UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI MESTRADO EM PRODUÇÃO VEGETAL
EFEITO DA INOCULAÇÃO COMBINADA DE RIZÓBIO E Trichoderma spp. NA PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO EM FEIJÃO-CAUPI NO CERRADO
ARIÁDILA GONÇALVES DE OLIVEIRA
GURUPI-TO JULHO DE 2012
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ARIÁDILA GONÇALVES DE OLIVEIRA
EFEITO DA INOCULAÇÃO COMBINADA DE RIZÓBIO E Trichoderma spp. NA PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO EM FEIJÃO-CAUPI NO CERRADO
Dissertação apresentada ao Mestrado em Produção Vegetal da Universidade Federal do Tocantins, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal - Área de Concentração em Fitotecnia.
GURUPI-TO JULHO DE 2012
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Trabalho realizado junto ao curso de Mestrado em Produção Vegetal da Universidade Federal do Tocantins, sob a orientação do Profº Dr. Aloísio Freitas Chagas Júnior, com o apoio
financeiro do Conselho Nacional de Pesquisa Científica (CNPq).
Banca examinadora:
________________________________________ Prof. Dr. Aloísio Freitas Chagas Júnior-
Universidade Federal do Tocantins (Orientador)
_________________________________________ Prof. Dr. Rodrigo de Castro Tavares -
Universidade Federal do Tocantins (Examinador)
_________________________________________ Prof. Dr. Gil Rodrigues dos Santos -
Universidade Federal do Tocantins (Examinador)
_________________________________________ Prof. Dr. Tarcisio Castro Alves de Barros Leal -
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Á minha mãe Aldinar Gonçalves de Carvalho ( in memorian), pelos ensinamentos de vida, por me fazer ser o que sou, mesmo não estando presente posso senti-la sempre do meu lado, nos momentos mais difíceis da minha vida ela sempre esteve comigo. Onde a senhora estiver mãe,jamais a esquecerei.
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AGRADECIMENTOS
À DEUS, por me proporcionar saúde, capacidade, sabedoria e força, e principalmente, pelas oportunidades que me tem concedido e por colocar tantas pessoas especiais na minha vida que tanto me ajudaram e apoiaram.
Aos meus pais Aldinar (in memorian) e João Batista, pela confiança, apoio e amor incondicional por terem me proporcionado tantas oportunidades para que eu trilhasse meu caminho até aqui. Vocês são a base para todas as conquistas que fiz e farei em minha vida.
A toda minha família pelo imenso apoio, confiança e dedicação, por compreenderem minha ausência por tão longos períodos. Principalmente por acreditarem que eu poderia conseguir.
Às minhas irmãs Eva Adriana e Andréia, pela dedicação, por saberem me ouvir nos momentos de dúvidas e incertezas e por me dar conselhos, obrigada por sempre estarem perto de mim.
Às minhas sobrinhas e filhas Ana Júlia e Maria Clara, minha maior felicidade. Obrigada pela alegria. Posso dizer que meus dias nunca começaram e nem terminaram mal, porque os seus sorrisos me fazia acreditar que tudo valia à pena, e que todo sofrimento seria passageiro.
Ao meu namorado, Inésio Ricardo Poletto com muito amor e profunda admiração agradeço por todo o incentivo, amor, orações, carinho e compreensão. Desculpa pelas horas de estresse e obrigada por tudo.
Aos meus melhores amigos, Sérgio, Ronice, Elcione e Aline. Pela convivência destes anos, pela companhia nos momentos de desespero, por confiarem em mim e me fazerem acreditar que eu podia chegar onde cheguei. Pela ajuda nos experimentos, pelo abrigo, pela amizade, companheirismo. Enfim sem vocês nada disso seria possível.
Aos colegas e também amigos: Higor Barbosa Reis, Rogério Tavares, Bruno Vizioli, Fábio Monteiro, Michel Dotto, Weslany, Gabriel, Lílian, Dalmárcia, Damianae outros que foram importantes para o desenvolvimento desse trabalho, e concretização dessa meta, sem vocês não teria chagado aonde cheguei. Obrigada pela agradável convivência e amizade.
Aos amigos que mesmo distante sempre estiveram presente: Lourian, Dayze, Mariele, Azelma, Cleydiane, Gisele, Daniele.
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Aos colegas de turma do Programa de Pós Graduação em Produção Vegetal, em especial, Luis Paulo (piqui), Vinícius (cabeça), Glauber, André (frota), pelo convívio e pela amizade.
Ao meu orientador Prof. Dr. Aloísio Freitas Chagas Júnior, pela confiança em transmitir seus conhecimentos, suas experiências, que tornaram possível a existência deste trabalho e apoiar-me em todas as dificuldades, ensinando, antes que com palavras, pelo exemplo. A confiança nas minhas possibilidades, o seu otimismo, apoio e respeito no decorrer de toda a orientação. Obrigada por tudo.
Aos professores da pós-graduação da UFT, Tarcísio Leal, Flávio, Henrique Guilhon, Elizangela, Saulo, Gil Rodrigues, Raimundo Wagner, pelos conhecimentos transmitidos durante as disciplinas ministradas, dedicação e amizade.
A todos os funcionários dos Laboratórios de Fitopatologia, Laboratório de Solos e Laboratório de Controle Biológico de Pragas pela inestimável colaboração na realização deste trabalho.
Aos membros da banca pela disponibilidade em contribuir com o nosso trabalho. Ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal- UFT, por possibilitar a concretização desse sonho.
Ao CNPq, pelo auxílio financeiro.
A Empresa JCO fertilizantes pela disponibilidade do material utilizado na avaliação.
A todos que direta ou indiretamente, cooperaram para o bom andamento do trabalho, principalmente aqueles que foram capazes de um gesto de compreensão e bondade, marcando de uma forma particular minha passagem por esta instituição.
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SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ... 9
LISTA DE TABELAS... 10
INTRODUÇÃO GERAL ... 12
CAPÍTULO I – Potencial de solubilização de fosfato e produção de AIA (ácido indol acético) por Trichoderma spp RESUMO ... 18 ABSTRACT ... 19 INTRODUÇÃO ... 20 MATERIAL E MÉTODOS ... 22 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 24 CONCLUSÕES ... 28
CAPÍTULO II – Promoção de crescimento por rizóbio e Trichoderma spp em feijão-caupi no cerrado, sul do Tocantins. RESUMO ... 30 ABSTRACT ... 31 INTRODUÇÃO ... 32 MATERIAL E MÉTODOS ... 34 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 37 CONCLUSÕES ... 50
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CAPÍTULO III – Efeito da inoculação combinada de rizóbio e Trichoderma spp em diferentes cultivares de feijão-caupi no cerrado, Gurupi-TO.
