UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
DAIANE PEREIRA CAMACHO
A ADERÊNCIA DE LEVEDURAS EM ANEL VAGINAL
CONTRACEPTIVO NuvaRing® ESTARIA RELACIONADA COM
CANDIDÍASE VULVOVAGINAL?
Resumo
Avaliar a aderência in vitro de diferentes leveduras, isoladas de exsudato vaginal de pacientes com candidíase vulvovaginal (CVV), em anel vaginal contraceptivo NuvaRing®. Foram utilizados quatro isolados de Candida sp e um isolado de Saccharomyces cerevisiae. Foram realizados ensaios de aderência por UFC/ml e radiomarcada, microscopia eletrônica de varredura (MEV) do anel e determinada a hidrofobicidade de superfície celular (HSC) das leveduras. Todas as leveduras foram capazes de aderir ao anel vaginal, apresentando diferenças entre si quanto à capacidade de aderência em UFC/ml, o que não ocorreu no ensaio
radiomarcado. A HSC foi compatível com a aderência por UFC/ml. A MEV comprovou a adesão, que mostrou-se diferente entre C. albicans e C. tropicalis. A aderência das leveduras testadas ao NuvaRing® poderia facilitar o desenvolvimento de CVV e CVVR nas pacientes susceptíveis usuárias deste método contraceptivo.
CAPÍTULO I INTRODUÇÃO
1- Considerações gerais
O gênero Candida é constituído de aproximadamente 200 diferentes espécies de leveduras, que vivem normalmente nos mais diversos nichos corporais, como orofaringe, cavidade bucal, dobras da pele, secreções brônquicas, vagina, urina e fezes. Dentre as espécies que compõem este gênero, Candida albicans apresenta maior relevância em função de sua taxa de prevalência em condições de
normalidade e de doença (ODDS et al., 1988; KURTZMAN e FEEL, 1998). As leveduras do gênero Candida, e em particular C. albicans, são patógenos oportunistas freqüentemente isolados das superfícies mucosas de indivíduos
normais (MORAGUES et al., 2003), estando muito bem adaptada ao corpo humano, sendo por isto capaz de colonizá-lo sem produzir sinais de doença em condições de normalidade fisiológica (GHANNOUM e RADWAN, 1990). Coloniza as mucosas de todos os seres humanos no decorrer ou pouco depois do nascimento, havendo
sempre o risco de infecção endógena (BROOKS et al., 2000). O delicado balanço entre o hospedeiro e este fungo comensal pode transformar-se em uma relação parasitária, resultando no desenvolvimento de infecções denominadas candidíases (CHAFFIN et al., 1998). Estas infecções fúngicas variam desde lesões superficiais em pessoas sadias até infecções disseminadas em pacientes neutropênicos
(COTRAN et al., 2000). Um aumento na incidência de infecções fúngicas causadas por espécies de Candida tem sido observado em pacientes imunocomprometidos (FIDEL et al., 1996).
C. albicans é um fungo com capacidade de dimorfismo, ou seja, pode ser
estando associado à colonização assintomática, ou como formas filamentosas (pseudohifas e hifas verdadeiras), observadas em processos patogênicos. Além disso, sob condições de crescimento sub-ótimas, neste fungo pode ocorrer a formação de clamidósporos, que são esporos arredondados que possuem uma espessa parede celular. Dessa forma, o fungo tem a capacidade de se adaptar a diferentes nichos biológicos, podendo ser considerado, a rigor, um organismo "pleomórfico" (LACAZ et al., 1991; CHAFFIN et al., 1998).
