Rodrigo Cardoso de OLiVEiRA1, Mileni da silva FERnAnDEs2, Fabio Henrique Gelonese de OLiVEiRA3, Tânia Mary CEsTARi4, Rumio TAGA5, Eulázio Mikio TAGA5, José Mauro GRAnJEiRO6
1. Professor Doutor do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, universidade de são Paulo, Bauru, sP, Brasil. 2 Doutoranda do Curso de Genética Evolutiva, universidade Federal de são Carlos, são Carlos, sP, Brasil.
3 Cirugião-dentista, Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, universidade de são Paulo, Bauru, sP, Brasil. 4. Doutora em Biologia Oral, Faculdade de Odontologia de Bauru, universidade de são Paulo, Bauru, sP, Brasil.
5. Professor Titular do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, universidade de são Paulo, Bauru, sP, Brasil.
6. Pesquisador sênior, instituto nacional de Metrologia, normalização e Qualidade industrial, Duque de Caxias, RJ, Brasil. Professor Adjunto do núcleo de Terapia Celular, Hospital universitário Antônio Pedro, universidade Federal Fluminense, niterói, RJ, Brasil.
Endereço para correspondência:
Rodrigo Cardoso de Oliveira
Faculdade de Odontologia de Bauru – usP Depto. de Ciências Biológicas
Al. Octávio Pinheiro Brisolla, 9-75 17012-101 – Bauru – são Paulo – Brasil E-mail: rodrigocardoso@usp.br
Recebido: 30/11/2011
Aceito: 13/03/2012
AbstrAct
The aim of this study was to evaluate the osteoconductive capacity of mixed medullary bovine bone (OBM) implanted on alveoli dental after extraction of the incisor of rats. We used five groups of Wistar rats (n = 50), which had the right upper incisor extracted. The animals were euthanized 7, 14, 21, 28 and 42 days after the extraction, and region of alveoli dental were collected for microscopic analysis (Hematoxylin and Eosin). The results showed a normal process of bone repair in the control group over the course of experimental periods, initially presenting the blood clot (7 and 14 days) and its subsequent replacement by granulation tissue (14 and 21 days) and new bone (28 and 42 days). In contrast, the test group (implantation of OBM) showed delayed bone healing process, with areas of necrosis in the initial periods (7, 14 and 21 days) and slow formation of granulation tissue (28 and 42 days) and bone formation in contact with particles of OBM implanted (42 days). The results obtained in this study demonstrate that the OBM presented discrete osteoconductive capacity, contributing to delay on alveolar repair. Possibly the compaction of the material hindered the proper blood clot formation.
Key words: Bioprosthesis. Bone regeneration. Bone and bones
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade osteocondutora do osso bovino misto (OBM) medular implantado em alvéolo dental de rato após a extração do incisivo. Foram utilizados 5 grupos com ratos Wistar (n = 50), os quais tiveram o incisivo superior direito extraído. Os animais foram eutanasiados 7, 14, 21, 28 e 42 dias após a extração e a região do alvéolo dental foi coletada para a análise microscópica (hematoxilina e eosina). Os resultados mostraram um processo de reparo ósseo normal no grupo controle com o decorrer dos perídos experimentais, apresentando inicialmente o coágulo sanguíneo (7 e 14 dias) e sua posterior substituição por tecido conjuntivo de granulação (14 e 21 dias) e tecido ósseo neoformado (28 e 42 dias). Em contrapartida o grupo teste (implante de OBM) mostrou atraso no processo de reparo ósseo, apresentando áreas de necrose nos períodos iniciais (7, 14 e 21 dias) e lenta formação de tecido conjuntivo de granulação (28 e 42 dias) e neoformação óssea em contato com as partículas de OBM implantadas (42 dias). Os resultados obtidos no presente estudo permitem concluir que o OBM demonstrou discreta capacidade osteocondutora, concorrendo para o atraso do reparo alveolar. Possivelmente a compactação do material dificultou a formação adequada do coágulo sanguíneo.
