquecido normalmente não ultrapassa cinco dias. A partir de então, com as colônias desenvolvidas, realiza-se a purificação deles, já que na maioria das vezes pode haver mais de uma espécie contaminante. As colônias são purificadas, tendo como critério as características morfológicas e microscópicas distintas dos isolados. As colônias selecionadas sofrem purificação pela técnica de esgotamento por estrias, no mesmo meio em que são repicadas para crescimento. O número de subcultivos (repicagens) é variável
e deve ser feito até que se obtenham colônias puras, comprovadas. Após os subcultivos, as colônias isoladas podem ser repicadas para tubos de ensaio com 20 mL de meio inclinado e armazenadas por curtos períodos de tempo a 4 °C.
Conservação até possível identificação
Uma vez isolado um microrganismo, é desejável e, às vezes necessário conservá-lo em laboratório para identificação, estudo ou uso no futuro. São várias as técnicas empregadas, e a escolha dependerá do tipo (gênero, espécie, grupo, subgrupo, raça, cepa, etc.) e do número de microrganismos diferentes, do tamanho do laboratório de microbiologia, das disponibilidades material e humana, bem como dos recursos financeiros disponíveis e da qualificação dos técnicos, entre outros fatores (GHERNA, 1995).
Identificação dos microrganismos
Após a etapa de purificação das colonias tanto de fungos quanto bactérias, o material deverá ser identificado utilizando as técnicas mais adequadas para cada grupo de microrganismos. Uma revisão bibliográfica fornecerá as informações necessárias para a seleção dos procedimentos adequados em cada caso. A identificação poderá ser feita por critérios visuais (macro e microscópicos), determinação da forma celular, coloração de Gram, coloração de Wirtz (esporos), EPM (ácido,e gás de glicose, urease, L-triptofano), Mili (motilidade, indol, lisina), utilização de citrato, fontes de carbono, testes de oxidação/fermentação, hidrólise de amido, hidrólise de gelatina, temperatura de crescimento, crescimento em NaCl 5%, crescimento em diferentes pHs, catalase, oxidase, produção de indol, redução de nitratos, reações de Voges-Proskauer, entre outras.
Montagem do material gráfico para identificação simplificada
Com base nas informações obtidas nas etapas anteriores e com um grupo seleto de organismos espera-se ser possível reunir características marcantes de cada um dos contaminantes de modo a permitir a criação de uma cartilha de identificação simplificada.
O objetivo é com base em características morfológicas e hábitos de crescimento, seja possível a identificação dos microrganismos envolvidos na contaminação dos explantes.
Por meio de diagramação de textos e imagens criar material gráfico intuitivo e e de fácil manipulação pelos técnicos de laboratório.
Texto limitado em 02 páginas Fundamentação Teórica
A Biotecnologia
A biotecnologia consiste na aplicação, em grande escala ou na transferência, para a indústria, dos avanços científicos e tecnológicos. Embora a palavra biotecnologia tenha sido usada a primeira vez em 1919, por um engenheiro agrícola da Hungria, as primeiras aplicações biotecnológicas pelo ser humano datam de 1800 a.C., com o uso de leveduras (organismo vivo) para fermentar vinhos e pães (produtos); desde então, o conceito de biotecnologia tem sido aplicado ao longo do tempo. O crescimento acelerado do campo da biotecnologia, entretanto, ocorreu a partir da década de 70, com o desenvolvimento da
engenharia genética ou tecnologia do DNA recombinante. No que diz respeito à procura por tecnologias consideradas produtivas, foram alcançados, no mundo, avanços altamente significativos no uso da biotecnologia moderna, entendida como um conjunto de técnicas, que inclui transgenia, processos enzimáticos, clonagem, micropropagação, métodos de fecundação in vitro e outros. Agricultores e agroindustriais de vários países vêm usando recursos oferecidos pela biotecnologia para resolver problemas de eficiência e qualidade de produtos além de processos produtivos. Com suas técnicas específicas, a biotecnologia modifica e melhora os sistemas biológicos. É reconhecida a base do futuro da agricultura e, lógico, da própria humanidade; seu uso elimina as barreiras biológicas normais, possibilitando a reprodução de plantas de difícil propagação, além da criação de plantas transgênicas (Carvalho, 1999).
