ANÁLISE MOLECULAR DE ISOLADOS SERIADOS DE. C. neoformans NA CRIPTOCOCOSE: RECIDIVA OU RE- INFECÇÃO?

Marilena dos Anjos Martins

ANÁLISE MOLECULAR DE ISOLADOS SERIADOS DE

C. neoformans NA CRIPTOCOCOSE: RECIDIVA OU

RE- INFECÇÃO?

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências

Área de Concentração:

Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública Orientadora:

Profa Dra Vera Lúcia Pereira- Chioccola

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pelo Centro de Documentação – Coordenadoria de Controle de Doenças/SES

©reprodução autorizada pelo autor

Martins, Marilena dos Anjos

Análise molecular de isolados seriados de C. neoformans na

criptococose: recidiva ou re-infecção? / Marilena dos Anjos Martins – São Paulo, 2006.

Dissertação (mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo.

Área de concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública Orientador: Vera Lúcia Pereira-Chioccola

1. Criptococose 2. Síndrome de imunodeficiência adquirida 3. Biologia molecular/métodos 4. Cryptococcus neoformans/isolamento &

Aos meus pais Judite e Antonio (in memoriam), que sempre se esforçaram e se sacrificaram para que eu estudasse. Muito obrigada por

terem me dado tanto amor. Tudo o que sou devo aos senhores.

Aos meus amores Martin e Eduardo, obrigada por

compreenderem minhas irritações e tentarem me ajudar. Vocês são muito importantes na minha vida.

A Dra Mara Cristina de Souza Pappalardo por sua disponibilidade e atenção. O esforço do seu trabalho originou esta tese.

As estagiárias da FUNDAP Daniela Crema e Elaine Cristina Cornetta pela colaboração na parte prática.

A todos os profissionais com quem eu tive oportunidade de trabalhar. Não citarei nomes para não ser injusta, porque, todos vocês

direta ou indiretamente foram muito importantes para a construção do profissional que sou hoje.

A todos os meus amigos, obrigada por fazerem parte da minha vida.

Aos professores que formaram a banca de qualificação e mestrado por sua valiosa contribuição.

Ao Programa de Pós-graduação da CCD e secretaria da pós graduação do IAL pela gentileza e atenção.

Em especial a minha orientadora Dra Vera Lúcia Pereira-Chioccola, pelo entusiasmo, incentivo e disponibilidade para realização desta

tese. Sua experiência foi fundamental na condução deste trabalho. Saiba que aprendi demais. A você meu carinho, admiração e minha sincera

A criptococose é uma das micoses que mais acomete os pacientes imunocomprometidos, principalmente aqueles com a síndrome da imunodeficiência adquirida (aids). Ela é causada por Cryptococcus

neoformans, levedura capsulada com tropismo pelo sistema nervoso central.

O curso da doença é grave pela ocorrência de meningoencefalite criptocóccica, freqüentemente fatal.

No Brasil, apesar da introdução do tratamento antiretroviral (HAART), a criptococose é a segunda doença neurológica mais prevalente, com várias recorrências e definidora de aids. O conhecimento da cepa infectante pode contribuir para estratégias de tratamento e prevenção de doença. Este estudo avaliou se as infecções recorrentes em pacientes com aids são devido à persistência da cepa inicial ou aquisição de nova cepa ou múltiplas cepas. Foram analisadas, retrospectivamente, 54 amostras de C.

neoformans isoladas de líquido cefalorraqueano (LCR) de 12 pacientes com

Cryptococcosis is the most common mycosis in immunodeficient patients, principally in aids. The course of infection is a serious and often life-threatening disease. This mycosis is caused by the encapsulated yeast

Cryptococcus neoformans that present tropism for the central nervous

AIDS - síndrome da imunodeficiência adquirida

AFLP – amplificação dos fragmentos de DNA gerados por enzima de restrição

Anfo B - anfotericina B

ATCC - American Type Culture Collection CDC - Center for Disease Control

CGB - agar a base de L-canavanina, glicina e azul de bromotimol CHEF - contour- clamped homogeneous electric field

CIM - concentração inibitória mínima 5-FC - 5-fluorcitosina

CNRE-1 - C. neoformans repetitive element 1

EK – eletrophoretic kariotyping (cariotipagem eletroforética)

EUCAST - European Commitee of Antibiotic Susceptibility Testing FZ – fluconazol

g – aceleração da gravidade

GRUPO I – pacientes com uma única internação GRUPO II – pacientes com mais de uma internação GXM - glucoronoxilomanana

IIER – Instituto de Infectologia Emílio Ribas IN - iniciador

IZ - itraconazol

HAART – highly active antiretroviral therapy HIV – vírus da imunodeficiência humana LCR- líquido cefalorraqueano

MEE - multilocus enzyme electroforese

NCCLS - National Commitee for Clinical Laboratory Standards OFAGE – orthogonal field alternation gel eletrophoresis

pb – pares de base

PFGE – eletroforese em campo pulsátil

PCR-RAPD – random amplification of polymorphic DNA RFLP - restriction fragment length polymorphism

LISTA DE TABELAS E FIGURAS

Página

Tabela 1 - Síntese dos dados e perfis moleculares por PFGE e PCR-RAPD dos isolados do grupo I...44

Tabela 2 - Síntese dos dados e perfis moleculares por PFGE e PCR-RAPD dos isolados dos pacientes do Grupo II ...51 .

Figura 1- Ciclo de vida do Cryptococcus neoformans...5

Figura 2 – Escolha dos iniciadores (in) para PCR-RAPD- perfis de bandas gerados por C. neoformans sorotipos A (ATCC 32045), D (ATCC 28958) e AD (ATCC 48184) com in 1 a 6 ...……...41

Figura 3 – Provável sorotipo dos isolados clínicos - similaridades observadas entre os perfis de bandas com in3 e in4 dos sorotipos A, D, AD e o isolado clínico do paciente P1b e do paciente P2a...41

Figura 4A - Grupo I- total de perfis de bandas gerados, por PFGE, nos isolados dos pacientes com mais de uma internação (I-IX)...45

Figura 4B- Representação esquemática da figura 4A...45

Figura 5A - Grupo I – perfis de bandas gerados, por PFGE, nos isolados seriados dos pacientes com mais de uma internação (P1, P2, P3)... 46

Figura 5B – Representação esquemática da figura 5A... 46

Figura 7 - Grupo I – perfis de bandas gerados, por PCR-RAPD com in3 nos isolados seriados dos pacientes com mais de uma internação (P1, P2, P3)...47

Figura 8- Grupo I- total de perfis de bandas gerados por PCR-RAPD com in4 nos isolados dos pacientes com mais de uma internação (I-VI)...48

Figura 9 - Grupo I- perfis de bandas gerados por PCR-RAPD com in4 nos isolados seriados dos pacientes com mais de uma internação (P1, P2, P3)...48

Figura 10A - Grupo II – total de perfis de bandas gerados por PFGE nos isolados dos pacientes com uma internação ( I- XI )...52

Figura 10B – Representação esquemática da figura 10A...52

Figura 11A - Grupo II – perfis de bandas gerados por PFGE nos isolados seriados dos pacientes com uma internação (P4- P12)...53

Figura 11B – Representação esquemática da figura 11A...53

Figura 12- Grupo II – total de perfis de bandas, gerados por PCR-RAPD com in3, dos isolados de pacientes com uma internação (I-XIII)...54

Figura 13 – Grupo II – perfis de bandas gerados por PCR-RAPD, com in3, nos isolados seriados dos pacientes com uma internação (P4-P12)...54

Página

1. INTRODUÇÃO...1

1.1.Histórico...2

1.2. Morfologia e Ciclo de Vida...3

1.3. Sorotipos do C. neoformans...6

1.4. Variedades do C.neoformans...6

1.5. Ecologia e Epidemiologia...8

1.6. Patogenia...11

1.7. Diagnóstico Laboratorial...12

1.8. Sensibilidade aos Antifúngicos...13

1.9. Antifúngicos e Tratamento...14

1.10.Criptococose e Aids...16

1.11. Tratamento da neurocriptococose em pacientes com Aids...17

1.12. Genotipagem...18

1.12.1. “Pulsed Field Gel Eletrophoresis” (PFGE) ou cariotipagem eletroforética (CE)...18

