UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE MEDICINA DA BAHIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ESTUDO DO POLIMORFISMO EM GENES DA RESPOSTA IMUNE E ASSOCIAÇÃO COM MANIFESTAÇÃO CLÍNICA, CARGA PROVIRAL E PRODUÇÃO DE CITOCINAS NA INFECÇÃO PELO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS TIPO 1 (HTLV-1).
MARCOS BRAZ
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
SALVADOR, BA 2017
III
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE MEDICINA DA BAHIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ESTUDO DO POLIMORFISMO EM GENES DA RESPOSTA IMUNE E ASSOCIAÇÃO COM MANIFESTAÇÃO CLÍNICA, CARGA PROVIRAL E PRODUÇÃO DE CITOCINAS NA INFECÇÃO PELO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS TIPO 1 (HTLV-1).
MARCOS BRAZ
Professor Orientador: Dra. Léa Cristina de Carvalho Castellucci Professor Co-orientador: Dra. Silvane Maria Braga Santos
SALVADOR, BA 2017
Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, da Faculdade de Medicina da Bahia, Universidade Federal da Bahia, como pré-requisito obrigatório para obtenção do título de Mestre em Ciências, da área de concentração em Ciências da Saúde.
IV COMISSÃO EXAMINADORA
Membros Titulares
Milton Ozório Moraes - possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (1992), mestrado em Ciências Biológicas (Biofísica) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (1996) e doutorado em Biologia Celular e Molecular pela Fundação Oswaldo Cruz (2000) e um curto Pós-doutorado (3 mêses em 2001) no Leiden Medical Centre na Holanda. Atualmente é pesquisador titular da Fundação Oswaldo Cruz e professor adjunto da Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
Maria Fernanda Rios Grassi - Possui graduação em Medicina pela Universidade Federal da Bahia (1989), mestrado na Universite de Paris VII (1993) e doutorado em Imunologia - Universite de Paris VII (1998). Pós-doutorado na Fundação Oswaldo Cruz (2000-2002). É pesquisadora Titular da Fundação Osvaldo Cruz e Professora Adjunto da Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública desde 2000.
Natália Barbosa Carvalho - Possui graduação em Ciências Biológicas pela Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais (2004), mestrado em Bioquímica e Imunologia (2007) e doutorado em Imunologia (2011), ambos pela Universidade Federal de Minas Gerais, com período de doutorado sanduíche no Instituto de Biologia Molecular e Celular da Universidade do Porto, Portugal (2009). Desde 2011 realiza pós-doutorado no Serviço de Imunologia do Hospital Universitário da Universidade Federal da Bahia.
Membro Suplente
Léa Cristina de Carvalho Castellucci - Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual de Feira de Santana (1997), Mestrado (2000) e Doutorado (2005) em Imunologia, com ênfase em Imunogenética, pela Universidade Federal da Bahia. Possui Pós-doutorado em Genética de Doenças Infecciosas pela Universidade de Cambridge, Inglaterra (2005-2007). Atualmente é pesquisador associado do Serviço de Imunologia da Universidade Federal da Bahia, Bióloga da Universidade Federal da Bahia e Professora do Curso de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia.
V INSTITUIÇÕES PARTICIPANTES
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
Complexo Hospitalar Universitário Professor Edgard Santos (Com-HUPES). o Serviço de Imunologia
VI EQUIPE
Profª Dra. Léa Cristina de Carvalho Castellucci – Chefa coordenadora da equipe.
Joyce Moura Oliveira – Doutora pelo Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Faculdade de Medicina da Bahia – Universidade Federal da Bahia.
Jamile Leão – Doutoranda pelo Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Faculdade de Medicina da Bahia – Universidade Federal da Bahia.
Lucas Frederico – Doutor pelo Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Faculdade de Medicina da Bahia – Universidade Federal da Bahia.
Tainã Souza Lago – Mestranda pelo Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Faculdade de Medicina da Bahia – Universidade Federal da Bahia.
Anadilto da Hora – Mestrando pelo Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Faculdade de Medicina da Bahia – Universidade Federal da Bahia.
VII FONTE DE FINANCIAMENTO
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Doenças Tropicais (INCT-DT) (INCT-DT – 573839/2008-5).
VIII
“A ciência humana de maneira nenhuma nega a existência de DEUS. Quando
considero quantas e quão maravilhosas coisas o homem compreende, pesquisa e
consegue realizar, então reconheço claramente que o espírito humani é obra de
DEUS, e a mais notável.”
Galileu Galilei
IX
Dedicatória
Em primeiro lugar, dedico a realização desse trabalho a Deus por sua presença
constante e real em minha vida. “Ora, a fé é a certeza daquilo que esperamos e
a prova das coisas que não vemos (Hebreus 11:1)”, ”Estejam vigilantes,
mantenham-se firmes na fé, sejam homens de coragem, sejam fortes (1
Conríntios 16:13)”, “Pois vocês sabem que a prova da sua fé produz
perseverança (Tiago 1:3)”, “Vocês sabem, lá no fundo do coração e da alma,
que nenhuma das boas promessas que o Senhor, o seu Deus, fez deixou de
cumprir-se. Todas se cumpriram, nenhuma falhou (Josué 23:14).”
A ele toda honra e glória!
Aqueles que souberam ser muito mais que pais, Helena Nunes e João Rocha,
meus alicerces, meus porto seguro, minhas fortalezas e as minhas razões de
viver.
As minhas irmãs e familiares com quem pude partilhar meus medos, tristezas,
alegrias, conquistas e incentivo para seguir em frente.
Ao meu companheiro Flávio Valécio, pela compreensão e incentivo durante
essa fase inesquecível.
A minha orientadora Léa Castellucci, por sua forma ímpar de orientar, por
sempre me nortear pelos os caminhos a serem trilhados, pela grande
profissional que és e em quem eu me espelho.
A minha co-orientadora Silvane Braga, que com sua forma de se dedicar a
ciência fez com que eu me apaixonasse ainda mais pela pesquisa e por sempre
me ensinar me mostrado o quão eu sou capaz.
E às pessoas que sempre estiveram ao meu lado me acompanhando e apoiando,
fazendo parte da minha vida e deste trabalho.
X AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Edgar Marcelino de Carvalho, por ser um exemplo de profissional, humano e humilde, por sua paixão inspiradora que sempre mostrou nas suas atividades de pesquisador, professor e médico, pela oportunidade oferecida para a realização desse trabalho e disponibilidade em atividades desenvolvidas no seu laboratório.
Aos colegas e companheiros (as) do grupo da Imunogenética, de forma especial a Joyce Oliveira, Jamile Leão Rêgo, Lucas Almeida e Tainã Lago, pela amizade, momentos de descontração, incentivo, apoio técnico e científico durante a realização das etapas deste trabalho e oportunidades de construção do conhecimento.
A Dra. Andrea Magalhães, pelos seus conselhos, momentos de descontração e acima de tudo por sua amizade ao longo desses anos de pesquisa.
A equipe do Ambulatório de HTLV situado no Ambulatório Magalhães Neto do Complexo Hospitalar Universitário Professor Edgard Santos, da Universidade Federal da Bahia (Com-HUPES-UFBA) pelo suporte durante a etapa de coleta, principalmente em relação à sensibilização dos pacientes.
Aos doadores de sangue voluntários, recrutados na Fundação de Hematologia e Hemoterapia da Bahia (HEMOBA), por colaborarem de forma tão generosa com o nosso estudo.
Ao grupo de pesquisa do SIM – Serviço de Imunologia do HUPES, por terem proporcionado as condições técnicas necessárias e auxiliado na realização das análises laboratoriais, meus agradecimentos.
Ao Laboratório de HTLV-1 (Dra. Natália, Dra. Glória e Ms. Camila) por me ensinarem, por me acompanharem e por tirarem as minhas dúvidas sempre com muita paciência e dedicação.
À Dra. Léa e Dra. Silvane, minha orientadora e co-orientadora, por ter me acompanhado desde o início e me orientado durante todo o desenvolvimento do projeto. Obrigado pela oportunidade.
Ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, a todos os professores, colegas e àqueles que de maneira direta ou indiretamente contribuíram para que esse estudo fosse realizado
11
Sumário
LISTA DE FIGURAS ... 13
LISTA DE TABELAS ... 14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... 15
RESUMO ... 17
ABSTRACT ... 18
1. INTRODUÇÃO ... 19
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 21
2.1 ASPECTOS GERAIS E EPIDEMIOLOGIA DO HTLV-1 ... 21
2.2 O VÍRUS ... 25
2.3 DOENÇAS ASSOCIADAS AO HTLV-1 ... 27
2.3.1 LEUCEMIA DAS CÉLULAS T DO ADULTO (ATL) ... 27
2.3.2 MIELOPATIA ASSOCIADA AO HTLV/PARAPARESIA ESPÁSTICA TROPICAL (HAM/TSP) ... 28
2.3.3 BEXIGA HIPERATIVA ASSOCIADA AO HTLV-1 ... 29
2.4 ASPECTOS IMUNOLÓGICOS ... 30
2.5 FATORES ENVOLVIDOS NA PATOGÊNESE DA HAM/TSP ... 32
2.6 ASPECTOS GENÉTICOS DO HOSPEDEIRO NA INFECÇÃO PELO HTLV-1... 34
2.6.1 ESTUDOS GENÉTICOS COM A INTERLEUCINA 10 (IL-10) ... 36
2.6.2 ESTUDOS GENÉTICOS EM GENES DO MHC DE CLASSE III – TNF, LTA E BAT1 - E A INFECÇÃO PELO HTLV-1. ... 37
3. OBJETIVOS ... 39
3.1 GERAL ... 39
3.1 ESPECÍFICOS... 39
4. METODOLOGIA ... 40
12
4.2. EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPAGEM ... 41
4.3. CULTURA DE CÉLULAS E DOSAGEM DE CITOCINAS ... 43
4.4 DETERMINAÇÃO DA CARGA PROVIRAL ... 44
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 44
5. RESULTADOS ... 46
5.1 RESULTADOS DO OBJETIVO I: Avaliar se os polimorfismos nos genes IL-10, TNF, LTA e BAT1 estão associados com as diferentes manifestações clínicas da infecção pelo HTLV-1 (portador assintomático, bexiga hiperativa e HAM/TSP). ... 46
5.1.1 ASSOCIAÇÃO ENTRE OS POLIMORFISMOS NO GENE DE IL10 E O HTLV-1. ... 46
5.1.2 ASSOCIAÇÃO ENTRE O POLIMORFISMO EM GENES DO MHC DE CLASSE III: (TNF, LTA E BAT1) E O HTLV-1. ... 52
5.2 RESULTADOS DO OBJETIVO II: Verificar a associação entre os genótipos de polimorfismos dos genes de IL-10 e TNF, com carga proviral nos diferentes grupos de indivíduos infectados pelo HTLV-1. ... 62
5.3 RESULTADOS DO OBJETIVO III: Verificar a associação entre os genótipos de polimorfismos dos genes de IL-10 e TNF com a produção espontânea de citocinas de IL-10 e TNF. ... 65
6. DISCUSSÃO ... 69
7. CONCLUSÕES ... 74
13 LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Áreas endêmicas para o HTLV-1 no Brasil e no mundo (adaptado de Gessain & Cassar, 2012). p. 23.
Figura 2. Prevalência de HTLV no Brasil. p. 24.
Figura 3. Estrutura do HTLV-1 (Adaptado de www.htlv.com.br). p. 25.
Figura 4. Organização genômica do HTLV. p. 26.
Figura 5. Resultado da genotipagem de uma placa do SNP rs1800896 (-1082 T/C) no gene IL10. p. 43.
FIGURA 6. Padrão do desequilíbrio de ligação entre os marcadores do MHC de classe III:
BAT1, LTA e TNF, avaliados no estudo. p. 61.
FIGURA 7. Associação entre carga proviral e as formas clínicas e entre os genótipos dos marcadores de IL-10 e TNF. p. 62.
FIGURA 8. Associação entre a produção espontânea de citocinas e as formas clínicas e entre
14 LISTA DE TABELAS
Tabela 1. SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) genotipados neste estudo. p. 42.
Tabela 2. Caracterização dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 de acordo com a idade e gênero. p. 46.
TABELA 3. Distribuição das frequências alélicas e genotípicas observadas para o polimorfismo rs1800896 no gene IL10. p. 47.
TABELA 4. Associação entre o polimorfismo -1082 C/T no gene de IL10 (rs1800896) e a infecção pelo HTLV-1. p. 48.
TABELA 5. Distribuição das frequências alélicas e genotípicas observadas para o polimorfismo rs1800871 no gene IL10. p. 49.
TABELA 6. Comparação entre o polimorfismo no gene de IL10 rs1800871 A/G e a infecção pelo HTLV-1: casos vs. controles. p. 50.
TABELA 7. Distribuição das frequências alélicas e genotípicas observadas para o polimorfismo rs3024496 no gene IL10. p. 51.
TABELA 8. Comparação entre o polimorfismo no gene de IL10 rs3024496 A/G e a infecção pelo HTLV-1: casos vs. controles. p. 52.
TABELA 9. Distribuição das frequências alélicas e genotípicas observadas para o polimorfismo rs1800629 no gene TNF. p. 53.
TABELA 10. Comparação entre o polimorfismo no gene de TNF rs1800629 A/G e a infecção pelo HTLV-1: casos vs. controles. p. 54.
TABELA 11. Distribuição das frequências alélicas e genotípicas observadas para o polimorfismo rs1799964 no gene TNF. p. 55.
TABELA 12. Comparação entre o polimorfismo no gene de TNFA rs1799964 C/T e a infecção pelo HTLV-1: casos vs. controles. p. 56.
TABELA 13. Distribuição das frequências alélicas e genotípicas observadas para o polimorfismo rs1800683 no gene LTA. p. 56.
TABELA 14. Comparação entre o polimorfismo no gene de LTA rs1800683 A/G e a infecção pelo HTLV-1: casos vs. controles. p. 57.
TABELA 15. Distribuição das frequências alélicas e genotípicas observadas para o polimorfismo rs909253 no gene LTA. p. 58.
TABELA 16. Comparação entre o polimorfismo no gene de LTA rs909253 A/G e a infecção pelo HTLV-1: casos vs. controles. p. 59.
TABELA 17. Distribuição das frequências alélicas e genotípicas observadas para o polimorfismo rs1799964 no gene BAT1. p. 59.
TABELA 18. Comparação entre o polimorfismo no gene de BAT1 rs2239527 C/G e a hanseníase: casos vs. controles. p. 60.
15 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Humana. ATL – Leucemia de células T do adulto.
BHE - Barreira Hematoencefálica.
CD4+ - Marcador para Linfócito T CD4+ / Linfócito T auxiliar.
CD8+ (LTC) - Marcador para Linfócito T CD8+ / Linfócito citotóxico. CI - Confidence Interval (intervalo de confiança).
CMSP - Células mononucleares do sangue periférico. DNA – Ácido Desoxirribonucléico.
DNAc - Ácido Desoxirribonucléico complementar. Global 1df - Valor de p a 1 grau de liberdade. Global 2df - Valor de p a 2 graus de liberdade.
GM-CSF - Fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos.
HAM/TSP - Paraparesia Espática Tropical/Mielopatia Associada ao HTLV-1. HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana.
HLA – Antígeno Leucocitário Humano.
HTLV-1 - Vírus linfotrópico de células T humana tipo 1. HTLV-2 - Vírus linfotrópico de células T humana tipo 2. HTLV-3 - Vírus linfotrópico de células T humana tipo 3. HTLV-4 - Vírus linfotrópico de células T humana tipo 4. HWE - Equilíbrio de Hardy Weinberg.
IFN- – Interferon gama. IL-1 – Interleucina 1. IL-10 – Interleucina 10. IL-15 – Interleucina 15. IL-1β - Interleucina 1 BETA. IL-2 – Interleucina 2.
16 IL-2R – Receptor de Interleucina 2.
IL-5 – Interleucina 5. IL-6 – Interleucina 6. LTA – Linfotoxina.
MHC – Complexo Principal de Histocompatibilidade. NK - Células natural killer.
OMS – Organização Mundial de Saúde. OR - Odds ratio (razão de possibilidades). PCR - Reação da polimerase em cadeia. PCR - Reação da polimerase em cadeia. pg/ml - Picogramas por mililitro.
RNA – Ácido Ribonucléico.
RNAm - Ácido Ribonucléico mensageiro. SNC – Sistema Nervoso Central.
SNPs - Single Nucleotide Polymorphism/Polimorfismo de Nucleotídeo único. Th1 - Linfócitos T auxiliar tipo 1.
Th2 - Linfócitos T auxiliar tipo 2. TNF – Fator de Necrose Tumoral.
