UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE BIOMEDICINA
ALISON MICHEL SILVA DE OLIVEIRA
ANÁLISE DA CINÉTICA DE CRESCIMENTO DO PLASMODIUM
FALCIPARUM EM ERITRÓCITOS COM ALTERAÇÕES
HEMATOLÓGICAS
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ANÁLISE DA CINÉTICA DE CRESCIMENTO DO PLASMODIUM FALCIPARUM EM ERTIRÓCITOS COM ALTERAÇÕES HEMATOLÓGICAS
por
ALISON MICHEL SILVA DE OLIVEIRA
Monografia apresentada à Coordenação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Válter Ferreira de Andrade Neto
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE BIOMEDICINA
A Monografia Análise da Cinética de Crescimento do Plasmodium falciparum em Eritrócitos com Alterações Hematológica
elaborada por Alison Michel Silva de Oliveira
e aprovada por todos os membros da Banca examinadora foi aceita pelo Curso de Biomedicina e homologada pelos membros da banca, como requisito parcial à obtenção do título de
BACHAREL EM BIOMEDICINA
Natal, _____ de ________________ de 2017.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________ Orientador Prof. Dr. Válter Ferreira de Andrade Neto Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN
__________________________________________________ Prof. Me. Christiane Medeiros Bezerra
Departamento de Microbiologia e Parasitologia - UFRN
__________________________________________________ Prof. Dr. Marcelo de Sousa Silva
5 RESUMO
A malária, também conhecida como paludismo, é uma doença infecciosa parasitária, de transmissão vetorial, causada por protozoários do gênero Plasmodium e caracterizada por febre aguda, calafrios, sudorese e cefaleia. Cinco espécies causam a malária humana no mundo: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale e P. knowlesi. Segundo o Relatório Mundial sobre a Malária de 2015, havia cerca de 214 milhões de casos de malária e 438 mil mortes pela doença por ano. No Brasil, houve um aumento de 28% no número de casos de malária registrados até julho de 2017 comparado com o ano de 2015. Como parasita intracelular, o Plasmodium depende do hospedeiro para sobreviver e fatores geneticamente determinados podem influenciar na suscetibilidade do indivíduo em desenvolver clinicamente a malária, especialmente os que resultam em alterações hematológicas como a anemia falciforme e a deficiência de G6PD e, de fato, há maior prevalência dessas anormalidades eritrocitárias em populações que residem em áreas endêmicas da malária. O efeito protetor dessas alterações hematológicas nas populações naturalmente expostas a malária aumenta com a idade, o que indica que o mecanismo de proteção possa não ser inteiramente inato e tenha, também, um componente imunológico adquirido. Assim, o presente estudo teve por objetivo comparar a cinética de crescimento in vitro do Plasmodium falciparum (cepa 3D7) em eritrócitos de indivíduos com alterações hematológicas de traço falciforme e da deficiência de G6PD. Os resultados mostraram que o crescimento in vitro do Plasmodium falciparum foi menor nas culturas com eritrócitos provenientes de paciente com traço falciforme e com deficiência de G6PD quando comparada com uma cultura com eritrócitos normais. Além disso, houve uma diferença significativa na curva de crescimento das culturas testadas, sendo a deficiência de G6PD a que apresentou taxa de menor sucesso de replicação do parasito. Isso sugere que essas alterações hematológicas possam ser decorrentes, também, da pressão seletiva na população de regiões endêmicas para a malária.
6 ABSTRACT
Malaria, is a parasitic infectious disease, in which propagation is vector, caused by protozoa of the genus Plasmodium and characterized by acute fever, chills, sweating and headache. Five species cause human malaria in the world: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale and P. knowlesi. According to the 2015 Malaria Report, approximately 214 million malaria cases and 438,000 malaria deaths per year. In Brazil, there was a 28% increase of no cases of malaria by July 2017 compared to the year 2015. As an intracellular parasite, Plasmodium depends on the host to survive and genetic factors can influence the susceptibility of the developing individual such as sickle cell anemia and G6PD deficiency, and, in fact, there is a higher prevalence of erythrocyte abnormalities in populations living in areas endemic to malaria. The infective protective effect in populations naturally exposed to malaria increases with age, indicating that the protection mechanism does not exist entirely innate and also has an acquired immunological component. Thus, the present study aimed to compare in vitro growth kinetics of Plasmodium falciparum (strain 3D7) in reporting erythrocytes with sickle cell neurotransformers and G6PD deficiency. The results showed that in vitro growth of Plasmodium falciparum was lower in erythrocyte cultures of patients with G6PD-deficient patients compared to a culture with normal erythrocytes. In addition, there was a significant difference in the growth curve of the tested cultures, being a deficiency of G6PD that presented lower rate of replication of the parasite. This suggests that human health and disease are also essential to selective pressure in the population of end regions for malaria.
