UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CARACTERIZAÇÃO DO CRESCIMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS ISOLADOS DA CAATINGA DO NORDESTE BRASILEIRO
Tony Mulembeshanya Kamuha
Cosme Rafael Martínez Salinas
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CARACTERIZAÇÃO DO CRESCIMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS ISOLADOS DA CAATINGA DO NORDESTE BRASILEIRO
Tony Mulembeshanya Kamuha
Cosme Rafael Martínez Salinas
Monografia apresentada ao Curso de Ciências Biológicas (Trabalho Acadêmico de conclusão de Curso), como requisito parcial à obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas
Catalogação na publicação Universidade Federal da Paraíba
Biblioteca Setorial do CCEN
K15c Kamuha, Tony Mulembeshanya
Caracterização do crescimento de fungos filamentosos isolados da caatinga do... / Tony Mulembeshanya Kamuha.– João Pessoa, 2013.
43f. : il. -
Monografia (Bacharelando em Ciências Biológicas) - Universidade Federal da Paraíba /CCEN.
Orientador: Profº Cosme Rafael Martínez Salines.
1.Fungos filamentosos – Caatinga - Nordeste. 2. Fungos filamentosos – Gêneros . 3. Fungos filamentosos - Crescimento
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Tony Mulembeshanya Kamuha
CARACTERIZAÇÃO DO CRESCIMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS ISOLADOS DA CAATINGA DO NORDESTE BRASILEIRO
Monografia apresentada ao Curso de Ciências Biológicas, como requisito parcial à obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas.
.
Data:_________________________________
Resultado: ____________________________
BANCA EXAMINADORA:
Professor Doutor Cosme Rafael Martínez Salinas DQ/CCEN/UFPB-ORIENTADOR
Professora Doutora Krystyna Gorlach-Lira DBM/CCEN/UFPB-MEMBRO TITULAR
Que homem é homem que não torna o mundo melhor. Jean Guillou
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Estudante-Convênio de Graduação (PEC-G) do Ministério da Educação (MEC), pela oportunidade oferecida de participar desse programa que me possibilitou uma formação superior.
À Universidade Federal da Paraíba, pela oportunidade de participar do Curso de Graduação em Ciências Biológicas para obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
financiamento concedido para realização desse trabalho (Edital
MCT/CNPq/MMA/MEC/CAPES/FNDCT – Ação Transversal/FAPs N0 47/2010).
Ao Professor Cosme Rafael Martínez Salinas, pela orientação, pelos ensinamentos, pelos conselhos, pelo apoio, pela confiança e pela oportunidade.
A Professora Ierecê Maria de Lucena Rosa, pelo carinho que ela tem demostrado e pela disponibilidade que ela tem oferecida no uso dos equipamentos do seu laboratório ajudando assim a concretização desse trabalho.
A Professora Krystyna Gordlach Lira, pelo auxílio e por ter aceitada de integrar a banca examinadora junto com os demais professores.
Ao Professor Felipe Wartchow, pelos ensinamentos recebidos na disciplina Micologia Geral e por ter aceitado de integrar a banca examinadora juntos com os demais professores.
Ao Professor Ariosto Marques, pelo auxílio e pela amizade me demostrado.
Aos Professores do Curso de Ciências Biológicas pelos ensinamentos que me ofereceram durante toda a minha graduação.
Aos estudantes, Allan Reis Albuquerque, Carlos Vinícius Carvalho do Nascimento, Ana Terra Neu, Fernanda Mikainy, Ubiratan Ribeiro e Rowse Alencar pela amizade, as conversas e a ajuda imprescindível que eles têm me dados durante a nossa convivência no laboratório.
À minha família, minha mãe Georgette, minha irmã Joelle e meu irmão Aime, pelo amor e pelo apoio incondicional que eles têm por mim.
RESUMO
Trinta e dois (32) isolados de fungos filamentosos pertencentes aos gêneros Apophysomyces, Aspergillus, Cunninghamella, Fennellomyces, Lichtheimia, Mucor, Penicillium, Rhizopus e Syncephalastrum da Caatinga do Nordeste Brasileiro foram avaliados em meio sólido Sabouraud quanto a taxa máxima de crescimento (TMC), área do micélio, mudança de pH do meio e a produção de massa seca. As TMCs foram aproximadas a partir do ajuste linear de medidas de área micelial (cm2) feitas durante o cultivo. Os isolados mostraram amplos tempos de cultivo (2 a 35 d), TMCs (1,20 a 34 cm2/d), áreas miceliais (2 a 60 cm2), mudanças do pH do meio (pH 2,1 a 7,1) e produções de massa seca (0,040 a 1,400 g/placa). Estes dados foram utilizados para classificar os fungos em cinco grupos fisiológicos distintos. Grandes áreas miceliais com baixas e altas produções de massa seca que, respectivamente, alcalinizaram e acidificaram intensamente o meio foram observadas dentro dos isolados de Aspergillus. Este gênero teve 71 % dos isolados com TMCs lento. Isolados de Penicillium mostraram baixo desempenho em TMCs e produção de massa seca, alguns acidificando moderadamente e outros alcalinizando o meio. Os isolados de Rhizopus mostraram as maiores TMCs (< 2 d de cultivo) com baixas produções de massa seca, alguns acidificaram e outros alcalizaram o meio, todos eles com grandes áreas de micélios. Existe variabilidade intra e interespecífica indicando que o crescimento (TMC e massa seca) dos fungos filamentosos em meio solido Sabouraud foi fortemente dependente do isolado. A definição de tendências fisiológicas semelhantes e discrepantes pode ser importante para empreendimentos biotecnológicos.
.
ABSTRACT
Thirty-two (32) isolates of filamentous fungi (Apophysomyces, Aspergillus, Cunninghamella, Fennellomyces, Lichtheimia, Mucor, Penicillium, Rhizopus and Syncephalastrum) from Caatinga in Northeast of Brazil were evaluated in solid state Sabouraud medium on the basis of the maximum growth rate, the mycelium area, the change of medium pH and the dry matter production. The maximum rates of growth were approximated from the linear adjustment measures of micelial area (cm²) made during cultivation. The isolates showed a wide cultivation times (2 to 35 d), maximum growth rates (1.20 to 34 cm²/d), micelial areas (2 to 60 cm²), changes of medium pH (pH 2.1 to 7.1) and production of dry mass (0.040 to 1.400 g/plate). These data were used to classify these fungi genera in five distinct physiological groups. Large areas with low and high micelial dry mass production which respectively alkalinized and strongly acidified the medium were observed within isolates of Aspergillus. This genus was represented 71 % by isolates with slow TMCs. Penicillium isolates showed low performance in TMCs and dry mass production, some moderately acidifying and other alkalinizing the medium. Isolates of Rhizopus showed the highest TMCs (<2 d cultivation) with low production of dry mass, some acidified and other alkalinized the medium, all with large areas of mycelia. There´s intraspecific and interspecific variability indicating that growth (TMC and dry mass) of filamentous fungi in solid state Sabouraud medium was heavily dependent on filamentous fungi isolated. The definition of similar physiological trends and outliers may be important for biotechnological developments.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Aspectos morfológicos dos mantos miceliais (ao final do cultivo) de alguns fungos filamentosos isolados de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro cultivados em meio sólido Sabouraud (30 °C). A: Absidia cylindrospora SIS 36; B: Apophysomyces elegans SIS 29; C: A. elegans SIS 29; D: Aspergillus sp. SIS 11; E: Aspergillus sp. SIS 03; F: Cunninghamella echinulata var echinulata SIS 34; G: Lichtheimia corymbifera SIS 33; H: Penicillium sp. SIS 12; I: Penicillium sp. SIS23; J: Rhizopus microsporus var chinensis SIS 31; K: R. stolonifer SIS 35 e L: R. microsporus var microsporus SIS 39. ... 26 Figura 2: Dinâmica de crescimento e aspectos morfológicos do manto do micélio de fungos filamentosos SIS7