17 RESUMO
Braz, M. ESTUDO DO POLIMORFISMO EM GENES DA RESPOSTA IMUNE E ASSOCIAÇÃO COM MANIFESTAÇÃO CLÍNICA, CARGA PROVIRAL E PRODUÇÃO DE CITOCINAS NA INFECÇÃO PELO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS TIPO 1 (HTLV-1). Salvador, 2017. Dissertação (Mestrado, Programa de pós-graduação em Ciências da Saúde) – Faculdade de Medicina da Bahia – Universidade Federal da Bahia. O vírus linfotrópico para células T humanas (HTLV-1) é o principal agente causador da Paraparesia Espástica Tropical/Mielopatia associada ao HTLV-1 (HAM/TSP) e da Leucemia da célula T do Adulto (LTA). A maioria dos indivíduos infectados permanece assintomática, somente 2 a 5% irão desenvolver uma das duas doenças. Existem poucos estudos na literatura avaliando o papel de genes do hospedeiro nesta infecção. Nosso objetivo foi investigar a possível associação do polimorfismo em genes da resposta imune e associação com manifestações clínicas, carga proviral e produção espontânea de citocinas na infecção pelo HTLV-1. Participou deste estudo um total de 298 indivíduos infectados pelo HTLV-1, sendo 164 indivíduos assintomáticos, 63 indivíduos com bexiga hiperativa e 71 pacientes com HAM/TSP coletados no Complexo Hospitalar Universitário Professor Edgard Santos da Universidade Federal da Bahia. Estes indivíduos realizam semestralmente ou anualmente, avaliação imunológica para dosagem de citocinas e determinação da carga proviral. Adicionalmente um grupo de 380 doadores voluntários de sangue, recrutados na Fundação de Hematologia e Hemoterapia da Bahia, foi utilizado como grupo controle. Após a extração do DNA, foi feita a genotipagem dos polimorfismos dos genes das citocinas IL10 (1082 T/C; -819 A/G e -512 A/G), TNF (-308 A/G e -1031C/T), LTA (-162 G/A e +252 G/A) e BAT1(-23G/C) por PCR em tempo real. Análise de regressão logística incondicional foi realizada através do programa STATAMTM (www.stata.com). As análises da associação entre diferentes genótipos de IL10 e TNF, produção de citocinas e carga proviral foram realizadas utilizando o teste de Kruskall Wallis e o teste de Mann-Whitney (U) através do programa Prism 5.0. Análise do polimorfismo no SNP rs1800896 (-1082 T/C) no gene IL10, mostrou um efeito protetor do alelo T em relação ao dano neurológico em ambas as comparações, Bexiga
hiperativa vs. Assintomáticos (OR=0,447; IC 0,28-0,70; p=0,001) e HAM/TSP + Bexiga hiperativa
vs. Assintomáticos (OR=0,693; IC 0,48-0,98; p=0,040). Na análise genotípica foi observado para
Bexiga hiperativa vs. Assintomáticos uma significância estatística na comparação dos genótipos C/T X C/C (OR=0,300; IC: 0,12-0,74; p=0,0001) e T/T X C/C (OR=0,175; IC: 0,06-0,45; p=0,0001).
Similarmente, na comparação HAM/TSP + Bexiga hiperativa vs. Assintomáticos, os genótipos C/T
X C/C (OR=0,385; IC: 0,16-0,84; p=0,018) e T/T X C/C (OR=0,355; IC: 0,15-0,79; p=0,012)
confirmam a associação com o alelo T neste marcador. Para os demais SNPs avaliados neste estudo, não foram observados resultados significantes (p 0,05). Os testes de associação entre os diferentes genótipos das três regiões promotoras de IL-10 e os genótipos das duas regiões promotoras de TNF com a carga proviral e com a produção espontânea de citocinas dos diferentes grupos de indivíduos infectados pelo HTLV-1, não resultou em associações significantes (p 0,05). Como perspectiva, estas pesquisas podem ser continuadas, por meio do estudo de outros genes candidatos e avaliações funcionais que possam responder melhor como ocorrem mecanismos reguladores por parte destas variações genéticas.
18 ABSTRACT
Braz, M. STUDY OF THE POLYMORPHISM IN IMUNE RESPONSE GENES AND ITS ASSOCIATION WITH CLINICAL MANIFESTATION, PROVIRAL LOAD AND CYTOKINES PRODUCTION IN HUMAN TYPE 1 LYMPHOTROPIC VIRUS INFECTION (HTLV-1). Salvador, 2017. Dissertação (Mestrado, Programa de pós-graduação em Ciências da Saúde) – Faculdade de Medicina da Bahia – Universidade Federal da Bahia.
The human T-cell lymphotropic virus (HTLV-1) is the major causative agent of HTLV-1 associated with Tropical Spastic Paraparesis/Myelopathy (HAM/TSP) and adult T-cell leukemia (HTLV). Most of the infected individuals remain asymptomatic, only 2 to 5% will develop one of the two diseases. There is a paucity of studies in the literature evaluating the role of host genes in this infection. Our objective was to investigate the possible association of polymorphisms in immune response genes and clinical manifestations, proviral load and spontaneous cytokine production in HTLV-1 infection. A total of 298 individuals infected with HTLV-1 were enrolled in the study, of which 164 were asymptomatic individuals, 63 were overactive bladders and 71 patients with HAM/TSP that were collected at the Professor Edgard Santos University Hospital Complex of the Federal University of Bahia. These individuals perform bi-annual or annual immunological evaluation for cytokine dosage and determination of proviral load. In addition, a group of 380 volunteer blood donors recruited from the Hematology and Hemotherapy Foundation of Bahia was used as a control group. After DNA extraction, the polymorphisms of IL-10 (-1082 T/C; -819 A/G and -512 A/G), TNF (-308 A/G and -1031 C/T), LTA (-162 G/A and +252 G/A) and BAT1 (-23G/C) were genotyped by real-time PCR. Unconditional logistic regression analysis was performed through the STATAMTM program (www.stata.com). The analysis of the association between different genotypes of IL10 and TNF, cytokine production and proviral load were performed using the Kruskall Wallis test and the Mann-Whitney (U) test using the Prism 5.0 program. Analysis of the polymorphism at the SNP rs1800896 (-1082 T/C) in the IL10 gene, showed a protective effect of the T allele on neurological impairment in both comparisons, Overactive Bladder vs. Asymptomatic (OR = 0,447; CI = 0,28-0,70, p = 0,001) and HAM/TSP + Overactive bladder vs. Asymptomatic (OR = 0,693, CI= 0,48-0,98, p = 0,040). In the genotypic analysis the groups Overactive bladder vs. Asymptomatic patients had a statistical significance in the comparisons C/T X C/C (OR = 0,300; CI=0,12-0,74; p = 0,0001) and T/T X C/C (OR = 0,175 -0,45, p= 0,0001). Similarly, in the comparison HAM/TSP + Overactive bllader vs. Asymptomatic, the C/T X C/C (OR = 0,385, CI=0,16-0,84, p = 0,018) and T/T X C/C (OR = 0,355, CI=0,15-0,79; = 0,012) genotypes confirm the association with the T allele in this marker. For the other SNPs evaluated in this study, no significant results were observed (p0,05). The association tests between the different genotypes of the IL-10 and TNF promoter regions with the proviral load and the spontaneous production of cytokines from the different groups of HTLV-1 infected individuals did not result in significant associations (p0,05). As a perspective, this study can be continued by the study of other candidate genes as well as functional evaluations that may respond better on how regulatory mechanisms occur through these genetic variations.
19 INTRODUÇÃO
O vírus linfotrópico de células T humana tipo 1 (HTLV-1), foi o primeiro retrovírus humano identificado e posteriormente associado com a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL), sendo esta doença inicialmente descrita no Japão, em 1977 (TAKATSUKI, et al., 1977). O HTLV-1 é também associado com o desenvolvimento
de uma condição inflamatória crônica e progressiva responsável por uma mielopatia degenerativa denominada Paraparesia Espática Tropical/Mielopatia Associada ao HTLV (HAM/TSP) (OSAME, et al., 1986). Ambos ATL e HAM/TSP ocorrem em menos de 5% dos indivíduos infectados enquanto a maioria permanece assintomática por longos períodos, sendo assim considerados portadores assintomáticos do vírus (ROMANELLI, et al., 2010).
Estima-se que aproximadamente 10 milhões de pessoas no mundo estão infectadas pelo HTLV-1 (GESSAIN & CASSAR, 2012). No Brasil, o vírus está presente em todos os estados sendo que, Maranhão e Bahia registram as maiores soroprevalências (CATALAN-SOARES, 2005). Salvador registra uma soroprevalência de 1,35% entre doadores de sangue (GALVÃO CASTRO, 1997) e na população geral, 1,8% de indivíduos estão (DOURADO, et al., 2003).