1.12.2. “Random Amplification of Polymorphic DNA” (PCR-RAPD)………. .20

1.13. Variabilidade dos isolados de C. neoformans...21

1.14. Estudo Molecular da Criptococose Recorrente...22

2. OBJETIVOS ...25

2.1. Objetivo Geral... 26

2.2. Objetivos Específicos... 26

3. MATERIAIS E MÉTODOS...27

3.1. Pacientes e amostras clínicas...28

3.2. Identificação dos isolados de C. neoformans e variedade...29

3.3. Cepas padrão de C. neoformans var. neoformans...30

3.4. Obtenção de Protoplastos...….31

3.5. PFGE...31

3.5.1. Corrida Eletroforética...32

3.5.2. Critérios para leitura das bandas...33

3.6. PCR-RAPD...33 3.6.1. Extração de DNA genômico...33

3.6.2. Avaliação da extração do DNA genômico...34 3.6.3. Quantificação do DNA genômico...34 3.6.4. Seleção das seqüências iniciadoras...…..35 3.6.5. Reação em cadeia da polimerase (PCR)...…...35 3.6.6. Eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida ...36 3.6.7. Critérios para leitura das bandas...37

4. RESULTADOS...38 4.1. Identificação bioquímica dos isolados...39 4.2. Seleção das seqüências iniciadoras...39 4.3. Análise molecular dos isolados dos pacientes do Grupo I...42 4.4. Análise molecular dos isolados dos pacientes do grupo II...49

5. DISCUSSÃO...56

6. CONCLUSÕES...65

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...67

1. INTRODUÇÃO

1.1. Histórico

A criptococose é uma infecção fúngica causada por levedura capsulada do gênero Cryptococcus. Este gênero compreende 34 espécies, sendo Cryptococcus neoformans o principal patógeno, daí o termo criptococose estar associado com infecção por C. neoformans. A doença foi descrita pela primeira vez em 1894, pelo patologista alemão Busse. Ele observou a presença de corpúsculos redondos a ovais em tumor de tíbia de uma paciente que posteriormente morreu com infecção disseminada. Estes corpúsculos cresceram em cultura. No mesmo ano, Sanfelice isolou a levedura capsulada em suco de pêssego e classificou-a como

Saccharomyces neoformans. Em 1895, Sanfelice inoculou a S. neoformans

em animal e, assim, provou a sua patogenicidade. Ele também reconheceu a semelhança entre esta levedura e a isolada por Busse. Em 1901, Vuillemin re-classificou os fungos isolados por Busse e por Sanfelice para o gênero

Cryptococcus como C. hominis e C. neoformans respectivamente. Estas

leveduras não apresentavam os ascósporos que caracterizavam o gênero

Saccharomyces (Kwon-Chung et al., 1992).

No Brasil, o primeiro caso de neurocriptococose foi relatado em 1941, na cidade de São José de Rio Preto, São Paulo (Reis-Filho et al., 1985).

1.2. Morfologia e Ciclo de Vida

Cryptococcus neoformans apresenta-se sob duas formas:

assexuada (ou anamorfa ou imperfeita) e sexuada (ou teleomorfa ou perfeita). A forma anamorfa apresenta-se como célula esférica ou ovalada com gemulação multipolar e uma cápsula polissacáride. A parede celular é espessa e o citoplasma contém estruturas globosas formadas por substâncias refringentes à luz do microscópio. A virulência está intimamente associada com a cápsula (Mendes-Giannini et al., 2001).

O ciclo de vida do C. neoformans foi descrito por Kwong-Chung em 1975. O estado sexuado (basidiomiceto pertencente ao gênero

Filobasidiella) foi obtido pela conjugação, “in vitro”, de duas leveduras

compatíveis α e a. No ponto de contato entre as células ocorre a formação de micélio dicariótico com septos dolipóricos e grampos de conexão. As hifas produzem basídios terminais subglobosos a clavados, nos quais ocorre a cariogamia e meiose. Os basidiósporos são produzidos em 4 pontos no ápice dos basídios. São unicelulares, ovais, elípticos ou piriformes com parede celular ligeiramente áspera (Kwong-Chung, 1975) (Figura 1).

esporos durante a formação da cadeia. Os basidiósporos são secos e acapsulados, mas quando entram em contato com meio de cultura, incham e tornam-se leveduras com brotamentos e cápsula (Kwong-Chung, 1976a; Kwong-Chung, 1980). O estado perfeito das duas variedades (var.) apresentam diferenças, dentre as quais a mais marcante é a forma e o tamanho dos basidiósporos. Na var. neoformans os basidiósporos são subglobosos a elípticos e delicadamente ásperos. Os produzidos da var.

bacillospora são estreitos, lisos, em forma de vara com ou sem curvatura

(Kwong-Chung, 1976b). Isolados clínicos e ambientais do tipo α são 30 a 40 vezes mais freqüentes que os do tipo a (Kwong-Chung et.al. 1978).

A forma anamorfa de C. neoformans pertence ao Reino Fungi; Divisão Eumycota; Sub-divisão Deuteromycotina; Classe Blastomycetes; Família Cryptococcaceae; Gênero Cryptococcus; Espécie neoformans; Variedades neoformans e gattii. A forma teleomorfa (Filobasidiella

neoformans) pertence ao Reino Fungi; Filo Basidiomycota; Classe Heterobasidiomycetes; Ordem Filobasidiales; Família Filobasidiaceae;

Gênero Filobasidiella; Espécie neoformans; Variedades neoformans e

meiose

Basidio

cariogamia

conjugação

germinação

α

Fase

haplóide

1.3. Sorotipos do Cryptococcus neoformans

As diferenças estruturais na composição da glucoronoxilomanana (GXM), principal componente da cápsula do C. neoformans, levam a diferenças antigênicas que são utilizadas para classificar, sorologicamente, as cepas de C. neoformans.

As primeiras distinções entre as cepas de C. neoformans foram feitas em 1935 por Benham que, por meio da reação de aglutinação e precipitação verificou diferenças antigênicas no polissacáride capsular de C.

neoformans. Em 1949, Evans classificou os isolados de C. neoformans em

três sorotipos ( A, B, C). Mais tarde, Vogel identificou o quarto sorotipo ( D) (Kwon-Chung, 1992).

Estudos posteriores realizados por Ikeda et al.(1982;1985) caracterizaram os fatores antigênicos dos 4 sorotipos até então conhecidos e propuseram um quinto sorotipo (AD). Assim, os fatores antigênicos do sorotipo A são 1, 2, 3 e 7; do sorotipo B são 1, 2, 4 e 5; do sorotipo C são 1, 4 e 6; do sorotipo D são 1, 2, 3 e 8; e do sorotipo AD são 1, 2, 3, 7 e 8.

Os sorotipos estão agrupados em 2 variedades; os sorotipos A, D e AD pertencem à espécie C. neoformans var. neoformans e os sorotipos B e C à espécie C. neoformans var. gattii (Kwon-Chung et al.,1982b).

1.4.Variedades do Cryptococcus neoformans

Foram realizadas várias tentativas para elaborar meios seletivos para distinguir diferenças bioquímicas entre as duas variedades. Kwon-Chung et al. (1982a) desenvolveram ágar à base de L-canavanina, glicina e azul de bromotimol (CGB) e verificaram que a variedade gattii cresce no meio CGB e hidrolisa a glicina, modificando o pH do meio e mudando a cor para azul-cobalto. As variedades também podem ser distinguidas pela habilidade de utilizar a D- prolina como fonte de nitrogênio. A var. gattii apresenta assimilação de D-prolina positiva nas provas in vitro de assimilação de fontes nitrogênio (Dufait et al., 1987).

Franzot et al.(1999) propuseram a criação de uma nova variedade tendo como base as diferenças genotípicas existentes entre os sorotipos A e D. Estes pesquisadores observaram que as cepas apresentavam padrões distintos após hibridização da sonda CNRE-1 “C.

neoformans repetitive element 1” com o DNA dos sorotipos A e D e

1.5. Ecologia e Epidemiologia

O primeiro isolado de C. neoformans foi obtido de suco de pêssego em 1895 e, depois, do leite em 1901. Mais tarde, em 1951, Emmons isolou amostras do solo e, em 1955, das excretas de pombos (Rippon, 1988; Levitz, 1991).