(Aspergillus sp.), SIS15 (Aspergillus sp.) e SIS30 (Rhizopus arrhizus var. arrhizus) ― isolados de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro cultivados (30 °C) em meio sólido Sabouraud (20 mL) contido em placas de Petri (diâmetro:100 mm). Modelo: y= b*x ± a; b: taxa máxima de crescimento.... 27 Figura 3: Taxa máxima de crescimento (A), Área do micélio (B), Massa seca (C) e pH do meio (D) de culturas
de fungos filamentosos (Experimento I) isolados de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro cultivados em meio sólido Sabouraud (30 °C). Isolados: SIS2 (Lichtheimia hyalospora); SIS4 (Aspergillus sp.); SIS9 (Aspergillus sp.); SIS29 (Apophysomyces sp.) e SIS 38 (Cunninghamella phaeospora). Dados médios (n = 4) classificados com a mesma letra não diferem significativamente (P < 0,05) pelo HSD de Tukey. CV é coeficiente de variação. ... 29 Figura 4: Taxa máxima de crescimento (A), Área do micélio (B), Massa seca (C) e pH do meio (D) de culturas
de fungos filamentosos (Experimento II) isolados de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro cultivados em meio sólido Sabouraud (30 °C). Isolados: SIS7 (Aspergillus sp.); SIS11 (Aspergillus sp.); SIS12 (Penicillium sp.); SIS15 (Aspergillus sp.); SIS28 (Fennellomyces heterothallicus); SIS30 (Rhizopus arrhizus var. arrhizus); SIS32 (Mucor prayagensis); SIS33 (Lichtheimia corymbifera) e SIS35 (Rhizopus stolonifer). Dados médios (n = 4) classificados com a mesma letra não diferem significativamente (P < 0,05) pelo HSD de Tukey. CV é coeficiente de variação. ... 30 Figura 5: Taxa máxima de crescimento (A), Área do micélio (B), Massa seca (C) e pH do meio (D) de culturas
de fungos filamentosos (Experimento III) isolados de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro (Projeto RENNORFUN) cultivados em meio sólido Sabouraud (30 °C). Isolados: Isolados: SIS6 (Penicillium sp.); SIS10 (Aspergillus sp.); SIS13 (Aspergillus sp.); SIS17 (Aspergillus sp.); SIS19 (Aspergillus sp.); SIS20 (Aspergillus sp.); SIS22 (Aspergillus sp.); SIS23 (Penicillium sp.) e SIS25 (Aspergillus sp.). Dados médios (n = 4) classificados com a mesma letra não diferem significativamente (P < 0,05) pelo HSD de Tukey. CV é coeficiente de variação. ... 31 Figura 6: Taxa máxima de crescimento (A), Área do micélio (B), Massa seca (C) e pH do meio (D) de culturas
de fungos filamentosos (Experimento IV) isolados de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro cultivados em meio sólido Sabouraud (30 °C). Isolados: Isolados: SIS3 (Aspergillus sp.); SIS8 (Aspergillus sp.); SIS21 (Penicillium sp.); SIS24(Penicillium sp.); SIS27 (Penicillium sp.); SIS31 (Rhizopus arrhizus var. arrhizus) ; SIS37 (Syncephalastrum racemosum); SIS39 (R. microsporus var. microsporus) e SIS40 (Lichtheimia blakesleeana). Dados médios (n = 4) classificados com a mesma letra não diferem significativamente (P < 0,05) pelo HSD de Tukey. CV é coeficiente de variação. ... 33 Figura 7: Relações da taxa máxima de crescimento (A), área do micélio (B), produção de massa seca (C) e
tempo de cultivo (D) com pH do meio final nas culturas de fungos filamentosos isolados de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro cultivados em meio sólido Sabouraud (30 °C). Dados médios (n = 4) de 32 isolados pertencentes a vários gêneros. Linhas horizontal e vertical são médias gerais para os 32 isolados. ... 35
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Grupos fisiológicos de fungos filamentosos (32 Isolados) obtidos de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro (Projeto RENNORFUN): Biodiversidade com relação a parâmetros de crescimento e fisiológicos quanto cultivados em meio sólido Sabouraud a 30 °C. Parâmetros considerados: Taxa máxima de crescimento, área e massa seca micelial e pH do meio ao termino do cultivo. ... 37
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C: Grau Celsius
ANOVA: Análise da variância
BDA: Batata dextrose agar
CM: Cellulose medium
CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CV: Coeficiente de variação
d: dia
DNA: Deoxyribonucleic acid
ha: Hectare
HSD: Honestly significant difference
MAYP: Maltose agar
OK: Oklahoma
RADP: Random amplification DNA polymorphic
RENNORFUN: Rede Norte-Nordeste de Fungos Filamentosos de Solos da Caatinga e da Amazônia
SIS: Sisbiota
SISBIOTA: Sistema Nacional de Pesquisa em Biodiversidade
TMC: Taxa máxima de crescimento
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ... 6 RESUMO ... 7 ABSTRACT ... 8 LISTA DE FIGURAS ... 9 LISTA DE TABELAS ... 10LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... 11
SUMÁRIO ... 12
1. INTRODUÇÃO ... 13
1.1. Caatinga ... 13
1.2. Caracterização dos fungos ... 13
1.3. Gêneros dos fungos filamentosos ... 16
1.4. Crescimento de fungos filamentosos ... 19
2. OBJETIVO ... 22
2.1. Objetivos gerais ... 22
2.2 Objetivos específicos ... 22
3. METODOLOGIA ... 23
3.1. Material biológico ... 23
3.2. Reativação dos isolados e condições de cultivo ... 23
3.3. Avaliação do crescimento dos fungos ... 23
3.5. Avaliação do pH do meio ... 24
3.6. Ajuste do modelo linear e análise estatística ... 24
4. RESULTADOS ... 25
5. DISCUSSÃO ... 38
6. CONCLUSÃO ... 40
13
1.INTRODUÇÃO
1.1. Caatinga
A Caatinga é um bioma incluso entre as florestas secas que ocupam 42 % das florestas tropicais e subtropicais do mundo (MOREIRA, 2006), caracteriza-se por ser uma floresta composta por árvores e arbustos baixos,3 a 7 metros de altura (IBAMA 2013), apresentando algumas características xerofíticas (PRADO, 2003). Portanto, as limitações nesse ambiente semiárido caracterizado por distribuição irregular de chuvas, altas taxas de evapotranspiração e baixa capacidade de retenção de água dos solos nem sempre são devidas a atividade antrópica, pois fatores abióticos de natureza climatológica exercem grande influência na vegetação desse ambiente (ALBUQUERQUE 1999 apud MOREIRA, 2006). “No Nordeste [Brasileiro], as áreas de Caatinga apresentam um regime de chuvas cuja deficiência hídrica ocorre na maior parte do ano [...]” (MENEZES; SAMPAIO, 2000 apud Moreira, 2006, p.1644). Elas abrangem áreas que representam 6,83% do território nacional (73.683.649 ha) e se estendem sobre os estados da Bahia, Ceara, Piauí, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Paraíba, Sergipe, Alagoas, Mato Grosso e Minas Gerais (IBAMA 2013).
1.2. Caracterização dos fungos
Cerca de 80.000 a 120.000 espécies de fungos têm sido descritos até hoje, embora o número total de espécies seja estimado a cerca de 1,5 milhões (HAWKSWORTH, 2001). Os fungos verdadeiros (Eumycota) são organismos eucarióticos que formam um táxon monofilético dentro do domínio Eukarya (WEBSTER; WEBER, 2007). O reino Fungi pode ser dividido em três grandes grupos: os bolores (mofos apresentam filamentos multicelulares: que formam um manto denominado de micélio), as leveduras (predominante unicelulares) e os cogumelos (corpo de frutificação suculento apresentando esporos); diferentemente dos protozoários, outro reino do domínio Eukarya, eles possuem paredes celulares e esporos de diversos tipos (PELCZAR, 1980). Eles possuem habitat diversos desde o meio aquático, água doce e marinha, até o meio terrestre onde eles podem ser encontrados na matéria orgânica em decomposição ou como parasitas de plantas e de animais incluindo o ser humano (PELCZAR,
14
Os fungos apresentam uma arquitetura da parede celular parecida a dos vegetais, mas diferente na sua composição química, pois, ela apresenta a quitina, um polímero de N-acetyl-D-glucosamina, na sua parede celular em vez de celulose como é o caso dos vegetais e glucano, um polímero de glicose altamente ramificado (WEBSTER; WEBER, 2007). Em algumas espécies de fungos há presença de outros compostos como manano, galactano ou quitosano, a parede celular apresenta uma matriz cimentante formada por lipídeos, polifosfatos e íons inorgânicos (PELCZAR, 1980; WEBSTER; WEBER, 2007). Os fungos são organismos quimiotróficos e muitas espécies podem crescer em ambientes extremos com baixo pH e altas temperaturas (PELCZAR, 1980).