RESUMO ... 52 ABSTRACT ... 53 INTRODUÇÃO ... 54 MATERIAL E MÉTODOS ... 56 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 59 CONCLUSÕES ... 75 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ... 76
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LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO II
Figura 1. Eficiência relativa de feijão-caupi cv. vinagre inoculado com rizóbio e Trichoderma, em relação ao tratamento adubado com nitrogênio, 50 dias após o plantio
(Safras 2011 e 2012). . ... 42
Figura 2: Eficiência simbiótica das estirpes de rizóbio dos tratamentos inoculado com
rizóbio e Trichoderma, em relação ao N total acumulado no feijão-caupi var. vinagre, 50 DAP. (Safra 2011 e 2012... 43
CAPÍTULO III
Figura 1: Eficiência relativa de feijão-caupi cv. Vinagre, Corujinha, Fradinho e Sempre
verde, inoculado com rizóbio e Trichoderma, em relação ao tratamento adubado com nitrogênio, 50 dias após o plantio. Experimentos 1, 2, 3 e 4. ... 65
Figura 2: Eficiência simbiótica das estirpes de rizóbio dos tratamentos inoculado com
rizóbio e Trichoderma, em relação ao N total acumulado no feijão-caupi 50 dias após o plantio. cv. Vinagre, Corujinha, Fradinho e Sempre verde (Experimentos 1, 2, 3 e 4). 66
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LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
Tabela 1. Isolados de Trichoderma obtidos do produto Trichoplus JCO e suas origens
de isolamento...22
Tabela 2. Solubilização de fosfato de cálcio em meio NBRIP modificado por isolados
de Trichoderma sp, em diferente intervalo de tempo (dias)...25
Tabela 3. Produção de AIA por Trichoderma em meios BD e FAN na ausência e
presença de L- triptofano...27
CAPÍTULO II
Tabela 1: Massa seca da parte aérea (MSPA), raiz (MSR) e total (MST) em feijão-caupi
cv. Vinagre inoculado com rizóbio e Trichoderma sp. (Trichoplus JCO). Safra 2011e 2012. Gurupi-TO ... 38
Tabela 2. Número de nódulos (NN) e massa seca dos nódulos (MSN) em feijão-caupi
cv. Vinagre inoculado com rizóbio e Trichoderma sp. (Trichoplus JCO). Safra 2011 e 2012. Gurupi-TO. ... 40
Tabela 3.Teor de Nitrogênio (TN), acúmulo de nitrogênio na parte aérea (ANPA) e
produtividade de feijão-caupi cv. Vinagre em Gurupi-TO. ... 41
Tabela 4.Incidência e severidade de podridão radicular (Rhizoctonia solani) de plantas
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Tabela 5. Estande inicial e estande final do feijão-caupi cv. Vinagre inoculado com
rizóbio e Trichoderma. ... 45
CAPÍTULO III
Tabela 1. Massa seca da parte aérea (MSPA), raiz (MSR), total (MST), número de
nódulos (NN) e massa seca dos nódulos (MSN) em feijão-caupi cv. Vinagre inoculado com rizóbio e Trichoderma sp.1 Experimento 1. ... 60
Tabela 2. Massa seca da parte aérea (MSPA), raiz (MSR), total (MST), número de
nódulos (NN) e massa seca dos nódulos (MSN) em feijão-caupi cv. Corujinha, inoculado com rizóbio e Trichoderma sp.Experimento 2. ... 61
Tabela 3. Massa seca da parte aérea (MSPA), raiz (MSR), total (MST), número de
nódulos (NN) e massa seca dos nódulos (MSN) em feijão-caupi cv. Fradinho, inoculado com rizóbio e Trichoderma sp. Experimento 3. ... 63
Tabela 4. Massa seca da parte aérea (MSPA), raiz (MSR), total (MST), número de
nódulos (NN) e massa seca dos nódulos (MSN) em feijão-caupi cv. Sempre verde, inoculado com rizóbio e Trichoderma sp. Experimento 4. ... 64
Tabela 5. Produtividade de feijão-caupi cv. Vinagre (Experimento 1), cv. Corujinha
(Experimento 2), cv. Fradinho (Experimento 3) e cv. Sempre verde (Experimento 4), inoculados com rizóbio e Trichoderma sp. ... 67
Tabela 6. Teor de Nitrogênio (TN), acúmulo de nitrogênio na parte aérea (ANPA) e
teor de fósforo em feijão-caupi cv. Vinagre, Corujinha, Fradinho e Sempre verde. Experimentos 1, 2, 3 e 4. ... 69
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Introdução Geral
O feijão-caupi, feijão-de-corda, feijão-de-rama ou feijão fradinho (Vigna
unguiculata (L.) Walp.) é um alimento básico para a população, principalmente do
Nordeste, sendo uma excelente fonte de proteínas, possuindo a maioria dos aminoácidos essenciais, carboidratos, vitaminas e minerais, além de ter grande quantidade de fibras dietéticas e baixa quantidade de gordura (ANDRADE JÚNIOR et al., 2003).
Apresenta elevada capacidade de fixação biológica do nitrogênio atmosférico e adapta-se bem a solos de baixa fertilidade, nas mais diversas condições climáticas (EHLERS & HALL, 1997). De acordo com Melo et al. (2003) o fato do feijão-caupi fixar o nitrogênio da atmosfera, por meio da simbiose com bactérias do gênero
Rhizobium, garante um melhor desenvolvimento vegetativo e produtivo, contribuindo
para redução do uso de fertilizantes nitrogenados.
Em diversas regiões semiáridas do mundo o caupi constitui uma das principais culturas, ocupando 13,9 milhões de hectares mundialmente distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais da África, da Ásia e das Américas, com produção de 4,9 milhões de toneladas grãos. O Brasil é o terceiro produtor mundial com 1,5 milhão de hectares cultivados e produção de 492,3 mil toneladas (SINGH et al., 2002; FAO, 2007). As regiões onde se concentram os maiores cultivos são as regiões Norte (55,8 mil hectares) e Nordeste (1,2 milhão de hectares), onde constitui uma das principais alternativas sociais e econômicas de suprimento alimentar e geração de emprego, especialmente
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para as populações rurais (FREIRE FILHO et al., 2005), alcançando quase a totalidade das áreas plantadas com feijão no Amazonas, Roraima, Rio Grande do Norte, Ceará , Maranhão e Piauí (SANTOS et al., 2007; CRAVO & SOUZA, 2007; FREIRE FILHO et al., 2007). No entanto, na região Centro-Oeste, a cultura está conquistando espaço em razão do desenvolvimento de variedades com características que favorecem o cultivo mecanizado (FAO, 2009).
O feijão-caupi contribui com 35,6 % da área plantada e 15 % da produção de feijão (feijão-caupi + feijão-comum) no país (FAO, 2009). Já no Cerrado o caupi vem sendo introduzido recentemente principalmente por sua compatibilidade com o sistema de rotação de cultura e também como cultura principal (ZILLI et al., 2006; MENEZES et al., 2007). Atualmente, o Tocantins possui uma área de plantio de feijão-caupi, na região de várzeas tropicais, em torno de 3,5 mil hectares e uma produção anual de 4,5 mil toneladas (CONAB, 2012).
O feijão-caupi é um alimento que tem um grande potencial para a expansão do consumo, como também para processamento industrial (FREIRE FILHO et al., 2007). O interesse pela cultura vem aumentando devido sua produção de alta qualidade, o que possibilita sua boa aceitação por parte de comerciantes, agroindústrias, distribuidores e consumidores, além do seu preço muito competitivo quando cultivado na época de safrinha (FREIRE FILHO et al., 2009).
Mesmo sendo uma cultura compatível com as condições ecológicas locais, ainda apresenta baixa produtividade, principalmente por predominarem as lavouras conduzidas sob dependência das chuvas (FREIRE FILHO et al., 2005). No sul do Estado do Tocantins as principais causas que limitam a produtividade do feijão-caupi que merecem destaque é o cultivo de variedades tradicionais com baixa capacidade produtiva, razão pela qual se observa que o aumento de produtividade pode ser alcançado mediante a utilização de sementes de qualidade superior.
O uso de insumos biológicos tem sido cada vez mais frequente na agricultura. E um desses que tem se mostrado indispensável para a sustentabilidade da agricultura brasileira é a fixação biológica de nitrogênio (FBN), haja vista o fornecimento de nitrogênio às culturas com baixo custo econômico, impacto ambiental reduzido e por terem resultados promissores quanto à utilização (MARTINS et al., 2003; LACERDA et al., 2004; RUMJANEK et al., 2005; SOARES et al., 2006; ZILLI et al., 2006; ZILLI et al., 2007; CHAGAS JR., 2009, 2010).
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No cerrado do Tocantins, entretanto, o uso de inoculantes na cultura do feijão-caupi ainda é muito limitado, necessitando de estudos de avaliação da fixação biológica do nitrogênio e da eficiência agronômica das estirpes de rizóbios nas condições de clima e solo do cerrado no Sul do Tocantins.
Outros fatores que limitam a produção do feijão-caupi no Brasil, encontram-se as doenças causadas por agentes patogênicos, as quais influenciam na qualidade e na quantidade de feijão produzida. Os fungos agrupam o maior número de patógenos nocivos a esta cultura, embora bactérias,nematóides e vírus também proporcionam danos significativos (ATHAYDE SOBRINHO et al., 2000). Possuem ampla diversidade de espécies patogênicas, estando presente em diversos habitats e colonizam vários tecidos vegetais (ATHAYDE SOBRINHO et al., 2000, 2005).
Dentre as principais doenças que atacam a planta do feijão-caupi está a mela, causada pelo fungo Rhizoctonia solani Kühn (teleomorfo Thanatephorus cucumeris). O fungo é um patógeno de planta habitante do solo que apresenta grande capacidade competitiva saprofítica e que sobrevive colonizando restos de cultura ou mediante a formação de estruturas de resistência, o que torna seu controle difícil (GODINHO et al., 1999). Em condições de campo, observa-se desfolha de 3 a 80% em linhagens de feijão-caupi de porte ereto (NECHET et al., 2006) e redução de 577 kg ha-1 na produção do genótipo suscetível (80% desfolha). A disseminação a partir do inóculo primário ocorre principalmente através de respingos de chuva, carreando fragmentos de micélio ou escleródios para as folhas e pecíolos de plantas jovens, antes do fechamento das entrelinhas na lavoura (SILVEIRA, 2003).
A característica inicial da doença manifesta-se através de anasarca (encharcamento), que indica que o fungo dispõe de uma bateria de enzimas que provocam a desintegração dos espaços intercelulares de outras substancias (toxinas e enzimas), que alteram a permeabilidade das células que perdem sua turgescência e morrem, sendo seus constituintes utilizados como substratos nutritivos para o fungo, caracterizando este patógeno como necrófilo (GODINHO et al., 1999). Os sintomas iniciais ocorrem nos estágios iniciais da germinação e emergência das plântulas, resultando em tombamento ou damping off.