As duas variedades diferem em seu “habitat” natural e distribuição geográfica. C. neoformans var neoformans tem distribuição mundial sendo freqüentemente isolado em fezes secas de pombos e solo contaminado com fezes de aves. Ainda não está bem esclarecida a sua origem nas fezes das aves, pois elas não são infectadas pela levedura. Supõe-se que as aves resistam à infecção devido a alta temperatura corporal, que varia entre 41 e 43ºC. Acredita-se que as leveduras possam estar associadas à matéria em decomposição (Kwon-Chung et al., 1992; Richardson et al., 1998).

No Brasil, amostras de C. neoformans var. neoformans já foram isoladas de madeira em decomposição, dentro de ocos de árvores das espécies Syzygium jambolana, Cassia grandis, Senna multijuga e Ficus

microcarpa em áreas urbanas da cidade do Rio de Janeiro. Estes dados

sugerem que esta variedade pode habitar diferentes locais não associados às aves (Lazera et al., 1993; 1996).

Fezes de pombo são reservatórios dos sorotipos A e D mas, o nicho ecológico desses sorotipos não é conhecido. O sorotipo D é raro, exceto na Europa, em que é agente de 20 a 100% dos casos de criptococose (Dromer et al, 1996).

C. neoformans var. gattii é predominante nas regiões tropicais e

entre doença em mamíferos e exposição à árvore (Ellis et al., 1990; Sorrell et al., 1997). No Brasil esta variedade já foi isolada de fezes de morcegos e de árvores nativas como oiti (Moquilea tomentosa) e Guettarda acreana da floresta amazônica (Lazera et al., 1993; Lazera et al., 1998; Lazera et al., 2000; Fortes et al., 2001).

Num estudo epidemiológico realizado por Kwong-Chung et al.(1984), o sorotipo B foi 4,5 vezes mais prevalente que o sorotipo C. A maioria dos isolados do sorotipo C foi obtida de isolados provenientes do sul da Califórnia. Callejas et al. (1998) relataram o isolamento deste sorotipo no meio ambiente, em amendoeira (Terminalia catappa) na Colômbia (Callejas et al., 1998).

A infecção em humanos ocorre por inalação de partículas infecciosas de C. neoformans suspensas no ar, por meio de correntes de vento ou distúrbios mecânicos. As leveduras encapsuladas (blastoconídeos) são muito grandes (4-20μm) para penetrar e escapar dos mecanismos de defesa do trato respiratório inferior. A hipótese mais favorável é de que as partículas infecciosas (menores que 2 μm) sejam leveduras haplóides acapsuladas dessecadas disseminadas por excretas secas de aves, especialmente pombos (Ellis et al., 1990). Coletas de ar de ambientes com excrementos de pombos demonstraram que existem partículas de C.

neoformans com diâmetros compatíveis com a deposição nos alvéolos, o

rapidamente nos alvéolos do que as células haplóides. Estudos de Kwon-Chung et al. (1992) reforçam esta teoria, pois mostraram que os basidiósporos são patogênicos quando inoculados em camundongos. Com relação aos basidiósporos da var. gattii, Ellis et al. (1990) sugeriram que estão presentes em eucaliptos.

A freqüência com que a população está exposta ao C.

neoformans var. neoformans indica que este agente tem caráter oportunista,

pois causa criptococose, preferencialmente, em pacientes imunossuprimidos. Já a var. gattii acomete, preferencialmente, pacientes não imunossuprimidos do sexo masculino após a segunda década de vida e em áreas geográficas limitadas indicando comportamento de patógeno primário, assemelhando-se a outros agentes de micoses sistêmicas (Rozenbaum et al., 1994).

A revisão de literatura realizada por Littman e Zimmerman mostrou que havia 300 casos de criptococose registrados até 1955. Com o passar dos anos os casos confirmados aumentaram drasticamente pelo uso de terapias imunossupressoras (Kwong-Chung et al., 1992).

No Brasil, estudos realizados nos estados do Rio de Janeiro e São Paulo mostraram que a maioria dos pacientes foi infectada pelo C.

neoformans var. neoformans (sorotipos A e D) e, uma minoria foi infectada

por C. neoformans var. gattii (sorotipo B) (Lacaz, et al., 1983; Rozenbaum, 1990; Morales, 1999; Calvo et al., 1999; Rozenbaum et al., 1994; Nishikawa et al., 2003).

A cidade de São Paulo apresenta clima tropical temperado. As populações de pombos podem ser consideradas um problema, não somente pelo grande número mas também, pela grande quantidade de fezes que são depositadas em locais públicos servindo de substrato para C. neoformans var. neoformans. Nesta cidade, também é comum a prática de reflorestamento de áreas públicas extensas, principalmente parques com espécies de eucalipto, reconhecidas como hospedeiras de C. neoformans var. gattii. Estas características permitem o estabelecimento de focos do fungo na cidade (Montenegro Netto, 1998; Montenegro et al., 2000).

1.6. Patogenia

C. neoformans não faz parte da microbiota normal, mas pode ser

seguintes formas clínicas: forma pulmonar regressiva, forma pulmonar progressiva e forma disseminada.

A forma pulmonar regressiva é encontrada em indivíduos sem imunossupressão e, normalmente, apresenta infecção pulmonar assintomática ou sintomas de infecção respiratória leve, com resolução espontânea. A forma pulmonar progressiva pode resultar da infecção primária, ou mais freqüentemente, de reativação de um foco quiescente. Na forma disseminada, a infecção pulmonar pode se disseminar por via hematogênica e atingir outros órgãos como o sistema nervoso central, causando meningoencefalite que é a principal manifestação clínica da doença. Pele, ossos, olhos e mais raramente coração, fígado, glândula supra-renal, tiróide e próstata podem, também ser acometidos. As principais manifestações clínicas da meningoencefalite são: febre, cefaléia, mudanças no nível de consciência (sonolência, confusão mental, estupor ou coma), tonturas, irritabilidade, convulsões, distúrbios visuais, náuseas ou vômitos (Rozenbaum, 1990; Moretti-Branchini et al., 2004).

1.7. Diagnóstico Laboratorial

Devido ao seu tropismo pelo sistema nervoso central, o líquido cefalorraqueano (LCR) é o material biológico mais utilizado para o diagnóstico laboratorial, porém, outros materiais biológicos podem ser utilizados como: escarro, lavado brônquico, pus de lesões cutâneo-mucosas, urina, tecidos obtidos por biópsia, secreção prostática, sangue e punção de medula óssea (Mendes-Giannini et al., 2001).

semeado em ágar Sabouraud e ágar BHI (Brain Heart Infusion). A semeadura do material biológico em ágar Niger permite que o C.neoformans desenvolva colônias com várias tonalidades de marrom devido a presença de

Guizotia abyssinica, que induz a produção de melanina mudando a cor da

colônia. A estes meios são adicionados antibióticos para inibir crescimento de bactérias. Um método rápido e altamente sensível utilizado em fluidos corpóreos como LCR, soro e urina é a detecção do antígeno polissacarídico de C. neoformans, pela aglutinação com partículas de látex (Mendes-Giannini et al., 2001).

1.8. Sensibilidade aos Antifúngicos

Os testes de sensibilidade são ferramentas importantes para determinação da resistência de um microorganismo frente a uma droga antimicrobiana. A metodologia considerada padrão para o teste de suscetibilidade aos antifúngicos para as espécies de Candida e do

Cryptococcus neoformans foi proposta pelo comitê norte-americano para

padronização de testes em laboratório clínico “National Commitee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS) documento M27-A.

No micrométodo considera-se para leitura da CIM, inibição de 50% (Rodriguez-Tudela et al., 2001).