Os bolores são fungos filamentosos que apresentam uma grande distribuição na natureza, bem como frequentemente encontrados nos pães velhos, nos queijos e nos frutos. O crescimento do filamento é realizado por um mecanismo de expansão celular na sua extremidade, cada filamento é denominado de hifa e esta cresce num emaranhado chamado de micélio. A hifa contém na maioria das vezes vários núcleos apresentando-se como um tubo nucleado com citoplasma. A formação dos esporos acontece na superfície dos micélios em estrutura denominada de esporóforo quando forma um saco na sua porção terminal é chamado de esporângio, de onde são dispersos os esporangiósporos para novos habitats. Os conídios são esporos assexuados que muitas vezes apresentam pigmento e são resistentes a dessecação; quando eles se formam, o micélio muda de cor de branco para preto, roxo, azul esverdeado, amarelo ou marrom. Porém, alguns fungos filamentosos apresentam esporos sexuados produzidos pela fertilização da oosfera resultando no oósporo ou pela fusão de duas hifas resultando no zigósporo (PELCZAR, 1980).
Os fungos apresentam importâncias ecológicas como na decomposição da madeira, do tecido e outros produtos derivados de fontes naturais utilizando eles como fonte de carbono e de energia, na fermentação industrial da cerveja, do vinho, na produção de antibióticos, de vitaminas e de ácidos orgânicos, na fabricação de pães e no amadurecimento do queijo (PELCZAR, 1980). Existem fungos exclusivamente parasitas (obrigatórios) que não sobrevivem livremente na natureza, e outros dependendo da situação podem atuar como sapróbio. “Os fungos parasitas são numerosos e suas ocorrências podem ou não estarem intimamente ligados à presença do hospedeiro, entre as condições bióticas e abióticas que
15 podem determinar o modo de vida desses fungos estão a disponibilidade do hospedeiro apropriado, os fatores ambientais e aqueles relacionados a dispersão dos esporos” (GUSMÃO, 2006, p.41-2). “[...], considera-se impossível a existência de um organismo, vegetal ou animal, que em alguma época da sua vida não tenha sido parasitado por algum fungo” (GUSMÃO , 2006, p.42).
Isso pode ser evidenciado na observação da interação entre fungos e outros organismos como plantas e animais levando a co-evolução, como os liquens, definidos como “uma associação entre um fungo e um simbionte fotossintético, resultando em um talo estável com estrutura específica” (GUSMÃO, 2006, p.42). As micorrizas, associação simbiótica entre fungos e raízes ocorrem em cerca de 95 % das plantas vasculares (TRAPPE, 1987 apud GUSMÃO, 2006). O endofitismo, que não produz sintoma de doença na planta hospedeira, apresentando o benefício da produção de metabolitos que inibem a ação de insetos e mamíferos herbívoros, em troca de suprimento alimentar, proteção e dispersão (CLAY, 1988); encontrado na maioria das fanerógamas (GUSMÃO, 2006). O saprofitismo, condição da maioria dos fungos, acontece em todos os ambientes, nessa interação o fungo precisa de oxigênio para sua sobrevivência (GUSMÃO, 2006).
Os fungos encontrados em solos apresentando alta salinidade, estresse hídrico ou térmico, podem apresentar processos fisiológicos e genéticos responsáveis pela sobrevivência nesses ambientes, assim a interação associativa com plantas pode aumentar a capacidade destas de sobreviver em ambientes extremos. Uma característica que pode ser explorada para a descoberta de novos genes, proteínas ou metabolitos importantes para aplicação agrícola e industrial (HAWKSWORTH, 1991, GUSMÃO, 2006).
A bioprospecção,
“[...] definida como a busca de uma aplicação útil de um processo ou produto obtido na natureza, em geral, está relacionada a compostos orgânicos derivados do metabolismo de microrganismos, plantas ou animais presentes em ambientes extremos, tal como o semi-árido, a floresta tropical e o deserto” (MELO; VALADARES-INGIS; NASS; VALOIS, 2002, BILLS; DOMBROWSKI; PELAEZ; POLISHOOK, 2002 apud GUSMÃO, 2006, p.204).
Ela envolve a triagem e seleção de fungos com aplicação industrial e ambiental e tem sido alvo de interesse das indústrias, dos governos e dos cientistas (MELO; VALADARES-INGIS;
16 NASS; VALOIS, 2002, BILLSET; DOMBROWSKI; PELAEZ; POLISHOOK, 2002 apud GUSMÃO, 2006).
1.3. Gêneros dos fungos filamentosos
O gênero Aspergillus é encontrado em frutas, vegetais e outros substratos capazes de fornecer os nutrientes necessários ao seu crescimento. Envolvido na deterioração de alimentos ele apresenta importância económica, é utilizado na fermentação industrial, na produção de ácido cítrico e de ácido glucônico (PELCZAR, 1980).
O gênero Penicillium ocorre amplamente na natureza, algumas espécies causam apodrecimento e outra deterioração de frutas, vegetais, grãos e pastos. Outras são utilizadas no amadurecimento de queijo. Algumas são utilizadas em fermentação industrial e na produção de antibióticos P. notatum e P. chrysogenum (Penicilina). E alguns se reproduzem sexualmente pela formação de ascósporos. Os fungos do gênero Penicillium possuem micélios vegetativos septados que penetram no substrato, produzindo hifas aéreas, nas quais se desenvolvem conidióforos. A coloração das colônias maduras é útil na identificação das espécies, que crescem melhor em temperaturas de 15 a 30 °C (PELCZAR, 1980).
O gênero Rhizopus ocorre em pães, vegetais, frutas e outros produtos da nutrição. Possui fungos com micélios não septados, cotonosos e formando esporangióforos nos nódulos onde se encontram os rizóides. (PELCZAR, 1980). As características dos Rhizopus são a presença de rizóides na base do esporangióforo, que podem estar crescendo em cachos, e o hábito estolonífero. “Há cerca de 10 espécies que crescem em solos” (DOMSCH; GAMS; ANDERSON, 1980 apud WEBSTER; WEBER, p.182, 2007, tradução nossa), em frutos, em outros alimentos e todos os tipos de materiais em decomposição, ocorrendo com frequência como contaminante de laboratório. Rhizopus stolonifer (R. nigricans) apresenta um crescimento rápido e é frequentemente encontrada em frutos maduros, especialmente quando são incubados em atmosfera húmida. Rhizopus microsporus causa dano às plântulas de arroz em que o crescimento da raiz é fortemente prejudicado pela toxina (rizoxina) excretada no solo contaminado pelo patógeno (WEBSTER; WEBER, 2007, tradução nossa), ela é sintetizada por bactérias do gênero Burkholderia vivendo endosimbioticamente no citoplasma das hifas do Rhizopus microsporus (PARTIDA-MARTÍNEZ; HERTWECK, 2005).
17
O gênero Lichtheimia possui 4 espécies (Lichtheimia corymbifera, L. ramosa, L. blakesleeana, L. hyalospora), que crescem apresentando colônias de crescimento rápido, principalmente em temperaturas ótimas entre 37 °C e 42 °C, predominantemente termo tolerantes com temperaturas máxima de crescimento de 55 °C. As hifas formam muitas vezes estolões e rizoides, com esporângios terminais. As hifas e os esporangióforos não são septados, nem ramificados, e raramente o esporangióforo apresenta um septo subesporangial. Os esporangióforos são eretos ou levemente dobrados com esporângios multi-esporados, esféricos e apofisário; os esporangiósporos são esféricos ou elipsoidais. A columela é esférica ou hemisférica, ocasionalmente cónica. Os zygosporos são desenvolvidos em gametângios opostos, de aspecto globoso a oval, com paredes grossas, nuas e lisas (HOFFMANN; WALTHER; VOIGT, 2009). O gênero Lichtheimia consiste de fungos sapróbios que habitam solo ou material vegetal morto. L. corymbifera e L. ramosa podem causar infecções fulminantes em pacientes com a imunidade comprometida (ALASTRUEY-IZQUIERDO; HOFFMANN; DE HOOG; RODRIGUEZ-TUDELA; VOIGT; BIBASHI; WALTHER, 2010).