Tendo em vista a natureza patogênica deste vírus, ainda outras condições associadas ao HTLV-1 são descritas (OSAME, et al., 1986). A maioria dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 permanece como portador assintomático por toda a vida, enquanto a outra parcela da população infectada desenvolve algum tipo de doença ligada ao vírus. Existem diversas manifestações clínicas associadas, dentre elas, poliomiosite, artropatia assoaciada ao HTLV-1, dermatite infecciosa, uveíte, Síndrome de Sjogren entre outras (MORGAN et al 1989; NISHIOKA et al 1989; LA GRENADE et al 1990).
20 Análises comparativas da resposta imune de pacientes com HAM/TSP mostram que estes indivíduos apresentam alterações em diversos parâmetros imunológicos quando comparados aos portadores assintomáticos do vírus (SANTOS, et al., 2004). Dentre os mais relevantes destacam-se os elevados títulos de anticorpos específicos para antígenos do HTLV-1, tanto no soro quanto no líquido cefalorraquidiano, a produção espontânea de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias o aumento da frequência de linfócitos T CD8+ específicos para o HTLV-1 e (NAGAI, et al., 2001).
Além da resposta imune, o aumento da carga proviral e a genética do hospedeiro são fatores de evolução para a HAM/TSP. Em um estudo recente, foi demonstrado à existência de um polimorfismo no gene IL-28B rs8099917 cujo genótipo GG foi associado com mielopatia (HAM/TSP) (CARDOSO, et al., 2011). Entretanto, na infecção pelo HTLV-1 poucos estudos avaliaram a importância de fatores genéticos do hospedeiro no desenvolvimento da HAM/TSP. Entre os genes documentados destaca-se o papel de variantes de IL-6 e IL-10 correlacionados ao desenvolvimento de HAM/TSP (GADELHA, et al., 2008) e a influência do polimorfismo de IFN na carga proviral de HTLV-1 (HADDAD, et al., 2011). Contudo, outros estudos são necessários para validar esses dados.
Nesse contexto, o estudo do polimorfismo em genes de resposta imune pode revelar novos marcadores de susceptibilidade ou resistência na nossa população. Dessa forma, o atual projeto realizou um estudo genético com indivíduos infectados pelo HTLV–1 e avaliou fatores do hospedeiro nessa infecção.
21 2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ASPECTOS GERAIS E EPIDEMIOLOGIA DO HTLV-1
Os retrovírus são patógenos que infectam várias espécies de vertebrados, principalmente aves e mamíferos, incluindo os humanos. Possuem importância na patologia humana e veterinária e constituem agentes etiológicos de diversas doenças que acometem seres humanos e outros animais; Neoplasias malignas, doenças neurológicas, hematológicas e são condições associadas a este retrovírus imunodeficiências, (DULBECCO, 1988; HEHIMANN E ERFLE, 1991).
Os retrovírus pertencem à família Retroviridae e utilizam a enzima transcriptase reversa para síntese de uma fita de DNA complementar (cDNA) a partir do RNA viral. Baseada nas suas estruturas morfológicas e patologias associadas, a familia Retroviridae é composta das subfamílias Oncovirinae, Lentivirinae e Spumavirinae (TEICH, 1982).
O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) foi o primeiro retrovírus a ser descrito no mundo (1980), isolado de um paciente com diagnóstico de linfoma cutâneo de células T (POIESZ et al., 1980). Posteriormente, outros três tipos deste retrovírus foram detectados e isolados: o HTLV-2, em 1982 no Japão, o HTLV-3 e o HTLV-4, ambos em 2005, na África (KALYANARAMAN et al., 1982; CALATTINI et al., 2005; WOLFE et al., 2005). Estudos epidemiológicos sugerem que o HTLV-1 tenha surgido na África, por meio da transmissão entre espécies, a partir de primatas não humanos, sendo levado para todo o mundo no século XVI, com o tráfico negreiro. Outra hipótese também aceita é a de que o vírus tenha sido espalhado inicialmente para Ásia e Europa e depois para as Américas, pelo Estreito de Bering e mais recentemente pela migração japonesa, no século XX (SANTOS & MENDONÇA LIMA, 2005, PAIVA & CASSEB, 2015).
22 Os principais subtipos do HTLV-1 são: tipo I-Cosmopolita, com distribuição mundial, apresentando cinco subgrupos relacionados com a distribuição geográfica (Transcontinental, Japonês, Norte Africano, Oeste Africano e Peruano), tipo II-África Central, tipo III- Malásia, com cepas distribuídas em Papua Nova Guiné e Austrália, tipo IV- isolado a partir de pigmeus de Camarões e de um indivíduo infectado no Gabão, tipo V - isolado do Congo, tipo VI – proveniente de um indivíduo do Gabão e o tipo VII- descrito como um novo subtipo na África Central (VICENTE et al, 2006). Estudos realizados no Brasil demonstram que o HTLV-1 pertence principalmente ao tipo Cosmopolita, sub-grupo transcontinental (KASHIMA et al, 2006).
A transmissão do HTLV-1 ocorre principalmente por três vias: a) horizontal (contato sexual), onde ocorre troca de fluidos corporais, sendo mais frequentemente transmitida do homem para mulher; b) vertical ou perinatal (da mãe para o filho), predominantemente através da amamentação, podendo ocorrer também durante o parto; c) parenteral, por meio de contato com seringas contendo sangue contaminado e por transfusão sanguínea (SANTOS & MENDONÇA LIMA, 2005; EDLICH et al, 2003). O diagnóstico é feito inicialmente com testes sorológicos que detectam anticorpos contra o vírus, utilizando o método de ELISA. A confirmação é feita pelo teste de
Western blot, capaz de discriminar se a infecção se dá pelo HTLV-1 ou HTLV-2. Em
alguns casos esses testes não são suficientes para o diagnóstico, sendo então necessário recorrer a testes moleculares, onde a técnica da reação da polimerase em cadeia (PCR), capaz de detectar o material genético proviral, é utilizada (CARNEIRO-PROIETTI et al, 2002).
Estima-se que 10 milhões de pessoas no mundo são portadoras do HTLV-1 (GESSAIN & CASSAR, 2012). A infecção é endêmica do Japão, Caribe, região central da África, Oceania e Oriente Médio. A América do Sul também é considerada
23 uma área endêmica, ocorrendo na Colômbia, Equador, Peru, Bolívia, Argentina, Chile e Brasil (Figura 1).
Figura 1 – Áreas endêmicas para o HTLV-1 no Brasil e no mundo (adaptado de Gessain & Cassar, 2012). A fígura mostra áreas endêmicas de alta prevalência de infecção pelo vírus na áfrica, Ásia e Américas Central e do Sul.
No Brasil, o HTLV-1 foi primeiramente descrito em 1986, em uma comunidade japonesa residente em Campo Grande (Mato Grosso do Sul - MS) (SANTOS & MENDONÇA LIMA, 2005). É possível que o vírus tenha chegado ao Brasil juntamente com o tráfico negreiro e com a vinda de imigrantes japoneses (CATALAN-SOARES & PROIETTI, 2006). O vírus está presente em quase todos os estados brasileiros e estimativas apontam que 2,5 milhões de pessoas estão infectadas, tornando o Brasil, um dos países com maior número de casos (CARNEIRO-PROIETTI et al, 2002). Estudo de soro-prevalência, realizado com doadores de sangue em diversas capitais brasileiras, mostrou uma maior prevalência do HTLV-1 nas regiões Norte (Belém) e Nordeste (São Luís, Salvador e Recife) (CATALAN-SOARES &
24 PROIETTI, 2006) (Figura 2). Um estudo multicêntrico e de base populacional registrou em Salvador uma das maiores prevalências do HTLV-1, com aproximadamente 1,8% da população geral infectada (DOURADO et al, 2003). A soropositividade para o HTLV-1 é observada principalmente na idade adulta, onde homens e mulheres se infectam pela via sexual e por meio de transfusões sanguíneas (CARNEIRO-PROIETTI et al, 2002).
Figura 2. Prevalência de HTLV no Brasil
Estudos de soroprevalência no Brasil indicam que o HTLV-1 está presente em todos os estados brasileiros, sendo mais prevalente na região Nordeste (adaptado de Catalan Soares, et al, 2005).