7 LISTA DE FIGURAS
Figura 1– Ciclo de Vida do Plasmodium... 12
Figura 2 – Patologia molecular da anemia de células falciformes... 16
Figura 3 – Via das pentoses-fosfato... 18
Figura 4 – Distensão sanguínea em lâmina... 22
Figura 5 – Cabine de segurança biológica classe II... 22
Figura 6 – Retículo de microscópio... 23
Figura 7 – Formas parasitárias intra-eritrocitárias... 24
8 LISTA DE GRÁFICOS E TABELAS
Tabela 1: Relações entre genótipos de deficiência de G6PD e a atividade
enzimática... 20 Tabela 2: Demonstração metodológica da distribuição inicial de sangue
cultura no teste... 22 Tabela 3: Relação entre alterações hematológicas e a susceptibilidade à
9 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
OMS Organização Mundial de Saúde
PfEMB-1 Proteína de membrana eritrocitária 1 do Plasmodium falciparum FyaFyb Antígenos do grupo sanguíneo Duffy
MNSs Antígenos do grupo sanguíneo MNS SNP Polimorfismo de nucleotídeo único PvDBP Plasmodium vivax Duffy-binding protein HbA Hemoglobina A
HbS Hemoglobina S
G6PD Glicose-6-fosfato-desidrogenase
HPLC Cromatografia líquida de alta performance NADP Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato rpm Rotações por minuto
11 1 INTRODUÇÃO
A malária, também conhecida como maleita, febre intermitente, paludismo, impaludismo, febre terçã ou febre quartã, foi primeiramente citada por Hipócrates ainda na era pré-Cristã quando ele descreveu suas características de ocorrência sazonal e de febre intermitente. É uma doença infecciosa parasitária caracterizada por febre aguda, calafrios, sudorese e cefaleia e de transmissão vetorial, causada por protozoários pertencentes ao Filo Apicomplexa, família Plasmodiidae e ao gênero Plasmodium, sendo conhecidas cerca de 150 espécies causadoras de malária em diferentes hospedeiros vertebrados, dos quais apenas cinco espécies parasitam o homem: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale e P. knowlesi (ALENCAR FILHO et al., 2014; NEVES et al., 2016).
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), em 2015 foi estimado que 3.2 bilhões de pessoas estavam em áreas de risco de serem infectadas pela malária e desenvolver a doença no mundo. Segundo o Relatório Mundial sobre a Malária de 2015, havia 214 milhões de casos de malária e 438 mil mortes pela doença neste ano, sendo que o pior cenário se deu em regiões africanas, onde cerca de 90% das mortes por malária ocorreram em crianças menores de cinco anos, que representaram dois terços de todas as mortes. No Brasil, foram registrados 313 casos de malária em 2015 e houve um aumento de 28% até julho de 2017 no mesmo período (WHO, 2015; BRASIL, 2015). O Plasmodium falciparum é a espécie mais letal, o foco da maior parte dos estudos e a que mais prevalece no continente Africano, sendo responsável pela maioria das mortes pela doença. No Brasil, o P. vivax é a espécie mais frequente assim como na maioria dos países fora da África Subsariana (ALENCAR FILHO et al., 2014; PEDROSA; MARTINS, 2016).
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na corrente sanguínea através de receptores específicos presentes na membrana das hemácias, como antígenos dos grupos sanguíneos Duffy e MNS. Após essa replicação vestibular, inicia-se a fase sanguínea em que os merozoítos, no interior dos eritrócitos, transformam-se em trofozoítos jovens, caracterizado pela forma de anel quando visualizados em microscópio óptico. Posteriormente, estes trofozoítos de estágio de anel transformam-se em trofozoítos maduros que, por sua vez, dão origem a novos esquizontes. Por fim, os esquizontes se rompem promovendo a lise do eritrócito e liberam vários merozoítos que infectarão outras hemácias, caracterizando os intervalos de febre e calafrio típicos da doença (NEVES et al., 2016; CDC, 2016).
