Acta Scientiarum. Biological Sciences ISSN: 1679-9283
Universidade Estadual de Maringá Brasil
Martinazzi Quirgo Nunes, Priscila; Rosa Foizer, Edgar; Carvalho Gomes, Levy; Chippari-Gomes, Adriana Regina
Avaliação da toxicidade do cobre para o piauçu (Leporinus macrocephalus, Garavello & Britski, 1988) por meio de parâmetros leucocitários e enzimáticos
Acta Scientiarum. Biological Sciences, vol. 32, núm. 1, 2010, pp. 87-92 Universidade Estadual de Maringá
.png, Brasil
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Avaliação da toxicidade do cobre para o piauçu (Leporinus
macrocephalus, Garavello & Britski, 1988) por meio de parâmetros
leucocitários e enzimáticos
Priscila Martinazzi Quirgo Nunes, Edgar Rosa Foizer, Levy Carvalho Gomes e Adriana Regina Chippari-Gomes*
Centro Universitário Vila Velha, Rua Comissário José Dantas de Melo, 21, 29102-770, Vila Velha, Espírito Santo, Brasil. *Autor para correspondência. E-mail: [email protected]
RESUMO. Como forma de monitoramento de áreas degradadas, testes de toxicidade têm sido amplamente utilizados. Este trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade do cobre para o piauçu a partir da determinação da CL50 96h e da análise de alterações nos padrões enzimáticos e leucocitários, em exposição subletal (25 e 50% da concentração letal) por 96h. A CL50 96h do cobre para o piauçu foi 0,09 ± 0,03 mg L-1. Após a exposição às concentrações subletal, os valores das concentrações enzimáticas de Alanina Aminotrasferase e Aspartato Aminotransferase não apresentaram diferença significativa entre os indivíduos do grupo-controle e dos expostos ao metal. A glicose plasmática apresentou aumento significativo nos peixes expostos a 25 e 50% da CL50, quando comparados ao controle. O eosinófilo, o linfócito e o neutrófilo não apresentaram diferença significativa do grupo-controle. Os trombócitos aumentaram significativamente nos peixes expostos a 50% da CL50; os monócitos, nos peixes expostos a 25 e 50% da CL50. Os resultados indicam que o piauçu é uma espécie sensível aos efeitos letais do cobre e que a exposição a concentrações subletais causa um distúrbio imunológico, porém não induz dano hepático, de acordo com as enzimas mensuradas.
Palavras-chave: cobre, exposição subletal, Leporinus macrocephalus, ecotoxicologia aquática, biomarcadores
enzimáticos.
ABSTRACT. Evaluation of the toxicity of copper for piauçu (Leporinus macrocephalus) through leukocyte and enzymatic parameters. Toxicity tests have been
widely used as a form of monitoring degraded areas. This work has as objective to evaluate the toxicity of copper for Piauçu from the determination of LC50 for 96 hours and analysis of alterations in the enzymatic and leukocyte patterns, in sublethal exposure (25 and 50% of the lethal concentration) for 96 hours. The LC50 of copper for Piauçu, during 96 hours, is 0.09±0.03 mg L-1 Cu2+. After exposure to the sublethal concentrations, enzymatic concentrations of Alanine Aminotrasferase and Aspartate Aminotransferase did not show any significant difference between the individuals of the control and metal groups. Plasma glucose showed a significant increase in fish exposed to 25 and 50% of LC50, when compared with control. Eosinophil, lymphocyte and neutrophil showed no significant difference from the control group. Thrombocytes increased significantly in the fish exposed to 50% of the LC50, as did monocytes in fish exposed to 25 and 50% of LC50. The results indicate that Piauçu is a species sensitive to the lethal effects of copper, and that exposure to the sublethal concentrations causes immune disorder; however, it does not induce liver damage according with the measured enzymes.