Clinicamente, a candidíase pode ser cutânea, mucosa, cutaneomucosa ou
visceral. Formas cutaneomucosas severas são menos comuns, encaixando-se em duas grandes categorias: candidíase cutaneomucosa crônica e candidíase vaginal crônica. A primeira está geralmente associada com um enfraquecimento da resposta imune mediada por células, como o observado em pacientes com AIDS e indivíduos com defeitos imunológicos hereditários. A segunda categoria é desencadeada por fatores de risco como gestação, uso de contraceptivos orais, antibioticoterapia, Diabetes mellitus, entre outros. A candidíase disseminada intensa está associada a neutropenia secundária à doença granulomatosa crônica, leucemia, terapia
antineoplásica ou imunossupressão após transplante. Estas observações sugerem que tanto as células fagocíticas quanto a resposta imune mediada por células
específicas participam na defesa do hospedeiro contra o microrganismo (ASHMAN e PAPADIMITRIOU, 1995; COTRAN et al., 2000).
diagnóstico da CVV é cada vez mais freqüente na prática diária da ginecologia e sua incidência tem aumentado drasticamente, tornando-se a segunda infecção genital mais freqüente nos Estados Unidos e no Brasil, precedida apenas pela vaginose bacteriana, representando 20 a 25% dos corrimentos vaginais de natureza infecciosa (CORSELLO et al., 2003). Estima-se que cerca de 75% das mulheres adultas apresentem pelo menos um episódio dessa vulvovaginite fúngica em sua vida, sendo que destas, 40 a 50% vivenciarão novos surtos e 5% atingirão o caráter recorrente CVVR (MARDH et al., 2002). Candida albicans é o principal agente que responde por 80 a 90% das CVV, e 10 a 20% a outras espécies chamadas C. nãoalbicans (SOBEL, 1993). C. glabrata é a segunda espécie em freqüência nas CVV,
embora tenham sido referidos os achados de Candida tropicalis, Candida
parapsilosis, Saccharomyces cerevisiae, Trichosporon sp dentre outras
(CONSOLARO et al., 2004; CORSELLO et al., 2003; COTRAN et al., 2000; PICHOVÁ et al., 2001; SOBEL, 1993).
Esta infecção caracteriza-se por prurido, ardor, dispareunia e pela eliminação de um corrimento vaginal em grumos, semelhante à nata de leite. Com freqüência, a vulva e a vagina encontram-se edemaciadas e hiperemiadas, algumas vezes acompanhadas de ardor ao urinar e sensação de queimadura (SOBEL, 1990). Os sintomas se intensificam no período pré-menstrual, quando a acidez vaginal aumenta (SALVATORE, 1980).
chegam à vagina penetram no seu epitélio superficial, ali permanecendo albergadas, podendo causar distúrbios imediatos ou constituir-se em reservatório para
reinfecções posteriores (FIDEL et al., 1996). 3- Candidíase vulvovaginal recorrente (CVVR)
Aproximadamente 5% das mulheres com CVV desenvolvem CVVR, a qual é definida usualmente como a ocorrência de 4 ou mais episódios de CVV no período de 12 meses (MARRAZZO, 2003; PATEL et al., 2004). Ao contrário das mulheres que tem episódios esporádicos de CVV, aquelas com a doença recorrente não se beneficiam de uma diminuição na freqüência de episódios sintomáticos com o passar da idade (MARRAZZO, 2003).
A patogênese da CVVR entre mulheres que não tem condições
predisponentes aparentes, que são a grande maioria, está sob investigação. Uma elevação na resistência de espécies de Candida não tem sido observada na maioria dos casos, embora, se analisarmos estas pacientes como um grupo, mulheres com recorrência tem uma prevalência discretamente mais elevada de C.
glabrata, a qual é menos sensível às drogas imidazólicas, comumente utilizadas no
tratamento de CVV e CVVR (SOBEL et al., 2001).