Considerados como microrganismo importante utilizado como inoculante em culturas agrícolas os fungos do gênero Trichoderma são microrganismos de vida livre e estão entre os mais estudados e conhecidos agentes de biocontrole no mundo (VERMA et al., 2007a,b). Atualmente, espécies de Trichoderma são os agentes de controle
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biológico mais comercialmente utilizados no Brasil (LOPES, 2009). Formulados como biopesticidas, biofertilizantes e inoculantes de solo (HARMAN et al., 2004), sendo T.
harzianum a espécie mais estudada (MARIANO et al., 2005).
Trichoderma spp. é um micoparasita necrotrófico eficaz no controle de
inúmeros fungos fitopatogênicos, principalmente aqueles com estruturas de resistência consideradas difíceis de serem atacadas por microrganismos, como esporos, escleródios, clamidósporos, microescleródios. Trichoderma spp. é um fungo imperfeito, pertencente à Sub-divisão Deuteromycotina, ordem Hifomicetes e família Moniliaceae e possui muitas espécies que são geneticamente distintas, podendo ser encontrado no mundo todo e em praticamente todos os tipo solos (MELO,1991).
Para a agricultura, além do controle de patógenos, o uso de Trichoderma spp. pode oferecer várias vantagens como: decomposição de matéria orgânica, uma microflora competitiva/deletéria através da colonização da rizosfera (HARMAN et al., 2004). Esse gênero apresenta características essenciais para um agente de controle biológico, como ausência de impacto negativo ao meio ambiente, presença de estruturas de reprodução de fácil propagação, principalmente em substratos naturais, capacidade de sobreviver em ambientes desfavoráveis, além de conter populações de patógenos em condições de solo diferentes (VINALE et al., 2008). Esse fungo vem sendo considerado por muitos autores como promotor de crescimento. O seu potencial tem sido verificado na germinação de sementes e no crescimento de plantas (LUZ, 2001; RESENDE et al., 2004; CARVALHO FILHO,2008).
O tratamento de sementes com microrganismos antagonistas pode promover bom desenvolvimento de plantas de forma geral, incluindo os efeitos benéficos na germinação de sementes, emergência e desenvolvimento das plântulas, uma vez que, fungos do gênero Trichoderma são capazes de atuar como bioestimulante do crescimento radicular, promovendo o desenvolvimento de raízes através de fitohormônios, e assim melhorar a assimilação de nutrientes o que aumenta a resistência diante de fatores bióticos não favoráveis, além de degradar fontes de nutrientes que serão de fundamental importância para o desenvolvimento do vegetal (HARMAN, 2000; HARMAN et al., 2004).
Para que o Trichoderma spp. seja eficiente, é necessário que ele consiga se adaptar e sobreviver no ambiente que irá crescer e atuar como agente de biocontrole, visto que sua habilidade no ambiente é dependente de fatores abióticos e bióticos como tipo de solo, pH, temperatura, umidade, aeração do solo, tipo de microflora, de substrato
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e nutrientes (HOWELL, 2003; BENÍTEZ et al., 2004; VERMA et al., 2007a).
A utilização de bioprodutos que atuam no controle biológico de microorganismos patogênicos é uma realidade atual no manejo integrado de doenças. Nesse cenário, inclusive no aspecto comercial da cultura do feijão-caupi, veem se destacando a produção de biocontroladores a base do fungo Trichoderma,que estão sendo propostos como mais uma ferramenta no controle de fitopatógenos em alternativa ou em combinação com o uso de fungicidas químicos em diversos sistemas de produção, uma vez que a combinação de métodos de controle com o objetivo de reduzir a intensidade de doenças radiculares pode resultar num aumento na produtividade sem que haja uma interferência negativa no meio ambiente. Os fungicidas químicos apresentam somente um controle temporário e usualmente necessitam de aplicações repetidas durante o crescimento da planta, enquanto agentes de controle biológico são capazes de se estabelecer colonizar e se reproduzir no ecossistema (ÁVILLA, et al., 2005)
Assim, a inoculação de rizóbio associado ao Trichoderma pode exercer uma ação antagonista contra patógenos da rizosfera atuando também como promotor de crescimento e a atividade infectiva e de fixação de nitrogênio das estirpes de rizóbio. Com a substituição de insumos convencionais por biológicos buscando a sustentabilidade e o aumento de produtividade é que este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da dupla inoculação de rizóbio e Trichoderma em feijão caupi cultivado em campo no município de Gurupi, no sul do Tocantins.
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Capítulo I
Potencial de solubilização de fosfato e produção de AIA
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Potencial de solubilização de fosfato e produção de AIA por Trichoderma spp. RESUMO
Fungos do gênero Trichoderma podem produzir substâncias que auxiliam a planta tanto no controle de fitopatógenos como na promoção do crescimento vegetal, através da síntese do ácido indol acético (AIA) e/ou solubilização de fosfato. Assim, avaliou-se o potencial de produção de AIA e a capacidade de solubilização de fosfato,
in vitro, por isolados de Trichoderma spp. A partir de culturas de Trichoderma crescidas
em meio BDA (batata, dextrose e Agar), foram retirados discos de aproximadamente 8,0 mm de diâmetro contendo micélio e conídios e repicados para Erlenmeyer (250 mL) contendo meios BD (batata e dextrose) e FAN na ausência e presença de L-triptofano, como precursor para biosíntese de AIA. Para a avaliação da capacidade de solubilização de fosfato, discos de aproximadamente 8,0 mm de diâmetro com micélio e conídios, também, foram repicados para Erlenmeyer (250 mL), contendo meio NBRIP (modificado) contendo os seguintes ingredientes (g L-1): glicose, 10,0; 10,0; MgCl2.6 H2O, 5,0; MgSO4.7H2O, 0,25; KCl, 0,2; (NH4)2SO4, 0,1. Foram adicionados ao meio, 50 mL de K2HPO4 (10%) e 100 mL de CaCl2 (10%), para formação de precipitado insolúvel de CaHPO4. Após análise colorimétrica, determinaram-se os teores de AIA e fósforo solúvel. Com relação à produção de AIA, todos os isolados, com exceção do isolados Tr-Dina, produziram AIA nos meios de cultura BD e FAN suplementado ou não com L-triptofanos. Os valores obtidos foram significativamente maiores com a utilização de L-triptofano, evidenciando o efeito positivo da utilização do L-triptofano como indutor para síntese de AIA. Quanto à solubilização de fosfato, os isolados testados foram capazes de solubilizar fosfato em meio NBRIP.
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Potential phosphate solubilization and AIA production of Trichoderma spp ABSTRACT
Fungi of the genus Trichoderma can produce substances that help the plant in the control of plant pathogens and in promoting plant growth, through the synthesis of indole acetic acid (IAA) and/or phosphate solubilization. Thus, to evaluate the potential production of IAA and ability to solubilize phosphate, in vitro, and Trichoderma spp. From Trichoderma colonies grown on PDA (potato dextrose agar), disks were obtained approximately 8.0 mm in diameter containing conidia and mycelium and transferred to Erlenmeyer flask (250 ml) containing means PD (potato dextrose) and FAN in the absence and presence of L-tryptophan, the precursor for biosynthesis of IAA. To evaluate the ability to solubilize phosphate, disks of approximately 8.0 mm in diameter and conidia and mycelium also were transferred to Erlenmeyer flask (250 mL) containing NBRIP medium (modified) containing the following ingredients (g L-1 ): glucose, 10.0, 10.0, MgCl2.6 H2O, 5.0; MgSO4.7H2O, 0.25, KCl 0.2, (NH4)2SO4, 0.1. Were added to the medium, 50 ml of K2HPO4 (10%) and 100 ml of CaCl2 (10%) to insoluble precipitate of CaHPO4. After colorimetric analysis, we determined the levels of IAA and soluble phosphorus. For the production of IAA, all isolates, except for isolated Tr-Dina, synthesize IAA in the culture media BD and FAN supplemented or not with tryptophan. The values were significantly higher with the use of L-tryptophan, showing the positive effect of the use of L-tryptophan as an inducer for the synthesis of IAA. The solubilization of phosphate, the strains tested were able to solubilize phosphate NBRIP means.
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INTRODUÇÃO
Fungos do gênero Trichoderma spp. estão entre os microrganismos mais comumente estudados como agentes de controle biológico de doenças em plantas e apresentam também atividade como promotores de crescimento de plantas (ALTOMARE et al., 1999; GRAVEL et al., 2007; SANTOS et al., 2010; MACHADO et al., 2011). Muitas destas espécies possuem a capacidade de se associar às raízes, formando uma interação interespecífica de simbiose, por mecanismos similares àqueles de fungos micorrízicos (BENÍTEZ et al., 2004).