25 2.2 O VÍRUS
O HTLV-1 é um retrovírus encapsulado pertencente à família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae e ao gênero do Deltaretrovírus (SAITO, 2010; RAMANAN et al, 2014). É constituído de um nucleocapsídio e um nucleoide e possui morfologia esférica medindo de 80 a 100nm de diâmetro (Figura 3) (KROON & PROIETTI, 2006). Seu genoma é composto por RNA de fita simples, possuindo os genes GAG, POL e ENV, além de uma região pX que contem os genes reguladores TAX e REX (Figura 4). O REX estabiliza o RNA mensageiro (RNAm) e regula o seu splicing e transporte. O TAX é importante para a transcrição viral e o principal alvo da resposta imune pelos linfócitos T citotóxicos (GOON et al, 2002).
26 Figura 4. Organização genômica do HTLV
Organização genômica do HTLV-1. (A): DNA proviral do HTLV. (B): Indicação dos genes e suas proteínas codificadas. (C): Principais mRNA do HTLV produzidos durante a transcrição do material viral (adaptado de Kroon & Proietti, 2006).
O ciclo de multiplicação do HTLV-1 ocorre inicialmente com a ligação do vírus a célula hospedeira, por meio de receptores específicos. Em seguida o vírus é capaz de penetrar na célula liberando todo o material genético no citoplasma. A fita simples de RNA viral é transcrita para uma fita dupla de DNA, por meio da enzima transcriptase reversa, que migra para o núcleo e integra-se ao DNA do hospedeiro. Uma vez unido,
27 na forma de provírus, utiliza a maquinaria do hospedeiro para o desenvolvimento de novos vírus (SANTOS &MENDONÇA LIMA, 2005).
2.3 DOENÇAS ASSOCIADAS AO HTLV-1
Estudos têm demonstrado que fatores genéticos e imunológicos do hospedeiro são responsáveis pelo aparecimento de duas doenças claramente associadas com soro-positividade para o HTLV-1: a Leucemia das Células T do Adulto (ATL) (UCHIAMMA, et al., 1977) e a Mielopatia Associada ao HTLV/Paraparesia Espástica Tropical (HAM/TSP) (OSAME et al 1986). Outras condições inflamatórias (por exemplo: Poliomiosite, artropatia associada ao HTLV-1, dermatite infecciosa, uveíte e síndrome de Sjogren) e condições infecciosas (estrongiloidíase, lepra, tuberculose, sarna norueguesa, hepatites (B e C), HIV e sífilis) também são associadas ao HTLV (MORGAN et al 1989; NISHIOKA et al 1989; LA GRENADE et al 1990; EDLICH ET AL, 2000).
2.3.1 LEUCEMIA DAS CÉLULAS T DO ADULTO (ATL)
A Leucemia/Linfoma de Células T do Adulto (ATL) é uma doença maligna das células T periféricas, associada à infecção pelo HTLV-1 (FISHER, et al., 2005). Foi a primeira doença humana identificada como tendo como agente etiológico um retrovírus. O HTLV-1 apresenta potencial oncogênico e essa capacidade advém das suas proteínas regulatórias, principalmente TAX (YOSHIDA 2001). Essa proteína é capaz de induzir a expressão do genoma viral e de ativar a expressão de genes celulares envolvidos no controle do crescimento celular. A expansão clonal de populações celulares com DNA danificado, pela atividade de TAX permitindo novos acúmulos de mutações, levaria a um processo de transformação maligna de algum clone celular, com expansão monoclonal do clone maligno e desencadeamento de ATL (YOSHIDA 2001).
28 A ATL é caracterizada por uma linfoproliferação maligna, devido ao crescimento clonal de células T CD4+ infectadas. Os pacientes apresentam hipercalcemia, infiltração grave de células leucêmicas em vários órgãos e uma curta sobrevivência. A ATL ocorre predominantemente em adultos, com igual frequência entre homens e mulheres (CARNEIRO-PROIETTI et al, 2006) onde a idade média para o inicio da doença é de 55 anos, após um longo período de latência (UCHIYAMA, 1997). Clinicamente a ATL é dividida nas formas: aguda, crônica, linfomatosa e indolente (smoldering). Os mecanismos patogênicos ainda não são bem esclarecidos, mas estudos indicam que a proteína viral TAX desempenha um papel importante na patogênese da ATL (CARNEIRO-PROIETTI et al, 2006). A verdadeira prevalência da ATL pode estar subestimada por motivos variados: a curta sobrevida nas formas aguda ou linfomatosa, a não diferenciação diagnóstica com outras doenças linfoproliferativas e a dificuldade de se confirmar o diagnóstico por técnicas laboratoriais especializadas, nas formas indolentes. Técnicas pouco disponíveis em países em desenvolvimento podem atrasar o reconhecimento do diagnóstico. Estima-se ser de 1-5% para ambos os sexos em áreas endêmicas, a incidência cumulativa de ATL entre os portadores de infecção por HTLV-1 (MURPHY, HTLV-1989).
2.3.2 MIELOPATIA ASSOCIADA AO HTLV/PARAPARESIA ESPÁSTICA TROPICAL (HAM/TSP)
Após a demonstração de anticorpos anti-HTLV-1 no soro e no líquor de pacientes que apresentavam tanto TSP quanto HAM, os pesquisadores chegaram à conclusão de que as duas doenças se tratavam da mesma entidade nosológica e em 1989 a OMS recomendou a utilização do termo HAM/TSP, utilizado até hoje (OSAME, 1990).
A HAM/TSP é uma doença inflamatória crônica e progressiva do sistema nervoso central caracterizada por acometer principalmente indivíduos adultos, acima de 40 anos,
29 ocorrendo mais freqüentemente em mulheres do que em homens (ARAÚJO & SILVA, 2006; CARNEIRO-PROIETTI et al, 2006). Cerca de 60% dos pacientes com HAM/TSP apresentam fraqueza muscular nos membros inferiores, e em alguns casos nos membros superiores também. Posteriormente estes pacientes progridem para uma espasticidade muscular anormal. Outros sintomas podem ser também observados nos pacientes com HAM/TSP como: prisão de ventre, dor nas costas, síndrome de Sjogren, distúrbios sensoriais, disfunção erétil e sintomas urinários. O curso da doença é variável entre os pacientes, podendo se desenvolver de forma rápida ou lenta (ARAÚJO & SILVA, 2006).
A maioria dos estudos genotípicos não mostra associação entre as variantes do vírus e o risco de desenvolver HAM/TSP (ARAÚJO & SILVA, 2006; BANGHAM E OSAME 2005; KASHIMA et al 2006). Desse modo, alguns fatores relacionados ao hospedeiro, podem levar ao desenvolvimento de HAM/TSP, tais como: o sexo feminino, a idade avançada (quarta e/ou quinta década de vida), uma craga proviral alta, e a contaminação pela via sexual (TAKENOUCHI ET AL 2003; BANGHAM E OSAME, 2005; LIMA, ET AL., 2007).
2.3.3 BEXIGA HIPERATIVA ASSOCIADA AO HTLV-1
Estimativas erroneamente apontam que menos de 5% dos indivíduos infectados desenvolve doenças associadas ao HTLV-1, enquanto a maioria permanece assintomática. Estudos recentes demonstraram uma prevalência elevada de manifestações clínicas nos indivíduos considerados como portadores assintomáticos, que podem estar associadas à infecção pelo HTLV-1. Disfunção erétil, sinais e sintomas neurológicos, gengivite, periodontite e sintomas urinários de bexiga hiperativa são algumas dessas manifestações clínicas observadas em indivíduos infectados pelo
30 HTLV-1, considerados como portadores assintomáticos por não preencherem os critérios da OMS para HAM/TSP (CASTRO et al, 2007; CASKEY et al, 2007; POETKER et al, 2011; OLIVEIRA et al, 2010; TANAJURA et al, 2015).
Enquanto os sintomas urinários de bexiga hiperativa são documentados em 100% dos pacientes com HAM/TSP, 25-30% dos portadores assintomáticos do vírus apresentam queixas urinárias (CASTRO et al, 2007). As queixas urinárias (noctúria, urgência e incontinência) podem representar os primeiros sintomas da mielopatia, sendo documentados anos antes do desenvolvimento da HAM/TSP (ARAUJO et al, 1998; CASTRO et al, 2007; OLIVEIRA et al, 2007). Estudos urodinâmicos e imunológicos sugerem que estes sintomas urinários podem representar uma manifestação precoce da HAM/TSP (CASTRO et al, 2007; SANTOS et al, 2012). Indivíduos infectados pelo HTLV-1, sem HAM/TSP e com bexiga hiperativa, apresentam alterações imunológicas (produção espontânea de IFN- e TNF) e alta carga proviral, semelhantes às observadas nos pacientes com HAM/TSP, sugerindo que estes indivíduos poderiam estar em um estágio inicial da HAM/TSP (SANTOS et al, 2012). Os indivíduos com bexiga hiperativa associada à infecção pelo HTLV-1, que não preenchem os critérios da OMS para serem considerados como pacientes com HAM/TSP, são denominados como prováveis HAM/TSP, de acordo com os critérios diagnósticos propostos por DE CASTRO-COSTA et al (2006).