Com o intuito de melhorar a metodologia, um grupo de pesquisadores europeus pertencentes ao “European Commitee of Antibiotic Susceptibility Testing” (EUCAST) avaliou mudanças nas condições do teste adequando-o para as diferentes espécies leveduras, em especial, não-fermentadoras de glicose, como Cryptococcus neoformans. Este comitê propôs as seguintes modificações ao documento M 27-A (NCCLS, 1997): adição de 2% de glicose ao meio RPMI-1640, inóculo de 0,5-2,5 X 105 UFC/ml e leitura em espectrofotômetro, com ponto de corte de 50% para azóis e 5- fluorocitosina e de 95% para Anfotericina B, (Rodriguez-Tudela et al., 2001). Os antifúngicos foram avaliados em 10 concentrações diferentes, sendo que a concentração final dos antifúngicos, antes da adição do inoculo da amostra variaram de 64 μg/ml a 0,125 μg/ml para FZ e 5-FC e de 16μg/ml a 0,03μg/ml para AnfoB e IZ. O valor de CIM que separa as amostras em sensível e resistente é denominado ponto de corte. No documento M27-A, Rex et al. (1997) propuseram uma terceira categoria chamada de sensibilidade dependente da dose (S-DD). Em 2002 o Doc. M27A2 substituiu

o anterior e é considerado o documento de referência para testes de sensibilidade para Candida spp e C. neoformans.

1.9. Antifúngicos e Tratamento

concentração, podendo ser fungicida ou fungistática. Isso pode explicar as recidivas após a suspensão da medicação. Para minimizar a intolerância e nefrotoxicidade causada pela Anfo B convencional, preparada com desoxicolato, foram desenvolvidas novas formulações como: Anfo B ligada a complexo lipídico (ABLC, Abelcet), AnfoB lipossomal (Ambisome) e Anfo B em dispersão coloidal (ABCD, Amphocil). Tais mudanças permitiram aumentar as doses diárias do paciente. Apesar das dificuldades metodológicas na detecção de isolados resistentes a Anfo B são raras as espécies que apresentam resistência à droga (Pappalardo, 2002; Vivaldini, 2003).

A 5-FC é um fármaco que atua sobre a síntese de ácidos nucléicos e apresenta excelente penetração no LCR. A resistência primária das leveduras a este antifúngico é pouco freqüente, mas é comum o surgimento de resistência secundária, ou adquirida durante o tratamento. Dependendo da gravidade da infecção, associa-se 5-FC à Anfo B (Bodey, 1996; Pappalardo, 2002).

O FZ é uma droga azólica, fungistática que age inibindo a enzima 14 α-dimetilase dependente do citocromo P-450. Este processo interrompe uma das etapas para formação do ergosterol, principal componente da membrana citoplasmática dos fungos, levando a perda da permeabilidade seletiva da célula (Andriole, 1998; Richardson et al., 1998).

1.10. Criptococose e aids

Primariamente, a criptococose era uma infecção rara e esporádica que acometia indivíduos com deficiência imunológica mediada por célula T como os pacientes com câncer, receptores de transplantes de órgãos e os submetidos ao tratamento com corticosteróides. Após a década de 80 e a introdução da aids, a infecção tornou-se uma das maiores causas de meningites ou meningoencefalites e morte com ocorrência de 5 a 15% dos casos (Kwon-Chung et al., 1990; Richardson et al.,1998).

A introdução da terapia antiretroviral (HAART–“highly active antiretroviral therapy”) na metade da década de 90 reduziu as taxas de infecções oportunistas em alguns países ocidentais. O uso de antiretrovirais confere aumento da produção de células T CD4 e consequentemente, resistência às infecções oportunistas. Em São Paulo, dados do Serviço de Epidemiologia do Instituto de Infectologia Emílio Ribas mostraram que as taxas de criptococose nos pacientes com Aids atendidos nesse hospital diminuíram nos últimos anos, a saber: 7,7% em 1995; 7,4% em 1996; 8,2% em 1997; 6,8% em 1998; 5,8% em 1999; 4,6% em 2000, 3,1% em 2001, se mantendo a mesma até abril de 2002 (3,1%) (Pappalardo et al., 2003). No Estado de São Paulo o porcentual de diagnóstico de criptococose em casos notificados de Aids em maiores de 13 anos foi de 1,32 % em 2004. (www.aids.gov.br).

1.11. Tratamento da neurocriptococose em pacientes com aids

A infecção pelo vírus HIV confere a criptococose certas características que interferem na escolha do tratamento. É necessária a instituição inicial de um tratamento de ataque que tem como objetivo negativar as culturas, seguido de tratamento profilático das recidivas, chamado de manutenção, por toda a vida. A elevada freqüência das recidivas, após a cura aparente, caso não seja seguido um tratamento de manutenção, sugere que alguns focos de infecção não foram erradicados. O agravamento do déficit imunitário, provavelmente seja o fator que permite o despertar dos focos quiescentes (Dupont, 1992).

O tratamento inicial dura cerca de 6 a 10 semanas ou até negativar as culturas em LCR. Nesta fase, geralmente utiliza-se tratamento com Anfo B. As recaídas são comuns em 50 a 75% dos casos, principalmente se a terapia for interrompida. Em alguns casos pode ser utilizado o FZ que, apesar de ser bem tolerado, para alguns pacientes é ineficaz. Quando o tratamento da fase inicial é feito somente com azóis, normalmente, há melhora clínica, mas as culturas em LCR permanecem positivas. A seguir passa-se para a fase de manutenção que tem duração variável dependendo da evolução clínica do paciente. O FZ é o fármaco de eleição nesta fase do tratamento (Pappalardo, 2002).

Após a estabilidade do sistema imune pelo uso das terapias antiretrovirais ocorre suspensão da medicação utilizada na fase de manutenção da criptococose (Pappalardo, 2002).

desenvolvimento de resistência de C. neoformans. Larsen et al (1989) concluíram que mesmo após o uso de terapia antifúngica no tratamento da meningite criptocóccica pode haver persistência de C. neoformans no trato urinário, provavelmente na próstata, que seria um órgão reservatório da infecção e responsável pela recorrência, principalmente, em pacientes com Aids.

1.12. Genotipagem

1.12.1. “Pulsed Field Gel Eletrophoresis” (PFGE) ou Cariotipagem Eletroforética (CE)

lise das células e manipulação de grandes moléculas de DNA na qual as células são suspensas em agarose de baixo ponto de fusão e colocadas em moldes antes de solidificarem. Estes moldes são introduzidos no gel de corrida da eletroforese.

Os sistemas utilizados para a realização da eletroforese sofreram várias modificações como o desenho do equipamento e distribuição dos eletrodos na cuba de eletroforese. Dentre os diferentes sistemas existentes, um dos mais utilizados é o sistema CHEF (Contour- Clamped Homogeneous Electric Field) descrito por Chu, et al. (1986). O campo elétrico na cuba de eletroforese é gerado por múltiplos eletrodos formando um contorno hexagonal.

A utilização desta metodologia em fungos apresenta alguns problemas. No caso de C. neoformans, a cápsula polissacáride interfere na formação do protoplasto e conseqüentemente, na extração do DNA. Como resultado os cariótipos são normalmente borrados ou rompidos incompletamente, especialmente na variedade gattii. Além disso, C.

neoformans produz nucleases que podem degradar o DNA de alta massa

molecular. Muitas vezes estes fatores fazem com que o número de cromossomos e o padrão de bandas não sejam conclusivos (Cazin et al., 1969; Wickes et al.,1994).

1.12.2. “Random Amplification of Polymorphic DNA” (RAPD)

A técnica foi descrita por Williams et al. (1990) e consiste na amplificação do DNA genômico utilizando iniciadores simples com seqüências de nucleotídeos arbitrárias. Estes iniciadores detectam polimorfismo na ausência de informação da seqüência específica de nucleotídeos e funcionam como marcadores genéticos. As seqüências de nucleotídeos dos iniciadores são pequenas (9 ou 10 bases), com 50 a 80% de G+C e sem seqüências palindrômicas. Quanto às condições de amplificação, a principal diferença para a reação em cadeia da polimerase (PCR) são as baixas temperaturas de anelamento (em torno de 36ºC). Esta técnica pode ser utilizada para amplificar segmentos de DNA genômico de uma grande variedade de espécies. Os polimorfismos entre os produtos amplificados são freqüentemente detectados e são úteis como marcadores genéticos.