Os mecanismos de promoção de crescimento vegetal por microrganismos do solo podem ser diretos e indiretos. Os diretos podem ser a produção de hormônios, ou outra substância análoga a estes, que influenciam no crescimento ou desenvolvimento da planta (BASHAN & HOLGUIN, 1997; MACHADO et al., 2011), ou ainda suprindo suas necessidades nutricionais pela solubilização de fosfatos (BLOEMBERG & LUGTENBERG, 2001; GRAVEL et al., 2007). Já os benefícios indiretos podem ser pela ação de microrganismos por meio da supressão de patógenos (HARMAN et al., 2004; BENÍTEZ et al., 2004; CARVALHO et al., 2011; SILVA et al., 2011; GAVA E MENEZES, 2012).Esse mecanismo leva ao desenvolvimento da planta, incluindo efeitos benéficos na germinação de sementes, emergência e desenvolvimento de plântulas e produção de grãos e frutos. Os nutrientes solubilizados tornam-se disponíveis para a absorção pela raiz, reduzindo assim a necessidade de adubações (HARMAN, 2000; ALTOMARE et al., 1999).
Quanto à produção do hormônio, a síntese de auxinas, particularmente o ácido indol-acético (AIA) promove o crescimento das raízes e a proliferação de pelos radiculares, o que pode melhorar a absorção de nutrientes e água do solo e, consequentemente, melhorar o crescimento da planta (CABALLERO-MELLADO et al., 2006). Vários estudos têm reportado que os microrganismos estão ativamente envolvidos na síntese de auxinas, tanto em meio de cultura quanto no solo (SOUCHIE et al., 2007; ALMANÇA, 2008; CARVALHO FILHO, 2008).
A biosíntese de AIA por microrganismos tem sido reportada, porém o L-triptofano, como aminoácido, tem sido usado como precursor fisiológico para a biosíntese de auxinas em plantas e microrganismos (KHALID et al., 2004). Os
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exsudados radiculares são fontes naturais de L-triptofano (LUM & HIRSCH, 2003) para a microbiota do solo, contribuindo para a síntese microbiana de AIA na rizosfera.
A produção de AIA por fungos tem sido reportada, evidenciando a capacidade de fungos em sintetizar AIA na rizosfera de plantas, podendo proporcionar o desenvolvimento radicular, como observado por Bjorkman (2004), Gravel et al. (2007), Souchie et al. (2007), Almança (2008) e Carvalho Filho (2008), em várias culturas.
Quanto à capacidade de solubilização de fosfatos, diversos microrganismos do solo, como os fungos, solubilizam diferentes formas de fosfatos inorgânicos. Os fungos foram relatados como solubilizadores de fosfatos em diversos trabalhos (SOUCHIE et al., 2005b; VASSILEV et al., 2006a,b; BARROSO & NAHAS, 2008; KAPRI & TEWARI, 2010). Tem-se reportado que os fungos e, provavelmente, todos os microrganismos do solo, sintetizam uma série de fosfatases que são necessárias para solubilizar fosfatos em meios contento fosfato ligado ou fixado (ILMER et al., 1995; RUDRESH et al., 2005; EL-KOMY, 2005). Kapri & Tewari (2010) destacaram o potencial de solubilização de fosfato por isolados de Trichoderma sp. em meio de cultura, indicado pelas concentrações de fosfato solúvel (µg mL-1), e o aumento significativo nos parâmetros de crescimento de grão de bico (Cicerarietinum) em ensaios de casa de vegetação, da mesma forma para culturas como Trifoliumrepens (trevo) e grão de bico, como reportado por Vassilev et al. (2006a) e Kapri & Tewari (2010), respectivamente.
A utilização de microrganismos que possuem a capacidade de realizar este tipo de solubilização tem sido empregada como forma de substituir ou reduzir o uso de fertilizantes fosfáticos solúveis, pois dessa forma haverá melhor aproveitamento dos fosfatos naturais (SILVA FILHO et al., 2002) e também dos fosfatos que se encontram adsorvidos.
Considerando o baixo nível de fertilidade do solo, em especial o fósforo nos solos do cerrado tocantinense, o estudo teve por objetivo avaliar o potencial de solubilização de fosfato e a capacidade de sintetizar AIA, ambos in vitro, usando isolados de Trichoderma spp. obtidos de produtos comerciais.
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MATERIAL E MÉTODOS
Os isolados de Trichoderma avaliados neste estudo foram obtidos junto à empresa JCO Fertilizantes e Bioprodutos. A partir do produto comercial contendo isolados de diferentes regiões no Brasil e que fazem parte do mix de fungos que formam o produto Trichoplus (Tabela 1).
Tabela 1: Isolados de Trichoderma obtidos do produto Trichoplus JCO e suas origens
de isolamento.
Isolados Espécie Origem de isolamento
Tr-SMa Trichoderma sp. Isolado de cultivo de sorgo
Tr-SMb Trichoderma sp. Isolados de cultivo de milheto
Tr-Euc Trichoderma harzianum (Hypocrea lixii) Isolado de cultivo de Eucalipto
Tr-har Trichoderma harzianum(T. asperellum) --*
Tr-Gok Trichoderma asperelum --
Tr-Dina Trichoderma longibrachiatum --
* Origem não definida.
Para o ensaio de solubilização de fosfato in vitro os isolados de Trichoderma spp. foram cultivados inicialmente em meio BDA (batata, dextrose e ágar) a 28 oC, por sete dias. A partir dessas culturas foram retirados discos de aproximadamente 8,0 mm de diâmetro contendo micélio e conídios e repicados para Erlenmeyer (250 mL), onde em seguida foram testados quanto ao potencial de solubilização de fosfato in vitro em meio NBRIP modificado (NAUTYAL, 1999), contendo os seguintes ingredientes (g L -1
): glicose, 10,0; 10,0; MgCl2.6 H2O, 5,0; MgSO4.7H2O, 0,25; KCl, 0,2; (NH4)2SO4, 0,1.Foram adicionados ao meio, 50 mL de K2HPO4 (10%) e 100 mL de CaCl2 (10%), para formação de precipitado insolúvel de fosfato de cálcio (CaHPO4). A estimativa quantitativa de solubilização de fosfato foi realizada em triplicata. A incubação foi realizada a 28±1 °C em um agitador a 150 rpm durante dez dias. Foram feitas avaliações aos cinco, sete e dez dias após a repicagem.
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Para a determinação da concentração de fósforo (P) solúvel utilizou-se o método colorimétrico de Murphy & Riley (1962), subtraindo-se o P solúvel contido nos tratamentos pelo contido na amostra controle (meio de cultura com fosfato e sem inóculo). Para as avaliações foram utilizadas uma parte do reagente, 0,5 ml da amostra filtrada mais 5mL de água destilada para cada amostra. Após 20 minutos de reação o P solúvel foi quantificado em espectrofotômetro no comprimento de onda de 725 nm de absorbância. A curva padrão para quantificação de P foi feita a partir do fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) e as concentrações calculadas em µg mL-1.
Para a produção de AIA in vitro por Trichoderma spp. inicialmente os isolados foram previamente cultivados em placa de Petri em meio BDA (batata, dextrose e Agar), por sete dias a 28 ºC. Para a avaliação da produção de AIA foram utilizados dois meios de cultura para fungos. O meio BDA e o meio FAN (glicose, 20 g; extrato de levedura, 3 g; K2HPO4, 0,6 g; MgSO4, 0,3 g; pH 5,9 – 6,1) (FAN, 2002). Os isolados foram transferidos, através de discos de aproximadamente 8,0 mm de diâmetros contendo o micélio e hifas do fungo, para frascos de Erlenmeyer (250 mL) contendo 50 mL com os meios BD e FAN na ausência (testemunha) e presença de L-triptofano. A concentração de L-triptofano utilizada foi de 100 mg L-1, sendo utilizadas três repetições por isolado para cada tratamento em cada meio utilizado.
Após três, cinco e sete dias de crescimento sob um agitador rotatório (150 rpm) a 26 ± 2 ºC, a massa fúngica foi separada por centrifugação a 12.000 rpm por 15 minutos. Para a análise colorimétrica de AIA (GORDON & WEBER, 1951) foram utilizados uma parte do reagente de Salkowski [FeCl3 0,5 mol L-1 + HClO4 (35%)] e duas partes do sobrenadante obtido de cada isolado. Após a comprovação qualitativa da presença de AIA (coloração rosa após 25 minutos de reação à temperatura de 28 ºC no escuro), o fitormônio foi quantificado em espectofotômetro em 530 nm. As concentrações, em µg mL-1, foram calculadas a partir de uma curva padrão com concentrações conhecidas da forma sintética do hormônio (0 a 100 µg mL-1), cujas leituras foram a base para calcular a concentração de AIA nas amostras.