Após algumas gerações de merozoítos sanguíneos, alguns dos parasitas se diferenciam em estágios eritrocíticos sexuais, os gametócitos. Somente os gametócitos são capazes de evoluir no inseto vetor, dando origem ao ciclo sexuado ou esporogônico. As formas evolutivas sexuais machos (microgametócitos) e fêmeas
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(macrogametócitos) são ingeridas por um mosquito fêmea de Anopheles durante o repasto sanguíneo. Por um processo denominado exflagelação, o microgametócito dá origem a oito microgametas, ao passo que, o macrogametócito transforma-se em um macrogameta. Durante o tempo de permanência no estômago do mosquito, um microgameta começa a penetrar em um macrogameta fecundando-o e gerando um zigoto que logo torna-se móvel (oocineto). No intestino médio, os oocinetos invadem a camada epitelial do órgão e se encistam, passando a serem chamados de oocistos. Tem-se início ao processo de divisão esporogônica em que há crescimento do oocisto seguido de seu rompimento e liberação de esporozoitos. Estes esporozoítos dirigem-se às glândulas salivares do mosquito onde estarão prontos e aptos a infectarem um novo hospedeiro humano perpetuando o ciclo de vida do Plasmodium e preservando a malária no mundo (NEVES et al., 2016; CDC, 2016).
O período de incubação varia de sete a trinta dias, sendo os períodos mais curtos observados com maior frequência nos casos de malária por P. falciparum. Somente o ciclo eritrocítico assexuado é responsável pelas manifestações clínicas e patologia da malária em consequência da destruição das hemácias parasitadas, da toxicidade resultante da liberação de citocinas, do sequestro de glóbulos vermelhos parasitados na rede capilar e da lesão capilar por deposição de imunocomplexos (NEVES et al., 2016). A infecção pelo parasita da malária pode, clinicamente, resultar desde ausência de sintomas ou sintomas leves até doença grave e morte. Devido a essa variação nos sintomas, a malária pode ser categorizada em malária não complicada ou clássica e malária severa ou complicada, entretanto, no geral a malária é uma doença curável quando diagnosticada precocemente e tratada adequadamente (CDC, 2015).
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discreta nas concentrações de hemoglobina (anemia leve), diminuição discreta das plaquetas (trombocitopenia), elevação da bilirrubina e de aminotransferases (CDC, 2015).
Já a malária severa ocorre quando a infecção do parasita é complicada por graves falhas orgânicas ou anormalidades no sangue (a exemplo de distúrbios hematológicos) ou no metabolismo do hospedeiro. As manifestações da malária severa incluem: (1) malária cerebral com comprometimento da consciência, convulsões, coma e outras anormalidades neurológicas; (2) anemia grave devido à hemólise intensa; (3) hemoglobinúria decorrente da hemólise; (4) anormalidades de coagulação sanguínea; e (5) insuficiência renal aguda (CDC, 2015). A citoadesão dos eritrócitos infectados pelo Plasmodium ao endotélio – mediada pela proteína de membrana eritrocitária 1 do P. falciparum (PfEMB-1) –, fatores trombocíticos e anormalidades plaquetárias são fatores determinantes para o agravamento e evolução da malária e podem causar tromboses vasculares (ALENCAR FILHO et al., 2014).
Ademais, o desenvolvimento intracelular normal do Plasmodium é acompanhado por diversas alterações nas hemácias tais como estruturais, bioquímicas e funcionais. Desse modo, o Plasmodium depende do hospedeiro para sobreviver, logo, qualquer perturbação na composição ou no arranjo de proteínas do eritrócito podem potencialmente impedir o crescimento e a sobrevivência do parasita e, assim, aumentar a resistência à infecção do Plasmodium, ou seja, fatores do hospedeiro, como os geneticamente determinados, podem influenciar na suscetibilidade do indivíduo em desenvolver clinicamente a malária, especialmente as que resultam em alterações hematológicas e, de fato, há uma maior prevalência de anormalidades eritrocitárias em populações que residem em áreas endêmicas da malária (LELLIOTT et al., 2015; NEVES et al., 2016; PEDROSA; MARTINS, 2016).