O cultivo in vitro permite o crescimento e multiplicação de células, tecidos, órgãos ou partes de órgãos de uma planta, sobre um meio nutritivo e em condições assépticas e ambientais (iluminação e temperatura) controladas. Esta técnica se baseia principalmente no aproveitamento da totipotência das células vegetais, ou seja, na capacidade de produzir órgãos (organogênese) ou embriões que originarão uma planta inteira (embriogênese somática) em um meio de cultivo favorável (Carvalho, 2000).
Micropropagação
A micropropagação é um método de propagação vegetativa amplamente estudado em diversas espécies vegetais, sendo a modalidade dentro da cultura de tecidos que mais se tem difundido e encontrado aplicações práticas comprovadas. Entre as vantagens de sua utilização, estão as possibilidades de se obter várias plantas a partir de um único explante inicial, independentemente de condições climáticas; redução do tempo e da área necessária à propagação da espécie; melhores condições sanitárias por meio do cultivo de meristemas previamente tratados por termoterapia, para eliminação de doenças;
reprodução do genótipo da planta-mãe, geralmente com fidelidade durante a multiplicação e a propagação vegetativa de espécies difíceis de serem propagadas por outros métodos (Erig; Schuch, 2005).
A micropropagação constitui um modo de se manter sempre disponíveis explantes sadios e livres de contaminação para aplicação de técnicas de regeneração por cultura de tecidos e transformação genética, além de ser altamente conveniente para manutenção de coleções de plantas de genótipos diferentes, livres de patógenos (Cabral et al., 2003).
A micropropagação tem sido realizada com sucesso em espécies hortícolas, ornamentais, frutíferas, medicinais e mais recentemente em espécies florestais (Nunes, 2005). A partir de uma planta de bananeira, por exemplo, podem ser obtidas através da micropropagação aproximadamente 1000 mudas, no prazo de oito meses. Em condições de campo são obtidas até 12 mudas no mesmo período. Quanto às orquídeas, leva-se cerca de dois anos para a obtenção de uma boa muda utilizando-se os métodos convencionais enquanto que, através do cultivo in vitro de meristemas, é possível a produção de centenas de mudas nesse mesmo período de tempo (Willadino e Câmara, 2005).
Fatores que Influem na Micropropagação
Murashige (1974) apresentou o conceito de três estágios de desenvolvimento no processo de propagação in vitro. No primeiro ocorrem a seleção dos explantes, desinfestação e cultura em meio nutritivo, sob condições assépticas, enquanto no segundo ocorre a multiplicação dos propágulos, mediante sucessivas subculturas em meio próprio para multiplicação e o terceiro é caracterizado pela transferência das partes aéreas produzidas para meio de enraizamento e subsequente transplante das plantas obtidas para substrato ou solo. Nesta fase, a planta fica mais suscetível ao estresse hídrico e ainda passa de uma existência heterotrófica para um estado autotrófico. Além dos fatores apontados por Murashige ainda podem ser destacados como fatores influenciadores do sucesso da multiplicação in vitro: Desinfestação inicial, a Contaminação, a Oxidação, o Meio de cultivo, e os Reguladores de crescimento.
Seleção de explantes
A princípio, qualquer tecido é capaz de expressar a totipotência, ou seja, a capacidade de desdiferenciação celular, que permite a formação de uma planta inteira, a partir de uma única célula. Geralmente, para se iniciar o cultivo in vitro são utilizados explantes de tecidos jovens com tamanhos que podem variar de 0,2 a 20 mm ou mais. Em geral, o tamanho do explante está relacionado com o objetivo do trabalho, devendo ser o menor possível quando se trata de se obter a limpeza clonal. Por outro lado, o tamanho do explante determina suas chances de sobrevivência e desenvolvimento (Willadino e Câmara, 2005).