Key words: copper, sublethal exposition, Leporinus macrocephalus, aquatic ecotoxicology, enzymatic
biomarkers. Introdução
A bacia hidrográfica do rio Doce possui extensão territorial de cerca de 3.400 km2, pertencentes aos
Estados de Minas Gerais e Espírito Santo, e hoje abriga o maior complexo siderúrgico da América Latina. Tais empreendimentos industriais, que apresentam elevados níveis de qualidade e produtividade industrial e que estão entre os maiores do mundo, desempenham papel
significativo nas exportações brasileiras de minério de ferro e aço. Apesar do grande desenvolvimento proporcionado à região, o potencial de impacto ambiental é bastante elevado.
88 Nunes et al. grande quantidade encontrada (PIRES et al., 2003). O
cobre é considerado um dos metais mais tóxicos para peixes (MATSUO et al., 2005). Quando em concentrações elevadas, resulta em várias disfunções no organismo, tais como diminuição no ganho de peso, menor crescimento, piora na conversão alimentar, aumento dos ovos, elevada morte de embriões, alterações histopatológicas no fígado e brânquias, além de distúrbios hematológicos e na regulação iônica. É considerado, quando em conjunto com o ferro, como catalisador de reações em que os radicais livres formados oxidam lipídios insaturados, tendo efeito direto na estrutura e na função da membrana das células (FERRARI et al., 2004).
Normalmente, o fígado é um dos órgãos mais prejudicados pela exposição ao cobre, uma vez que, neste órgão, são realizadas várias reações bioquímicas, incluindo o metabolismo dos metais. Desta forma, o fígado acaba acumulando grande parte dos metais absorvidos (LINDE et al., 1998). Uma forma de avaliar os danos causados ao fígado é a analise das aminotransferases, que são enzimas intracelulares responsáveis por catalisar a transferência de um grupamento amina de um α-aminoácido para um α-cetoácido, caracterizando um processo de detoxificação. As aminotransferases são amplamente utilizadas para o diagnóstico de certas afecções do fígado que levam à necrose e à destruição dos tecidos (OLIVEIRA, 2003). Outro importante indicador de contaminação por metal são os leucócitos por apresentarem alterações evidentes em resposta à contaminação (MAZON et al., 2002).
O piauçu (Leporinus macrocephalus) é uma das espécies nativas de peixe de água doce mais criada no país (TATAJE; ZANIBONI FILHO, 2005). A espécie é naturalmente encontrada em toda a bacia do Paraguai e Paraná, porém, pela sua grande utilização em pisciculturas de todo o país, acabou difundindo-se em outras bacias, incluindo a do rio Doce.
Apesar do grande impacto ambiental a que a bacia do rio Doce está sujeita, existem poucos estudos que verificam os efeitos dos principais poluentes nos peixes locais, sendo, portanto, vital o estudo toxicológico da biota. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi determinar a concentração letal de cobre para a o piauçu e avaliar a toxicidade deste metal, em exposição subletal, a partir de alterações nos parâmetros leucocitários e enzimáticos e nos valores de glicose plasmática.
Material e métodos
Determinação da concentração letal (CL50)
Juvenis de piauçu (Leporinus macrocephalus, Garavello & Britski, 1988) (1,53 ± 0,74g e 6,5 ±
0,83 cm, média ± desvio-padrão) foram adquiridos na estação de piscicultura da Associação de Aquicultores do Espírito Santo, AQUES, Cariacica, Estado do Espírito Santo, e transportados para o Laboratório de Ecotoxicologia Aquática do Centro Universitário Vila Velha, Vila Velha, Estado do Espírito Santo. No laboratório, os peixes foram aclimatados por dez dias, em um tanque de 500 L com sistema de aeração permanente, sendo alimentados três vezes ao dia com ração comercial extrusada com 36% de proteína bruta (Nutriaves, Estado do Espírito Santo). A alimentação foi suspensa 48h antes do experimento e durante todo o período experimental. Após a aclimatação, os peixes foram separados em aquários com capacidade de 25 L, onde ficaram 24h aclimatando, até a adição do cobre. Cada aquário continha dez juvenis, e os testes foram realizados em triplicata. Os animais foram expostos a seis diferentes concentrações: 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 e 0,3 mg L-1 de cobre, mais aquários-controle (sem
metal), por um período de 96h. O agente químico cobre foi utilizado na forma de sulfato de cobre pentaidratado (CuSO4. 5H2O). O fotoperíodo foi
controlado para 10h com luz artificial e 14h sem luz. A mortalidade foi avaliada a cada 24h.
