ANÁLISE DE AMINOACIDOS ATRAVÉS DAS TÉCNICAS DO AGRUPAMENTO E PARCELAMENTO DE SEÇÕES DE CHOQUE PARA NÊUTRONS
Dante Luiz Voi
Instituto de Engenharia Nuclear - IEN-CNEN/RJ Caixa Postal 68550
21941-970, Rio de Janeiro, Brasil
Hélio Fernandes da Rocha
Universidade Federal do Rio de Janeiro - Instituto de Pediatria - IPPMG / UFRJ Av. Brigadeiro Trompowski ,s/n
21941-970 - Rio de Janeiro, Brasil
RESUMO
Neste trabalho são analisados aminoácidos utilizados em soros para administração parenteral em pacientes de hospitais com importância específica na área de Nutrição e com a finalidade de verificar os dados fornecidos pelo fabricante. Amostras dos aminoácidos individuais fenilalanina, cisteina, metionina, tirosina e treonina foram medidas com o espectrometro de cristal instalado no canal de irradiação J-9 do reator Argonauta. Foram utilizadas como padrões de calibração para o sistema de medidas, amostras de alta pureza de ouro, grafite e água pesada. Os valores calculados de seções de choque para efeito de comparações foram obtidos por análise de estrutura molecular, conformação e composição química dos materiais, e os dados da literatura foram manipulados utilizando as técnicas de agrupamento e parcelamento de seções de choque para nêutrons.
Keywords: individual amino acids, neutron cross sections, spectrometry, molecular structure, molecular dynamics
I. INTRODUÇÃO
O método de medidas e análise de seções de choque para nêutrons foi desenvolvido em nosso laboratório para o controle de qualidade de materiais especiais usados na área nuclear[1,2]. Em função das mudanças introduzidas pelo governo no sentido de exigir retorno a curto prazo dos trabalhos de pesquisa, uma das aplicações imediatas destas técnicas surgiu da necessidade do controle de qualidade de materiais biológicos, comercializados com os hospitais, originados de importações. As soluções de aminoácidos utilizados nos hospitais para administração parenteral em pacientes, carecem de análises rotineiras de qualidade em função das diversas procedências. Em convênio com o Instituto de Pediatria da UFRJ e com a Nutri-Ente estamos desenvolvendo projetos na área de Nutrição em que propomos desenvolver técnicas para aplicações em terapia e diagnósticos, no controle de qualidade e na caracterização da composição de materiais biológicos. Para efeito destas aplicações o método do agrupamento e parcelamento de seções de choque para nêutrons foi utilizado para análise de aminoácidos isolados e soluções de aminoácidos. Os
aminoácidos, açucares e nucleotídeos são os compostos básicos para a formação das células. Os aminoácidos são os componentes básicos dos alimentos, são as subunidades das proteinas e importantes para nosso organismo tendo dependência nos metabolismos do nitrogênio e do enxôfre para a sua produção. Os vertebrados recebem a totalidade de seu nitrogênio de sua fonte de dieta de proteinas e ácidos nucleicos. No corpo estas moléculas são divididas em componentes de aminoácidos e nucleotídeos, que são então repolimerizados em novas proteinas e ácidos nucleicos ou utilizados para fazer outras moléculas. Metade dos vinte aminoácidos encontrados em proteinas são os aminoácidos essenciais para os vertebrados e não podem ser sintetizados de outros ingredientes da dieta. As rotas metabólicas dos aminoácidos essenciais estão presentes somente em microorganismos e em plantas . Os aminoácidos essenciais são produzidos em outros organismos, habitualmente por processos ou caminhos demorados e energéticamente dispendiosos que foram se perdendo no curso da evolução dos vertebrados . As enzimas que sintetizam os aminoácidos essenciais foram aparentemente perdidas no início da evolução animal, possivelmente devido à pronta
disponibilidade desses aminoácidos na sua dieta[3,4]. Os outros dez aminoácidos podem ser sintetizados usando uma variedade de materiais crus, incluindo intermediários do ciclo do ácido cítrico. Os aminoácidos importantes ao nosso organismo são em número de 20, ocorrem em todas as proteinas, quer sejam em bactérias, plantas ou animais. São formados por um carbono principal(carbono-α), tendo em seu terminal esquerdo um grupo amino(NH2), no terminal
direito um grupo carboxila (COOH), e uma cadeia lateral (R) que confere o nome ao aminoácido, figura 1.