2.4 ASPECTOS IMUNOLÓGICOS
Embora o HTLV-1 apresente um tropismo pelos linfócitos T CD4+ e CD8+, outros tipos celulares, tanto in vitro quanto in vivo, também podem ser alvos do HTLV-1 (macrófagos, linfócitos B e células dendríticas), (MARTINS & BRITO-MELO, 2006). Uma vez infectadas pelo HTLV-1 ocorre expansão clonal preferencial dos linfócitos T CD4+ e T CD8+, estimulados pela ação transativadora de TAX. A proteína
31 viral TAX atua ativando e regulando a expressão de vários genes celulares, além de interagir com fatores de transcrição impedindo que a célula entre em apoptose. Observa-se assim, a expressão constitutiva do receptor da Interleucina IL-2R e a produção de citocinas como IL-1β, IL-2, IL-15, GM-CSF, capazes de induzir ativação e proliferação celular persistente (TENDLER et al., 1991; YOSHIDA et al., 2001). Em resposta a infecção pelo HTLV-1, os linfócitos T infectados tornam-se capazes de proliferar espontaneamente, independente de presença estímulos (KRAMER et al., 1989), gerando uma intensa produção espontânea de citocinas pró-inflamatórias como IFN-, TNF e IL-6. Citocinas do perfil Th1, em especial o IFN-, são essenciais para a função citotóxica e modulam negativamente a resposta Th2, como observado nos pacientes com doenças alérgicas e parasitárias (SOUZA-MACHADO, 2003). A eficiência da reposta celular do hospedeiro à TAX é reconhecida como um fator importante para o desenvolvimento das doenças associadas ao HTLV-1, principalmente a HAM/TSP. Células T CD4+ de pacientes com HAM/TSP produzem grandes quantidades de IFN-, TNF, GM-CSF e IL-1, contribuindo para a patogênese da doença (NISCHIURA et al., 1996; GOON et al., 2002, GOON et al., 2003; SANTOS et al, 2004). Estudos, analisando o perfil de citocinas produzidas pelas células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de portadores assintomáticos do HTLV-1, demonstraram uma alta produção espontânea de IFN-, TNF, IL-5 e IL-10, quando comparada à produção espontânea de células de indivíduos com sorologia negativa para HTLV-1, sugerindo que células de indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentam um perfil de citocinas tanto Th1 quanto Th2 (CARVALHO et al., 2001). Estudos adicionais confirmaram a maior linfoproliferação e produção espontânea de IFN- pelas células dos pacientes com mielopatia, quando comparado aos portadores assintomáticos, e chamaram a atenção
32 para a variabilidade da produção de IFN- entre os portadores, com aproximadamente 40% apresentando um padrão de resposta imune similar ao observado nos pacientes com HAM/TSP (SANTOS et al., 2004).
Em resposta à infecção pelo HTLV-1, os linfócitos T citotóxicos CD8+, auxiliados pelas células T CD4+ produtoras de citocinas do tipo 1, desempenham um papel fundamental no reconhecimento e lise das células infectadas. Estudos apontam tanto para o papel protetor quanto para a participação das células T CD8+ na patogênese da HAM/TSP. Assim, uma resposta eficiente destas células suprimiria a frequência de células expressando TAX e conseqüentemente reduziria a carga proviral do HTLV-1, diminuindo o risco da mielopatia (BANGHAM & OSAME, 2005). Por outro lado, uma resposta imune intensa e exacerbada dos linfócitos T CD8+, com grande produção de citocinas como IFN- e TNF, poderia contribuir para o dano tecidual observado no sistema nervoso central (SNC) dos pacientes com HAM/TSP (JACOBSON et al, 1992; AZIME et al., 2000; JACOBSON, 2002). Esta alteração foi demonstrada pelo encontro de uma elevada frequência de células T CD8+ específicas para o HTLV-1 no líquor e sangue periférico dos pacientes com HAM/TSP (NAGAI et al., 2001).
2.5 FATORES ENVOLVIDOS NA PATOGÊNESE DA HAM/TSP
Entre os fatores relacionados ao vírus foi observado que alterações na estrutura do HTLV-1 (substituições de nucleotídeos no gene TAX) estariam associadas ao risco de desenvolver HAM/TSP (FURUKAWA et al., 2000). Outro importante fator de risco é a carga proviral do HTLV-1, ou seja, a percentagem de células mononucleares do sangue periférico que carregam o provirus do HTLV-1. Vários estudos apontam para a associação entre alta carga proviral e o desenvolvimento de HAM/TSP. A carga proviral, tanto no sangue periférico quanto no líquor de pacientes com HAM/TSP, é significantemente mais elevada do que a carga proviral dos portadores assintomáticos,
33 constituindo assim um importante pré-requisito para o desenvolvimento da HAM/TSP
(NAGAI et al., 1998; OLINDO et a.l, 2005; GRASSI et al., 2011).
Estudos demonstram que a carga proviral e o risco de HAM/TSP são diretamente influenciados pela eficiência da resposta imune celular contra o HTLV-1 (BANGHAM, 2008). Uma resposta eficiente dos linfócitos T CD8+ específicos para TAX manteria a população de células infectadas em equilíbrio, reduzindo a carga proviral, enquanto que em uma resposta celular pouco eficiente, a carga viral continuaria alta e os linfócitos T CD8+, constantemente estimulados, produziriam citocinas inflamatórias (IFN- e TNF) que participariam do processo patogênico da HAM/TSP (BANGHAM, 2009). Como a resposta dos linfócitos T CD8+ apresenta variação individual, sugeriu-se também que fatores genéticos do hospedeiro poderiam estar implicados no controle da carga proviral e, portanto influenciariam na susceptibilidade ou resistência à HAM/TSP (JEFFERY et al, 1999).
O encontro de citocinas pró-inflamatórias no líquor dos pacientes com HAM/TSP sugere que células infectadas pelo HTLV-1migram do sangue periférico para o SNC e ultrapassam a barreira hematoencefálica (BHE), tendo então um papel importante na patogênese da HAM/TSP. Algumas hipóteses foram propostas para explicar o papel do HTLV-1 no desenvolvimento da HAM/TSP: 1) a da toxicidade direta, onde células da glia infectadas seriam destruídas por citocinas produzidas por linfócitos T CD8+ específicos para o HTLV-1 após atravessarem a BHE; 2) a da autoimunidade, que sugere que células da glia apresentando antígenos semelhantes aos antígenos virais seriam atacadas por células T CD4+ ativadas que atravessaram a BHE e (3); a última e mais aceita das hipóteses, que é a do dano circundante ou “bystanter”, que propõe que células T CD4+ e CD8+ infectadas atravessariam a BHE e produzindo grandes
34 quantidades de citocinas pró-inflamatórias induziria intensa inflamação e destruição tecidual (OSAME et al, 2002; NAGAI et al., 2003).
No contexto da infecção pelo HTLV-1, tem sido demonstrado que células infectadas atravessam a BHE, produzem citocinas pró-inflamatórias (IL-1 e TNF) e são suficientes para perturbar a permeabilidade da barreira (AFONSO et al., 2008). Vários estudos têm demonstrado que as quimiocinas podem participar da patogênese da HAM/TSP (NARIKAWA et al., 2005; GUERREIRO et al., 2006; MONTANHEIRO et al., 2007).
2.6 ASPECTOS GENÉTICOS DO HOSPEDEIRO NA INFECÇÃO PELO HTLV-1
Os estudos que mostram a contribuição de fatores genéticos do hospedeiro no entendimento da susceptibilidade ou patogênese do HTLV-1 são recentes, considerando o interesse e o avanço sobre a imunopatogênese da doença (JACOBSON et al. 1997).