Os dados foram submetidos à análise de variância e ao teste de agrupamento de médias Scott-Knott a 5% de probabilidade utilizando o programa estatístico ASSISTAT versão 7.6 beta (SILVA, 2008).
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
Todos os isolados mostraram cresceram em meio NBRIP modificado, com o desaparecimento simultâneo do fosfato de cálcio adicionado ao meio, dentro de sete dias, na maioria dos casos. A concentração de fosfato solubilizado gradualmente aumentou, na maioria dos isolados, de cinco a sete dias, e diminuiu em seguida, aos 10 dias de crescimento (Tabela 2). A concentração de fosfato variou de 2,74 a 8,44 µg mL -1
nos filtrados de cultura dos isolados de Trichoderma na primeira avaliação (cinco dias), com os isolados Tr-SMa (7,45), TR-SMb(6,59)e Tr-Dina (8,44) apresentando concentrações significativamente superiores (p<0,05). Aos sete dias de crescimento, as concentrações encontradas para os isolados Tr-Euc e Tr-Dina (8,31 e 8,35 µg mL-1, respectivamente), foram superiores (p<0,05) aos demais isolados. Na avaliação aos 10 dias, o isolados Tr-Dina apresentou concentração de fosfato de 6,20 µg mL-1, superior (p<0,05) aos demais isolados. A concentração de fosfato significativamente mais baixa foi registrado para o filtrado de cultura do isolado Tr-har, que variou de 2,47 a 3,33 µg mL-1 nas três épocas de avaliação.
A diminuição do fosfato de cálcio observado no meio de cultura com os isolados indica o potencial de Trichoderma para a solubilização de fosfato inorgânico. A diminuição, em geral, da concentração de fosfato solubilizado, na última avaliação, aos 10 dias após a repicagem, pode ter sido em função da utilização pelos fungos para os processos celulares. Houve variação dos isolados de Trichoderma quanto ao potencial de solubilização de fosfato sendo os isolados Dina, SMa, SMb e Tr-Euc e os mais eficazes na solubilização de fosfato (Tabela 2). Resultados semelhantes foram reportados por Kapri e Tewari (2010) que destacou o potencial de solubilização de fosfato por Trichoderma sp. isolados da rizosfera de diferentes árvores, onde todos os isolados testados foram capazes de solubilizar fosfato tricálcio em meio NBRIP. A capacidade de solubilização de fosfatos por fungos em diferentes meios sólidos e líquido, também, foram reportados por outros autores (ALTOMARE et al., 1999; SILVA FILHO et al., 2002; ALAM et al., 2002; SOUCHIE et al., 2005b).
A capacidade de solubilização de fosfato por microrganismos pode estar relacionada à acidificação do meio, devido a diminuição do pH em função da liberação
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de ácidos orgânicos ao meio. Segundo Illmer & Schinner (1992), houve uma diminuição do pH até quatro dias seguidos por um aumento gradual durante a solubilização de fosfato por Penicillium e Pseudomonas em culturas líquidas. Porém, Kapri & Tewari (2010) concluíram que, contrariamente ao que o pH decrescente para culturas individuais até 48 horas e depois a aquisição de constância, as concentrações de fosfato solúveis continua a aumentar após 48 h. Isto sugere claramente que a queda de pH não é o fator único para a solubilização de fosfato.
Os fungos demonstraram crescimento abundante no meio líquido. Resultados semelhantes foram encontrados por Nahaset al (1994), Illmer & Schinner (1995) e Souchie et al. (2005b), que relatam maior capacidade de solubilização de fosfatos para os fungos comparados às bactérias, sendo isto, possivelmente, devido à maior produção de biomassa e redução de pH.
O aumento inicial na concentração de fosfato, dos cinco aos sete dias, seguido por uma diminuição gradual no filtrado de cultura, aos 10 dias de cultivo, também foi reportado em outros trabalhos (NAUTIYAL, 1999; KAPRI & TEWARI, 2010). Esta diminuição da concentração de fosfato aos10 dias pode ser correlacionada com a sua fixação no micélio de Trichoderma, e segundo Kapri & Tewari (2010), este fosfato poderá ser libertado de uma forma facilmente disponível em estreita proximidade com as raízes após a lise de micélio com a idade.
Tabela 2: Solubilização de fosfato de cálcio (10 g L-1) em meio NBRIP (modificado) por isolados de Trichoderma sp, em diferente intervalo de tempo (dias)1.
Isolados Concentração de fosfato solubilizado (µg mL
-1 )
5 dias 7 dias 10 dias
Tr-SMa 7,45 aA 6,75 bA 3,45 bB Tr-SMb 6,59 aA 6,57 bA 3,81 bB Tr-Euc 2,7 4cC 8,31 aA 4,55 bB Tr-har 3,33 cA 2,86 cA 2,47 cA Tr-Gok 5,98 bA 3,22 cB 4,60 bA Tr-Dina 8,44 aA 8,35 aA 6,20 aB Controle 0,29 dA 0,29 dA 0,30 dA C.V.(%) 2 13,5 11,2 14,2 1
Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem entre si pelo teste de Scott Knott a 5%.2 Coeficiente de Variação.
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Todos os isolados, com exceção do isolados Tr-Dina, produziram AIA nos meios de cultura BD e FAN suplementado ou não com L-triptofano (Tabela 3). Na ausência do indutor, a síntese de AIA variou significativamente de 1,4 a 3,0 µg mL-1, com os isolados Tr-SMa e Tr-har respectivamente nas avaliações aos três dias de crescimento no meio BD e os isolados Tr-Euc (1,4) com a menor média e Tr-SMb(2,3) e Tr-Gok (2,3) com as maiores médias para o meio FAN. No quinto dia de avaliação não houve diferença significativa entre os tratamentos com os isolados, somente em relação ao isolado Tr-Dina, que não apresentou concentração de AIA, e a testemunha, para o meio BD. Para o meio FAN as maiores concentrações foram para os isolados SMb(2,3) e Gok (2,5). No sétimo dia de crescimento, os isolados SMa (2,0), Tr-SMb (2,0), Tr-Euc (1,8) e Tr-har (1,8) apresentaram as maiores médias (p<0,05) para o meio BD e o isolado Tr-SMb(2,8) para o meio FAN.
Com o uso do L-triptofano, aos três dias de avaliação as maiores médias foram observadas para os tratamentos com os isolados Tr-SMa, Tr-SMb e Tr-har para o meio BD e o isolado Tr-Euc para o meio FAN. No quinto dia de avaliação, destaque para o isoladoTr-SMb para o meio BD e os isolados Tr-SMa , Tr-SMb e Tr-Euc para o meio FAN, superiores (p<0,05) aos demais tratamentos. Já no sétimo dia de avaliação, o isolado Tr-SMb apresentou as maiores médias (p<0,05) para os meios BD e FAN (Tabela 3). Na comparação dos tratamentos com e sem L-triptofano, houve diferença significativa nas três épocas de avaliação e nos dois meios utilizados, evidenciando o efeito positivo da utilização do L-triptofano como indutor para síntese de AIA.
Carvalho Filho (2008) concluiu que alguns isolados de Trichoderma revelaram produção do fitohotmônio AIA, em testes de filtrados de colônias com o reagente de Salkowski. Gravel et al. (2007), também verificaram a produção de AIA por um isolado de T. atroviride, utilizando diferentes meios de cultura contendo os precursores triptofano, triptamina e triptofol. Almança (2008), testando cinco isolados de
Trichoderma, encontrou resultados semelhantes aos encontrados no presente trabalho,
também com isolados que não apresentaram produção de AIA em níveis detectáveis,como observado para o isolado Tr-Dina nos dois meios utilizados (Tabela 3).
Em trabalhos realizados por Gravel et al. (2007) verificaram a capacidade de
Pseudomonas putida e T. atroviride em promover o crescimento reprodutivo de plantas
de tomate sob condições típicas de crescimento hidropônico. Atribuíram esse crescimento ao resultado dos numerosos modos de ação exibidos pelos organismos
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testados, incluindo a regulação da concentração de ácido indolilacético na rizosfera. Estes autores verificaram a capacidade destes microrganismos em produzir AIA in vitro a partir de diferentes precursores, inclusive o L-triptofano, e concluiu que na dose de 0,75mM de L-triptofano, aumentou-se a produção de AIA, o peso fresco e comprimento do caule e raízes da cultura.