Figura 1. Fórmula química básica dos aminoácidos À semelhança dos açucares, todos os aminoácidos, exceto a glicina, existem como isômeros óticos, nas formas L(levógiro) e D(dextrógiro). Entretanto, sómente os da forma L são encontradas nas proteinas, embora alguns D- aminoácidos ocorrem como parte da parede de bactérias e em alguns antibióticos. Podem ser agrupados de acordo com a natureza de suas cadeias laterais, que podem ser ácidos, básicos, polares não-carregados e hidrofílicos e, não-polares e hidrofóbicos:
• os aminoácidos de cadeias laterais ácidas são o ácido aspártico e o ácido glutâmico;
• os de cadeias laterais básicas são a lisina a arginina e a histidina;.
• os de cadeias polares não-carregadas e hidrofílicos são a asparagina, glutamina, serina, treonina e tirosina e • os aminoácidos de cadeias laterais não-polares e
hidrofóbicos são a alanina, a valina, a leucina, a isoleucina, a prolina, a fenilalanina a metionina, o triptofano, a glicina e a cisteina [3].
Para formar uma estrutura macroscópica ou seja para formar cadeias, os aminoácidos podem ser polimerizados através de uma reação de condensação (eliminação de uma molécula de água) de forma que as ligações entre vizinhos se fazem necessariamente na forma cabeça – cauda. Para formar uma proteina por exemplo, se unem dois ou mais aminoácidos através de ligações peptídicas.
A importância do controle de qualidade sobre aminoácidos ou suas soluções está na necessidade das verificações, da composição e fórmula químicas do produto. Esse controle foi realizado através da análise da composição química e estrutura molecular de cada aminoácido com a aplicação do método do agrupamento e parcelamento de seções de choque para nêutrons em conjunto com as medidas de espectrometria de nêutrons. As medidas de espectrometria de nêutrons foram realizadas com o espectrometro de cristal para nêutrons instalado no canal de irradiação J-9 do reator Argonauta. A presença de
metais tóxicos nos aminoácidos também é necessária para uma análise completa mas não é realizada neste trabalho.
II. MATERIAIS, MÉTODOS E PROCEDIMENTOS Aminoácidos Individuais Fornecidos para os Testes. As amostras de aminoácidos são apresentadas na forma de grãos finos produzidos pela polimerização através de uma reação de condensação com eliminação de uma molécula de água. A ligação entre moléculas de aminoácidos é feita pelo conjunto CO-NH e é denominada ligação peptídica. Após incorporados a um peptídeo os aminoácidos individuais (ou unidades monoméricas) são chamados de resíduos de aminoácidos. Cinco dos aminoácidos essenciais foram fornecidos pela Nutri-Ente e foram selecionados em função de suas fórmulas químicas para efeito de verificar os dados fornecidos pelos fabricantes e para que os dados obtidos com nêutrons fossem posteriormente utilizados para cálculos e análises referentes a soluções de aminoácidos, que serão analisadas posteriormente. São eles a treonina, a tirosina (de cadeias laterais polares não-carregadas), a metionina, a fenilanina e a cisteina (de cadeias laterais não-polares). Mesmo que os resultados referentes a estes cinco aminoácidos sejam satisfatórios são necessárias medidas com nêutrons dos quinze aminoácidos restantes. Medidas rotineiras utilizando estas técnicas com acompanhamento estatístico de amostragens de aminoácidos e soluções de aminoácidos para administração parenteral de pacientes de hospitais se fazem necessárias.