INTRODUÇÃO
A regeneração ou reposição de tecidos/órgãos que tenham sido perdi-dos é um obstáculo para diversos profissionais da área da saúde (médicos, cirurgiões-dentistas, veterinários entre outros), além do próprio paciente10. Dentre os diversos tecidos que compõe os vertebrados, o tecido ósseo é o que possui uma destacada capacidade de regeneração14,18. No entanto, em casos de lesões ósseas extensas (traumas, remoção de tecido por causa de tumor etc.)14 ou fraturas instáveis que não ocorre a regeneração e patologias como a pseudoartrose podem advir.
Ao longo de toda a história humana, mas particularmente nas últimas décadas, biomateriais vêm sendo desenvolvidos no sentido de auxiliar o processo de regeneração do tecido ósseo10,18,23. Para essa função, os biomateriais devem apresentar, entre outras características, biocompa-tibilidade, previsibilidade, fácil manuseio e segurança8,18. No contexto atual da medicina regenerativa devem, ainda, serem absorvíveis e ca-pazes de funcionar como carreadores de células para a engenharia de tecidos8,15. Entre os diversos biomateriais estudados, os de origem xeno-génica (bovina) vem sendo largamente empregados como enxertos ós-seos7,11,30. Entre eles estão o colágeno do tipo I, hidroxiapatita, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs)15, osso cortical e osso medular, todos de origem bovina7,25. Dentre as vantagens dos xenoenxertos destacam-se a fonte abundante, baixo custo e semelhança estrutural/bioquímica com o tecido hospedeiro5,25,29.
Trabalhos da literatura tem mostrado o uso do osso bovino como bioma-terial para regeneração óssea há mais de 60 anos24. Estudos in vitro27 e in
vivo23, anteriores, mostram que o osso bovino desmineralizado ou despro-teinizado é biocompatível2,25 e apresenta capacidade osteocondutora23,30.
Uma possível rota de processamento do osso bovino, visando a preserva-ção da porpreserva-ção inorgânica de hidroxiapatita e a porpreserva-ção orgânica de colágeno, denominada osso bovino misto (OBM), permitiria a obtenção de um bio-material alternativo com composição mais próxima do osso natural, maior resistência mecânica que o colágeno isolado e biodegradabilidade, diver-samente dos biomateriais cerâmicos naturais ou sintéticos. De fato, estudo prévios em sítios subcutâneos7,11 e intraósseos30 confirmaram a biocompa-tibilidade, a capacidade osteocondutora e a bioabsorção30. Entretanto, até o presente momento, não foi determinada a sua eficiência em promover o reparo ósseo em condições específicas para a odontologia (implantodontia e periodontia), como é o caso de defeitos ósseos na região do osso alveolar.
Nesse sentido o objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade osteocon-dutora do osso bovino misto (OBM) medular implantado em alvéolo dental de rato após a extração do incisivo.
MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL OBM
Ossos bovinos foram obtidos de um frigorífico, em seguida esses foram submetidos à limpeza mecânica e tratamento químico com peróxidos e agentes caotrópicos, neutralizado em tampão fosfato e liofilizado27. O osso
bovino misto (OBM) medular em partículas foi processado e esterilizado previamente por radiação gama (25 KGy) como descrito previamente27.
ANIMAIS UTILIZADOS
Foram utilizados 50 ratos machos (Rattus norvegicus) da espécie Wistar com 300 g cada, procedentes do Biotério Central da Faculdade de Odon-tologia de Bauru – FOB-USP. Os animais foram divididos em 5 grupos ex-perimentais de acordo com os períodos de 7, 14, 21, 28 e 42 dias após a cirurgia, (10 animais/período). Por todo o tempo experimental os animais foram mantidos em gaiolas com boas condições de alimentação, ração e água ad libitum.
A pesquisa foi realizada segundo as normas recomendadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), após a aprovação pelo Con-selho Comitê de Ética em pesquisa animal da Faculdade de Odontologia de Bauru – Universidade de São Paulo.