Para a determinação da CL50 (concentração que
mata 50% da população), foi utilizado o software JSpearman Test, baseado no método Trimmed – Spearman Karber. Com os resultados obtidos, foi possível calcular a CL50 para 24, 48, 72 e 96h de
exposição. Os resultados da CL50 para cada tempo de
exposição (24, 48, 72 e 96h) foram comparados por análise de variância (Anova) e teste de Tukey (p < 0,05). Exposição à concentração subletal
Para a realização dos testes subletais, foi tomado por base o valor da CL50 (96h). Foram utilizados 24
exemplares de piauçu (12,7 ± 1,26 cm e 24,88 ± 8,52 g, média ± desvio-padrão). Os peixes foram colocados, individualmente, em 24 caixas de plástico com capacidade de 1,5 L, com aeração constante. Os peixes foram expostos a três diferentes concentrações de cobre: 0 (0 mg L-1), 25 (0,023 mg
L-1) e 50% (0,045 mg L-1) da CL
50 (96h), sendo
testados oito peixes em cada concentração (n = 8). O experimento teve duração de 96h.
O restante do sangue foi centrifugado a 3.000 rpm para separação do plasma. As enzimas plasmáticas foram dosadas pelo método colorimétrico, com utilização de um kit enzimático comercial (Doles). Para a análise da Glicose plasmática, utilizou-se kit comercial (Doles).
Os resultados obtidos foram representados como média ± erro-padrão e comparados com o controle (0%) por Anova e teste de Dunnett’s. Os dados foram analisados com o auxílio do programa estatístico SigmaStat 3.0.
Análise da água durante os experimentos
A qualidade da água foi monitorada no início, no meio e no final dos dois experimentos. O oxigênio dissolvido (mg L-1) e a temperatura (ºC) foram
medidos com um oxímetro digital (YSI 85), o pH com um potenciômetro digital e a dureza total por titulação. Resultados e discussão
Qualidade da água durante os experimentos
A qualidade da água apresentou as seguintes características durante os experimentos: oxigênio dissolvido – 7,65 ± 0,29 mg L-1; temperatura – 25,3 ±
0,16ºC; condutividade – 99,3 ± 29,66 μs cm-1; pH –
6,4 ± 0,27 unidades; e dureza – 33,03 ± 4,74 mg L-1.
Determinação da concentração letal (CL50)
As CL50 do cobre para Leporinus macrocephalus em
24, 48, 72 e 96h foram de 0,19 ± 0,05; 0,11 ± 0,03; 0,09 ± 0,03 e 0,09 ± 0,03 mg L-1, respectivamente.
A CL50 para o período de 24h foi significativamente
maior do que para os períodos de 72 e 96h (Figura 1).
0 0,04 0,08 0,12 0,16 0,2 0,24 0,28 24 48 72 96 Tempo de exposição (h) CL 50 C ob re ( m g/ L) a ab b b CL 50 C o br e (m g L -1)
Figura 1. Concentração letal de cobre para juvenis de piauçu
(Leporinus macrocephalus) em diferentes tempos. A barra de erros indica o intervalo de confiança. Letras diferentes indicam diferença significativa nos tempos de exposição por Anova e teste de Tukey (p < 0,05).
A variação entre as concentrações de CL50 (96h),
nas diferentes espécies de peixes, é atribuída à biologia de cada organismo aquático, pois cada
espécie responde diferentemente aos mais diversos eventos, inclusive a agentes tóxicos. No presente estudo, a CL50 (96h) para Leporinus macrocephalus foi
de 0,09 mg L-1 de Cu2+, indicando que esta espécie é
sensível ao cobre, quando comparada à tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) (CL50 (96h) = 0,590 mg
L-1 de Cu2+; MASUTTI et al., 2006), outra espécie
amplamente difundida na bacia do rio Doce. A CL50 (96h) obtida neste estudo foi muito similar a obtida por Gomes et al. (2009), testando o cobre para esta mesma espécie. Os resultados indicam que o piauçu pode ser um bom indicador para análises toxicológicas agudas referentes à bacia do rio Doce.