O explante deve ser selecionado cuidadosamente, pois o tipo de explante utilizado determina, muitas vezes, o grau de sucesso na micropropagação. Explantes jovens provenientes de sementes e partes jovens de plantas adultas são os preferidos, embora tecidos maduros também sejam utilizados em alguns casos. Os explantes devem preferencialmente ser retirados de plantas em crescimento ativo e que não estejam passando por qualquer tipo de estresse e ataque de pragas ou doenças (Teixeira, 2005).
Desinfestação inicial
O processo de desinfestação pode começar com os pré-tratamentos aplicados na planta matriz, principalmente para combater microrganismos. Quando se utilizam explantes de plantas crescidas no campo, deve-se dar preferência aos ramos novos em crescimento ativo, cuja coleta deve ser feita no início do período de brotação. Órgãos e tecidos com contaminação endógena são de difícil desinfestação. Quando se detecta a presença de fungos ou bactérias endógenas deve-se preferir outras fontes de explantes, sobretudo aquelas derivadas de plantas cultivadas em ambientes controlados (Teixeira, 2005). Este controle deve ser feito desde a desinfestação do material vegetal até a esterilização dos instrumentos e recipientes utilizados na manipulação do explante. Os instrumentos (pinças, bisturis etc) devem ser submergidos em etanol 96%; flambados, ou esterilizados por meio de calor intenso e colocados sobre um suporte limpo, dentro da câmara de fluxo laminar. A desinfestação do explante é uma etapa essencial na qual podem ser utilizadas diversas substâncias de ação germicida, dentre os quais os mais utilizados estão o etanol, o hipoclorito de sódio e o de cálcio, além dos habituais detergentes de cozinha ou Tween
20, que podem ser aplicados na solução desinfestante, com o objetivo de facilitar o contato dos agentes esterilizantes com o tecido, reduzindo a tensão superficial. A concentração dos agentes desinfestantes e o tempo de exposição pode variar, de acordo com o objetivo do trabalho, o tamanho e a natureza do explante (Willadino e Câmara, 2005).
Contaminação
A micropropagação de plantas é uma técnica que possibilita a propagação massal de genótipos selecionados, no entanto, a contaminação por microrganismos continua sendo um dos principais problemas para a aplicação dessa técnica podendo chegar, inclusive, a ser um fator limitante para o estabelecimento de cultivo in vitro de certos explantes (Ribas et al., 2003). Um dos maiores problemas diz respeito à contaminação bacteriana e fúngica;
além dessas contaminações superficiais, é frequente se deparar com contaminações presentes no interior dos tecidos, conhecida como contaminação endógena, mais frequente em explantes derivados de plantas cultivadas no campo. A contaminação por bactérias acontece, geralmente, devido à contaminação endógena dos explantes e plântulas. A contaminação por fungo ocorre em virtude da deficiência na manipulação durante o subcultivo e à presença de esporos no ambiente onde o subcultivo é realizado ou a infestação por ácaros (Abreu et al., 2002). Para minimizar essas contaminações é recomendável cultivar a planta, da qual serão coletados os explantes, em condições parcialmente controladas, como telados com cobertura plástica ou casa de vegetação. O cultivo de planta nesses ambientes permite maior controle da irrigação, adubação, controle de pragas e doenças (Teixeira, 2005).
Oxidação
A oxidação fenólica é altamente dependente da espécie e do genótipo. Ela depende igualmente do tipo de explante utilizado. Em geral, explantes jovens oxidam menos que os velhos; outro fator que influencia a oxidação in vitro e a época do ano. Nos períodos do ano mais favoráveis ao crescimento, a oxidação fenólica dos explantes in vitro é menor.
Essa oxidação representa um dos mais sérios problemas, especialmente na fase de estabelecimento da cultura in vitro de explantes de espécies lenhosas. (Teixeira, 2005).