PROCEDIMENTOS CIRÚRgICOS
Realizou-se a exodontia do incisivo superior direito com os animais sob anestesia geral obtida por meio da administração de Dopalen (cloridato de quetamina; Agribrands do Brasil Ltda, Paulínia – SP) e Anasedan (cloridato de xilazina; Agribrands do Brasil Ltda, Paulínia – SP) na proporção de 0,14 mL/100g de peso do animal, por via intramuscular17.
Após a exodontia, o alvéolo foi preenchido com coágulo sanguíneo do próprio animal (grupo controle) ou com OBM (partículas de 200-400 µm) misturado em solução salina estéril 0,9%, que foi introduzido com o auxílio de porta-amálgama modificado/adaptado e condensado com um conden-sador para amálgama de Ward nº1. Inseriu-se aproximadamente 12 mg do material. Assim os animais foram divididos em dois grupos:
Grupo I (controle): Preenchimento do alvéolo com coágulo sanguíneo. Grupo II (material teste): Preenchimento do alvéolo com OBM misturado em solução salina estéril 0,9%.
COLETA DAS PEÇAS
Decorrido os períodos experimentais (7, 14, 21, 28 e 42 dias) os animais foram eutanasiados de acordo com as normas do Colégio Brasileiro de Expe-rimentação Animal (COBEA). As maxilas foram removidas e fixadas, por uma semana, em formol 10% tamponado.
PROCESSAMENTO HISTOTÉCNICO
As peças foram imersas em solução de EDTA (0,5 M em pH 7,4), que foi renovada semanalmente até a sua desmineralização. Em seguida, as peças foram lavadas em água destilada por 24 horas, receberam processamento histotécnico padrão para cortes semi-seriados no sentido longitudinal de 5µm de espessura e foram coradas com hematoxilina e eosina padrão18.
ANÁLISE HISTOLÓgICA
Em seguida, os cortes histológicos foram analisados ao microscópio ópti-co para determinação da resposta tecidual e descrição dos eventos presen-tes nos grupos controle e presen-teste nos diferenpresen-tes períodos experimentais. Foi feita a avaliação da presença de: coágulo sanguíneo, tecido de granulação, tecido ósseo neoformado, tecido fibrótico e material implantado. Oliveira RC de, Fernandes M da S, Oliveira FHG de, Cestari TM, Taga R, Taga EM, Granjeiro JM
ANÁLISE HISTOLÓgICA
Período de 7 dias: No grupo controle observou-se uma intensa migração e proliferação de células semelhantes à fibroblastos. O alveólo era preen-chido ora por coágulo sanguíneo ora por tecido conjuntivo de granulação (Figura 1A), sugerindo a regressão do coágulo e substituição pelo tecido conjuntivo. No grupo preenchido com OBM notaram-se áreas necróticas próximas ao material implantado, além de neoformação óssea entre as paredes do alveólo e o material implantado (Figura 1B). Também foi regis-trado, em alguns animais do grupo teste, regiões de reabsorção das paredes ósseas do alveólo.
Período de 14 dias: Na região apical do alvéolo, no grupo controle, no-tou-se intensa neoformação óssea a partir da borda óssea e resquicíos do coágulo sanguíneo (Figura 1C). Em algumas áreas, especialmente na região cervical, havia tecido conjuntivo presente, no grupo controle. Notaram-se, no grupo teste, as partículas de OBM circundandas por tecido conjuntivo de granulação, enquanto havia neoformação óssea próxima às paredes do alveólo dental (Figura 1D). Áreas necróticas próximas às partículas foram observadas nesse período.
Período de 21 dias: Neste período houve intensa neoformação óssea e reabsoção do coágulo sanguíeno no grupo controle (Figura 2A). Enquan-to o grupo teste apresentava as partículas do material em praticamente toda a extensão do alveólo. Áreas necróticas próximas às partículas de OBM, em algumas regiões, eram visíveis neste período (Figura 2B). As regiões de neoformação óssea eram restritas as áreas adjacentes ao osso da parede alveolar.
Período de 28 dias: As características histológicas nesse período não dife-riram do período anterior (21 dias) para ambos os grupos avaliados. Em um dos animais do grupo teste registrou-se partículas do material no interior das fossas nasais.