Técnicas do Agrupamento e Parcelamento de Seções de Choque para Nêutrons para a Determinação de Fórmulas Moleculares e Composição de Aminoácidos. Quando são necessárias informações sobre a composição química, estrutura e dinâmica moleculares de materiais hidrogenados, a ferramenta utilizada são os nêutrons de baixa energia que possuem comprimento de onda da ordem das distâncias interatômicas e assim permitem obter informações nestas dimensões. As seções de choque para nêutrons dos elementos químicos e seus isótopos são encontrados nos manuais do BNL [5] , ANL ou “barnbooks” para todas as energias de nêutrons . Quando trabalhamos com grupos de átomos ou pequenas moléculas o procedimento para obter os valores de seções de choque para nêutrons é, fazer soma direta dos componentes do grupo de átomos ou moléculas se desconsiderarmos a influência das ligações químicas. No entanto as informações sobre composição, estrutura e dinâmica moleculares de materiais só são obtidas através de medidas com nêutrons de baixas energias que são sensíveis às ligações químicas e estes dados não são encontrados em manuais. Para isto foram desenvolvidos as técnicas do agrupamento e parcelamento de seções de choque para nêutrons utilizado para moléculas e polímeros [1], que consistem em analisar os compostos em suas estruturas, conformações e formas de apresentação para atribuir valores de seções de choque de modo prático. Os compostos moleculares são divididos em grupos de radicais ou pequenas moléculas cujas seções de
choque são determinadas utilizando dados conhecidos e que podem ser manipulados para a obtenção do valor de seção de choque desejado. Estas técnicas estão sendo aplicadas com rigor em nossos trabalhos nos estudos de materiais biológicos.
Espectrometro de Cristal do IEN-CNEN-RJ, a Técnica da Difração de Nêutrons e o Método da Transmissão para a Obtenção de Medidas de Seções de Choque para Nêutrons. O espectrometro de cristal para nêutrons, instalado no canal de irradiação J-9 do reator Argonauta é utilizado para medir seções de choque totais para nêutrons Os nêutrons emergentes do reator são selecionados por energia, pela técnica de difração de nêutrons através de um cristal monocromador de calcita, incidem sobre o material em teste, são absorvidos e espalhados pela amostra, e os que são transmitidos são registrados por um detetor do tipo BF3 .
Seções de Choque Totais para Nêutrons. A seção de choque total para nêutrons de um material é dada por
σ
=
1/ ln 1/T (1)
η
η é o número de átomos por barn da amostra definido por η=N0ρ x / A
N0 é o número de Avogadro,
ρ é a densidade da amostra (g/cm3) x é a espessura da amostra (cm) A é a massa atômica da amostra
T é a transmissão de nêutrons pela amostra dada por
T=(I-Ibg)/(I0-I0bg) (2)
I-Ibg é a intensidade de nêutrons transmitida pela amostra e
corrigida da radiação de fundo
I0-I0 bg é a intensidade de nêutrons sem a amostra no feixe
e corrigida da radiação de fundo
Para moléculas, compostos químicos ou polímeros , na fórmula (1) a massa atômica é substituída pela massa molecular ou por uma massa média calculada de acordo com a estrutura e conformação do material [1].
O erro numa medida de seção de choque é obtido através da aplicação da fórmula de propagação de erros[7]
∆σ=1/η ((∆I0’/I0)2 + (∆I’/I)2)1/2 onde ∆I0’= ((∆I0)2 + (∆I0 bg’)2)1/2 ∆I’= ((∆I)2 + (∆I bg ’ )2)1/2
as parcelas ∆I0 , ∆I0 bg , ∆I , e ∆I bg são os erros nas
intensidades, ou seja as raízes quadradas das intensidades. Análise das Moléculas de Aminoácidos para Efeito de Geração de Dados para os Cálculos de Seções de Choque para Nêutrons. Os resíduos de aminoácidos foram considerados como unidades principais para os cálculos das seções de choque. As fórmulas químicas e estruturas de cada aminoácido estão representadas na figura 2.