4- Fatores predisponentes do hospedeiro
A expressão da relação parasita/hospedeiro depende do balanço entre a
virulência do microrganismo e as defesas do hospedeiro. Tanto fatores locais como sistêmicos podem contribuir para a invasão tecidual por C. albicans e por leveduras
C. não- albicans. Sua intensa multiplicação no canal vaginal é favorecida por uma
corticóides, parecem favorecer a infecção. Ainda parecem contribuir o uso de antibióticos, estrogenioterapia, pequenos traumas como o ato sexual, hábito de usar roupas muito justas ou de fibras sintéticas, além da dieta alimentar muito ácida (FERNANDES e MACHADO, 1996; NARDIN et al., 2000). A utilização de antibióticos pode incrementar tanto a colonização quanto à infecção por Candida. Embora diferentes estudos não tenham sido conclusivos neste sentido, antibióticos podem suprimir a flora vaginal lactobacilar, que é o principal mecanismo defensivo vaginal frente aos fungos (ZIARRUSTA, 2002).
Na prática, a infecção vaginal por C. albicans geralmente é associada com situações de debilidade do hospedeiro ou quando o teor de glicogênio do meio vaginal está elevado e a conseqüente queda do pH local propicia o desenvolvimento da infecção. Qualquer alteração dos níveis de glicose, especialmente em situações de hiperglicemia, e qualquer estado em que se produz uma elevação do glicogênio vaginal, pode desencadear CVV (GOSWAMI et al., 2006). O excesso de glicogênio aumenta o substrato nutritivo dos fungos, promovendo um incremento na sua capacidade de adesão (LACAZ, 1980; PEREIRA et al., 1996). Altos níveis de produção de hormônios femininos, especialmente a progesterona, aumentam a disponibilidade de glicogênio no ambiente vaginal, o qual serve como excelente fonte de carbono para o crescimento e germinação das leveduras (SOBEL, 1990). Raramente isola-se Candida na pré-menarca, fato este que associado a baixa prevalência CVV na menopausa enfatizam a dependência hormonal da infecção (FERRER, 2000). Como muitas mulheres são portadoras assintomáticas de Candida em pequenas quantidades, neste estado a levedura é considerada como comensal e as alterações no ambiente vaginal do hospedeiro são necessárias para que a
Fatores predisponentes do hospedeiro já bem conhecidos, incluindo Diabetes mellitus, imunossupressão, gravidez e terapias hormonais, apenas explicam
parcialmente a CVVR. O uso de antibiótico de amplo espectro, uso de contraceptivo oral, dispositivo intra-uterino, higiene pessoal e práticas sexuais têm sido estudados como fatores de risco para recorrência (PATEL et al., 2004). Acredita-se que a CVVR esteja relacionada com uma depressão nos processos imunes da mucosa normal, o que permitiria uma certa "tolerância" da mucosa ao microrganismo, pelo fato de ser encontrada alta incidência de CVVR em mulheres com imunidade celular prejudicada (FIDEL et al.,1996).
5- Fatores de virulência de leveduras
A patogenicidade ou virulência de um microrganismo é definida como a sua
capacidade de determinar doença, sendo esta mediada por múltiplos fatores. Apesar de certos aspectos da virulência serem determinados geneticamente, estes são expressos pelos microrganismos apenas quando existem condições ambientais favoráveis, tais como teor nutricional, atmosfera de oxigênio e temperatura. Estas condições são específicas para cada microrganismo e para cada isolado de
determinado agente. Podem variar de hospedeiro para hospedeiro e mesmo entre os diferentes tecidos de um mesmo hospedeiro (GHANNOUM e RADWAN, 1990). A virulência das espécies patogênicas de Candida spp depende dos vários
fatores, tais como adesão a substratos inertes e biológicos, formação de tubo
germinativo com conseqüente desenvolvimento da forma filamentosa, variabilidade genotípica, produção de toxinas e enzimas extracelulares hidrolíticas, variabilidade antigênica, imunomodulação dos mecanismos de defesa do hospedeiro e
5.1- Aderência