Período de 42 dias: O alveólo dentário foi preenchido por tecido ósseo no grupo contole (Figura 2C), indicando o reparo completo dessa região. O qua-dro histológico exibido no grupo teste era de reparo alveolar incompleto, com formação de tecido ósseo ao redor das partículas de OBM e presença de tecido conjuntivo fibroso sem presença de células inflamatórias (Figura 2D).
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figura 1 - Fotomicrografia dos períodos de 7 (A e B) e 14 (C e D) dias:
A) Grupo controle. Pode se notar a formação de tecido conjuntivo de granulação próximo a parede óssea do alveólo e presença do coágulo sanguíneo. B) Grupo teste. Observa-se a formação de tecido ósseo en-tre o osso alveolar e as partículas de OBM. Conteúdo necrótico pode ser visto. C) Grupo controle. neoformação óssea avançada pode ser notada, além de pequenas áreas com coágulo sanguíneo. D) Grupo teste. Observa-se a formação de tecido ósseo entre o osso alveolar e as partículas de OBM e presença de conteúdo necrótico. Coloração H&E. Magnificação de 10x. siglas: CO-coágulo sanguíneo; nE-conteúdo necrótico; OBM-osso bovino misto; On-osso neoformado; Os-osso; TC-tecido conjuntivo.
figura 2 - Fotomicrografia dos períodos de 21 (A, B e C) e 42 (D e E)
dias. A) Grupo controle. neoformação óssea ocupando grande parte
da área do alveólo pode ser notada, além de pequenas áreas com coágulo sanguíneo B) Grupo teste. área de necrose próxima ao OBM C) Grupo teste. Observa-se a formação de tecido ósseo próximo ao osso alveolar. Também são visíveis as partículas de OBM e conteúdo necrótico na região mais interna do alveólo. D) Grupo controle. Osso neoformado ocupando a região do alveólo. O coágulo sanguíneo não foi registrado nesse grupo. E) Grupo teste. Observa-se a formação de tecido ósseo circundando as partículas de OBM, além de presença de tecido conjuntivo. Coloração H&E. Magnificação de 10x (A, B e C) e 40x (D e E). siglas: CO-coágulo sanguíneo; nE-conteúdo necrótico; OBM-osso bovino misto; On-OBM-osso neoformado; Os-OBM-osso.
DISCUSSÃO
Estudos histológicos têm mostrado que o processo de reparo alveolar em ratos é similar aos humanos, porém mais rápido1,17. Em adição, alguns trabalhos demonstram que a utilização de alguns biomateriais atrasa o processo de repa-ro ósseo, uma vez que necessitam de um tempo maior para ser reabsorvido4,21. Esses relatos foram confirmados pelos resultados apresentados neste estudo, onde o OBM promoveu o atraso do processo de reparo quando comparado ao alvéolo preenchido apenas pelo coágulo sanguíneo.
Trabalhos anteriores20,21 que estudaram a resposta celular frente à im-plantação de hidroxiapatita em alvéolos de ratos e humanos indicam que o reparo alveolar é prejudicado pela presença de materiais, ainda que re-conhecidamente biocompatíveis, como a hidroxiapatita (HA). No presente trabalho, no grupo teste, além do atraso no processo de reparo alveolar no-tou-se persistência de focos de necrose até 28 dias, sendo que tais eventos podem ter decorrido pelo excesso de material implantado e compactado. Tal condição dificultou a formação e organização do coágulo sanguíneo no interior da massa de material implantada, impedindo, assim, que neutró-filos e macrófagos, células responsáveis pelo início da reação inflamatória que precede o reparo, chegassem até o centro da lesão e ao material. Posto que a formação e organização do coágulo sanguíneo são fundamentais para assegurar/ordenar o reparo do alvéolo e a angiogênese1, sua ausência, além de atraso no reparo, pode ter favorecido a necrose pela ausência de nutrien-tes e da capacidade homeostásica do sangue.