O gênero Mucor ocorre no solo, no estrume, nas frutas, nos vegetais e em alimentos amiláceos. Algumas espécies são responsáveis pela decomposição de alimentos e outros são empregados na fabricação de queijos e produtos alimentícios (PELCZAR, 1980). “Cerca de 50 espécies de Mucor são atualmente conhecidas” (KIRK; CANNON; DAVID; STALPERS, 2001 apud WEBSTER; WEBER, p.180, 2007, tradução nossa). “O gênero é cosmopolita, com muitas espécies sendo difundida em solo ou em substratos em contato com o solo” (WEBSTER; WEBER, p.181, 2007, tradução nossa). A maioria das espécies é mesófila crescendo em temperaturas entre 10 °C a 40 °C com temperaturas ótimas entre 20 °C e 35 °C, mas algumas espécies como M. miehei ou M. pusillus são termofílicas com temperatura mínima de crescimento de cerca de 20 °C e temperatura máxima atingindo os 60 °C (COONEY; EMERSON, 1964; MAHESHWARI; BHARADWAJ; BHAT, 2000 apud WEBSTER; WEBER, 2007, tradução nossa). M. circinelloides e M. indicus são utilizados como iniciadores em processamento de alimentos para quebrar polissacáridos amiláceos em arroz, mandioca e sorgo, liberando açúcares simples para a preparação de alimentos fermentados ou a produção de álcool (HESSELTINE, 1991, WEBSTER; WEBER, p.181, 2007). “A maioria das espécies de Mucor cresce rapidamente em ágar, à temperatura
18 ambiente, enchendo uma placa de Petri em 2 a 3 dias com micélio aéreo grosseiro” (WEBSTER; WEBER, p.181, 2007). Quando incubadas em cultura líquida sob condição semi anaeróbia, algumas espécies crescem num estado levedura. O gênero Mucor, exibe propriedades típicas de outros Zygomycetes, porém, existe uma característica que faz com que algumas, mas não todas as espécies do gênero, sejam bastante distintas de outros Zygomycetes. Apesar de todos os Mucor exibirem uma variedade diferenciada de morfologia de hifas, apenas os que podem crescer na forma de levedura multipolar esférico são referidos como dimórfico, por exemplo: M. racemosus, M. rouxii, M. genevensis, M. bacilliformis e M. subtilissimus (ORLOWSKI, 1991, 1995). Poucas espécies do gênero Mucor (M. circinelloides, M. hiemalis e M. racemosus) são patógenos humanos, entretanto, a doença mucormicose foi designado segundo o gênero. Sendo ela, referindo-se à doença causada por espécies de fungos da ordem Mucorales. As infecções são oportunistas, derivadas de esporangiosporos presentes no solo ou no ar, e estão normalmente associadas com os pacientes que sofrem de outras doenças tais como diabetes, leucemia, AIDS e condições de pós-operatório(WEBSTER; WEBER, 2007).
O gênero Fennellomyces é composto por espécies que produzem esporangióforos de paredes deliquescentes, esporângios apofisário com uma vesícula subsporangial. Quatro espécies são conhecidas: F. gigacellularis, F. heterothallicus, F. linderi, F. verticellatus (BENNY; BENJAMIN, 1975).
No gênero Apophysomyces, a espécie A. elegans produz estolhos, rizoides e esporangióforos curtos, cenocíticos que terminam em uma columela apofisária, o esporângio é multi-esporado com uma parede deliquescente; com algumas apófises construídas abaixo do esporângio. Os esporangiósporos são globosos a elipsoides, com superfície lisa; e a presença de zygosporo é desconhecido (MISRA; SRIVASTAVA; LATA, 1979). O fungo A. elegans é uma espécie termo tolerante que causa grave infeções em humanos (GUARO, 2011).
O gênero Syncephalastrum, é o único gênero da família Syncephalastraceae (WEBSTER; WEBER, 2007), a análise da sequência do DNA indica que é próximo de certos gêneros tradicionalmente classificados nas famílias Mucoraceae e Thamnidiaceae (O’DONNELL; LUTZONI; WARD; BENNY, 2001, tradução nossa). A espécie S. racemosum pode ser isolada de solo de área tropical e subtropical (DOMSCH; GAMS; ANDERSON, 1980 apud
19 WEBSTER; WEBER, p.195, 2007, tradução nossa). “Ele cresce rapidamente em cultura com uma grande variação de temperatura de 7 a 40 °C e é principalmente sapróbio e foi implicado em mucormicose em hospedeiro humano assim como em animal. Ele foi também isolado em produtos alimentícios, grãos de cereais, outros grãos e temperos. Em cultura, ele forma ramos aéreos que termina em vesículas esféricas ou claviformes” (WEBSTER; WEBER, 2007, p.195, tradução nossa).
O gênero Cunninghamella possui 12 espécies encontradas em solos de regiões quentes do mundo (DOMSCH; GAMS; ANDERSON, 1980, ZHENG; CHEN, 2001, WEBSTER; WEBER, 2007). C. elegans e C. echinulata são sapróbios, C. bertholettiae é patógeno humano e pode ser fatal, C. echinulata pode ser um micoparasita destruidor de Rhizopus arrhizus e C. elegans e C. echinulata têm sidos utilizados na biotransformação de produtos farmacêuticos (KIESLICH, 1997 apud WEBSTER; WEBER, 2007). Estudos da sequência de DNA tem reagrupado C. echinulata com alguns gêneros tradicionalmente classificados na família Mucoraceae (O’DONNELL; LUTZONI; WARD; BENNY, 2001), mas a comparação de ácido graxo e a composição da parede celular de C. japonica e Blakeslea trispora sugere que Cunninghamella seja relacionado a membros da família Choanephoraceae (WEBSTER; WEBER, 2007).
1.4. Crescimento de fungos filamentosos
Diversos processos têm sidos utilizados para conservação de fungos filamentosos, apresentando vantagens e desvantagens, a escolha do método depende da disponibilidade no laboratório, da longevidade da preservação, da estabilidade genética da cultura para a manutenção das características morfológicas, metabólicas e de patogenicidade entre outros fatores. Entre esses métodos, destaca-se o repique periódico em meio sólidos, com ou sem proteção de óleo mineral, podendo após a semeadura (ou repique), os tubos serem deixados em temperatura ambiente, na geladeira ou no congelador (RODRIGUEZ; LÍRIO; LACAZ, 1992).
Cabanillas e Jones (2009) utilizaram medidas diárias do crescimento radial (arranjo de eixos ortogonais) de micélios de fungos sob efeito de temperatura e composição do médio de cultivo para aproximar as taxas médias (mm/dia) e taxa máxima de crescimento através do
20 modelo linear. Essa aproximação permitiu comparar o crescimento de oito isolados de fungo entomopatogênico do gênero Isaria e selecionar o meio Sabouraud dextrose ágar com extrato de levedura e a temperatura de 30 °C como os mais adequados para esses isolados.
A comparação de fungos potencialmente lignocelulolítico de espécies diferentes (Pleurotus ostreatus, P. eryngii, P. pulmonarius, Agrocybe aegerita, Lentinula edodes, Volvariella volvacea e Auricularia aurícula-judae) sob efeito da composição do meio (BDA e CM) e de diferentes temperaturas de incubação foi realizada através da taxa de crescimento. Estes parâmetros foram obtidos a partir do ajuste de modelo linear utilizando-se medidas de expansão do micélio em “Race tube” (ZERKARVIS; PHILIPPOUSSIS; IOANNIDOU; DIAMANTOPOULOU, 2001).
Taxas de crescimento foram obtidas em nove diferentes estirpes de Hericium através das medidas do tempo de disseminação do micélio entre intervalos equidistantes na superfície do meio sólido BDA e de resíduos madeireiros suplementados com rejeito agroindustrial. Essas taxas foram utilizadas para avaliar o efeito da temperatura (placa de Petri) e dos rejeitos agroindustriais (Race tube) assim como para diversificar a disponibilidade de estirpes de Hericium para a produção de cogumelos (HAN; HYUK; SANG; CHANG; SEONG; WON, 2005).
Dois modelos matemáticos foram aplicados para obter as taxas de crescimento radial (mm/d) na seleção do meio de cultivo e da temperatura ótima de crescimento em três isolados fungos entomopatogênicos Nomuraea rileyi. O meio MAYP e as temperaturas de 22-26 °C foram selecionadas, e os dados da taxa de crescimento e os parâmetros termais associados aos modelos foram utilizados para comparar com outras estirpes N. rileyi caraterizadas em estudos que aplicaram o mesmo modelo (EDELSTEIN; LECUONA; TRUMPER, 2004).
O cultivo em meio solido do fungo Phellinus linteus foi utilizado para encontrar a melhor condição de cultivo para o processamento de resíduos de amido. Para aproximar os efeitos simultâneos da concentração de substrato, do pH e da temperatura sobre a taxa de crescimento do micélio foram utilizados a análise de superfície de resposta e um desenho composto central, apresentando o pH e a temperatura como fatores significativamente decisivos no crescimento do micélio, entretanto, não foi encontrada para a concentração do substrato. A
21 condição ótima de crescimento do micélio para o processamento dos resíduos de amido foi: concentração 16,5 g L-¹; pH = 6,0 e; temperatura de 29,7 ºC obtendo-se um crescimento de 6,1 ± 0,8 mm/d (SEUNGYONG; HYOKWAN; MINKYUNG; SEOKHWAN, 2008).
O polimorfismo genético verificado por RAPD e a diversidade de algumas características fisiológicas (antibioses, resistência a fungicida, ensaio de virulência e taxa de crescimento) do fungo micopatogênico Verticillium fungicola foram realizados em 07 isolados ― 03 obtidos no Estado de Veracruz (México) e 04 isolados originários da Europa Ocidental. As taxas de crescimento do micélio em meio sólido desse fungo foram consideradas como uma componente do potencial de micopatogenicidade desses isolados, auxiliando na diferenciação taxonômica desse fungo (LARGETEAU; MATA; SAVOIE, 2008).