Figura 2. Fórmulas Moleculares dos Aminoácidos para Efeito de Cálculos das Seções de Choque para Nêutrons Cálculos de Seções de Choque Totais para Nêutrons para as Medidas de Transmissão. As seções de choque dos materiais a serem medidos foram inicialmente determinadas através de análise das estruturas e conformações das moléculas para a posterior atribuição dos valores de seções de choque obtidas de consulta de manual e literatura [5,8].
Foi levado em conta o critério da Transmissão ½, ou seja, para cada amostra foi calculada uma espessura considerando a expressão (1) atribuindo-se uma densidade hipotética, com o valor de T=1/2 e valores das seções de choque na energia de 0,05 eV obtidos do manual, literatura [5,8] e anotações particulares, pelo fato destes tipos de dados não constarem em manuais ou em literatura específica.
Medidas de Seções de Choque Totais para Nêutrons com o Espectrometro de Cristal do IEN. As medidas de seções de choque foram obtidas com o espectrometro de cristal do IEN instalado no canal de irradiação J-9 do reator Argonauta operando com fluxo de nêutrons de 2,14x109 n/cm2 no núcleo. O feixe emerge do tanque de alumínio passando por um bloco de grafite de 60 cm com orifício de 1” de diâmetro e em seguida passa por um colimador do tipo “Soller Slit” . À saída do canal o fluxo de nêutrons é 105 n/cm2 e tem distribuição de forma maxwelliana em energia, é refletido pelo cristal de calcita, que segundo o ângulo 2θ=25o difrata nêutrons de 0,05 eV com intensidade
de 102 n/cm2. Em seguida o feixe passa pelo trocador de amostras, por um definidor de 1,5 cm de diâmetro e por outro colimador do tipo “Soller Slit”. Antes de atingir o detetor passa por outro definidor de feixe de 1,5 cm de diâmetro.
A intensidade do feixe monocromático de nêutrons registrada pelo detetor BF3 , depois de passar pelo sistema
de colimação e definição angular, é de 10.000 cpm com radiação de fundo de 5%.
Seções de Choque Totais para Nêutrons de Materiais Padrões. Para efeito de calibração do sistema para as medidas dos materiais biológicos, foram inicialmente medidas as seções de choque dos materiais utilizados como padrões de absorção e espalhamento de nêutrons, o ouro e a água pesada nuclearmente puros( 99,99% e 99,741%, respectivamente).
Seções de Choque Totais para Nêutrons de Materiais Biológicos. Os materiais biológicos, a solução de aminoácidos e os aminoácidos individuais foram medidos, todos em duas espessuras diferentes para que a seção de choque para T=1/2 fosse determinada através de análises das curvas de Transmissão contra as espessuras das amostras. Feito isto os resultados foram comparados com as seções de choque totais calculadas pelas técnicas do agrupamento e parcelamento de seções de choque.
III. RESULTADOS E CONCLUSÕES
Medidas de Seções de Choque Totais dos Materiais Padrões e Materiais Biológicos. Os valores medidos das seções de choque totais das amostras padrões de ouro e água pesada são mostrados na tabela 2 e comparados aos valores da literatura[5], comprovam a calibração do sistema para as medidas. Os dados referentes às amostras utilizadas nas medidas são apresentados na tabela 1. Os resultados das determinações de seções de choque para nêutrons dos aminoácidos, seus respectivos erros e desvios são mostradas na tabela 2. Foram realizados três ciclos de medidas que resultaram nos valores médios apresentados. Os valores çalculados de seções de choque foram obtidos por análise de estrutura molecular, conformação e composição química dos materiais, e dados manipulados da literatura[5,8] utilizando as técnicas de agrupamento e parcelamento de seções de choque para nêutrons[1]. Exceto a metionina, todas as amostras se mostraram dentro dos resultados esperados.