A RAPD é ideal para tipagem de cepas de C. neoformans, principalmente em estudos epidemiológicos em larga escala. Em análises comparativas pode-se identificar a fonte de infecção, distinguir re-infecção de falha no tratamento ou recidiva (Haynes et al.1995). Um dos primeiros trabalhos realizados na genotipagem de C. neoformans utilizando RAPD foi descrito por Crampin et al. (1993), no qual 12 isolados foram analisados (9 clínicos, 1 ambiental e 2 de coleção de cultura de países diferentes). Cada isolado gerou um perfil de banda diferente que variou de 4 a 12 bandas com tamanho variando de aproximadamente 100 a 1500 pb.

2 iniciadores para detectar maior polimorfismo e maximizar a reprodutibilidade (Micheli et al., 1993).

1.13. Variabilidade dos isolados de C. neoformans

Várias metodologias já foram utilizadas para estudar os perfis de bandas dos isolados de C. neoformans como “multilocus enzyme electrophoresis” (MLEE ou MEE); RAPD, utilizando-se diferentes seqüências iniciadoras; RFLP com sonda CNRE-1; DNA fingerprint e PFGE ( Barchiesi et al. 1995; Brandt et al. 1996a; Brandt et al. 1996b; Currie et al., 1994; Franzot et al. 1997; Fries et al. 1996; Haynes et al. 1995; Horta et al. 2001; Igreja et al. 2004; Klepser et al. 1998; Perfect et al. 1989; Polachek et al. 1989; Spitzer et al. 1993; Varma et al. 1995).

Os estudos moleculares mostraram que os isolados de C.

neoformans exibem diferentes graus de heterogeneidade genética entre

amostras clínicas e ambientais mesmo em pequenas áreas geográficas (Curie et al., 1994). Acredita-se que exista maior diversidade de genótipos entre isolados de C. neoformans var. neoformans do que entre os isolados de C. neoformans var. gattii (Calvo et al., 2001). Os relatos de Meyer et al., 1993 também sugerem que a variedade gattii é geneticamente mais homogenia do que a var. neoformans.

As diferenças cromossômicas entre as cepas fazem com que a cariotipagem seja uma ferramenta útil para propósitos epidemiológicos (Perfect et al., 1993). O polimorfismo genômico detectado pela reação de PCR-RAPD apresenta uma maior ou menor heterogeneidade nos perfis de bandas dependendo do iniciador utilizado (Rezende, 2002).

por Franzot et al. (1997) em isolados do Rio de Janeiro e Belo Horizonte ( 14 cariótipos em 51 isolados) e por Calvo et al. (2001) em isolados provenientes de várias regiões do Brasil (9 cariótipos em 25 isolados) ambos por PFGE. Resultados semelhantes foram obtidos por Igreja et al.(2004) com “PCR fingerprinting” de isolados do Rio de Janeiro e por Vivaldini (2003) e Aoki et al. (1999), ambos por RAPD em isolados de São José do Rio Preto e Campinas, respectivamente, ambas no Estado de São Paulo. Maior heterogeneidade, por RAPD, foi verificada por Rezende (2002) em isolados clínicos provenientes de Araraquara e Ribeirão Preto e por Horta et al.( 2002) com isolados do Rio Grande do Sul. Barreto de Oliveira et al., (2004) demonstraram uma considerável diversidade genotípica em isolados brasileiros pela amplificação seletiva de fragmentos de DNA gerados por enzima de restrição (AFLP).

O conhecimento da variação genética de um patógeno é essencial em diferentes aspectos como, relacioná-la com resposta imune do hospedeiro, virulência, mecanismos de escape, evolução e adaptação do microrganismo (Jain et al., 2005).

1.14. Estudos moleculares sobre a criptococose recorrente

Os métodos moleculares são normalmente utilizados para distinguir diferenças entre as variedades e entre os sorotipos. São extremamente úteis na resolução e distribuição das amostras, demonstrando o grau de relacionamento do isolado inicial e o da recidiva no mesmo paciente (Polachek et al., 1989; Wickes et al., 1994).

recorrência são os mesmos em todas as técnicas utilizadas (Franzot et al., 1997; Perfect et al. 1989; Spitzer et al., 1992; Varma et al., 1992; Spitzer et al., 1993; Brandt et al., 1996; Chen et al., 1996; Garcia-Hermoso et al., 1999; Sukroongreung et al. 2001; Igreja et al., 2004).

Casos de padrão genotípico diferentes entre os isolados da infecção inicial e os da recorrência foram relatados por Barchiesi et al.,1995; Haynes et al., 1995; Fries et al., 1996; Sullivan et al., 1996; Almeida, 2000; Rezende, 2002.

Outros autores sugerem casos de infecção mista, isto é, mais de uma cepa de C. neoformans co-infectando o mesmo hospedeiro (Barchiesi et al, 1995; Fries et al., 1996; Klepser et al., 1998; Rezende, 2002; Igreja et al., 2004; Jain et al., 2005).

Brandt et al. (1996b) analisaram 102 isolados de 33 pacientes por MEE, PFGE, RAPD e “DNA fingerprinting” com sonda CNRE-1. Todos os isolados seriados do mesmo paciente foram idênticos por MEE, RAPD e DNA fingerprinting. Porém por PFGE, em 24% dos pacientes os isolados seriados mostraram perfis com pelo menos 2 bandas de diferença. Devido às divergências de resultados os autores se mostraram relutantes em sugerir que houve re-infecção por nova cepa somente com a alteração do cariótipo sem que houvesse mudança nos perfis do RAPD, MEE ou RFLP.

Mais tarde, Igreja (1999) estudando, por “PCR fingerprinting”, isolados seriados de C. neoformans provenientes de pacientes do Rio de Janeiro, observou que a maioria das amostras foi idêntica. Contudo, dois pacientes apresentaram diferenças, em um deles os isolados diferiram em subtipo e em outro os isolados foram bem diferentes quanto ao perfil de bandas e a confirmação bioquímica concluiu que um dos isolados era da var.

gattii. Os mesmos resultados foram encontrados posteriormente,

incluindo-se análiincluindo-se por RAPD (Igreja et al., 2004).

Resultados semelhantes foram obtidos por Vivaldini (2001) em isolados de LCR provenientes de pacientes da cidade de São José do Rio Preto (São Paulo). A análise por RAPD mostrou que os isolados seriados do mesmo paciente apresentaram alto grau de similaridade genética sugerindo que a infecção foi causada pela mesma cepa inicial. No estudo de Rezende (2002), dos 5 pacientes com amostras seriadas, 2 apresentaram isolados com perfis de bandas idênticos sugerindo recidiva pela mesma cepa inicial; 2 apresentaram perfis de bandas diferentes (isolados de sorotipos diferentes) sugerindo infecção mista e um paciente com isolados do mesmo sorotipo mas com perfis diferentes sugerindo re-infecção por nova cepa ou alteração genética.

Determinar se a análise molecular de isolados seriados de C.

neoformans, provenientes de pacientes com Aids e criptococose, podem

distinguir se infecções recorrentes são recidivas ou re-infecções.

2.2. Objetivos Específicos:

1- Estabelecer os perfis genotípicos de isolados clínicos de C.

neoformans por PFGE e PCR-RAPD;

2- Analisar a diversidade de perfis genotípicos entre os pacientes e no mesmo paciente;

3.1. Pacientes e amostras clínicas

Este estudo foi realizado utilizando-se amostras de C. neoformans isoladas de LCR de 12 pacientes com meningoencefalite e Aids internados no Instituto de Infectologia Emílio Ribas (IIER). As amostras foram coletadas no período de 1995 a 1997. Elas foram previamente estudadas por Pappalardo (2002) para análise dos testes de sensibilidade a antifúngicos associados às informações clínicas, localidade, data de coleta e administração de antifúngicos. Os critérios utilizados para a inclusão dos pacientes no estudo de Pappalardo foram: a) pacientes com no mínimo 3 isolados de C. neoformans de LCR; b) 1ª coleta de LCR realizada no momento do diagnóstico de criptococose de SNC e sem uso de Anfo B ou FZ; c) idade maior ou igual a 13 anos; d) diagnóstico de Aids segundo normas do CDC (1987); e) prontuário médico disponível no Serviço de Arquivo Médico do IIER. O estudo da série de casos foi descritivo e retrospectivo. Os dados epidemiológicos, clínicos e laboratoriais foram consultados no período de 1997 a 2000 (Pappalardo, 2002).