Em Montini; Passos e da Eira (2006) realizaram a diferenciação entre estirpes de Lentinula edodes através da estimativa da taxa instantânea de crescimento de seus micélios (meio sólido) e de seu vigor (avaliação da densidade de cor na escala cinza). A primeira variável foi obtida com base nas medidas de área micelial (mm2/d). Neste estudo, foram estimadas taxas de crescimento na ordem de 800 mm2/d que foram obtidas através de ajuste de um modelo exponencial. Os autores verificaram que o isolado que teve menor taxa de crescimento demonstrava maior vigor.
22
2. OBJETIVO
2.1. Objetivos gerais
Caracterizar o crescimento dos isolados de fungos filamentosos obtidos do solo da Caatinga do Nordeste Brasileiro.
2.2 Objetivos específicos
Analisar a taxa máxima de crescimento, a produção da massa seca do micélio e a alteração do pH do meio de cultivo por isolados de fungos.
23
3. METODOLOGIA
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Síntese Orgânica e Biocatálise (Departamento de Química) do Centro das Ciências Exatas e da Natureza da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) no período de março 2012 a março 2013.
3.1. Material biológico
Isolados de várias espécies de fungos filamentosos provenientes da micoteca da RENNORFUN - Rede Norte-Nordeste de Fungos Filamentosos de Solos da Caatinga e da Amazônia – que foram obtidos dos solos da Caatinga do Estado de Pernambuco e da Paraíba foram a plataforma biológica objeto desse estudo. As culturas de fungos filamentosos foram preservadas em tubos de ensaio com meio sólido Sabouraud sob refrigeração (4 °C). Os gêneros (isolados) utilizados foram: Apophysomyces (SIS29), Aspergillus (SIS3, SIS4, SIS7, SIS8, SIS9, SIS10, SIS11, SIS13, SIS15, SIS17, SIS19, SIS20, SIS22 e SIS25), Cunninghamella (SIS38), Fennellomyces (SIS28), Lichtheimia (SIS2,SIS33 e SIS40), Mucor (SIS32), Penicillium (SIS6, SIS12, SIS21, SIS23, SIS24 e SIS27), Rhizopus (SIS30, SIS31, SIS35 e SIS39) e Syncephalastrum (SIS37) (alguns exemplos estão na figura 2).
3.2. Reativação dos isolados e condições de cultivo
Com auxílio de uma alça de platina e sob condição de câmara de fluxo laminar, amostras de micélio das culturas estoques foram repicadas para placa de Petri contendo meio Sabouraud e em seguida incubadas em estufa microbiológica a 30 °C. Após o crescimento do micélio, discos (diâmetro de 4 mm) de micélio foram retirados das bordas das colônias e transferidos para o centro de novas placas de Petri contendo 20 mL de meio Sabouraud segundo a metodologia descrita por Castillo (2012). As placas foram incubadas em estufa microbiológica a 30 °C, o crescimento foi monitorado diariamente e registrado na placa a área do micélio durante um período dependente da adaptabilidade de cada fungo ao meio de crescimento. O critério para finalização do cultivo foi a freada do crescimento do manto micelial, depois disso o fungo foi retirado e armazenado sob refrigeração (4 °C). Placas sem inoculação foram incluídas no experimento como controle. Todos os cultivos foram feitos em duplicatas. A micoteca foi avaliada em quatros experimentos independentes.
3.3. Avaliação do crescimento dos fungos
Após a finalização do período de cultivo foi realizada a digitalização dos registros das áreas do micélio com auxílio de um Scanner de imagem (HP Photosmart C3100 series). As imagens
24 foram processadas com auxílio do programa PDF-X Change Viewer - Versão 2,5, Build 203.0 (Tracker Software Products Ltd., Canada) para medir as áreas do micélio durante o crescimento dos fungos.
3.4. Avaliação da massa seca
As placas com cultura de fungos foram aquecidas a 70 °C em forno micro-onda e com auxílio de uma pinça, os micélios foram retirados do excesso do meio fundido e transferidos para uma peneira (abertura da malha de 1 mm). Os micélios foram lavados 3 vezes com água destilada aquecida entre 70 °C e 90 °C. Em seguida, os micélios foram levados para estufa com circulação de ar a 75 °C para a secagem até obter massa constante. Ao fim desse processo, os micélios secos foram transferidos para um dessecador e após o esfriamento, as massas secas foram medidas gravimetricamente.
3.5. Avaliação do pH do meio
Para determinar a variação do pH do meio ao final do cultivo, 6 mL de uma mistura do meio sólido (livre do micélio) e de água destilada (1:1, v/v) foi constituída em tubo Falcon (15 mL) e homogeneizada com auxílio de bastão de vidro. A suspenção homogenia obtida foi utilizada para estimar por potenciometria (pHmeter) o grau de acidez ou alcalinidade produzidos pelos isolados no meio Sabouraud durante o seu cultivo.
3.6. Ajuste do modelo linear e análise estatística
As medidas foram tabuladas e as taxas de crescimento estimadas utilizando-se de modelo linear (Excel Starter 2010, Microsoft Corporation, Albuquerque, New Mexico). Os dados foram analisados quanto a variância (ANOVA) com o auxílio do programa Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK). Cada experimento foi constituído de dois blocos possuindo duas repetições por bloco. O efeito da variabilidade dos fungos foi avaliada pela estatística F para o nível de significância de 5 % de probabilidade e as médias desses efeitos foram comparadas pelo teste HSD de Tukey.
25
4. RESULTADOS
Trinta e dois (32) isolados de fungos filamentosos da Caatinga do Nordeste Brasileiro foram avaliados em meio de cultivo Sabouraud, apresentando diversidade no formato do micélio (circular, irregular), crescimento superficial e subsuperficial, coloração e textura, diferenças nos tamanhos e nos tempos de cultivo (Figura 1). No início desse estudo e no decorrer da experimentação foram realizados blocos de reativação de isolados no meio de cultivo Sabouraud. Essa reativação serviu para seleção dos isolados que manifestaram pronto crescimento.
Dos 32 isolados reativados no início do experimento, 5 apresentaram crescimento para realização do primeiro repique e constituíram o experimento I (4 dias de duração). Na sequência foram efetivados os experimentos II (15 dias), III (35 dias) e IV (35 dias) que avaliaram 09 isolados de fungos filamentosos diferentes em cada experimento.
26
Os dados das áreas (cm²) foram utilizados para aproximar modelos lineares descritivos dando acesso à taxa máxima do crescimento do micélio de cada isolado (Figura 2), restrita a fase de franco crescimento (sem limitações bióticas e abióticas). Para isto é mostrada as aproximações feitas para os isolados SIS7, SIS15 e SIS30. O modelo linear permitiu, respectivamente, estimar taxas máximas de crescimento de 1,18; 16 e; 29,8 cm²/d.
Figura 1:Aspectos morfológicos dos mantos miceliais (ao final do cultivo) de alguns fungos
filamentosos isolados de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro cultivados em meio sólido Sabouraud (30 °C). A: Absidia cylindrospora SIS 36; B: Apophysomyces elegans SIS 29; C: A. elegans SIS 29; D: Aspergillus sp. SIS 11; E: Aspergillus sp. SIS 03; F:
Cunninghamella echinulata var echinulata SIS 34; G: Lichtheimia corymbifera SIS 33; H: Penicillium sp. SIS 12; I: Penicillium sp. SIS23; J: Rhizopus microsporus var chinensis SIS
31; K: R. stolonifer SIS 35 e L: R. microsporus var microsporus SIS 39.
A B D C F G H J I E L K
27
Figura 2: Dinâmica de crescimento e aspectos morfológicos do manto do micélio de fungos
filamentosos SIS7 (Aspergillus sp.), SIS15 (Aspergillus sp.) e SIS30 (Rhizopus arrhizus var. arrhizus) ― isolados de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro cultivados (30 °C) em meio sólido Sabouraud (20 mL) contido em placas de Petri (diâmetro:100 mm). Modelo: y= b*x ± a; b: taxa máxima de crescimento.