Exposição à concentração subletal
Os peixes expostos ao cobre não apresentaram diferença significativa nas enzimas AST e ALT, quando comparados ao controle (Figura 2). As concentrações de AST no tratamento-controle, 25% da CL50 e 50% da CL50 foram, respectivamente,
141,64 ± 3,36; 139,51 ± 3,08; 148,36 ± 4,43 U.I. L-1
(Figura 2). As concentrações de ALT no tratamento- controle, 25% da CL50 e 50% da CL50 foram, respectivamente, 21,08 ± 0,69; 18,02 ± 0,57; 25,91 ± 0,59 U.I. L-1 (Figura 2). 100 110 120 130 140 150 160 A S T ( U .I ./L ) AST (U.I. L -1) 0 25 50 Tratamento (%) 0 5 10 15 20 25 30 A L T ( U .I./L ) A S T ( U .I. L -1) 0 25 50 Tratamento (%)
Figura 2. Concentração de Aspartato Transaminase (AST) e Alanina
90 Nunes et al. O elevado acúmulo de metais no fígado pode
ocasionar sérias lesões hepáticas e histopatológicas, como, por exemplo, aumento no volume celular (distúrbios osmorregulatórios), necrose e degeneração dos hepatócitos, promovendo disfunções no órgão (MAZON et al., 2002). Tais lesões podem ser avaliadas pela presença de algumas enzimas, que são liberadas no plasma pelo tecido hepático danificado, como as transaminases (HEATH, 1995; CHAMPE; HARVEY, 1996). Assim, a presença de níveis elevados dessas enzimas no plasma indica lesão de células ricas em transaminases (CHAMPE; HARVEY, 1996). As concentrações de ALT e AST presentes no plasma sanguíneo dos indivíduos expostos ao contaminante não apresentaram diferenças significativas com relação ao grupo-controle. Este resultado é contrário aos obtidos
com Colossoma macropomum (OLIVEIRA, 2003),
Cyprinus carpio (KARAN et al., 1998), Hypothalamichthys molitrix e Silurus glanis
(NEMCSÓK; BENEDECZKY, 1995) expostos à concentração subletal de cobre. Alguns destes autores relacionam o dano hepático à concentração de cobre; portanto, as concentrações de cobre testadas neste trabalho não foram suficientes para causar dano hepático em juvenis de piauçu.
A glicose plasmática apresentou aumento significativo nos peixes expostos a 25 e 50% da CL50, quando comparados ao controle (Figura 3).
As concentrações de glicose foram de 53,76 ± 4,31; 109,15 ± 19,33; 103,84 ± 6,06 mg dL-1 nos
peixes do grupo-controle e nos expostos a 25 e 50% da CL50, respectivamente (Figura 3). Os
aumentos observados nas concentrações de glicose em peixes expostos a metais podem ocorrer simplesmente por estresse, por causa de mudanças nas características ambientais, que ocasionam maior atividade metabólica e, consequentemente, maior necessidade de energia por parte dos organismos (NEMCSÓK; BENEDECZKY, 1995; SANTOS; PACHECO, 1999). A hiperglicemia, em peixes de água doce, pode estar relacionada a uma resposta comum à presença de agentes estressores e tem sido considerada indicador secundário de poluição ambiental (ALKINDI et al., 1996). Neste estudo, os níveis de glicose aumentaram significativamente nos peixes expostos ao cobre, quando comparados ao grupo-controle, porém não foi observada uma diferença na magnitude da resposta glicêmica entre os peixes expostos a 25 e 50% da CL50. Esta
hiperglicemia frente à exposição ao cobre também foi observada por Laurén e McDonald (1984) em
Salmo gairdneri, por Nemcsók e Benedeczky
(1995) em Cyprinus carpio, Hypothalamichthys
molitrix e Silurus glanis, por Pelgrom et al. (1995)
em Oreochromis mossambicus e por Griffin et al. (1999) em Ictalurus punctatus. 0 20 40 60 80 100 120 140 G li c os e (m g/ dL) * * G lic ose (m g d L -1) Controle 25 50 Tratamento (%)
Figura 3. Glicose plasmática em juvenis de piauçu (Leporinus
macrocephalus) expostos a 0% (controle; 0 mg L-1), 25% (0,0235 mg L-1) e 50% (0,047 mg L-1) da concentração letal de cobre. Os resultados são a média ± erro-padrão de oito peixes por tratamento. *Indica diferença significativa comparado ao controle.