Os isolados foram mantidos na seção de Micologia do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, a –20ºC em caldo BHI contendo 20% de glicerol. Do trabalho original, contendo 168 amostras isoladas de 35 pacientes, foram recuperadas 54 isolados de 12 pacientes.

As amostras foram identificadas com a letra P (paciente), seguida do número de amostras (P1 a P12). Cada isolado recuperado do mesmo paciente recebeu uma letra, sendo “a” para o isolado inicial (primeira amostra), “b”, “c” e assim por diante para as demais amostras seqüenciais.

pacientes que só foram internados uma vez e todos os isolados foram coletados durante essa internação. Pertencem a este grupo 9 pacientes, totalizando 39 isolados.

As tabelas 2 e 3 (Resultados) mostram todos os pacientes, isolados e períodos de coleta.

3.2. Identificação dos isolados de Cryptococcus neoformans e variedade

Para cada isolado congelado foi retirada uma alíquota e semeada em ágar Sabouraud. A seguir, as placas foram incubadas a 30ºC até que houvesse crescimento de colônias de leveduras. Todos os isolados foram re identificados seguindo os métodos clássicos de identificação (Kwong-Chung, 1998). As provas descritas a seguir foram realizadas nas culturas de C.

neoformans semeadas em agar Sabouraud-dextrose-cloranfenicol incubadas

a 25°C por até 48h. Com exceção da prova de assimilação as demais foram realizadas colocando-se uma pequena alçada da cultura nos diferentes meios descritos abaixo:

- Hidrólise da uréia: foi semeada em agar uréia de Christensen e incubada a 25ºC por 5 dias. A reação foi considerada positiva quando o meio mudou de cor e tornou-se rosa.

- Presença de enzima fenoloxidase: foi semeada em agar Niger e incubada a 30ºC por 72h. A reação foi positiva com o crescimento de colônias de coloração marrom, indicando a presença da enzima.

- Assimilação de fontes de Carbono e Nitrogênio: Foi preparada suspensão da levedura em solução fisiológica até obter a turbidez 2 da escala de Mc Farland. Os meios de cultura “C” (meio isento de fontes de carbono) e “N” (meio isento de fontes de nitrogênio) foram fundidos e deixados atingir temperatura de 40ºC. Os meios fundidos foram vertidos em placas de Petri 90 X 15 mm e a estes foram adicionados de 1 a 2 ml da suspensão de leveduras. Após homogeneização e solidificação do agar, foram adicionadas as fontes de carbono nas placas contendo meio “C” e as fontes de nitrogênio na placa contendo meio “N”. Após incubação a 25ºC por até 5 dias foram anotadas na ficha de identificação a presença ou ausência de halo de crescimento ao redor da fonte testada.

- Determinação da variedade: foi semeada em tubo contendo agar a base de L- canavanina, glicina e azul de bromotimol (CGB) e incubada a 25ºC por 5 dias. As culturas pertencentes a var. neoformans não crescem e não modificam a cor do meio. As pertencentes a var. gattii crescem e fazem com que o indicador torne o meio azul-cobalto.

3.3. Cepas padrão de C. neoformans

Para controle dos ensaios moleculares foram utilizadas cepas padrão correspondentes aos três sorotipos da variedade neoformans. Trata-se de cepas da American Type Culture Collection (ATCC) que são mantidas na Seção de Micologia a -20º C em caldo BHI contendo 20% glicerol. As cepas foram as seguintes: C. neoformans var. neoformans sorotipo A (ATCC 32045), C. neoformans var. neoformans sorotipo D (ATCC 28958) e C.

neoformans var. neoformans sorotipo AD (ATCC 48184). Para utilização

3.4. Obtenção de protoplastos.

A metodologia, com algumas modificações, baseou-se em vários protocolos (Perfect et al., 1989; Polachek et al., 1989; Barchiesi et al., 1995). As amostras foram semeadas com descritas no item 3.2. Posteriormente foram transferidas para tubos cônicos contendo 20 ml de meio líquido YEPD (1% extrato de levedura; 2% dextrose; 2% bactopeptona) e incubadas a 30ºC por 18 a 20 h sob agitação constante de 90g. As culturas foram centrifugadas por 15 min a 2.800g a 4ºC (ALC 4239R). Após o descarte dos sobrenadantes, os sedimentos foram lavados por 3 vezes com 20 ml de água destilada estéril (por 15 min a 2.800g) e transferidos para tubos de 1,5 ml. Para a digestão da cápsula e parede, as células foram ressuspensas com 200μl de tampão CES (20mM tampão citrato pH 5,6; 50mM EDTA pH 8,0; 0,9M sorbitol) contendo 10mg/ml de enzima lítica de Trichoderma harzianum (Sigma) e incubadas a 37ºC por 2 a 3h, fazendo agitações constantes. Após a incubação, os microtubos foram centrifugados a 4.100 g por 10 minutos a 4ºC, feitas três lavagens com 1ml de tampão CES e ressuspensos em 200μl de tampão CES.

3.5. PFGE

3.5.1. Extração de DNA cromossômico

adequados para confecção dos blocos. Após a polimerização a 4ºC por 20 min os blocos foram removidos dos moldes e colocados em tubos de 2 ml de fundo chato ou placas de cultivo de tecido com 24 poços contendo 2 ml de tampão NET (0,01M Tris HCl pH 7,5; 0,45M EDTA pH 8,0; 1% Laurilsarcosil) e 100μl de proteinase K (20mg/ml). Os tubos ou placas foram incubados por 18h a 50ºC. A seguir foram realizadas 5 lavagens com EDTA 50mM pH 8,0 por 30 min a temperatura ambiente e sob agitação. Os blocos foram mantidos no mesmo tampão e armazenados a 4ºC até o momento do uso.

3.5.2. Corrida eletroforética

3.5.3. Critérios para leitura das bandas

Os tamanhos das bandas foram determinados pela comparação com marcador de peso molecular e os perfis eletroforéticos dos isolados foram comparados visualmente. Os isolados foram considerados idênticos (mesmo tipo de DNA) quando todas as bandas forem exatamente iguais. Foram considerados similares e identificados como subtipos quando a diferença foi de uma banda. Foram considerados diferentes quando a diferença foi de duas bandas ou mais (Barchiesi et al., 1995; Brandt et al.,1996b; Franzot et al., 1997).

Para facilitar a análise das bandas, abaixo das imagens dos géis foi colocada a representação esquemática. Esta representação foi realizada sem auxílio de programas computacionais, apenas sobrepondo traços sobre as bandas existentes na imagem. De acordo com a espessura dos traços estabeleceu-se o seguinte critério:

1

2

3

3.6. PCR-RAPD

3.6.1. Extração de DNA genômico

Para promover a precipitação das proteínas foram adicionados aos sobrenadantes 200μl de clorofórmio-isopropanol (24:1). As misturas foram homogeneizadas e centrifugadas a 15.000g por 15 min. A parte aquosa de cada tubo contendo somente os ácidos nucléicos foi transferida para um novo microtubo. A precipitação das moléculas de DNA foi realizada adicionando-se 3 vezes o volume de isopropanol. Os tubos foram centrifugados a 15.000g por 10 min. Após o descarte dos sobrenadantes, os sedimentos foram lavados com 200-500μl de etanol 70% e centrifugados a 15.000g por 10 min. Os sobrenadantes foram desprezados e os sedimentos foram secos pela inversão do microtubo em papel de filtro. Aos sedimentos foram acrescentados 50μl de H2O contendo 20μg/ml de RNAse e estocados

a –20ºC.

3.6.2. Avaliação da extração do DNA genômico

As amostras de DNA genômico foram analisadas por eletroforese em agarose 2% contendo brometo de etídio. A presença de banda única e bem definida no gel sob luz ultravioleta caracterizou a boa extração do DNA genômico.