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eritropoiese resultantes de mutações expressas neste processo como alterações estruturais e numérica de proteínas e receptores. Tais distúrbios são prevalentes em populações com longa história de exposição à malária e a partir da observação desse fato, Haldane em 1949 propôs a existência de um mecanismo de proteção das hemoglobinopatias contra a malária, hipótese confirmada por Allison em 1954. No mundo, as mais comuns doenças monogênicas são as hemoglobinopatias, sendo estimado o nascimento de aproximadamente 400 mil crianças portadoras de hemoglobinopatias, das quais cerca de 90% estão nos países em desenvolvimento. Além disso, qualquer perturbação nas vias de invasão do parasita aos eritrócitos é benéfica ao hospedeiro e várias alterações hematológicas podem afetar o desenvolvimento da doença (LELLIOTT et al.,2015; PEDROSA; MARTINS, 2016).
A ausência de receptores específicos na superfície dos eritrócitos impede a invasão dos merozoítos, como ocorre em indivíduos que não apresentam o antígeno do grupo sanguíneo Duffy (FyaFyb) e indivíduos que não apresentam antígeno do grupo sanguíneo MNS (MNSs) e são, portanto, resistentes a infecção por P. vivax e P. falciparum, respectivamente. Populações africanas que possuem uma alta prevalência de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) na região promotora de controle da expressão do receptor do antígeno Duffy previne sua expressão na membrana do eritrócito e resulta no fenótipo sanguíneo Duffy-negativo. O Duffy é um ligante para a proteína PvDBP (Plasmodium vivax Duffy-binding protein) do merozoito do P. vivax sendo essencial no processo de invasão. Algo semelhante ocorre com o P. falciparum, entretanto, as interações parasita-hospedeiro para essa espécie são complexas com vias metabólicas redundantes e diferentes ligantes no hospedeiro (LELLIOTT et al., 2015; NEVES et al., 2016).
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que o ferro está no estado de Fe+++) que é tóxica para o parasita (LUZZATTO, 2012; SERJEANT, 2013; NEVES et al., 2016).
Diante disso, neste estudo, focaremos na variante estrutural da hemoglobina que ocorre na anemia falciforme e na alteração hematológica da deficiência de G6PD, em virtude da semelhança da ocorrência dessas doenças com a distribuição dos casos de malária (PEDROSA; MARTINS, 2016).
A anemia falciforme foi a primeira doença a ser identificada a nível molecular a partir dos padrões de mobilidade eletroforética por Linus Pauling em 1949. A causa da doença é uma mutação em que há a substituição de ácido glutâmico por valina na posição 6 da cadeia da beta globina, gerando uma hemoglobina anormal denominada hemoglobina S (HbS) (Figura 2). A HbS é insolúvel e quando desoxigenada polimeriza-se em fibras longas, deformando o eritrócito e conferindo à hemácia uma conformação alongada e rígida, determinada de hemácia em foice. Posteriormente ao processo de falcização, as hemácias apresentam uma alteração nas proteínas de membrana e aumentam a expressão de moléculas de adesão, o que leva a adesão dos eritrócitos ao endotélio e desencadeia um fenômeno inflamatório, ativação da coagulação, hipóxia, isquemia e oclusão de regiões da microvasculatura e de grandes vasos, resultando em infarto de vários órgãos, além da redução da sobrevida da hemácia. (HOFFBRAND, 2013; OLIVEIRA et al., 2015; NAIK; HAYWOOD, 2015).
Figura 2: Patologia molecular da anemia de células falciformes. Fonte: HOFFBRAND, 2013.
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acidose, desidratação e desoxigenação (proveniente, por exemplo, de altitudes, cirurgia, parto, estase circulatória, exercício intenso) e resultam em infartos dolorosos nos ossos, síndrome mão-pé (dactilite dolorosa) e mais gravemente em acidente vascular cerebral. Já as crises hemolíticas consistem em aumento de hemólise com queda da hemoglobina e aumento da reticulocitose (HOFFBRAND, 2013).