Meios de cultura
Segundo Caldas et al. (1998), no cultivo in vitro o meio deve conter todas as fontes de micro e macronutrientes, vitaminas, reguladores de crescimento, além de fontes de carbono e oxigênio para que a planta possa desenvolver como se estivesse em condições naturais, apesar de que quando cultivada in vitro, esta ser heterotrófica e apresentar tamanho limitado. Esses meios desempenham várias funções, como suporte físico para o explante, fornecimento de nutrientes necessários à sua sobrevivência e seus componentes podem ser utilizados para dirigir o crescimento e o desenvolvimento do material vegetal.
Há inúmeras formulações dos meios de cultura, não existindo um meio padrão, embora o mais amplamente difundido seja o meio idealizado por Murashige e Skoog, conhecido mundialmente como meio MS.
Reguladores de crescimento
Hormônios vegetais, ou reguladores de crescimento, são aqueles produzidos pela própria planta; em baixas concentrações, são biologicamente ativos, podendo promover, inibir ou modificar o crescimento, geralmente em um local diferente daquele onde foi produzido. Os reguladores de crescimento são substâncias sintéticas que produzem efeitos semelhantes aos produzidos pelos hormônios naturais. Os fitormônios são classificados em cinco grupos: auxinas, citocininas, giberelinas, etileno e inibidores. Os reguladores de crescimento mais utilizados são auxinas, citocininas e giberelinas (Santos, 2003).
Texto limitado em até 05 páginas
3. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO ETAPA OU FASE DO PROJETO
Objetivo Específico Etapa/Fase (O que?) Especificação (Como?) Início Semanas e meses
Término Semanas e meses
Levantamento bibliográfico sobre
o tema
Referencial Teórico
Estudo de teoria referentes à cultura de
tecidos vegetais e as contaminações por
microrganismos
Março 2018 (primeira semana) (4 semanas)
Abril 2018 (primeira semana) Selecionar
visualmente os tipos de contaminantes mais frequentes;
Avaliação
Seleção visual dos tipos de contaminantes mais
frequentes
Abril 2018 (segunda semana)
Maio 2018 (primeira semana) Coletar amostras
dos contaminantes mais frequentes para isolamento de
cultura;
Coleta de material micro biológico
Coleta de amostra dos microrganismos para
plaqueamento e cultura primária
Maio 2018 (segunda
semana)
Abril 2018 (segunda semana) Isolar e crescer as
culturas selecionadas;
Isolamento de culturas
Isolar culturas puras a partir do material plaqueado na seleção
Abril 2018 (terceira semana)
Maio 2018 (quarta semana) Identificar os
microrganismos isolados a fim de classificá-los, pelo menos, em nível de
gênero.
Identificação
Identificação por técnicas específicas
para cada microrganismo das
culturas
Junho 2018 Agosto 2018
Revisar bibliografia a fim de caracterizar as
fontes mais prováveis destes
microrganismos;
Revisão bibliográfica
Estudo de teoria sobre os microrganismos identificados e suas
principais fontes
Setembro 2018 (primeira semana)
Outubro 2018 (última semana)
Elaborar uma cartilha de identificação por critérios visuais dos
microrganismos com as informações
obtidas;
Diagramação Diagramação utilizando
o software Corel Draw Novembro 2018 Dezembro 2018
Elaboração de artigo científico para publicação.
Redação e organização das informações
Publicação de artigo em Evento Científico e
finalização dos relatórios
Janeiro 2019 (terceira semana)
(1 mês)
Fevereiro 2019 (terceira semana)
4. REQUISITOS PARA SELEÇÃO DE BOLSISTAS:
(Requisitos/habilidades básicas do bolsista para o respectivo projeto)
Estar cursando à partir da fase:
Conhecimentos específicos ou disciplinas cursadas:
Cursando/cursado a disciplina de microbiologia Disponibilidade de executar as atividades: Pelo menos 02 horas semanais
5. REFERÊNCIAS
( Descrever as utilizadas na elaboração do projeto. Todas as referências deverão estar citadas no corpo do projeto, conforme normas ABNT)
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