A aderência das leveduras à mucosa vaginal é reconhecida como um passo essencial na colonização microbiana e um evento chave na iniciação do processo patogênico, uma vez que, a colonização prévia é aceita como fator predisponente ao processo infeccioso (KAMAI et al., 2002). Alguns microrganismos não invasivos permanecem aderidos à superfície hospedeira, enquanto outros utilizam essa
adesão como a primeira etapa para a invasão tecidual (FINLAY e FALKOW, 1989). A aderência é considerada um importante fator de virulência de Candida spp,
sendo o primeiro estágio para a colonização dessas leveduras em diversas regiões do hospedeiro, com subseqüente disseminação quando ocorre um desequilíbrio nas defesas do hospedeiro (HAZEN et al., 2001). Vários mecanismos de aderência de
Candida spp têm sido propostos, incluindo atração eletrostática, interação
hidrofóbica e envolvimento de adesinas específicas (JABRA-RIZKI et al., 2001). A adesão de patógenos à superfície de células eucarióticas é mediada por
macromoléculas denominadas adesinas, as quais são estruturas da superfície do microrganismo que interagem com receptores específicos nas células eucarióticas (FINLAY e FALKOW, 1989; PIRES et al., 2001). As fibronectinas têm sido caracterizadas como receptores em células de mamíferos para a ligação de certos microrganismos. Foi descrita sua presença na superfície das células epiteliais vaginais e a interação de Candida spp com a mesma, sobretudo em certas fases do ciclo menstrual (KLOTZ et al., 1985).
Devido a importância e significância da aderência, alguns estudos in vivo e in
vitro tem sido desenvolvidos para quantificar e caracterizar a aderência de C.
albicans a superfícies celulares e inanimadas (JABRA-RIZKI et al., 2001; SHIN et al.,
mucosa vaginal (JABRA-RIZKI et al., 2001). 5.2- Biofilme
Estuda-se também a aderência de um microrganismo avaliando a sua
capacidade de formar biofilmes, que constituem um outro tipo de aderência, na qual os microrganismos formam agregados unicelulares, gerando estruturas
multicelulares que aderem a superfícies. Sua formação ocorre em resposta a uma variedade de condições, incluindo alta densidade celular, privação de nutrientes e estresse físico ambiental (O´TOOLE et al., 2000).
Atualmente, biofilmes são conhecidos como comunidades microbianas
organizadas que ficam aderidas a superfícies (DOUGLAS, 2003; WATNICK e KOLTER, 2000). Essas comunidades quase sempre são constituídas por vários gêneros e espécies, envoltos em suas matrizes extracelulares, que por sua vez são formadas por componentes do hospedeiro e produtos bacterianos secretados
(WATNICK e KOLTER, 2000). Estudos recentes sugerem que nos biofilmes ocorre uma complicada “conversa” dos microrganismos entre si e com as células do
hospedeiro, através da liberação de moléculas sinalizadoras conhecidas como “quorum-sensing”, as quais são essenciais para sua formação e manutenção (HOGAN et al., 2004; RAMAGE et al., 2002).
CVVR (DOUGLAS, 2003).
Além de fatores inerentes ao hospedeiro, tem sido postulado que existem
diferenças na patogenicidade de isolados de Candida sp. Em estudos in vitro tem se observado que isolados de C. não-albicans produzem mais biofimes e de maior consistência, quando comparados a isolados de C. albicans. Em estudo in vitro de aderência e formação de biofilme em superfície cateter, observou-se que isolados de
C. parapsilosis e C. tropicalis foram mais biofilme quando comparado a C. albicans
(CAMACHO et al., 2007). Outro estudo de SHIN et al. (2002), mostrou que C.
tropicalis e C. parapsilosis produzem quantidades significativas de biofilme quando o
meio contém 8% de glicose. Estes dados confirmam as evidências de que as infecções fúngicas caudas por C. não-albicans apresentam interesse especial por duas razões: primeiramente a virulência e a patogenicidade; secundariamente, a ocorrência da resistência às drogas antifúngicas atualmente disponíveis (DIEKEMA et al, 2002), sendo importante ressaltar a resistência a antifúngicos de biofilmes formados por espécies de Candida (CHANDRA et al, 2001).