O diagnóstico da doença falciforme é estabelecido a partir da identificação de quantidades significativas de HbS. Clinicamente, em indivíduos homozigotos para a condição (Hb SS) que possuem as duas cadeias de β-globina do tipo S, a doença caracteriza-se em inchaço espontâneo doloroso das mãos e dos pés em bebês (dactilite), episódios recorrentes de dor intensa sem etiologia identificada, anemia inexplicável não relacionada a deficiência de ferro, palidez, icterícia e anemia grave com aumento esplênico. Laboratorialmente isso se reflete em anemia normocítica, esfregaços de sangue periférico com células falciformes, eritroblastos, células em alvo entre outros eritrócitos anormais e presença de HbS em ensaio de hemoglobina por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e eletroforese (BENDER, 2017).
Já a condição heterozigota (HbAS), na qual os indivíduos possuem uma cadeia de β-globina do tipo S e uma do tipo A (normal), é benigna, sem anemia e com eritrócitos de aspecto normal na distensão sanguínea. A porcentagem de HbS varia de 25 a 45% do total de hemoglobina, sendo uma quantidade insuficiente para produzir as manifestações falciformes na maioria das circunstâncias, logo, os indivíduos são, em geral, assintomáticos, entretanto, estão em risco de apresentar complicações em situações de esforço físico intenso, desidratação e/ou altitudes o que pode induzir a ocorrência de eventos vaso-oclusivos de células falciformes, infarto esplênico em altas altitudes e em risco aumentado de tromboembolismo venoso (HOFFBRAND, 2013; SERJEANT, 2013; BENDER, 2017).
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populações do Mediterrâneo e em grupos indígenas aborígenes a prevalência é de 20 a 40% (NAIK; HAYWOOD, 2015; BENDER, 2017)
A enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) é essencial na via das pentoses-fosfato, uma via alternativa de oxidação da glicose-6-fosfato, que reduz a nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato (NADP). Essa é a única via de manutenção do potencial redox nos eritrócitos, pois é a única fonte de NADPH nas hemácias, reduzindo NADP+ para NADPH que, por sua vez, é necessário para a produção de glutationa reduzida a qual protege a célula de agentes oxidantes. A deficiência dessa enzima torna o eritrócito suscetível ao estresse oxidativo (Figura 3) (HOFFBRAND, 2013; LEY et al., 2017).
A deficiência de G6PD é uma doença genética ligada ao sexo na qual mutações no gene que codifica a enzima podem reduzir sua atividade enzimática ou sua estabilidade o que resulta em diferentes graus de deficiência de G6PD. Mais de 180 variantes genéticas diferentes são conhecidas para essa condição e é a enzimopatia mais comum com pelo menos 400 milhões de indivíduos afetados em todo o mundo. Essa deficiência está associada a uma proteção contra a malária e a uma maior suscetibilidade à hemólise oxidante, porém a gravidade da anemia hemolítica depende da variante da deficiência de G6PD (WHO, 2016; LEY et al., 2017).
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Como a deficiência de G6PD decorre de uma herança ligada ao X (locus Xq28), tendo padrão de herança recessivo ligado ao sexo, os homens têm apenas um alelo para a enzima, enquanto que as mulheres têm dois. Assim, existem dois fenótipos para os homens (normal e afetado) uma vez que possuem apenas um cromossomo X (hemizigoto). Já as mulheres, possuem dois cromossomos X e durante o seu desenvolvimento embrionário inativam aleatoriamente um desses cromossomos, fenômeno conhecido como lionização. Como consequência desse processo, as mulheres heterozigotas para G6PD manifestam uma gama de atividades intermediárias para a enzima variando desde atividade normal típica a deficiência de G6PD que reflete a atividade enzimática média dessas duas populações celulares, uma com uma cópia do gene que codifica uma variante normal e uma cópia de gene que codifica uma variante deficiente de G6PD, como demonstrado na Tabela 1 (WHO, 2016; LEY et al., 2017).