O monócito apresentou aumento significativo nos peixes expostos a 25 e 50% da CL50, quando
comparados aos peixes-controle (Tabela 1). O trombócito foi significativamente menor nos peixes expostos a 50% da CL50. Eosinófilo, linfócito e
neutrófilo dos grupos expostos ao cobre não apresentaram diferença significativa do controle.
Tabela 1. Leucócitos em juvenis de piauçu (Leporinus
macrocephalus) expostos a 0% (controle; 0 mg L-1), 25% (0,0235 mg L-1) e 50% (0,047 mg L-1) da concentração letal de cobre. Os resultados são a média ± erro-padrão de oito peixes por tratamento. Tratamento Parâmetro Controle 25% 50% Monócito (%) 4,71±0,75 16,14±2,45* 12,33±2,46* Trombócito (%) 44,88±2,58 42,43±7,31 24,29±6,10* Eosinófilo (%) 0,25±0,16 1,14±0,71 1,14±0,51 Linfócito (%) 40,00±4,80 28,80±8,89 52,14±6,86 Neutrófilo (%) 12,17±2,69 21,50±6,55 8,17±1,14
*Indica diferença significativa comparado ao controle.
uma situação de estresse, desfavorecendo as condições de equilíbrio homeostásico conferidas por este leucócito. Este aumento nos trombócitos após a exposição ao cobre já havia sido observado em truta arco-íris (Salmo gairdneri) por Dick e Dixon (1985). Por outro lado, Mazon et al. (2002) não observaram alteração nos trombócitos após exposição do curimatã (Prochilodus
scrofa) ao cobre, porém a concentração de cobre utilizada
(0,029 mg L-1) foi menor do que a utilizada no grupo
exposto a 50% da CL50 neste trabalho.
Enquadrado dentro dos agranulócitos, os monócitos são, na sua maioria, células arredondadas, com citoplasma basofílico, vacuolizado, núcleo bem excêntrico, alongado ou esférico. São células em trânsito, responsáveis principalmente por reações inflamatórias gerais e respostas imunológicas fagocitárias, sendo de extrema importância nos mecanismos de defesa contra antígenos variados (TAVARES-DIAS; MORAES, 2004). A porcentagem de monócitos foi significativamente maior nos peixes expostos ao metal, passando de 4,71 ± 0,75 no controle para 16,14 ± 2,45 a 25% e para 12,33 ± 2,46 a 50% da CL50, sugerindo, assim, uma tentativa de detoxificação
por parte destes organismos, caracterizando o efeito negativo do cobre em juvenis de piauçu. Martins et al. (2004) observaram que juvenis de piauçu expostos a parasitas também apresentam aumento significativo na porcentagem de monócitos. Os resultados indicam que este aumento é uma condição natural da espécie em resposta a diferentes situações desfavoráveis.
Conclusão
Concentrações de cobre de até 50% da CL50 não
causam alterações hepáticas no piauçu que possam ser verificadas pela análise de Aspartato Transaminase e Alanina Transaminase.
Os peixes submetidos aos tratamentos de 25 e 50% da CL50 sofreram alteração no sistema imune,
com comprometimento da homeostase e dos mecanismos de defesa contra antígenos.
A exposição ao cobre causa alteração no metabolismo energético do piauçu, indicando tratar-se de uma situação estressante.
Agradecimentos
À Associação dos Aquicultores do Espírito Santo - AQUES, pela doação dos peixes. Trabalho financiado por projeto interno UVV # 10/2007. L. C. Gomes é bolsista de produtividade em pesquisa do CNPq. Referências
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