5.3- Hidrofobicidade de superfície celular (HSC)
Já é conhecido que células leveduriformes hidrofóbicas são mais virulentas em ratos do que células leveduriformes hidrofílicas. A expressão de HSC por C.
albicans tem sido desta forma correlacionada com virulência aumentada,
provavelmente por estimular fenômenos de aderência, resistência à fagocitose e germinação (HAZEN et al., 2001). Embora o mais forte mecanismo envolvendo a aderência está provavelmente relacionada a uma adesina manoproteína de C.
albicans, HSC tem sido descrita por vários investigadores como envolvida na
aderência (JABRA-RIZKI et al., 2001).
glabrata apresenta maior HSC e aderência ao substrato estudado em relação à C. albicans.
6- Métodos Contraceptivos e relação com CVV
A flora vaginal composta por lactobacilos constituem uma barreira defensiva
importante frente a CVV, sendo que os lactobacilos atuam em três diferentes níveis. Em primeiro lugar, competem com os fungos pelo nutrientes. Em segundo, realizam um processo de co-agregação, sendo com isto capazes de competir e bloquear os receptores epiteliais para os fungos, inibindo desta forma a adesão dos mesmos ao epitélio vaginal. Este mecanismo de defesa é o mais importante. E em terceiro, são capazes de produzir substâncias (bacteriocinas) capazes de inibir a germinação de micélios. Isto pode explicar porque tratamentos com antibióticos podem
desencadear CVV em decorrência da depleção da flora vaginal (ZIARRUSTA, 2002). As alterações hormonais, principalmente as estrogênicas, parecem influenciar
na incidência de episódios agudos de CVV. Existe uma incidência aumentada desta infecção entre mulheres grávidas, usuárias de anticoncepcionais orais com alto teor de estrogênio, e aquelas sob terapia hormonal de reposição após a menopausa. Em contraste, mulheres no período anterior à menarca e posterior à menopausa
raramente adquirem infecções vaginais fúngicas. Porém, a relação entre hormônios reprodutivos e imunidade vaginal local permanece ainda desconhecida.
(FERNANDES e MACHADO, 1996).
Os métodos contraceptivos podem também promover a CVVR. As mulheres que tomam pílulas contraceptivas orais têm uma taxa mais alta de CVVR (RINGDAHL, 2000; SOBEL et al., 1998), uma vez que células de Candida apresentam receptores para estrogênio e progesterona que, quando estimulados, aumentam a proliferação fúngica (REED , 1992; RINGDAHL, 2000).
em geral, é plausível que mulheres usuárias de NuvaRing® também sejam afetadas. Durante um grande estudo de eficácia e tolerabilidade, 13,7% das mulheres usuárias do anel contraceptivo informaram a presença de vaginite, embora apenas 5%
acreditassem que a vaginite estava relacionada ao tratamento (ROUMEN et al.,2001; VERHOEVEN et al., 2004).
JUSTIFICATIVA
Atualmente, observa-se um grande número de mulheres que fazem uso de métodos contraceptivos. Apesar de todos os benefícios destes métodos, existem aquelas que apresentam maior predisposição a infecções vaginais. As leveduras que habitam normalmente a mucosa vaginal podem tornar-se patógenos
oportunistas devido a situações de debilidade da hospedeira, desenvolvendo infecções denominadas candidíases. O diagnóstico de candidíase vulvovaginal (CVV) é cada vez mais freqüente na prática diária da ginecologia e sua incidência tem aumentado drasticamente. Candida albicans é o principal agente das CVV, no entanto, outras espécies não-albicans podem causar esta infecção.
São vários os fatores identificados como causa do aparecimento de CVV tais como: gravidez, Diabetes mellitus e o uso de corticóides. Contudo, o uso de
contraceptivo oral contendo estrógeno ou uso de dispositivos intra-uterinos, também podem constituir risco para o desenvolvimento de candidíase.