20 Tabela 1: Relações entre genótipos de deficiência de G6PD e atividade enzimática. Fonte: Adaptado de WHO, 2016. GENÓTIPO SEXO ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA G6PD FENÓTIPO XY - Tipo
selvagem Masculino Normal Normal
X*Y - Hemizigoto < 30% do normal Deficiente
XX - Tipo selvagem
Feminino
Normal Normal
X*X* -
Homozigoto < 30% do normal Deficiente
X*X -
Heterozigoto < 30% do normal Deficiente
X*X - Heterozigoto
Entre 30% e 80%
do normal Intermediário X*X -
Heterozigoto < 80% do normal Normal
21 2 MATERIAIS E MÉTODOS
O presente estudo foi conduzido a partir de pesquisa experimental em que, inicialmente, foi coletado cerca de 8 mL de sangue de cada doador voluntário para o teste: um doador sem histórico familiar e sem suspeitas de alterações hematológicas sendo este usado como controle; um doador diagnosticado com traço falciforme; um doador diagnosticado com deficiência de G6PD, sendo este heterozigoto; e um outro doador diagnosticado com deficiência de G6PD, sem pistas quanto à herança. Foi realizado a lavagem dos eritrócitos de forma idêntica para cada sangue coletado. A lavagem das hemácias foi realizada de forma adaptada pois, originalmente, essa lavagem usa uma solução isotônica para fins transfusionais, mas para o uso em cultura, a solução isotônica foi substituida por meio RPMI-1640 Medium. Adiante, o sangue foi levado a centrifuga onde girou a 1800 rpm por 10 minutos para separação do plasma, camada leucoplaquetária e eritrócitos. Após isso, foram levados à cabine de segurança biológica onde o plasma e a camada leucoplaquetária foram descartados com auxílio de uma bomba de sucção e pipeta Pasteur. Em seguida, adicionou-se meio RPMI-1640 em uma proporção de 20% do volume do concentrado de hemácias. Depois, o tubo foi selado e levado novamente à centrífuga. Ao término, o tubo foi levado de volta à cabine e o sobrenadante foi descartado. Esse processo foi feito três vezes. Entretanto, pode ser necessário mais repetições caso o sobrenadante continue não límpido.
22 Tabela 2: Demonstração metodológica da distribuição inicial de sangue cultura no teste.
Garrafa Inóculo inicial Sangue controle Sangue traço falciforme Sangue G6PD 1 heterozigoto Sangue G6PD 2 Azul 100 µL 400 µL - - - Laranja 100 µL - 400 µL - - Cinza 100 µL - - 400 µL - Amarela 100 µL - - - 400 µL
Para prosseguimento do teste foi padronizado que a manipulação empregada em cada garrafa seria idêntica. Assim sendo, 2 µL de cada garrafa foi utilizado para distensão em lâmina (Figura 4) durante cada momento de manipulação, 100 µL foi removido e armazenado para testes posteriores e, em seguida, 110 µL de sangue cultura foi adicionado para renovação de hemácias em cada manipulação. Cada garrafa recebeu 40 segundos de mistura carbogênica na proporção de 5% de gás carbônico (CO2), 3% de oxigênio (O2) e 92% de nitrogênio (N2) ao final de cada manipulação realizada. Ao todo, o teste teve duração de 15 dias, período em que as hemácias permanecem adequadas para o cultivo, e rendeu oito pontos de análise, de zero a sete, sendo o ponto zero o inóculo inicial de 0,76% de parasitemia.
O manuseio das garrafas de cultura foi realizado de acordo com o método de Trager e Jensen (1976) modificado, com auxílio de cabine de segurança biológica (Figura 5) em quase sua totalidade sendo necessário, em algumas etapas, a manipulação do material biológico fora da cabine. A limpeza da cabine de segurança foi feita sempre no início e ao término de cada uso. Álcool a 70% foi passado nas superfícies do interior da cabine e, em seguida, todo o material de trabalho foi limpo, também com álcool a 70%, e inserido no interior da cabine. confirmado que tudo estava limpo e com o material posicionado, a luz ultravioleta (UV) foi ligada e mantida por 25 minutos. Ao término desse tempo, uma caixa plástica que contém as garrafas de cultivo foi retirada da estufa a 37°C e transferida para a cabine
de segurança com o devido cuidado de limpa-la bem para evitar contaminação. O
Figura 5: Cabine de segurança biológica
classe II. Figura 4: Distensão sanguínea em
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conteúdo de cada garrafa foi transferido para um falcon de 15 mL individualmente e, em seguida, foram fechados e selados com parafilm. Após isso, os falcons foram retirados da cabine de segurança e levados à centrífuga para separar o meio de cultivo RPMI-1640 complementado e o concentrado de hemácias. A centrífuga foi programada para girar a 1800 rpm durante 10 minutos a 37º C. Ao final desse tempo, os falcons foram levados à cabine tendo o cuidado de serem limpos com o álcool a 70%. De volta a cabine, o meio RPMI-1640 foi descartado com auxílio de uma bomba de sucção acoplada a uma pipeta Pasteur ou alguma pipeta com capacidade para maiores volumes. Em seguida, foi realizado uma distensão de cada concentrado de hemácias de cada garrafa para análise em microscópio óptico. A distensão foi feita com apenas 2 µL para que não haja grande alteração no hematócrito. Ao final da confecção das lâminas, a cabine foi deixada ligada e fechada enquanto fora feita a coloração com panótico e posterior leitura em microscópio.