Vários estudos têm tentado associar a presença de SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) no genoma do hospedeiro com susceptibilidade à infecção ou o resultado das manifestações clínicas em indivíduos infectados pelo HTLV-1 (TAGHADDOSI, et al 2013; VALLINOTO, et al 2012; PONTES, et al 2005). Entretanto, a maioria dos estudos, até agora, enfatizou o polimorfismo do tipo SNP rs12979860 no gene de IL28B. Um estudo brasileiro não conseguiu encontrar uma associação positiva entre os polimorfismos IL28B rs12979860 e um aumento para o risco de desenvolver HAM/TSP em 24 pacientes (SANABANI, et al. 2012).
Assone et al., 2014, relatou em seu trabalho com genótipo GG SNP rs8099917 no gene de IL28B que, a população estudada não estava em equilíbrio de HWE (Equilíbrio de Hardy Weinberg), o que pode até indicar um risco maior para os
35 pacientes portadores do genótipo GG. Segundo Assone et al., 2014, as pessoas com genótipo GG SNP rs8099917 e o genótipo CT rs12979860 ambos marcadores do gene de IL-28B pode apresentar uma resposta imune contra a infecção por HTLV-1 (ASSONE et al. 2014).
Treviño et al, 2012, investigaram a prevalência do polimorfismo rs12979860 no gene IL-28B em um grupo espanhol e relatou um aumento da freqüência dos genótipos CT/TT em HAM/TSP comparados com indivíduos assintomáticos. Além disso, esses autores relataram uma maior carga proviral mediana em portadores dos genótipos CT/TT, sugerindo a influência deste SNP como biomarcador importante para acompanhamento nos indivíduos infectados pelo HTLV-1 (TREVINO, et al. 2012).
Nos achados de Vallinoto et al.,2015, com polimorfismo rs12979860 no gene IL-28B, não foram observadas diferenças nas freqüências alélicas e genotípicas entre os grupos de pacientes sintomáticos, pacientes assintomáticos e indivíduos controle. Além disso, ainda de acordo com Vallinoto et al., 2015, seus resultados não suportam o uso do SNP rs12979860 como um fator preditivo no desenvolvimento de HAM/TSP (VALLINOTO et al., 2015).
Gadelha e colaboradores 2008, demonstraram que polimorfismos no gene da Interleucina 6 (IL-6), nas posições -174 e -634 estão associados com o desenvolvimento de HAM/TSP em indivíduos infectados pelo HTLV-1 da cidade de Salvador-BA e que o polimorfismo -174G>C, está associado também com uma diminuição nos níveis de osteocalcina dos indivíduos assintomáticos infectados pelo HTLV-1 de até 45 anos (GADELHA et al. 2008).
36 2.6.1 ESTUDOS GENÉTICOS COM A INTERLEUCINA 10 (IL-10)
A IL-10 é uma citocina secretada por células de perfil Th2 e atua inibindo a síntese de citocinas inflamatórias produzida por células Th1, representando uma das mais importantes citocinas imunoregulatórias (MOSMANN, et. al., 1989; FISHMAN, et. al., 1994). Polimorfismos nos genes desta citocina vêm sendo associado com doenças infecciosas como AIDS (OLEKSYK , et. al., 2009), Tuberculose (MEENAKSHI et al., 2013) e Hanseníase (FRANCESCHI, et. al., 2009; ALVARADO-ARNEZ et. al., 2015).
Sabouri et al., 2004, analisou 6 polimorfismos (-592, -819, -1082, -2763, -2849 e -3575) na região promotora da IL-10 em pacientes de Kagoshima, cidade do Japão que se caracteriza por ser uma área endêmica para HTLV-1. Em seu estudo, foram avaliados 280 pacientes com HAM/TSP e 255 portadores assintomáticos e foi demonstrado que o alelo A do gene de IL-10 -592 A/G, apresenta atividade transcricional induzida pelo gene TAX-HTLV-1 em linhagem de células T. O mesmo, alelo A foi associado com menor susceptibilidade de desenvolvimento da HAM/TSP nesta população.
Shirdel, et. al., 2013, e colaboradores investigaram a associação de polimorfismos do gene de IL-10 e a infecção pelo HTLV-1 e desenvolvimento de HAM/TSP em uma população afetada no nordeste do Irã (Mashhad). Neste estudo, os alelos IL-10 -819 T e -519 A estão associados à progressão para HAM/TSP, porém, os estudos realizados com o alelo -1082 T não mostraram nenhuma associação significante na evolução ou predisposição para HAM/TSP (SHIRDEL, et al., 2013).
37 2.6.2 ESTUDOS GENÉTICOS EM GENES DO MHC DE CLASSE III – TNF, LTA E BAT1 - E A INFECÇÃO PELO HTLV-1.
O TNF é uma citocina pró-inflamatória produzida por células Th1 que podem inibir a proliferação de células Th2, desempenham um papel chave na defesa do hospedeiro contra patógenos, é codificada pelo gene TNF e sintetizada como uma proteína de membrana, principalmente por macrófagos e células T, (FISHMAN, 1994). O TNF solúvel é um potente mediador capaz de induzir estímulos potencialmente patogênicos que atuam rapidamente na promoção da resposta inflamatória e imunológica. Entretanto, quando produzido em excesso e liberado de forma sistêmica em grandes quantidades, pode levar a complicações fatais como colapso circulatório e falência múltipla de órgãos (SILVA, 2003). Até então, um único estudo foi publicado avaliando o polimorfismo no gene de TNF-em portadores infectados pelo HTLV-1, entretanto em pacientes com ATL (TSUKASAKI, et. al., 2001).
A linfotoxina alfa (LTA) é uma glicoproteína citotóxica composta por 17 aminoácidos homóloga ao fator de necrose tumoral-β e produzida por linfócitos Th1 (RUDDLE et al, 1968, WILLIAMS et al, 1968). O gene de LTA está geralmente em desequilíbrio de ligação com a região promotora de TNF (ALCAIS et al., 2007). Até o presente momento, não existe publicados na base de dados PubMed estudos envolvendo polimorfismos genéticos associando o gene LTA com as formas clínicas na infecção pelo HTLV-1 e a maior parte dos trabalhos sobre linfotoxina, relatam influência sinérgica com TNF devido ao desequilíbrio de ligação bem documentado entre os dois genes.
O transcrito 1 associado ao HLA de classe III (BAT1),atualmente chamado de DDX-38B está localizado no braço curto do cromossomo 6 do genoma humano, nas
38 proximidades dos genes de TNF e LTA, associado ao complexo principal de histocompatibilidade de classe III Humano, região que contém genes que afetam a susceptibilidade a desordens imunopatológicas (ALLCOCK, PRICE et al., 2001; PRICE, WONG et al., 2004). O BAT1 atua na regulação negativa da produção de citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-6 e TNF (ALLCOCK, WILLIAMS et al., 2001; PRICE, WONG et al., 2004), e desempenha um papel fundamental na exportação do RNA mensageiro do núcleo para o citoplasma (SPIES, 1989; PEELMAN, CHARDON et al., 1995) e na tradução (ALLCOCK, PRICE et al., 2001). Até o presente momento, não existe publicados na base de dados PubMed estudos envolvendo polimorfismos genéticos associando o gene BAT1 com as formas clínicas na infecção pelo HTLV-1.
Os estudos do polimorfismo em genes de resposta imune podem identificar marcadores de susceptibilidade ou resistência para o desenvolvimento da HAM/TSP. Sendo assim, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a possível associação entre polimorfismo em genes da resposta imune (IL-10, TNF, LTA e BAT1) e as diferentes apresentações clínicas da infecção pelo HTLV-1, a carga proviral e a produção espontânea de citocinas inflamatórias e regulatórias.
39 3. OBJETIVOS
3.1 GERAL
Avaliar a possível associação entre polimorfismos em genes da resposta imune e a infecção pelo HTLV-1.
3.1 ESPECÍFICOS
I. Avaliar se os polimorfismos nos genes IL-10, TNF, LTA e BAT1 estão associados a diferentes manifestações clínicas da infecção pelo HTLV-1 (portador assintomático, indivíduos com bexiga hiperativa associada ao HTLV-1 e pacientes com HAM/TSP). II. Verificar a associação entre os genótipos de polimorfismos dos genes de IL-10 e TNF com carga proviral, nos diferentes grupos de indivíduos infectados pelo HTLV-1. III. Verificar a associação entre os genótipos de polimorfismos dos genes de IL-10 e TNF com a produção espontânea das citocinas de IL-10 e TNF.