No experimento I foram avaliados cinco isolados de fungos filamentosos em relação a taxa máxima de crescimento com coeficiente de variação (CV) de 15,9 %, a medida da área
28 micelial no fim do cultivo (CV de 13,2 %), a massa seca do micélio produzida (CV de 19,15 %) e a medida do pH do meio após o cultivo (CV de 8,6 %). Neste experimento o isolado SIS38 apresentou a maior taxa de crescimento (30 cm²/d) significativamente diferente dos isolados remanescentes pelo teste HSD de Tukey (P < 0,05), estes últimos podem ser descriminados em dois grupos, o primeiro grupo composto pelos isolados SIS4 e SIS29 que apresentaram as menores taxas máximas de crescimento (< 5 cm²/d) e o segundo grupo composto pelos isolados SIS2 e SIS9 que apresentaram taxas máximas de crescimento intermediárias (20 cm²/d).
Em relação as medidas da área do micélio no fim do cultivo dos isolados de fungos filamentosos desse experimento (Figura 1B), os cincos isolados avaliados podem ser divididos em dois grupos: um grupo composto por SIS2, SIS9 e SIS38 que apresentaram extensa área do micélio (> 50 cm²) e o outro grupo de isolados SIS4 e SIS29 que apresentaram pequenas áreas do micélio (< 10 cm²).
Quanto a massa seca do micélio produzida (Figura 1C) se observou que os 5 isolados podem ser separados em dois grupos: um grupo composto por SIS2, SIS9 e SIS38 que apresenta produção de massa seca (> 0,96 g) e que não se diferenciam significativamente pelo teste HSD de Tukey, e um outro grupo composto por SIS4 e SIS29 que apresenta produção menores de massa seca (< 0,40 g). O Figura 1D mostra as medidas do pH do meio após o cultivo dos isolados, o cultivo do isolado SIS4 resultou em aumento significativo do pH para ± 7. Entretanto, os isolados SIS2, SIS29 e SIS38 tiveram ações contrárias. Estes diminuíram o pH do meio para faixa entre 5 à 3. Estas medidas de pH não diferenciaram significativamente os isolados deste último grupo pelo teste HSD de Tukey. O isolado SIS9 reduziu fortemente o pH do meio com valor abaixo de 3.
29
Figura 3: Taxa máxima de crescimento (A), Área do micélio (B), Massa seca (C) e pH do meio (D)
de culturas de fungos filamentosos (Experimento I) isolados de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro cultivados em meio sólido Sabouraud (30 °C). Isolados: SIS2 (Lichtheimia hyalospora); SIS4 (Aspergillus sp.); SIS9 (Aspergillus sp.); SIS29 (Apophysomyces sp.) e SIS 38 (Cunninghamella phaeospora). Dados médios (n = 4) classificados com a mesma letra não diferem significativamente (P < 0,05) pelo HSD de Tukey. CV é coeficiente de variação.
O Figura 02 mostra a taxa de crescimento (CV = 9,52 %), áreas miceliais (CV =3,15 %), a produção da massa seca (CV = 14,7 %) e as mudança de pH do meio (CV = 3,24 %) resultado do cultivos de nove fungos filamentosos componentes do experimento II. Quanto a taxa de crescimento o isolado SIS 30 foi significativamente superior (34 cm²/d) dos demais isolados (Figura 2A).
Nos isolados remanescentes pode se perceber três grupos de crescimento, com o primeiro grupo (SIS7 e SIS12) apresentando taxa de crescimento lento (<5 cm²/d), um segundo grupo (SIS11 e SIS15) com taxa de crescimento intermediário (10 a 15 cm²/d) e o terceiro grupo (SIS33, SIS35 SIS32 e SIS28) com elevada taxa de crescimento > 20 cm²/d.
Em relação a área micelial, três grupos foram observados: o primeiro grupo composto pelos isolados SIS15, SIS28, SIS32, SIS33 e SIS35 que apresentaram áreas do micélio extensos (≈ 60 cm²); um segundo grupo composto pelos isolados SIS11 e SIS30 com um
A B
A
D C
30 manto micelial inferior aos gerado pelos isolados SIS15 e SIS32, no entanto, não diferente significativamente de SIS28, SIS33 e SIS35 e; o terceiro grupo composto pelos isolados SIS7 e SIS12 que apresentaram as menores áreas miceliais (< 15 cm²).
A produção da massa seca mostrou que o isolado SIS30 teve o menor desempenho (<0,16g). Este desempenho não diferiu significativamente da produzida pelos isolados SIS7, SIS12 e SIS28. Estes últimos constitui um grupo com produção intermediário de massa seca próxima de 0,20 g. Os isolados SIS11, SIS15, SIS32, SIS33 e SIS35 apresentaram as melhores produções nesse experimento próximas de 0,24 g, sendo estas semelhantes (P< 0,05) as produções consideradas intermediárias observadas nos isolados SIS7, SIS12 e SIS28.
Figura 4: Taxa máxima de crescimento (A), Área do micélio (B), Massa seca (C) e pH do meio (D)
de culturas de fungos filamentosos (Experimento II) isolados de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro cultivados em meio sólido Sabouraud (30 °C). Isolados: SIS7 (Aspergillus sp.); SIS11 (Aspergillus sp.); SIS12 (Penicillium sp.); SIS15 (Aspergillus sp.); SIS28 (Fennellomyces heterothallicus); SIS30 (Rhizopus arrhizus var. arrhizus); SIS32 (Mucor prayagensis); SIS33 (Lichtheimia corymbifera) e SIS35 (Rhizopus
stolonifer). Dados médios (n = 4) classificados com a mesma letra não diferem
significativamente (P < 0,05) pelo HSD de Tukey. CV é coeficiente de variação.
A B
31
Quanto a mudança do pH do meio, 3 grupos foram aproximados (Figura 2D): um isolado que se destaca (SIS11) por aumentar significativamente o pH do meio para ± 6,9; um grupo composto pelos isolados SIS15, SIS28 e SIS32 que alteraram pouco o pH do meio (pH ± 5,5) sendo que os isolados SIS15 e SIS28 apresentarem valores de pH significativamente diferentes pelo teste HSD de Tukey. O segundo grupo composto pelos isolados SIS7, SIS12 e SIS33 apresentaram mudanças intermediárias de pH abaixo de 5. E um terceiro grupo composto pelos isolados SIS30 e SIS35 que apresentou valores de pH abaixo de 4.
Figura 5:Taxa máxima de crescimento (A), Área do micélio (B), Massa seca (C) e pH do meio (D) de culturas de fungos filamentosos (Experimento III) isolados de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro (Projeto RENNORFUN) cultivados em meio sólido Sabouraud (30 °C). Isolados: Isolados: SIS6 (Penicillium sp.); SIS10 (Aspergillus sp.); SIS13 (Aspergillus sp.); SIS17 (Aspergillus sp.); SIS19 (Aspergillus sp.); SIS20 (Aspergillus sp.); SIS22 (Aspergillus sp.); SIS23 (Penicillium sp.) e SIS25 (Aspergillus sp.). Dados médios (n = 4) classificados com a mesma letra não diferem significativamente (P < 0,05) pelo HSD de Tukey. CV é coeficiente de variação.
A B
32
O Figura 3 apresenta a taxa de crescimento (CV de 24,4 %), áreas do micélio produzidas (CV de 22,3 %), a produção de massa seca (CV de 33,8%) e as alterações do pH do meio (CV de 9,5 %) dos isolados de fungos filamentosos componentes do experimento III. No geral, nesse experimento, os isolados avaliados mostraram baixas taxas de crescimento (< 5 cm²/d) sendo que os isolados SIS20 e SIS25 foram as exceções. Estes se destacaram apresentando taxas de crescimento > 7 cm²/d. O resto dos isolados SIS6, SIS10, SIS13, SIS17, SIS22 e SIS23 apresentaram taxas de crescimento baixo (< 5 cm²/d).
O resultado da produção da área do micélio (Figura 3B) permite visualizar 3 grupos de isolados de fungos filamentosos: o primeiro grupo composto por SIS19, SIS20, SIS22, SIS23 e SIS25 que apresentam área do micélio > 40 cm²; o segundo grupo composto por SIS13 e SIS17 que apresentam áreas do micélio com ± 15 cm², sendo que o isolado SIS17 não se diferenciou significativamente dos isolados SIS6 e SIS10. Estes últimos apresentaram as menores áreas do micélio do experimento (< 10 cm²), mas não diferentes significativamente do terceiro grupo. As produções de massa seca dos fungos avaliados, mostram que 6 dos 9 isolados (SIS6, SIS19, SIS20, SIS22, SIS23 e SIS25) apresentaram produção de massa seca > 0,16 g — Figura 3C. Entre estes últimos isolados, 4 isolados (SIS6, SIS19, SIS22 e SIS23) apresentaram produção de massa seca intermediária e não se diferenciaram significativamente do isolado SIS13 cuja produção de massa seca foi de ± 0,11 g. Os isolados SIS10 e SIS17 apresentaram as produções significativamente menores de massa seca, porém, a produção do isolado SIS10 não se diferenciou significativamente da observada no isolado SIS13, que foi superior a produção do isolado SIS17.