No microscópio óptico foi realizada a determinação da parasitemia de cada garrafa. A contagem foi feita no corpo da distensão, em dez campos e com auxílio de retículo (Figura 6). Em cada campo foram contados o número de eritrócitos totais e o número de eritrócitos parasitados dentro das dimensões do retículo. Ao término da contagem os números foram anotados e analisados levando-se em consideração o aspecto do conteúdo das garrafas antes e depois da centrifugação. Feito as correlações, retornou-se a cabine de segurança para iniciar os ajustes predeterminados para o teste. De cada garrafa foi retirado 100 µL de concentrado de hemácias e, em seguida, adicionado 4,5 ml de meio RPMI-1640 complementado aquecido a 37º C. Após isso, 110 µL de sangue novo de cada tipo foi adicionado em cada respectiva garrafa. Por fim, cada garrafa foi ventilada com mistura carbogênica por 40 segundos e levadas a estufa a 37°C.
24 Figura 7: Formas parasitárias intra-eritrocitárias.
25 3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
O teste teve início com um inóculo idêntico para cada garrafa tendo uma parasitemia inicial de 0,76%. Após 48h houve a primeira manipulação e conferência da parasitemia. Tem-se então o ponto um (P1) (Gráfico 1) em que se notou um rápido crescimento nas garrafas controle, falciforme e G6PD-1, sendo que o crescimento do controle foi semelhante ao do G6PD-1 heterozigoto ao passo que o do traço falciforme foi próximo da metade quando comparada com elas. Isso mostrou uma possível resistência vindoura do traço falciforme que, de alguma forma, impede o crescimento do parasito. A garrafa G6PD-2, por sua vez, teve um decaimento para próximo de 0% e manteve-se assim adiante até que foi decidido retira-la do teste. Esse evento provavelmente foi decorrente de hemólise no seu inóculo inicial após descongelamento, o que levou a perda de parasitos já no ponto zero (P0).
Gráfico 1: Curva de crescimento de Plasmodium falciparum.
Nas 48h seguintes, no ponto dois (P2), percebeu-se início de uma redução geral e progressiva da parasitemia e assim permaneceu no ponto três (P3). No ponto quatro (P4), a garrafa controle voltou a mostrar crescimento, mas não manteve o desenvolvimento. Esse caimento não era esperado e, por isso, foi realizada uma rápida investigação das razões por trás dessa ocorrência. Ao verificar algumas
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Tempo - Intervalo de 48 horas
Curva de crescimento de PF 3D7
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variáveis, constatou-se que o meio de cultura estava com o pH elevado, fora do ideal para o cultivo. Devido a isso, novo meio foi preparado e inserido no decorrer do teste. No ponto cinco (P5) percebeu-se uma aproximação na parasitemia das três culturas sugestivo de uma fase de readaptação ao meio; a garrafa G6PD-1 heterozigoto manteve a tendência, a traço falciforme mostrou uma resposta final as altas concentrações de metabólitos presentes até que, nas horas seguintes, não houve mais visualização de parasitos nas lâminas. Na garrafa controle, houve uma queda na parasitemia posterior a um aumento e seguido de um retorno da parasitemia perdida. Possivelmente a lâmina foi feita durante a etapa do ciclo do parasito em que há liberação de merozoitos e estes vão em busca de infectar novos eritrócitos. Nesta etapa, há uma perda visual dos parasitos e, portanto, um viés na contagem. Outro fator que reforça essa teoria é que adiante, houve apenas aumento na parasitemia da garrafa controle promovida pela esquizogonia.