40 4. METODOLOGIA
4.1. LOCAL, POPULAÇÃO ESTUDADA e TIPO DE ESTUDO
O Ambulatório Multidisciplinar de HTLV-1 no Ambulatório Magalhães Neto do Complexo Hospitalar Universitário Professor Edgard Santos, da Universidade Federal da Bahia (Com-HUPES-UFBA), é um dos centros de referência para o diagnóstico e acompanhamento de indivíduos infectados pelo HTLV-1, em Salvador-Bahia. Para este estudo foram selecionados indivíduos matriculados e acompanhados neste ambulatório, de ambos os sexos, com a idade variando entre 18 e 78 anos e diagnóstico confirmado da infecção (ELISA e Western-blot), Os indivíduos foram alocados em três grupos distintos de acordo com a forma clínica: A) Grupo 1 – Portadores assintomáticos da infecção pelo HTLV-1; B) Grupo 2 – Indivíduos com diagnóstico de HTLV-I que apresentam manifestação de bexiga hiperativa e C) Grupo 3 – Pacientes com diagnóstico de HAM/TSP. As amostras (plasma e DNA) utilizadas fazem parte do biorrepositório do Serviço de Imunologia do COM-HUPES.
Todos os participantes foram incluídos no estudo, após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, seguido por entrevistas guiadas utilizando questionário clínico-epidemiológico e coleta de 20 ml de sangue para posterior extração de DNA e armazenamento do plasma. Além disso, este projeto, Parecer/Resolução Aditiva N° 35/2013 foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa – CEP/MCO/UFBA. Maternidade Climério de Oliveira – Universidade Federal da Bahia.
Participou deste estudo um total de 298 indivíduos infectados pelo HTLV-1, sendo este número composto por 164 indivíduos com o perfil previamente descrito para o Grupo 1 (portador assintomático), 63 indivíduos com os critérios para o grupo 2 (indivíduos com bexiga hiperativa) e 71 pacientes com critérios elegíveis para o grupo 3 (HAM/TSP). Adicionalmente um grupo conjunto de 380 doadores voluntários de
41 sangue, recrutados na Fundação de Hematologia e Hemoterapia da Bahia (HEMOBA), foi utilizado como grupo controle. Os indivíduos acompanhados no ambulatório Multidisciplinar de HTLV realizam semestralmente ou anualmente, avaliação imunológica para dosagem de citocinas e determinação da carga proviral. O resultado da produção espontânea de citocinas e da carga proviral são adicionados em um banco de dados mantidos no Serviço de Imunologia e são disponibilizados para estudos posteriores. Para a análise dos genes candidatos propostos, foi realizado um estudo populacional do tipo caso-controle.
4.2. EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPAGEM
O DNA genômico foi obtido a partir de sangue total utilizando-se o método de “salting-out” com proteinase K (Dynal, Technical Handbook. 1ed. Oslo, Norway). Os marcadores dos genes selecionados Tabela 1, foram escolhidos com base na literatura e utilizando a informação disponível sobre suas seqüências em bancos de dados de domínio público como o Ensembl (www.ensembl.org) e o projeto 1000 Genomes (http://www.internationalgenome.org). A genotipagem foi feita pelo ensaio de TaqMan®, tecnologia da Applied Biosystems. O ensaio de TaqMan® é um ensaio de nuclease 5’, o qual utiliza a atividade exonuclease 5’ 3’ da enzima polimerase Thermus
aquaticus (Taq) para clivar sondas duplamente marcadas com corante repórter e
aneladas a uma sequência alvo localizada entre os dois sítios ligantes do primer. Um software específico faz a leitura das placas, atribuindo de forma automatizada a genotipagem das amostras no teste.
42 t Gene SNP Localização Cromossomo Alelos TNF_rs1800629 promotor(-308) 6 A/G TNF_rs1799964 promotor 6 C/T
LTA_rs909253 Intron (+252) 6 A/G
LTA_rs1800683 5`UTR 6 A/G
BAT1_rs2239527 5`UTR 6 G/C
IL10_rs1800896 Inter/Promotor 1 T/C
IL10_rs1800871 Inter/Promotor 1 A/G
IL10_rs3024496 3`UTR 1 A/G
Tabela 1. SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) genotipados neste estudo.
43 Figura 5. Resultado da genotipagem de uma placa do SNP rs1800896 (-1082 T/C) no gene IL10: Indivíduos homozigotos para o alelo 1 representados na cor vermelha; Indivíduos homozigotos para o alelo 2 representados na cor azul e indivíduos heterozigotos para alelos 1:2 representados na cor verde.
4.3. CULTURA DE CÉLULAS E DOSAGEM DE CITOCINAS
Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foram obtidas após coleta de sangue venoso heparinizado e separação através gradiente de Ficoll-Hypaque. As células foram ajustadas para 3 x 106 células/ml e cultivadas, sem estímulo, em RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino. Estas culturas foram mantidas por 72 horas em estufa à 37ºC e 5% CO2. Após este período, foi coletado o sobrenadante da
44 cultura destas células e a dosagem de citocinas (IL-10 e TNF) foi realizada pela técnica de ELISA sanduíche, por meio de Kits comercialmente disponíveis (R&D Systems Inc). Brevemente, as placas foram sensibilizadas com anticorpo de captura específico e após lavagem e bloqueio, as amostras foram adicionadas e incubadas a 4ºC. Após lavagens, um anticorpo marcado com biotina, seguido do conjugado foi adicionado e a reação revelada. A leitura da densidade óptica foi feita em espectrômetro com 450 mm. Os resultados foram expressos em pg/ml por interpolação das densidades ópticas obtidas em curva-padrão. Os dados da produção espontânea de IL-10 e TNF dos indivíduos participantes deste estudo foram obtidos do banco de dados de citocinas mantidos no Serviço de Imunologia do Com-HUPES-UFBA.
4.4 DETERMINAÇÃO DA CARGA PROVIRAL
A carga proviral do HTLV-1 foi mensurada por reação em cadeia de polimerase (PCR) em tempo real através do sistema TaqMan (Dehee et al, 2002). O DNA da albumina foi quantificado em paralelo como controle interno. O DNA das amostras foi extraído utilizando Proteinase K e o método de salting-out. A amplificação e a aquisição dos dados foram realizadas utilizando o sistema de detecção de sequencia da ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Os dados da carga proviral dos participantes deste estudo também foram obtidos do banco de dados do Serviço de Imunologia do Com-HUPES-UFBA.
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Métodos de associação foram utilizados para analisar os dados. A hipótese nula é de que o estado da doença é totalmente independente dos marcadores genotípicos, isto é, não há ligação ou associação devido ao desequilíbrio de ligação observado entre os marcadores e qualquer gene casual não observado que controlaria a doença. Análise de regressão logística incondicional foi realizada através do programa STATAMTM
45 (www.stata.com). As análises da associação entre diferentes genótipos de IL10 e TNF, produção de citocinas e carga proviral foram realizadas utilizando o teste de Kruskall Wallis e o teste de Mann-Whitney (U) através do programa Prism 5.0.
46 5. RESULTADOS
Na Tabela 2 são mostradas as características clínico-epidemiológicas dos indivíduos infectados por HTLV-1 da amostra estudada. Do total de 298 pacientes infectados pelo HTLV-1, 164 (55,04%) são considerados como portadores assintomáticos, 63 (21,14%) são indivíduos com manifestação de bexiga hiperativa associada ao HTLV-1 e 71 (23,82%) apresentam HAM/TSP. Ainda de acordo com a tabela 2, podemos observar que a maioria dos casos é do sexo feminino com idade acima de cinqüenta anos. Em relação aos controles (doadores de sangue), 264 são do sexo masculino e 116 do sexo feminino. A média de idade dos controles foi de 34,80 ± 10,24.
Tabela 2. Caracterização dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 de acordo com a idade e gênero Características Total N(298) Portador assintomático N (164) Bexiga hiperativa N (63) HAM/TSP N(71) Homem 100 63 15 22 Mulher 198 101 48 49 Idade>50 anos 184 94 46 44 Idade≤50 anos 114 70 17 27 Média de idade (min-max) 53(23-78) 51(23-76) 54(29-70) 53(27-78)
5.1 RESULTADOS DO OBJETIVO I: Avaliar se os polimorfismos nos genes IL-10, TNF, LTA e BAT1 estão associados com as diferentes manifestações clínicas da infecção pelo HTLV-1 (portador assintomático, bexiga hiperativa e HAM/TSP).
5.1.1 ASSOCIAÇÃO ENTRE OS POLIMORFISMOS NO GENE DE IL10 E O HTLV-1.
rs1800896 T/C:
Na população avaliada, a análise do polimorfismo no SNP rs1800896 (-1082 T/C) no gene IL10, mostrou frequências alélicas de 35,0% e 65,0% para os alelos C e T