TABELA 1. Características de Amostras Padrões e Amostras de Aminoácidos Individuais
Amostra Forma Pureza (%) Densidade (g/cm3) Origem Padrão Ouro Sólido 99,999 19,32 Reactor Experim. (USA) Padrão Ägua Pesada Líqui do 99,741 1,10±0,01 Merck (USA) Treonina Pó >99 0,80±0,01 Ajinomoto Cisteina Pó >99 0,95±0,01 Ajinomoto Tirosina Pó >99 0,80±0,01 Ajinomoto Fenilalanina Pó >99 0,79±0,01 Ajinomoto Metionina Pó >99 0,55±0,01 Ajinomoto
TABELA 2. Seções de Choque Totais para Nêutrons de Amostras de Aminoácidos, Calculadas e Obtidas com o Espectrometro de Cristal do IEN.
Amostra σT(0,05eV) (barn) medida ∆σ/σ x100 (%) σT(0,05eV) (barn) calculada PadrãoOuro 75±4 3 78±7 Padrão Ägua Pesada 13±1 0 13±1 Treonina 378±17 0,3 377±0,3 Cisteina 252±12 0,4 253±0,3 Tirosina 512±24 2,4 500±0,3 Fenilalanina 453±21 0,2 452±0,3 Metionina 441±20 6 467±0,3 REFERÊNCIAS
[1] Voi, D.L., Estudos da Estrutura e Dinâmica Moleculares da Baquelite Através de Medidas de Seções de Choque para Nêutrons, Tese de Doutoramento, COPPE-UFRJ,1990.
[2] Voi, D.L., Medidas de Seções de Choque para Nêutrons de Grafites e Polímeros, II Encontro Técnico-Científico Nacional de Carbono e Grafite, São José dos Campos-SP 28 a 30 de Novembro de 1999.
[3] Alberts, B. Bray,D. Johnson A Lewis, J. Raff M. Roberts K. and Walters,P., Fundamentos da Biologia Celular, Editora Universitária, Porto Alegre, R.S.,1999.
[4] Voet, D. Voet J.G. and Pratt, C.W., Fundamentos de Bioquímica, Artmed Editora, Porto Alegre, R.S.,2000.
[5] Mughabghab, S.F. and Garber, D.I., , Neutron Cross Sections, Vol. I e II, BNL- 325, 1973
[6] Voi, D.L. Rogers, J.D. Vinhas L.A Filho, J.M. Determination of Neutron Double Differential Scattering Cross-Sections for Calcined Bakelite, INDC (BZL)- 7/G, International Nuclear Data Comittee, IAEA, Vienna (1983), page 8.
[7] Voi, D.L., Medidas de Seções de Choque para Nêutrons com o Espectrometro de Cristal do IEN, Tese de Mestrado, COPPE-PEN, UFRJ, Dezembro de 1978
[8] Herdade, S.B. Espalhamento de Nêutrons Lentos na Água, Polietileno e Compostos Metílicos, Tese de Doutoramento, Universidade de Campinas, São Paulo, 1969.
ABSTRACT
Amino acids used in parenteral administration in hospital patients with special importance in nutritional applications were analyzed to compare with the manufactory data. Individual amino acid samples of phenylalanine, cysteine, methionine, tyrosine and threonine were measured with the neutron crystal spectrometer installed at the J-9 irradiation channel of the 1 kW Argonaut Reactor of the Instituto de Engenharia Nuclear (IEN). Gold and D2O high purity
samples were used for the experimental system calibration. Neutron cross section values were calculated from chemical composition, conformation and molecular structure analysis of the materials. Literature data were manipulated by parceling and grouping neutron cross sections.