Por fim, o ponto sete (P7) pareceu ser um bom reflexo do que seria in vivo, em que um indivíduo normal, representado pela garrafa controle, seria susceptível; o indivíduo com traço falciforme, representado pela garrafa laranja, seria resistente; e o indivíduo com deficiência de G6PD, representado em cinza, seria intermediário, possuindo uma certa diminuição na taxa de crescimento se comparado ao indivíduo normal. Esses dados foram compatíveis com o que fora encontrado em estudos prévios revisados por Lelliot et al. (2015) como demonstrado no Gráfico 2.
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infectados, uma maior depuração (fagocitose) de eritrócitos infectados e uma redução do crescimento parasitário.
Gráfico 2: Taxas de crescimento do Plasmodium falciparum.
Em relação ao baixo crescimento do parasita em hemácias com deficiência de G6PD, a literatura sugere que isso ocorre porque uma exposição sustentada a um agente oxidante resultará em hemólise independentemente da idade do eritrócito além de uma menor oxigenação devido à formação da metemoglobina e de um ambiente de estresse oxidativo (LEY et al., 2017). As relações entre alterações hematológicas e a susceptibilidade à malária estão resumidas na Tabela 3.
-1 0 1 2 3 4 5 6 P0 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P a ra si te m ia
Tempo - Intervalo de 48 horas
Taxa de crescimento de PF 3D7
28 Tabela 3: Relação entre alterações hematológicas e susceptibilidade à malária. Fonte: Adaptado de LELLIOT et al., 2015.
Desordem eritrocitária
Suscetibilidade a
malária Invasão Crescimento Citoadesão
Traço falciforme (HbAS) (Baixo oxigênio) ou normal (Baixo oxigênio) Doença falciforme (HbSS) (Baixo oxigênio) ou (Baixo oxigênio) HbAC Normal HbCC Normal
HbAE Normal Desconhecido
HbEE Não esclarecido Normal ou Normal Desconhecido Talassemia α+ (_α /α α) Normal (Alto oxigênio) Talassemia α0 (__/α α) ou normal ou normal Talassemia HbH (__/_α) ou normal Talassemia β0
(_/β) Não esclarecido Normal
(Alto oxigênio)
Desconhecido Deficiência de
G6PD Normal ou normal Desconhecido
Deficiência de PK Desconhecido Normal Desconhecido Negatividade do
Duffy (P.vivax) (P.vivax) Normal Desconhecido Grupo sanguíneo
ABO
(Tipo O) (Tipos A e AB)
29 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados mostraram que o crescimento in vitro do Plasmodium falciparum foi menor nas culturas com eritrócitos provenientes de paciente com traço falciforme e com deficiência de G6PD quando comparada com uma cultura com eritrócitos normais. Além disso, houve uma diferença na curva de crescimento das culturas testadas, sendo a deficiência G6PD sem conhecimento quanto a herança a que apresentou taxa de menor sucesso de replicação do parasito.
Segundo Hoffbrand (2013) e Ley et al. (2017), eritrócitos com a deficiência de G6PD estão mais suscetíveis a sofrerem estresse oxidatido devido à ausência ou redução da produção de NADPH e, consequentemente, de glutationa reduzida, que elimina os agentes oxidantes. Assim, os radicais livres podem oxidar o ferro da hemoglobina, tirando-o do estado ferroso (Fe ++) para o estado férrico (Fe+++), formando a metemoglobina. Com isso haverá uma menor oxigenação na célula além de um ambiente de estresse oxidativo o que pode ser a causa do menor crescimento do parasita.
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de fato vantajoso possuir uma das alterações hematológicas e, juntamente, ser infectado pelo parasito da malária?
Os resultados do estudo indicam que essas alterações hematológicas possam ser decorrentes, também, da pressão seletiva na população de regiões endêmicas para a malária. Nenhuma das alterações hematológicas conferem total proteção contra a infecção pelo Plasmodium, reduzindo apenas o desenvolvimento da doença uma vez instalada e, consequentemente, a morbidade e mortalidade associadas a malária. Adiante, é notável a necessidade de aprimoramentos e refinamentos na execução do teste como maior número de amostras e inclusão de outras condições como talassemias e ainda compreender os mecanismos que desencadeiam maior fagocitose dos eritrócitos infectados. Outro fator que poderia ser inserido ao estudo é um teste confirmatório para as alterações hematológicas associadas ao estudo.
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