As alterações do pH do meio (Figura 3D) sugere que estes isolados podem ser divididos em; um grupo (SIS17, SIS19, SIS20, SIS22 e SIS23) que induziu um aumento do pH acima de 6,3; o isolado SIS13 que aparenta não alterar o valor do pH do meio (≈ 5,5) e que não diferiu significativamente dos outros isolados pelo teste HSD de Tukey; e um segundo grupo composto por SIS6, SIS10 e SIS25 que diminuiu significativamente o pH do meio (pH < 4,8).
No experimento IV, a avaliação da taxa de crescimento (CV de 30,61 %), da área do micélio (CV de 24,4 %), da produção da massa seca (CV de 108 %) e da modificação do pH
33 do meio (CV de 8,4 %) do conjunto de isolados de fungos são apresentadas no Figura 4. Os comportamentos da taxa de crescimento dos isolados estão distribuídos em três grupos: um
Figura 6:Taxa máxima de crescimento (A), Área do micélio (B), Massa seca (C) e pH do meio (D) de culturas de fungos filamentosos (Experimento IV) isolados de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro cultivados em meio sólido Sabouraud (30 °C). Isolados: Isolados: SIS3 (Aspergillus sp.); SIS8 (Aspergillus sp.); SIS21 (Penicillium sp.); SIS24(Penicillium sp.); SIS27 (Penicillium sp.); SIS31 (Rhizopus arrhizus var. arrhizus) ; SIS37 (Syncephalastrum racemosum); SIS39 (R. microsporus var. microsporus) e SIS40 (Lichtheimia blakesleeana). Dados médios (n = 4) classificados com a mesma letra não diferem significativamente (P < 0,05) pelo HSD de Tukey. CV é coeficiente de variação.
desses grupos é composto pelos isolados SIS31, SIS37, SIS39 e SIS40 que apresentaram taxas de crescimento (> 20 cm²/d), estes não se diferenciaram pelo teste HSD de Tukey. Com o isolado SIS40 não apresentando diferença significativa com o isolado SIS3, podendo ambos serem considerados como um segundo grupo com dinâmica de crescimento intermediário (± 17 cm²). Um último grupo de isolados (SIS8, SIS21, SIS24 e SIS27) apresenta taxas de crescimento < 5 cm²/d, estes isolados não se diferenciaram estatisticamente pelo teste HSD de Tukey.
D
A B
34 Na Figura 4B, a avaliação da área do micélio apresentou um grupo predominante de fungos filamentosos (SIS3, SIS8, SIS21, SIS27, SIS31, SIS37, SIS39 e SIS40), estes apresentaram áreas do micélio > 40 cm² e que não se diferenciaram significativamente pelo teste HSD de Tukey. O isolado SIS24 foi o único isolado que teve área do micélio < 10 cm² e que se diferenciou significativamente dos demais isolados.
Quanto a “massa seca produzida” não foi detectada diferença significativa na dependência dos isolados de fungos sob avaliação (Figura 4C) pela estatística F (P<0,05).
Para as modificações do pH do meio (Figura 4D) os isolados podem ser divididos em: um isolado (SIS39) que alcalinizou fortemente o meio (pH >7,1); um isolado (SIS3) que acidificou o fortemente o meio (pH < 3,9); um grupo de isolados (SIS8, SIS21, SIS27, e SIS39) que apresentou valores de pH do meio próximo de 7 e; outro grupo de isolados (SIS31 e SIS37) que apresentou valores de pH entre 5,8 a 6,3. Este último grupo não se diferenciou significativamente quanto a mudança do pH do meio da maioria dos isolados do grupo precedente (SIS8, SIS21 e SIS27). Vale ressaltar que os isolados SIS24 e SIS40 não diferiram significativamente quanto a modificação do pH do meio (pH: 4,8-5,3) em comparação aos isolados SIS31 e SIS37.
Para a primeira análise geral (Figura 5A) pode-se verificar que os isolados analisados mostraram uma taxa máxima de crescimento média de 12 cm2/d e um pH do meio de cultivo de 5,3. Observa-se que existem fungos com baixa e alta taxa máxima de crescimentos que acidificam o meio (pH < 4) assim como também, existem fungos que alcalinizam o meio com dinâmicas de crescimentos altas ou baixas. A dispersão destes dados mostra que os fungos se distribuem nos quatros quadrantes definidos pelas médias de TMC e pH. Quanto as área de micélio produzidas, o padrão de dispersão dos fungos indicam maior números de fungos com áreas micélio maior que 40 cm², uns alcalinizando e outros acidificando o meio de crescimento (Figura 5B).
Quanto a dispersões dos isolados associadas a produção de massa seca e tempo de crescimento observa-se um padrão semelhante (Figura 5C e D). A maioria dos isolados da micoteca concentra-se por terem mostrado produções de micélio seco abaixo de 0,35 g e tempo de cultivo de 12 dias. Este grupo mostra uma ampla dispersão quanto a mudança de pH do meio. Vale ressaltar que muitos dos isolados que se encontram próximos quanto a relação
35 “produção de massa seca de micélio e mudança de pH” podem estar distantes quando compara-se com a relação “tempo de cultivo e mudança de pH”.
Figura 7: Relações da taxa máxima de crescimento (A), área do micélio (B), produção de massa
seca (C) e tempo de cultivo (D) com pH do meio final nas culturas de fungos filamentosos isolados de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro cultivados em meio sólido Sabouraud (30 °C). Dados médios (n = 4) de 32 isolados pertencentes a vários gêneros. Linhas horizontal e vertical são médias gerais para os 32 isolados.
Esta diferenciação permite inferir categorias a partir do modelo de comportamento desta micoteca quanto a produção de massa seca, taxa de crescimento, área de micélio, mudança de
A
D C
36 pH do meio e tempo de cultivo. Para isto a amplitude das variações desses desempenhos foram divididas em quatro categorias como: a) Taxa máxima de crescimento ― lento (< 9 cm²/d), moderadamente lento (≥ 9 à < 18 cm²/d), moderadamente rápido (≥18 à < 27 cm²/d) e, rápido (> 27 cm²/d); b) Área de micélio: ― pequena (< 15 cm²), moderadamente pequena (≥ 15 à < 30 cm²), moderadamente grande (≥ 30 à < 45 cm²) e, grande (> 45 cm²); c) Massa seca ― baixa (< 0,4 g), moderadamente baixa (≥ 0,4 g à < 0,8 g), moderadamente grande (≥ 0,8 g à < 1,2 g) e, grande (> 1,2 g); d) Mudança do pH do meio ― acidificando intensamente (pH < 3,5), acidificando moderadamente (pH ≥ 3,5 à pH < 5,0), alcalinizando moderadamente (pH ≥ 5,0 à pH < 6,5) e, alcalinizando (pH > 6,5), e) Tempo de cultivo ― cessaram de crescer na primeira semana de cultivo; cessaram de crescer entre a primeira e segunda semana de cultivo; cessaram de crescer entre a segunda e a terceira semana de cultivo; e cessaram de crescer após da quarta semana de cultivo.
Seguindo essas categorizações desses quatros aspectos da coleção de fungos filamentosos os isolados foram classificados em cinco grupos (Tabela 01):
1. Grupo I (03 espécies): 10 isolados que mostraram crescimento lento, cessaram de crescer entre uma a três semanas, acidificaram moderadamente o meio e, desenvolveram colônias pequenas à moderadamente pequenas com baixa produção de massa seca.
2. Grupo II (02 espécies): 6 isolados com crescimento lento, cessaram de crescer na maioria em três a quatros semanas de cultivo, acidificaram pouco o meio e desenvolveram colônias moderadamente grande à grande com baixa produção de massa seca;
3. Grupo III (01 espécie): 4 isolados com crescimento moderadamente lento, cessaram de crescer na primeira semana de cultivo, alterando de modo amplo o pH do meio (moderadamente ácido à levemente alcalino) e desenvolvendo colônias moderadamente grande à grande com baixa massa seca;
4. Grupo IV (05 espécies): 6 isolados com crescimento moderadamente rápido, cessaram de crescer na primeira semana de cultivo, acidificaram muito o meio e, desenvolveram colônias moderadamente grande à grande com ampla produção de massa seca;
5. Grupo V (04 espécies): 6 isolados com crescimento rápido, cessaram de crescer na primeira semana de cultivo, alteraram de modo amplo o pH do meio (intensa acidificação à levemente alcalino) e desenvolveram colônias grandes com ampla produção de massa seca.
37
Tabela 1.