A produção de AIA pelos isolados de Trichoderma avaliados sugere o uso potencial desses fungos como promotores do crescimento radicular de espécies vegetais de importância agrícola, conforme documentado por Bjorkman (2004), Resende et al. (2004), Gravel et al., (2007), Almança (2008) e Carvalho Filho (2008). Este fitormônio produzido pelos microrganismos, quando se encontra em concentrações baixas atua estimulando o crescimento, e quando o mesmo apresenta-se em altas concentrações, pode prejudicar o desenvolvimento radicular (SILVEIRA, 2008).
Tabela 3: Produção de AIA (µg mL-1) por Trichoderma em meios BD e FAN na ausência (S Trip.) e presença (C Trip.) de L-triptofano.1
Tratamentos AIA (µg mL
-1
) - MEIO BD
3 dias 5 dias 7 dias
S Trip. C Trip. S Trip. C Trip. S Trip. C Trip. Tr-SMa 1,4 aB 11,1 aA 1,7 aB 11,7 bA 2,0 aA 14,3 bA Tr-SMb 1,8 aB 13,3 aA 1,9 aB 14,8 aA 2,0 aB 18,7 aA Tr-Euc 2,0 aB 5,6 bA 1,7 aB 5,8 cA 1,8 aB 8,3 cA Tr-har 3,0 aB 9,4 aA 1,9 aB 7,4 cA 1,8 aB 6,2 cA Tr-Gok 1,6 aB 4,7 bA 1,6 aB 5,0 cA 1,3 bB 6,4 cA Tr-Dina 0,0 cA 0,0 dA 0,0 cA 0,0 eA 0,0 dA 0,0 eA Testemunha 0,5 bA 0,7 cA 0,4 bA 0,6dA 0,4cB 0,4 dA Média 1,5 B 6,4 A 1,3 B 6,5 A 1,3 B 7,8 A C.V.(%) 2 11,4 12,1 9,8 13,5 9,7 12,5
AIA (µg mL-1) - MEIO FAN
Tr-SMa 1,7 bB 14,3 bA 1,5 bB 15,2 aA 1,4 cB 13,3 bA Tr-SMb 2,3 aB 13,2 bA 2,3 aB 15,5 aA 2,8 aB 19, 9 aA Tr-Euc 1,4 bB 18,9 aA 1,5 bB 14,3 aA 1,7 bB 14,4 bA Tr-har 1,5 bB 13,3 bA 1,5 bB 9,0 bA 1,6 bB 6,9 dA Tr-Gok 2,3 aB 11,6 cA 2,5 aB 9,7 bA 2,3 bB 9,1 cA Tr-Dina 0,0 dA 0,0 eA 0,0 dA 0,0 dA 0,0 eA 0,0 fA Testemunha 0,4 cB 0,4 dA 0,4 cB 0,8 cA 0,6 dB 0,7 eA Média 1,4 B 10,2 A 1,4 B 9,2 A 1,5 B 9,2 A C.V. (%) 8,9 13,2 9,1 11,2 9,9 11,3 1
Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem entre si pelo teste de Scott Knott a 5%. 2 Coeficiente de Variação.
28 CONCLUSÕES
A maioria dos isolados de Trichoderma usados nesse trabalho foram capazes de produzir AIA tanto na presença quanto na ausência do percussor L-triptofano, com exceção apenas do isolado Tr-Dina.
O isolado que apresentou melhor desempenho quanto a produção de AIA foi o Tr-SMa.
O precursor L-triptofano apresentou efeito positivo como indutor para a síntese de AIA.
Todos os isolados de Trichoderma estudados foram capazes de solubilizar fosfato de Cálcio em meio de cultura.
O melhor resultado para solubilização de fosfato de cálcio foi obtido pelo isolado Tr-Dina.
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Capítulo II
Promoção de crescimento em feijão-caupi por rizóbio
eTrichoderma spp. no cerrado do Sul do Tocantins, Safras 2011
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Promoção de crescimento em feijão-caupi por rizóbio e Trichoderma spp no cerrado no Sul do Tocantins, safras 2011 e 2012
RESUMO
O trabalho teve como objetivo verificar a resposta de feijão-caupi cultivar Vinagre a inoculação com rizóbio e Trichoderma sp. no cerrado em Gurupi, em dois anos consecutivos (2011 e 2012). Foi feita a avaliação do efeito desses micro-organismos quanto à capacidade de exercer ação antagonista contra Rhizoctonia solani agente causal da mela, além da promoção de crescimento de plantas e de fixação de nitrogênio das estirpes de rizóbio. O experimento foi realizado em campo, com delineamento experimental de blocos ao acaso, correspondendo aos tratamentos: inoculação de rizóbio e Trichoderma sp. na semente; inoculação de rizóbio na semente e
Trichoderma sp. no solo; inoculação de rizóbio na semente e Trichoderma sp. na
semente e solo; somente inoculação de rízobio; controle adubado com nitrogênio (50 kg ha-1 de N); e testemunha sem inoculação, em duas épocas de desenvolvimento do feijão-caupi (25 e 50 dias após o plantio- DAP). A inoculação foi realizada com as estirpes INPA 03-11B e UFLA 03-84. Para os tratamentos com a utilização de Trichoderma sp., foi utilizado o inoculante comercial (Trichoplus JCO) em pó. Os resultados indicam que o potencial em fixação de nitrogênio das estirpes testadas e de bioproteção de
Trichoderma foi de fundamental importância para a produção de biomassa, nodulação e
produtividade, o que pode estar relacionada com a efetiva capacidade de fornecimento de nitrogênio e bioproteção contra patógenos pelas estirpes utilizadas. No geral a inoculação com rizóbio e Trichoderma na semente e no solo, proporcionaram melhores resultados nas variáveis analisadas para as duas safras nas duas avaliações, com produtividade das plantas superior (p>0,01) aos demais tratamentos.
Palavras-Chave: Vigna unguicula L. (Walp.); fixação biológica de nitrogênio;
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Growth promotingin cowpea by rhizobia and Trichoderma spp. in cerrado in southern Tocantins, crops 2011 and 2012
ABSTRACT
The study aimed to examine the response of cowpea cultivar vinegar inoculation with rhizobia and Trichoderma sp. cerrado in Gurupi in two consecutive years (2011 and 2012). Was performedto evaluate the effectthese microorganisms and the ability to exercise antagonist action against Rhizoctonia solan icausal agent of blight, acting as a promoter of plant growth and infective activity and nitrogen fixation of rhizobia strains. The experiment was conducted under field conditions and experimental design of randomized blocks, corresponding to the treatments: inoculation with rhizobia and
Trichodermasp. in the seed, the seed inoculation with rhizobia and Trichoderma sp. in
the soil, the seed inoculation with rhizobia and Trichoderma sp. in the seed and soil, only inoculation with rhizobia, control fertilized with nitrogen (50 kg N ha-1) and non-inoculated, in two periods of development of cowpea (25 and 50 days after planting-DAP). Inoculation was performed with the strains INPA 03-11B and UFLA 03-84. For treatments with Trichoderma sp. was used to inoculate Trichoplus JCO powder. The results showed that nitrogen fixation potential of the tested strains of Trichoderma and bioprotection was essential for the production of biomass, nodulation and yield, which may be related to the effective capacity to supply nitrogen and biopreservation against pathogens by strains used. Overall inoculation with rhizobia and Trichoderma in the seed and soil, provided better results in the variables analyzed for both crops in both evaluations, with higher productivity (p> 0.01) than other treatments
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INTRODUÇÃO
O feijão-caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp.) é um alimento básico para a população, principalmente do Norte e Nordeste, sendo uma excelente fonte de proteínas, possuindo todos os aminoácidos essenciais, carboidratos, vitaminas e minerais, além de ter grande quantidade de fibras dietéticas e baixa quantidade de gordura (ANDRADE JÚNIOR et al., 2003; FREIRE FILHO, 2005).
Por apresentar elevada capacidade de fixação biológica do nitrogênio atmosférico, o feijão-caupi adapta-se bem a solos de baixa fertilidade, nas mais diversas condições culturais (EHLERS & HALL, 1997). De acordo com Melo et al. (2003) o fato do feijão-caupi fixar o nitrogênio da atmosfera, por meio da simbiose com bactérias fixadoras de nitrogênio, garante um melhor desenvolvimento vegetativo e produtivo, contribuindo para redução do uso de fertilizantes nitrogenados.
O feijão-caupi é um produto que tem um grande potencial para a expansão do consumo, como também para processamento industrial (FREIRE FILHO et al., 2007). O interesse pela cultura vem aumentando devido sua produção de alta qualidade, o que possibilita sua boa aceitação por parte de comerciantes, agroindústrias, distribuidores e consumidores, além do seu preço muito competitivo quando cultivado na forma de safrinha (FREIRE FILHO et al., 2009).