3.6.3. Quantificação do DNA

Cada amostra de DNA foi diluída 1:200 em H2O Milli Q estéril e

razão abaixo de 1,6 (presença de proteínas ou contaminantes) foram novamente processadas. As leituras realizadas a 260 nm determinaram as concentrações de DNA. Segundo Sambrook et al. (1989) absorbância igual a 1 equivale à concentração de 50μg/ml de DNA dupla fita.

3.6.4. Seleção das seqüências iniciadoras

Com objetivo de selecionar os oligonucleotídeos que gerassem o melhor perfil de bandas para a leitura visual, as cepas padrões correspondentes aos três sorotipos da variedade neoformans sorotipos A, D e AD. foram ensaiadas por PCR-RAPD. Foram testadas 6 seqüências arbitrárias de 10-mer, desenhadas especificamente para uso em PCR-RAPD (Amersham Biosciences). Trata-se de seqüências universais que podem ser utilizadas para qualquer microorganismo e são as seguintes: 1. 5’-GGTGCGGGAA-3’ -(in1); 2. 5’-GTTTCGCTCC-3’ -(in2); 3. 5-GTAGACCCGT-3’ -(in3); 4. AAGAGCCCGT-5-GTAGACCCGT-3’ -(in4); 5. AACGCGCAAC-5-GTAGACCCGT-3’ -(in5); 6. 5’-CCCGTCAGCA-3’ -(in6).

3.6.5. Reação em cadeia pela polimerase (PCR)

As reações de amplificação foram realizadas com auxílio de um kit Ready-to-Go/RAPD Analysis Beads (Amersham-Pharmacia-Biotech) contendo of 1,5 unidades de Taq DNA polimerase; 10mM Tris-HCl, pH 8,3; 30mM KCl; 3mM MgCl2; 0,4mM de cada dNTP. Cada reação foi realizada

realizadas em termociclador (Progene) e consistiram num ciclo inicial de desnaturação de 5 min a 95ºC, 45 ciclos de desnaturação a 95ºC por 1 min, anelamento por 36ºC por 1 min e extensão a 72ºC por 2 min. O procedimento foi finalizado por um ciclo final de extensão por 10 min. Após o término da reação os tubos contendo o DNA amplificado foram mantidos em freezer – 20ºC até o momento da corrida eletroforética.

3.6.6. Eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida

3.6.7. Critérios para leitura das bandas

4.1. Identificação bioquímica dos isolados

Todos os isolados recuperados do congelamento apresentaram cápsula ao exame direto com tinta da China, produção de fenoloxidase, urease e crescimento a 37ºC. Na prova de assimilação de fontes de nitrogênio, todos os isolados foram positivos para peptona e negativos para KNO3. Na prova de assimilação de fontes de carbono, todas as amostras

foram positivas para a glicose, sacarose, maltose, trealose, L-raminose e inositol. Apresentaram resultado positivo ou variável para celobiose e negativo para lactose. Desta forma, todos os isolados foram identificados como Cryptococcus neoformans. Quanto à determinação da variedade, os isolados não cresceram no meio CGB e não assimilaram D-prolina, sendo classificados como variedade neoformans.

4.2. Métodos moleculares

Em seguida, as amostras foram submetidas aos métodos moleculares. Todos os isolados foram analisados por PFGE e por PCR-RAPD.

Na PCR-RAPD optou-se pela corrida eletroforética em gel de poliacrilamida 3,5%, por apresentar melhor discriminação entre as bandas, principalmente as de menor intensidade.

* * * * * *

pb sorotipo A sorotipo D sorotipo AD

200-* 200-* 200-* 200-* * *

pb sorotipo A sorotipo D sorotipo AD

200-Figura 2. Escolha dos iniciadores para PCR-RAPD: Perfis de bandas de C.

neoformans var. neoformans sorotipos A (ATCC 32045), D (ATCC 28958) e AD

(ATCC 48184) com 6 iniciadores (in1a 6). Géis de poliacrilamida 3,5 % corados pelo brometo de etídio. Marcador molecular 100pb. * iniciadores selecionados.

pb in 3 in 4

* * *

*

1000-

200-

* * *

*

1000-

200-

4.3. Análise molecular dos isolados dos pacientes do Grupo I

O Grupo I foi constituído de 15 isolados provenientes de três pacientes (P1, P2, P3). Na primeira internação, durante a fase aguda, foram tratados com Anfo B e, na fase de manutenção com FZ. Na 2º internação voltaram ao tratamento com Anfo B.

O paciente P1 foi internado duas vezes com intervalo de 136 dias entre as internações. Foram recuperados 6 isolados, três da 1ª internação (a, b, c), com intervalos de coleta de aproximadamente 10 dias. Na segunda internação foram recuperados 3 isolados (d, e, f), com intervalos de coleta de 10 e 3 dias respectivamente. O paciente P2 foi internado duas vezes com intervalo de 75 dias. Da 1ª internação foi recuperado um isolado (a) e da segunda internação 3 isolados (b,c,d) com intervalos de 8 e 2 dias entre si. O paciente P3 foi internado duas vezes com intervalo de 20 dias entre as internações. Da 1ª internação foram recuperados 4 isolados (a, b, c, d) com intervalos de aproximadamente 5 dias entre eles. Da 2ª foi recuperado um isolado (e). A tabela 2 mostra a síntese destes dados.

Os isolados do Grupo I geraram 9 perfis eletroforéticos em PFGE sendo que todos os pacientes apresentaram perfis de bandas distintos entre si (Figura 4A). Para facilitar a visualização dos perfis eletroforéticos foi confeccionada a representação esquemática das bandas (figura 4B).

Os isolados do Grupo I geraram no total 9 perfis de bandas na PCR-RAPD utilizando-se o in3 (figura 6).

Na análise dos perfis de bandas dos isolados seriados de cada paciente, os 6 isolados do paciente P1 apresentaram 3 perfis de bandas distintos. Os coletados da 1ª internação geraram 1 perfil de banda e os da 2ª internação três perfis de bandas sendo que um deles foi idêntico ao da 1ª internação. Dos isolados do paciente P2 foram obtidos 3 perfis de bandas um da 1ª internação e dois da 2ª internação. Do paciente P3 foram obtidos 3 perfis de bandas, dois da 1ª internação e um da 2ª internação (figura 7).

Com in4 foram obtidos 6 perfis de bandas distintos entre as amostras provenientes dos pacientes do Grupo I (figura 8).

Na análise dos isolados seriados por paciente, os isolados dos pacientes P1 apresentaram 2 perfis de bandas distintos, um perfil proveniente da 1ª internação e 2 perfis de bandas na 2ª internação sendo que um deles foi idêntico em ambas internações. O paciente P2, apresentou resultado semelhante ao paciente P1. Os isolados do paciente P3 apresentaram dois perfis de bandas distintos um de cada internação (Figura 9).

Tabela 1. Síntese de dados dos isolados e perfis moleculares de C.

neoformans dos pacientes do Grupo I encontrados pelos métodos de

PFGE e PCR-RAPD.