Grupos de isolados de fungos obtidos de acordo com a taxa máxima de crescimento e área do micélio em meio sólido Sabouraud a 30 °C. Fungos Isolados a partir de solos da caatinga do Nordeste Brasileiro.Grupos Isolados Espécies Envolvidas Comportamento das Culturas
I
¹SIS4, ²SIS6, ¹SIS7, ¹SIS10,
²SIS12, ¹SIS13, ¹SIS17, ²SIS21, ²SIS24, 5SIS29
Penicillium sp., Apophysomyces elegans, Aspergillus sp.,
Crescimento lento (< 9 cm2/d), desenvolvendo pequenas (<15 cm2) a moderadamente pequenas (15-30 cm2) colônias que cessaram de crescer, na maioria, em uma a duas semanas de cultivo e poucas além da terceira semana. Os isolados mostraram baixa produção de massa seca micelial (< 0,4 g), na maioria, acidificando (pH 5,0 a 3,5) ou acidificando pouco (pH 6,5 a 5,0) o meio Sabouraud. Um isolado alcalinizo pouco (pH 6,5 a 8,0) o meio.
II
¹SIS8, ¹SIS19, ¹SIS22, ²SIS23, ¹SIS25, ²SIS27Penicillium sp. e Aspergillus sp. Crescimento lento, desenvolvendo moderadamente grandes (30 a 45 cm2) e grandes (> 45
cm2) colônias que cessaram de crescer, na maioria, em três a quatro semanas de cultivo. Os isolados mostraram baixa produção de massa seca micelial a maioria, acidificando pouco ou alcalinizando levemente (pH 6,5 a 8,0) o meio Sabouraud.
III
¹SIS3, ¹SIS11, ¹SIS15, ¹SIS20 Aspergillus sp. Crescimento moderadamente lento (9 a 18 cm2/d), desenvolvendo moderadamente grandes a grandes colônias que cessaram de crescer na primeira semana de cultivo. Os isolados mostraram baixa produção de massa seca micelial, acidificando ou alcalinizando levemente o meio Sabouraud.IV
4SIS 2, ¹SIS 9, 6SIS 28, 8SIS 32, ³SIS 35, 4SIS 40Lichtheimia blakesleeana, L. hyalospora, Rhizopus stolonifer, Fennellomyces heterothallicus, Mucor prayagensis, Aspergillus sp.
Crescimento moderadamente rápido (18 a 27 cm2/d), desenvolvendo moderadamente grandes a grandes colônias que cessaram de crescer na primeira semana de cultivo. Os isolados mostraram baixa, moderada-baixa (0,4 a 0,8 g) e grande (> 1,2 g) produção de massa seca micelial, acidificando intensamente (pH< 3,5) ou acidificando o meio Sabouraud.
V
³SIS30, ³SIS31, 4SIS33, 9SIS37,7
SIS38, ³SIS39
Rhizopus arrhizus var. arrhizus, R. microsporus var. chinensis, R.microsporus var. microsporus, Lichtheimia corymbifera, Syncephalastrum racemosum, Cunninghamella phaeospora
Crescimento rápido (> 27 cm2/d), desenvolvendo grandes colônias que cessaram de crescer na primeira semana de cultivo. Os isolados mostrara baixa, moderada-baixa e alta (0,8 a 1,2 g) produção de massa seca micelial, acidificando intensamente, acidificando pouco ou alcalinizando levemente (pH 6,5 a 8,0) o meio Sabouraud.
38
5. DISCUSSÃO
Durante o experimento, certos isolados de fungos se destacaram pelo comportamento das variáveis analisadas (taxa máxima de crescimento, área do micélio alcançada ao final do cultivo, modificação do pH do meio e tempo de cultivo) quando cultivados em meio sólido Sabouraud. Notadamente, 50 % dos isolados analisados neste estudo tiveram taxas de crescimento abaixo de 9 cm²/d.
Em este estudo, o isolado SIS4, fungo pertencente ao gênero Aspergillus, que alcalinizou o meio por elevar o pH para 7,1, podendo indicar que este isolado estaria envolvido em atividades de degradação, como indica a descrição de Pelczar (1980), e excreção de metabólitos de natureza básica. Os fungos SIS8, SIS19, SIS22, SIS23 e SIS25 apresentaram grande área do micélio, mas a extensão dessa área do micélio não se traduziu em aumento da massa seca, o que poderia indicar que esses fungos cresceram de maneira superficial, expandindo-se na placa e mantendo pouco contato com o meio, apresentando pela maioria pH acima de 6.
Os fungos SIS2 e SIS9, respectivamente dos gêneros Lichtheimia e Aspergillus apresentaram um aumento significativo na extensão da área do micélio, com grande produção de massa seca durante o experimento e intensa acidificação do meio. Isto pode indicar a ocorrência de uma maior atividade metabólica no meio de cultivo Sabouraud com produção de excreções de natureza ácida desses isolados. Outros isolados que apresentam acidificação do meio foram SIS3 (Aspergillus) e SIS30 (Rhizopus) com produção de massa seca inferior aos dos SIS2 e SIS9. Podendo indicar nesta tendência fisiológica que correlaciona negativamente a acidificação do meio com produção de massa seca.
Para nossas observações dentro dos gêneros, o gênero Aspergillus com 14 isolados apresentou, neste estudo, uma ampla distribuição em 4 diferentes grupos destacando a diversidade desse gênero na micoteca analisada quanto aos parâmetros estudados. Neste podemos verificar 5 isolados no primeiro grupo (SIS4, SIS7, SIS10, SIS13 e SIS17), 4 isolados no segundo grupo (SIS8, SIS19, SIS22 e SIS25), 4 isolados no terceiro grupo (SIS3, SIS11, SIS15 e SIS20) e um isolado no quarto grupo (SIS9).
O gênero Penicillium com 6 isolados apresentou uma distribuição mais restrita apenas nos dois primeiros grupos com crescimento lento, o primeiro grupo composto pelos isolados
39 (SIS6, SIS12, SIS21 e SIS24) e o segundo grupo composto pelos isolados (SIS23 e SIS27) demostrando que esses grupos apresenta uniformidade com dinâmica de crescimento lento no meio de cultivo Sabouraud. O gênero Apophysomyces apresentou um isolado (SIS29) com dinâmica de crescimento lento.
O gênero Rhizopus com 4 isolados verificou uma segregação para o grupo 5 com dinâmica de crescimento rápido (SIS30, SIS31, SIS35 e SIS39), aspecto que está de acordo com o descrito para esse gênero por Webster e Weber (2007). Essa dinâmica de crescimento indica que a composição do meio Sabouraud é nutricionalmente mais adequada para a amostra deste gênero contemplado nesta experimentação. Vale ressaltar que o isolado SIS30 manifestou a maior taxa máxima de crescimento (34 cm²/d) nesta população analisada. Montini; Passo e Eira (2006) diferenciaram isolado de Lentinula edodes através da taxa de crescimento dos seus micélios, informando estimativa máxima de 8 cm²/d. Ainda neste grupo de Rhizopus analisado, foi observado a produção de micélios cotonosos como indicado por Pelczar (1980). O gênero Lichtheimia com três isolados apresentou distribuição em dois grupos com dinâmica de crescimento moderadamente rápido (SIS2 e SIS40) e rápido (SIS33) em acordo com o informado em HOFFMANN (2009).
Os gêneros Fennellomyces (SIS28) e Mucor (SIS32) e, os gêneros Syncephalastrum (SIS37) e Cunninghamella (SIS38), com apenas um representante, apresentaram dinâmicas de crescimento moderadamente rápido e rápido, respectivamente. Para Mucor e Syncephalastrum a produção de micélio aéreo grosseiro e o rápido crescimento foram observados em Webster e Weber (2007).
A análise da biodiversidade nas culturas de fungos filamentosos neste estudo permite uma primeira aproximação quanto a diferenciação dos isolados pertencentes a uma espécie, indicando ainda que o crescimento em meio sólido Sabouraud é fortemente depende do isolado. Vale ressaltar a importância prática deste estudo que viabilizam empreendimento de novos estudos de cunho biotecnológico a partir de fungos de mesmo gênero ou gêneros diferentes com similaridades culturais e fisiológicas.
40
6. CONCLUSÃO
O experimento sobre a caracterização de isolados de fungos filamentosos da Caatinga do Nordeste Brasileiro demonstrou a existência de uma grande variabilidade intra e interespecífica em relação ao comportamento das culturas em meio sólido de Sabouraud, sendo fortemente dependente do isolado. O que resultou na formação cinco grupos determinados principalmente pela taxa máxima de crescimento e a área do micélio. Percebem-se algumas relações que apontam para tendências de crescimento Percebem-semelhantes e discrepantes que podem ser importantes para empreendimentos biotecnológicos.