Até o presente momento, são escassos os estudos que avaliam a influência
do anel vaginal contraceptivo no desenvolvimento de CVV, sendo uma possibilidade plausível, uma vez que o anel permanece por três semanas alojado na vagina,
este novo método contraceptivo poderia estar envolvido na manutenção de leveduras vaginais e conseqüentemente no desenvolvimento de CVV.
OBJETIVOS Objetivo geral:
O presente estudo teve como objetivo avaliar a aderência in vitro de diferentes leveduras, isoladas de exsudato vaginal de pacientes com CVV, em anel vaginal contraceptivo NuvaRing®.
Objetivos específicos:
1. Avaliar a aderência de leveduras C. albicans e não-albicans ao anel vaginal contraceptivo através da técnica de contagem de colônias em placas, após período de incubação de 1 hora;
2. Avaliar a aderência de leveduras ao anel vaginal contraceptivo por incorparação de timidina tritiada;
3. Determinar a hidrofobicidade de superfície celular das leveduras;
4. Avaliar a aderência de leveduras ao anel vaginal contraceptivo através de visualização em Microscopia Eletrônica de Varredura.
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46. SOBEL, J. D. ; KAPERNICK, P.S.; ZERVOS, M.; REED, B.D.; HOOTON, T.; SOPER, D.; NYIRJESY, P.; HEINE, M.W.; WILLEMS, J.; PANZER, H.;
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48. WATNICK, P.; KOLTER, R. Biofilm, city of microbes. J Bacteriol., v. 182, p. 2675-2679, 2000.
CAPÍTULO II
Artigo “WOULD THE ADHERENCE OF YEAST TO NuvaRing®
CONTRACEPTIVE VAGINAL RING BE RELATED TO VULVOVAGINAL CANDIDIASIS?”, pág.22-48, submetido para publicação aguardando resultado.
Address correspondence:
Dra. Terezinha Inez Estivalet Svidzinski
Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Análises Clínicas Av. Colombo, 5790; Maringá – PR – Brasil; 87020-900
CAPÍTULO III
CONCLUSÕES1. Todas as leveduras testadas aderiram muito bem ao anel vaginal, tanto através do ensaio de aderência in vitro por UFC/ml, que evidenciou C.
albicans como a menos aderente e C. glabrata e C. tropicalis as mais
aderentes, quando por adesão radiomarcada, cujas leveduras aderiram de maneira mais uniforme.
2. A adesão foi comprovada também através da MEV, que demonstrou um padrão de adesão muito diferente entre C. albicans e C. tropicalis, e que portanto, parece ser característico de cada levedura.
3. A MEV evidenciou também a superfície irregular do NuvaRing®, o que muito provavelmente auxilia no processo de adesão.
4. Os resultados de HSC do presente estudo variam consideravelmente entre os diferentes isolados testados, em escala crescente de valores na mesma
ordem que os de UFC/ml, demonstrando que, quanto maior o caráter hidrofóbico destas leveduras, mais aderentes ao anel.
5. O aumento freqüente de isolados de leveduras C. não-albicans em CVV em algumas populações, pode ser explicado, ao menos em parte, neste estudo, demonstrando a correlação entre a grande capacidade de adesão e de HSC destas leveduras, em particular C. glabrata.
6. Tanto para CVV quanto para CVVR, o anel vaginal poderia contribuir com a dificuldade de eliminação destas leveduras do canal vaginal pelo tratamento adotado.
PERSPECTIVAS FUTURAS
1. Realizar estudos de co-agregação de leveduras com Lactobacillus acidophilus da flora microbiana vaginal predominante.
2. Avaliar a capacidade de adesão do co-agregado em anel vaginal contraceptivo e em células epiteliais vaginais, com intuito de verificar possíveis alterações no processo de adesão.