Paciente Isolado-tempo Internação Perfis de bandas (nº)

(dias) PFGE RAPD

in3 RAPD in4 a - 0 b - 10 dias c - 20 dias 1ª 1 1• 1 • P1 d -155 dias e -160 dias f - 163 dias 2ª 1 3• 2 • a – 0 1ª 1 • 1 1• P2 b - 75 dias c - 84 dias d - 86 dias 2ª 2 • 2 2• a - 0 b - 4 dias c - 10 dias d - 15 dias 1ª 4 2 1 P3 e – 34 dias 2ª 1 1 1

2200 –

1125-

750-Kb PM I II III IV V VI VII VIII IX

2200 –

1125-

750-Kb PM I II III IV V VI VII VIII IX

Figura 4A. Grupo I – perfis de bandas gerados por PFGE nos isolados dos pacientes com mais de uma internação (I-IX). Gel de agarose 1,1% corado por brometo de etídio. PM- marcador molecular de S. cerevisiae. 1 banda 2 bandas 3 bandas 2200 – 1125-

750-Kb I II III IV V VI VII VIII IX

1 banda 2 bandas 3 bandas 1 banda 2 bandas 3 bandas 2200 – 1125-

750-Kb I II III IV V VI VII VIII IX

2200 –

1125-

750-Kb I II III IV V VI VII VIII IX Kb I II III IV V VI VII VIII IX

Kb PM P1 P2 P3 2200- 1125750 -# 1ª 2ª 1ª 2ª 1ª 2ª 2ª Kb PM P1 P2 P3 2200- 1125750 -# 1ª 2ª 1ª 2ª 1ª 2ª 2ª

Figura 5A. Grupo I – perfis de bandas gerados por PFGE nos isolados seriados dos pacientes com mais de uma internação (P1, P2 e P3). Gel de agarose 1,1% corado por brometo de etídio. PM- marcador molecular de S. cerevisiae # internações

1 banda 2 bandas 3 bandas Kb P1 P2 P3 2200- 1125- 750-# 1ª 2ª 1ª 2ª 1ª 2ª 2ª 1 banda 2 bandas 3 bandas 1 banda 2 bandas 3 bandas Kb P1 P2 P3 2200- 1125- 750-# 1ª 2ª 1ª 2ª 1ª 2ª 2ª

200- 500- 1000- 200- 500-

1000-Figura 6. Grupo I – total de perfis de bandas gerados por PCR-RAPD com in3 nos isolados dos pacientes com mais de uma internação (I-IX). Géis de poliacrilamida 3,5 % corados por brometo de etídio. Marcador molecular 100pb

1 2 _{1 2}

P1

P2

P3

P1

P2

P3

200- 500- 1000-pb I II III IV V VI 200- 500- 1000-pb I II III IV V VI 200- 500- 1000-pb I II III IV V VI

Figura 8. Grupo I – total de perfis de bandas gerados por PCR-RAPD com in4, nos isolados dos pacientes com mais de uma internação (I-VI). Géis de poliacrilamida 3,5 % corados por brometo de etídio. Marcador molecular 100pb. 1,2 2 200- 500- 1000-1 2 # 1,2 2

P1

P2

P3

P1

P2

P3

4.4. Análise molecular dos isolados dos pacientes do Grupo II

am tratados na fase aguda da seguinte f

os demais receberam Anfo B associado a FZ. Durante esta fase 4 pacientes foram a ó

s P8, P9 e P11 apresentaram dois perfis de bandas e os demai

as. .

O Grupo II foi composto de 39 isolados de 9 pacientes (P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11 e P12). Eles for

orma: O paciente P9 recebeu Anfo B convencional e lipossomal e

bito: P4, P5, P6, P7 e os demais passaram para a fase de manutenção. Nesta fase, o paciente P11 recebeu AnfoB e os P8, P9, P10, e P12 receberam FZ. O paciente P8 faleceu e os pacientes P9, P10, P11 e P12 tiveram alta recebendo FZ. Foram recuperados os seguintes isolados: do paciente P4, 2 isolados (a,b) com intervalo de coleta de 16 dias entre eles. Do paciente P5, 4 isolados (a,b,c,d) com intervalos de 26 dias, 1 e 2 dias entre eles. Do paciente P6, 4 isolados (a,b,c,d) com intervalos de coleta de 6 e 1 dia. Do paciente P7, 7 isolados (a,b,c,d,e,f,g) com intervalo de coleta de 3, 1,4 e 1 dia. Do paciente P8, 2 isolados (a,b) com intervalo de coleta de 20 dias. Do paciente P9, 8 isolados (a,b,c,d,e,f,g,h) com intervalo de coleta de 5, 2, 3, 15 e 2 dias. Do paciente P10, 4 isolados (a,b,c,d), com intervalo de coleta de 16, 8 e 7 dias. Do paciente P11, 4 isolados (a,b,c,d) com intervalo de coleta de 2, 7 e 15 dias. Do paciente P12, 4 isolados (a,b,c,d) com intervalo de coleta de 16, 5 e 9 dias. A síntese dos dados esta expressa na tabela 2.

Os isolados do Grupo II geraram 9 perfis eletroforéticos na PFGE (figura 10A). Para facilitar a visualização dos perfis de bandas foi confeccionada a representação esquemática (figura 10B).

Os paciente

Os isolados do Grupo II geraram 13 perfis de bandas distintos na PCR-RAPD utilizando-se o in3 (Figura 12).

A figura 13 mostra os perfis de bandas gerados pelo in3 nos isolados seriados de cada paciente. Todos os isolados dos pacientes P4, P5, P6, P7, P9 e P10 apresentaram um único perfil de banda. Os isolados dos pacientes

s P4, P5, P6, P8, P11 e P12 apresentaram dois perfis. Os pacien

P8 e P12 apresentaram dois perfis e os isolados do paciente P11 três perfis distintos.

Com o in4 foram obtidos 13 perfis distintos entre os isolados provenientes dos pacientes deste (figura 14).

Na análise dos isolados seriados de cada paciente, os isolados dos pacientes P7, P9 e P10 apresentaram um único perfil de bandas e os isolados dos paciente

tes P4, P5 e P12 apresentaram isolados com perfis de bandas idênticos (figura 15).

Tabela 2. Síntese dos dados e perfis moleculares, por PFGE e PCR-RAPD, os isolados dos pacientes do Grupo II.

Paciente Isolado-tempo Perfis de bandas (nº)

d

- 2200-1125 750 2200 -1125 750

Figura 10A- Grupo II total de perfis de bandas gerados por PFGE nos isolados dos pacientes com uma internação (I-IX). Gel de agarose 1,1% corado por brometo de etídio. PM- marcador molecular de S. cerevisiae

1 banda 2 bandas 3 bandas

Kb I II III IV V VI VII VIII IX 22001125 750 -1 banda 2 bandas 3 bandas 1 banda 2 bandas 3 bandas

Kb I II III IV V VI VII VIII IX

750 -

22001125

-Kb I II III IV V VI VII VIII IX

750 - 22001125 - 22001125 750

22001125 750 -+ -+ -+ + 22001125 750 - 22001125 750 -+ -+ -+ +

Figura 11A Grupo II – perfis de bandas gerados por PFGE nos isolados seriados dos pacientes com uma internação (P4 a P12). Gel de agarose 1,1% corado por brometo de etídio. PM - marcador molecular de

S.cerevisiae *óbito + perfis idênticos

1 banda Kb P4* P5* P6* P7* P8* P9 P10 P11 P12 + + + 2200-1125 - 2 bandas 3 bandas 750 -+ 2 bandas 3 bandas 1 banda 1 banda 2 bandas 3 bandas Kb P4* P5* P6* P7* P8* P9 P10 P11 P12 + + + 22001125 750 -Kb P4* P5* P6* P7* P8* P9 P10 P11 P12 22001125 750 -+ + + + +

200- 500-

1000-bp I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII

200- 500- 1000- 200- 500-

1000-bp I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII

Figura 12. Grupo II – total de perfis de bandas gerados por PCR-RAPD com in3 nos isolados dos pacientes com uma internação (I a XIII). Géis de poliacrilamida 3,5 % corados por brometo de etídio. Marcador molecular 100pb. pb P4* P5* P6* P7* P8* P9 P10 P11 P12 200

-Figura 13. Grupo II – perfis de bandas gerados por PCR-RAPD com in3 nos isolados seriados dos pacientes com uma internação (P4 a P12). Géis de poliacrilamida 3,5 % corados por brometo de etídio. Marcador molecular

- 200 - 500 - 1000 200- 500-

1000-pb I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII

- 200 - 500 - 1000 200- 500-

1000-pb I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII

- 200 - 500 - 1000 - 200 - 500 - 1000 200- 500- 1000- 200- 500-

1000-pb I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII

Figura 14. Grupo II – total de perfis de bandas gerados por PCR-RAPD com in4 nos isolados dos pacientes com uma internação (I a XIII). Géis de poliacrilamida 3,5 % corados por brometo de etídio. Marcador molecular 100pb. 200- 500- 1000- 500- 1000- 500- 1000- 200-+ 200-+ + + + +