Mesmo sendo uma cultura compatível com as condições ecológicas locais, ainda apresenta baixa produtividade, principalmente por predominarem as lavouras conduzidas sob dependência das chuvas (FREIRE FILHO et al., 2005). No sul do Estado do Tocantins as principais causas que limitam a produtividade do feijão-caupi que merecem destaque é o emprego de variedades tradicionais com baixa capacidade produtiva e a incidência de doenças.
Os fungos agrupam o maior número de patógenos nocivos a esta cultura, embora bactérias, nematóides e vírus proporcionam danos significativos (ATHAYDE SOBRINHO et al., 2000). Possuem ampla diversidade de espécies patogênicas, estando presente em diversos habitats e colonizam patogenicamente várias partes vegetais (ATHAYDE SOBRINHO et al., 2000, 2005). As doenças causadas por patógenos que habitam o solo podem provocar prejuízos severos na produtividade da cultura.
Dentre as principais doenças que afetam a planta do feijão-caupi, destaque para a mela, causada pelo fungo Rizoctonia solani, este fungo é um patógeno que habita o
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solo que possui ampla gama de hospedeiros, grande capacidade competitiva saprofítica e que sobrevive colonizando restos de cultura ou mediante estruturas de resistência (GODINHO et al, 1999). Os sintomas da doença são observados inicialmente nas folhas próximas ao solo com manchas de formato irregular que coalescem causando uma necrose e a posterior desfolha das plantas e a adesão das folhas da planta pela teia micelial do fungo Os sinais são as teias miceliais e os microescleródios formados nos tecidos vegetais (NECHET & HALFELD-VIEIRA, 2006). Esta doença pode levar a perdas na produtividade, perdas de estande e vigor das plantas.
Microrganismos usados como inoculante em culturas agrícolas os fungos do gênero Trichoderma são considerados microrganismos de vida livre e estão entre os mais estudados e conhecidos agentes de biocontrole no mundo (VERMA et al., 2007b). Podem ser usados como formulados em biopesticidas, biofertilizantes e inoculantes de solo (HARMAN et al., 2004), sendo T. harzianum a espécie mais estudada (MARIANO et al., 2005).
Esses microrganismos têm a capacidade de controlar os patógenos das sementes, os quais sobrevivem no solo causando podridão, morte das plântulas e tombamento; proteger as partes subterrâneas das plantas contra patógenos; melhorar a taxa de germinação e o vigor das sementes; melhorar a absorção de nutrientes; promover o crescimento e aumentar o rendimento das plantas (HARMAN, 2000), promovendo o desenvolvimento de raízes através de fitohormônios, e assim melhorar a assimilação de nutrientes o que aumenta a resistência diante de fatores bióticos não favoráveis, além de degradar fontes de nutrientes que serão de fundamental importância para o desenvolvimento do vegetal (HARMAN et al., 2004; LUCON, 2008; VERMA et al., 2006).
A necessidade de usar produtos biológicos que sirvam como alternativas e apresentem controle dos principais patógenos e aumento de rendimento de biomassa e, consequentemente, produção de grãos de culturas como o feijão-caupi é crescente. Os fungicidas químicos apresentam somente um controle temporário e usualmente necessitam de aplicações repetidas durante o crescimento da cultura, enquanto agentes de controle biológico são capazes de se estabelecer colonizar e se reproduzir no ecossistema (ÁVILLA, et al., 2005)
Assim, a inoculação de rizóbio e Trichoderma pode exercer uma ação antagonista contra patógenos da rizosfera atuando também como promotor de crescimento e a atividade infectiva e de fixação de nitrogênio das estirpes de rizóbio.
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Com a substituição de insumos industriais por biológicos buscando a sustentabilidade e aumento de produtividade é que este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da dupla inoculação de rizóbio e Trichoderma em feijão-caupi cultivado em campo no sul do Tocantins, Gurupi.
MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos em duas safras, 2011 e 2012, na estação experimental da Universidade Federal do Tocantins no Campus de Gurupi – TO, localizado a 11º 43’ de latitude sul e 49º 04’ de longitude oeste, a 280 m de altitude. A caracterização climática local é de clima tropical úmido com pequena deficiência hídrica (B1wA’a’) conforme classificação Tornthwaite (TOCANTINS, 2005); ou cerrado ou Savana Tropical segundo Köppen- Geiger (PEEL, 2007).
Foram cultivadas plantas de feijão-caupi da variedade vinagre de porte semi-ereto, de ciclo médio-tardio: 70 a 90 dias, com grãos de tegumento de cor vermelha.
Antes do plantio, na primeira safra, coletou-se uma amostra de solo composta e realizou-se a caracterização física e química, onde foram encontrados os seguintes valores: 1,5 cmolc dm3 de Ca; 0,7 cmolc dm3 de Mg; 0,1 cmolc dm3 de K; 2,8 mg dm3 de P; 0,07 cmolc dm3 de Al; 7,4 cmolc dm3 de CTC; 2,3 cmolc dm3 de SB; 30% de V; pH 5,4 em água; 1,0 % de matéria orgânica; textura de 72,3, 8,2 e 19,5 % de areia, silte e argila, respectivamente (EMBRAPA, 1997).
Para o preparo do solo, na primeira safra, foi realizada a correção da acidez do solo 60 dias antes do plantio, aplicando-se calcário dolomitico PRNT 85%, na dose de 0,965 t ha-1 e incorporação realizada através de uma gradagem. Posteriormente, foi realizada a adubação mineral antes da semeadura, nas duas safras, aplicando-se 80 kg de P2O5na forma de superfosfato simples, e 60 kg de K2O na forma de KCl, baseada na análise de solo e na necessidade da cultura.
Os tratamentos utilizados foram: Inoculação de rizóbio e Trichoderma spp. na semente; inoculação de rizóbio na semente e Trichoderma sp. no solo; inoculação de rizóbio na semente e Trichoderma sp. na semente e solo; somente inoculação de rizóbio; controle adubado com nitrogênio e testemunha sem inoculação. O experimento foi em blocos ao acaso e três repetições.
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A inoculação foi realizada com as estirpes INPA 03-11B e UFLA 03-84 caracterizadas como Bradyrhizobium sp., recomendadas pela Rede de laboratórios para recomendação, padronização e difusão de tecnologia de inoculantes microbianos de interesse agrícolas para a cultura do feijão-caupi no Brasil (RELARE) (CAMPO & HUNGRIA, 2007).
As estirpes utilizadas, após crescimento em meio YMA por cinco dias, foram suspensas individualmente em solução salina (0,2% MgSO4) e cada uma dessas suspensões (109 células mL-1) foi adicionada às sementes.
Para os tratamentos com a utilização de Trichoderma sp., foi utilizado o inoculante Trichoplus JCO em pó, com dose de 20 g por kg de sementes. No tratamento com aplicação direta no solo foram utilizados 3 kg de Trichoplus JCO em pó por hectare, correspondo a 4 g por parcela experimental. O produto comercial Trichoplus JCO, formulado com Trichoderma spp., com concentração mínima de conídio viáveis de 2 x 1012 L-1, foi aplicado conforme indicações do fabricante, direto nas sementes e misturado no adubo nos tratamentos com Trichoderma no solo.
Para o tratamento com o uso de nitrogênio (controle adubado), foi utilizado 50 kg ha-1 de N, sendo dividido em duas aplicações: 20 kg ha-1 de N no momento do plantio e 30 kg ha-1 de N de cobertura 25 dias após a emergência das plantas na forma de uréia.
Realizou-se o desbaste das plântulas aos 15 dias após a semeadura, deixando-se 10 plantas por metro linear.
Os experimentos foram conduzidos de janeiro a abril de 2011 na primeira safra e de novembro de 2011 a fevereiro de 2012 na segunda safra, com emergência a partir do terceiro dia após semeadura. Cada parcela, em cada experimento, constou de nove linhas de plantio de feijão-caupi, com cinco metros de comprimento, por quatro metros de largura e o espaçamento entre linhas de plantio foi de 0,50 m. O tamanho de cada parcela experimental foi de 20 m2.
A avaliação foi feita em duas épocas 25 e 50dias após o plantio (DAP). Para cada avaliação foram coletadas seis plantas de cada parcela, sendo realizada a lavagem das raízes em água corrente para a retirada de todo material indesejável tomando cuidado para não perder raízes e nódulos, com auxilio de uma peneira.
A parte aérea foi separada das raízes com um corte feito na base do caule, e os nódulos foram retirados e contados. Posteriormente a parte aérea, a raiz e os nódulos foram colocados em saco de papel e conduzidos para secagem em estufa por 72 horas a 65º C até atingir o peso constante.