É sabido também que a HA tem a capacidade de adsorver proteínas22. A despeito do coágulo não ter atingido toda a região enxertada, proteí-nas solúveis no líquido intersticial podem ter se adsorvido ao material implantado. Isto, aliado a um excesso de OBM compactado, poderia acentuar o edema local, o que concorreria para a exacerbação da resposta inflamatória. Destaque-se que a formação óssea ocorreu somente após a reabsorção do tecido necrótico e a partir da região apical, onde o existe menor volume de material e menor condensação, lentamente avançando para a área central do defeito. Aos 42 dias as células inflamatórias eram ausentes e notava-se partículas de OBM ora envoltas por tecido conjunti-vo, ora por tecido ósseo neoformado.
Não se pode descartar, contudo, que o material tenha induzido direta-mente a diminuição significativa do número de células, das funções mito-condrial e a lisossomal, provavelmente pela presença de resíduos do proces-samento do material como demonstrado anteriormente26.
Uma vertente adicional, abordada por alguns estudos9,28, relatam sobre a possibilidade da remoção e/ou desnaturação das chamadas Oliveira RC de, Fernandes M da S, Oliveira FHG de, Cestari TM, Taga R, Taga EM, Granjeiro JM
pode promover alterações importantes nas propriedades mecânicas e biológicas destes. Entre elas a mudança na estrutura de colágeno pre-sente no material e, secundariamente, na atividade biológica das BMPs, além de redução na atividade de osteoclastos16. Como o OBM também foi tratado com uréia e esterelizado por radiação gama (25KGy) não se pode descartar a contribuição potencial destes fatores na morte celular e atraso no reparo observados.
Em contrapartida, um estudo prévio em calvária de coelhos com Kiehl
bone12, biomaterial similar ao OBM, relatou-se a ossificação direta sobre a superfície do material. Resultado este confirmados posteriormente para o mesmo material usado no presente estudo30. Destaque-se, ainda, que a bioaboserção do OBM anteriormente relatadas não foi confirmada no presente trabalho, e a osteocondução foi observada discretamente apenas no período de 42 dias. Esta discrepância pode ser devido aos di-ferentes sítios de implantação, pois no estudo anterior30 o OBM foi colo-cado na tíbia de rato, um sítio com turnover ósseo menor que o alvéolo dentário; ainda, o biomaterial estava na forma de um pino, apresentan-do uma área de superfície muito menor que a existente nos grânulos apresentan-do material utilizado no presente estudo. A maior área de superfície pro-move uma interação mais intensa com o tecido, podendo ter ocasionado a necrose observada.
Alguns autores tem considerado o tempo de reparo alveolar e reabsorção do mateial mais lento como certa vantagem em aplicações específicas4,13. Primeiramente, os biomateriais implantados em alvéolos onde foram ex-traídos dentes podem permitir um arcabouço para o crescimento tecidual ósseo e impedir a invasão de tecidos competidores (tecido conjuntivo gengival e epitélio) com o tecido ósseo19. A capacidade do biomaterial em proporcionar um reparo tecidual ósseo ordenado é chamado de regenera-ção óssea guiada (RGO)6. Além disso, alguns estudos defendem a ideia de ganho/manutenção do rebordo alveolar a longo prazo2,4, como também a elevação de seio maxilar13,25. Foi implantada HA natural bovina em sítios de extração dental em humanos promovendo significativa manutenção do rebordo 9 meses após as extrações4. O mesmo grupo3, avaliou o uso de osso bovino para aumento/reconstrução de cristal do rebordo alveolar e poste-rior suporte de implantes endosseos, confirmando o sucesso do protocolo pela avaliação clínico-histológica 9 meses após a cirurgia.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos no presente estudo permitem concluir que o OBM demonstrou discreta capacidade osteocondutora, concorrendo para o atra-so do reparo alveolar. Possivelmente a compactação do material dificultou a formação adequada do coágulo sanguíneo.
Os autores agradecem os servidores da FOB-USP, Thelma L. Silva, Luiz C. da Silva, Erasmo G. da Silva e Danielle S. Ceolin, pelo auxílio técnico prestado. Este trabalho foi financiado pela FAPESP: Proc. 02/13867-8.
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