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A avaliação de biomassa foi feito através da massa seca da parte aérea (MSPA), da raiz (MSR), e total (MST), assim como o número de nódulos (NN) e massa seca dos nódulos (MSN). Com a biomassa da parte aérea da última avaliação (50 DAP) determinou-se a eficiência relativa (ER) calculada determinou-segundo a fórmula: ER = (MSPA inoculada / MSPA com N) x 100 (LIMA et al., 2005).
Foi feita ainda a avaliação do estado nutricional das plantas, determinando-se os teores de N na parte aérea, pelo método de Kjeldahl (BREMNER & MULVANEY, 1982). O N acumulado (ANPA) na matéria seca da parte aérea (MSPA) foi calculado, multiplicando o peso pelo teor de N. Com base nos valores de nitrogênio acumulado (N total) determinou-se a eficiência simbiótica, calculada por meio da fórmula: ES = [(Ntotal fixado – Ntotal TS/N) / (Ntotal TC/N – Ntotal TS/N) x 100], em que Ntotal fixado = Nitrogênio total do tratamento; Ntotal TS/N = Nitrogênio total da testemunha sem nitrogênio; Ntotal TC/N = Nitrogênio total do tratamento controle com nitrogenada (controle adubado) (LIMA et al., 2005).
Por ocasião das avaliações (25 e 50 DAP), foi realizada a avaliação de severidade de mela (Rizoctonia solani) e estande inicial e final. Para a avaliação de, foi utilizada a escala de notas para a incidência: 0 = sem incidência e 1 = com sintoma de mela e percentual com sintomas de mela: 1 = sem sintoma, 3 = até 30%, 5 = 31 a 60%, 7 = 61 a 90% e 9 > 90% (VAN SCHOONHOVEM & PASTOR-CORALES, 1987). Aos 25 DAP, foi avaliado o estande inicial, em uma área de 2 m2, e o estande final foi avaliado aos 50 DAP (em plena floração). A eficácia (E%), ou eficiência de controle da mela pelos tratamentos, foi calculada utilizando-se a equação: E% = {1 – [Ti / Tc]} x 100, na qual E% = eficácia dos tratamentos; Ti = % média do estande final no tratamento i; Tc = % média do estande final no tratamento e testemunha (GAVA & MENEZES, 2012).
A produção de grãos foi obtida nas fileiras centrais de cada parcela com área útil de 6m2, após a maturação fisiológica das plantas, quando aproximadamente 80% das vagens apresentavam-se secas. Em seguida, as vagens foram debulhadas manualmente corrigindo-se a umidade dos grãos para 14%. Após a colheita foi quantificada a produtividade por hectare.
Os dados foram submetidos à análise de variância e ao teste de agrupamento de médias Scott-Knott a 5% de probabilidade utilizando o programa estatístico ASSISTAT versão 7.6 beta (SILVA, 2008).
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na avaliação da massa seca da parte aérea (MSPA) aos 25 dias após o plantio (DAP) na safra 2011, não houve diferença significativa entre os tratamentos inoculados e o controle adubado, somente em relação à testemunha. Para a massa seca da raiz (MSR) as maiores médias (p<0,05) foram encontradas para os tratamentos com inoculação de rizóbio e Trichoderma e controle adubado com exceção do tratamento com rizóbio e Trichoderma na semente. Quanto à matéria seca total (MST), as maiores médias (p<0,05) foram encontradas para os tratamentos inoculados com exceção, novamente, para o tratamento inoculado com rizóbio e Trichoderma na semente e controle adubado. Para a safra 2012, as maiores médias (p<0,05) para a MSPA foram encontradas para os tratamentos com inoculação de rizóbio e Trichoderma na semente e rizóbio e Trichoderma na semente e no solo. Quanto a MSR não houve diferença significativa entre os tratamentos inoculados e o controle adubado, somente em relação à testemunha. Para a MST, os tratamentos com inoculação de rizóbio e Trichoderma na semente e rizóbio e Trichoderma na semente e no solo foram superiores (p<0,05).
Na avaliação aos 50 dias após o plantio (DAP) na safra 2011, a MSPA foi significativamente superior (p<0,05) para os tratamentos inoculados com rizóbio e
Trichoderma na semente e rizóbio e Trichoderma na semente e no solo e o controle
adubado que diferiu do tratamento com rizóbio e a testemunha. Para a MSR as maiores médias (p<0,05) foram encontradas para os tratamentos com inoculação de rizóbio e
Trichoderma e controle adubado que diferiram da testemunha e rizóbio isolado. Quanto à
MST, as maiores médias (p<0,05) foram encontradas para os tratamentos inoculados com rizóbio e Trichoderma na semente, rizóbio e Trichoderma na semente e no solo e o controle adubado (Tabela 1). Para a safra 2012, as maiores médias (p<0,05) para a MSPA foram encontradas para os tratamentos com inoculação de rizóbio e Trichoderma, com exceção do tratamento com rizóbio e Trichoderma no solo e a testemunha. Quanto a MSR, as maiores médias (p<0,05) foram encontradas para os tratamentos com inoculação do rizóbio e Trichoderma. Para a MST, os tratamentos com rizóbio e Trichoderma, com exceção do tratamento com rizóbio e Trichoderma no solo, foram superiores (p<0,05), porém, não diferiram do controle adubado.
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Ainda em relação à MSPA aos 25 DAP, no geral os melhores resultados foram encontrados na safra de 2011, e os melhores tratamentos foram com rizóbio e Trichoderma na semente e no solo e o tratamento só rizóbio. Na safra de 2012 os melhores tratamentos foram rizóbio e Trichoderma na semente e rizóbio e Trichoderma na semente e no solo (Tabela 1).
Na comparação das duas safras, para a avaliação aos 50 DAP, a MSPA e MST foram, em geral, superiores (p<0,05) para a safra 2012, da mesma forma considerando a média geral dos tratamentos para a MSPA e MST (Tabela 1). Estes resultados podem ser considerados positivos para a utilização destes isolados de Trichoderma, uma vez que, ao colonizar o sistema radicular da planta, o fungo pode inibir a colonização por fitopatógenos, formando uma barreira em torno da raiz, além de promover o crescimento da plântula.
Tabela 1: Massa seca da parte aérea (MSPA), raiz (MSR) e total (MST) em feijão-caupi var.
vinagre inoculado com rizóbio e Trichoderma sp. (Trichoplus JCO)(1). Safra 2011e 2012. Gurupi-TO.
TRATAMENTO
MSPA (g) MSR (g) MST (g)
Safras Safras Safras
2011 2012 2011 2012 2011 2012
25 DAP(2)
Rizóbio e Trich. Semente 1,3aA 1,2 aA 0,3bA 0,2 aA 1,6bA 1,4aA
Rizóbio e Trich. Solo 1,7aA 1,0bB 0,4aA 0,3 aA 2,1 aA 1,3bA
Rizóbio e Trich. Sem/Solo 1,8aA 1,2 aB 0,4aA 0,2 aA 2,2 aA 1,4 aA
Rizóbio 1,8aA 1,0bB 0,4aA 0,2 aA 2,2 aA 1,2 bA
Controle Adubado(3) 1,7aA 0,9cB 0,4aA 0,2 aA 2,1aA 1,1cA
Testemunha (4) 0,4bA 0,2 dA 0,1cA 0,1 bA 0,5cA 0,3 dB
Média 1,5 A 0,9 B 0,3 A 0,6 A 1,8 A 1,1 B
C.V(5) 12,0 13,4 13,5 17,6 11,3 11,4
50 DAP
Rizóbio e Trich. Semente 6,3aB 11,4aA 1,3aA 1,4aA 7,6aB 12,8aA
Rizóbio e Trich. Solo 4,3bB 9,4bA 1,4 aA 1,4aA 5,7bB 10,8bA
Rizóbio e Trich. Sem/Solo 6,1 aB 12,9aA 1,4aA 1,5aA 7,5aB 14,4aA
Rizóbio 4,6bB 11,8aA 1,3bA 1,0 bA 5,9bB 12,8aA
Controle Adubado 6,0 aB 11,7aA 1,4aA 1,0bA 7,4aB 12,7aA
Testemunha 1,8cB 3,1cA 0,6cA 0,3cA 2,4cA 3,4cA
Média 4,9 B 10,1A 1,2 A 1,1 A 6,1B 11,2 A
C.V 7,2 11,9 7,0 31,5 6,1 14,5
(1)
Médias seguidas de mesma letra minúscula, nas colunas, e maiúscula na linha, não diferem entre si pelo teste SccotKnott 5%. (2) DAP = Dias após o plantio. (3) Controle adubado com N mineral. (4) Testemunha sem inoculação e sem adubação. (5) Coeficiente de Variação.
