Klaus Weber e Mary Osborn Scientific American As proteínas no citoplasma formam uma matriz altamente estruturada, porém maleável, que afeta a forma da célula, a divisão e o movimento, e o transporte de vesículas e organelas. Ela pode também ter uma participação no metabolismo.
O citoplasma de uma célula não é uma massa de geléia disforme na qual o núcleo e outras organelas estão espalhadas. Ele é altamente estruturado. Uma matriz fibrosa de proteína s se espalha no citoplasma, entre o núcleo e a superfície interna da membrana plasmática, ajudando a estabelecer a forma da célula e participando da locomoção e divisão celular. Conhecida como citoesqueleto, a matriz também pode influenciar o movimento de organelas dentro da célula e até mesmo afetar o metabolismo da célula, fornecendo um arcabouço tridimensional para os eventos moleculares que são os processos vitais da célula.
Os microscopistas primeiro observaram fibras no citoplasma de alguns tipos de células durante o século XIX; mais tarde a prata e outros corantes foram usados para melhorar a visibilidade das fibras do citoesqueleto sob a luz do microscópio óptico. Nos anos 50 e 60, a microscopia eletrônica revelou três sistemas de filamentos distintos no citoplasma. Recentes estudos bioquímicos e imunológicos identificaram um conjunto distinto de proteínas, caracterizando cada sistema de filamentos.
Tanto a aparência estrutural como a bioquímica distinguem os três sistemas. As fibras mais finas são os microfilamentos; estes têm em média 6 nanômetros (bilionésimos de um metro) de diâmetro e são feitas da proteína actina. Os microtúbulos têm 22
nanômetros de diâmetro e consistem de tubulina. O diâmetro dos filamentos intermediários varia entre 7 e 11 nanômetros; e suas proteínas constituintes variam de acordo com o tipo celular.
As proteínas que caracterizam cada sistema de filamentos podem ser purificadas em laboratório, tornando possível o uso da técnica de microscopia de imunofluorescência, para conseguir uma visão geral da configuração de cada tipo de filamento dentro da célula. Primeiro aplicada a um componente do citoesqueleto (o sistema de microfilamentos) em 1974, a técnica requer um anticorpo para uma proteína específica. O anticorpo é feito injetando-se a proteína purificada num animal experimental. Então permite-se ao anticorpo ligar-se a uma proteína alvo numa célula fixada, através da introdução do anticorpo por buracos feitos na membrana plasmática. Depois, expõe-se a célula a um segundo anticorpo que reconhece o primeiro e que foi marcado com um composto fluorescente. Quando a célula é vista sob o microscópio de fluorescência, o anticorpo fluorescente ilumina a distribuição do primeiro anticorpo e, desse modo, a da proteína a qual está ligado.
Quando o primeiro anticorpo é específico para actina, o marcador fluorescente revela um arranjo de fibras de estresse: que são feixes longos e grossos de microfilamentos que correm paralelos e próximos a membrana plasmática. As fibras de estresse são, particularmente, proeminentes em células que estão bem espalhadas: células que repousam horizontalmente no substrato. Muitas células normais e células que foram transformadas por um vírus que induz tumores, têm forma arredondada e não apresentam fibras de estresse. O anticorpo também revela uma fina rede de microfilamentos abaixo da membrana; a rede é mais visível na "ruffling edge" (região onde a membrana está ondulada) da célula fixada, que marca a borda de uma célula viva movendo-se sobre um substrato.
Um anticorpo que é específico para tubulina torna visível uma organização diferente. Os microtúbulos que ilumina não estão concentrados perto da membrana plasmática; ao contrário, eles irradiam a partir de um centro organizador próximo do núcleo, conhecido como centrossomo ou citocentro. O centrossomo consiste de 2 estruturas cilíndricas compactas conhecidas como centríolos e o material que o circunda. Microtúbulos individuais saem dos centríolos para baixo da membrana plasmática. Em contraste com as fibras de estresse, os microtúbulos radiais não desaparecem quando uma célula espalhada assume uma forma arredondada, embora eles devam mudar de comprimento. Sob o microscópio de fluorescência é mais difícil obter uma resolução de microtúbulos vizinhos numa célula arredondada do que numa estendida, o que pode explicar a visão errônea de que o complexo microtubular está quebrado e mal definido em células transformadas.
Um notável rearranjo do complexo microtubular ocorre no início da mitose, o processo de divisão celular. A microscopia de imunofluorescência mostra que à medida que os cromossomos no núcleo se condensam e começam a se separar em 2 grupos, os microtúbulos são desarranjados e a tubulina é reorganizada para formar o fuso mitótico: uma estrutura de microtúbulos paralelos que se estende dos pólos de uma célula em divisão até os cromossomos no centro, e também se estende entre os pólos opostos. O fuso guia e, provavelmente, supre a força de direção para o movimento dos 2 grupos de cromossomos para os pólos. É o elemento do citoesqueleto que é responsável pela correta divisão do material genético das células parentais entre as 2 células-filhas.
O anticorpo que é necessário para se observar o terceiro sistema de filamentos numa célula, os filamentos intermediários, varia de acordo com a sua proteína constituinte, a qual por sua vez depende do tipo celular. Mantendo a sua bioquímica variável, o arranjo dos
filamentos intermediários é diferente em tecidos diferentes (e algumas células parecem não possuir nenhum deles). Os filamentos intermediários, geralmente, envolvem todo o citoplasma, mas em algumas células, eles estão organizados em feixes e em outras são distribuídos como filamentos individuais. Em vários tipos de células, o seu rearranjo parece estar relacionado àquele dos microtúbulos.
A microscopia de imunofluorescência é uma poderosa ferramenta para se estudar o arranjo geral dos filamentos do citoesqueleto, e ela também provou ser valiosa na determinação de que outras proteínas estão associadas com os diferentes sistemas de filamentos. Com alguns truques, a técnica pode até mesmo produzir uma imagem que documente 3 proteínas numa única célula ou imagens estereoscópicas, dando uma impressão tridimensional.
A microscopia eletrônica consegue uma maior resolução que a de imunofluorescência . Um corte preparado para a microscopia eletrônica convencional tem somente em torno de 200 vezes a espessura de uma célula, entretanto, e por isso, não fornece uma visão geral da estrutura citoesquelética. Novos microscópios eletrônicos de alta voltagem, podem ser usados para estudar cortes mais grossos, nos quais fibras citoesqueléticas individuais podem ser seguidas por longas distâncias. Uma outra forma de se observar a organização do citoesqueleto em larga escala, na eletrônica, é tratar as células com um detergente suave. Este faz buracos na membrana plasmática e retira muitas proteínas solúveis do citoplasma, deixando os microfilamentos, microtúbulos e filamentos intermediários intactos. Tais preparações não precisam ser seccionadas antes da microscopia eletrônica.
A configuação dos elementos do citoesqueleto também pode ser clareada através da microscopia de congelamento rápido e sombreamento profundo: congelando rapidamente e
fraturando uma célula, removendo água e aplicando uma fina camada de platina. Sob o microscópio eletrônico, o espécime tratado fornece imagens que dão uma impressão tridimensional do citoesqueleto exposto. A microscopia eletrônica ganhou também a especificidade bioquímica da imunofluorescência, através do uso de anticorpos marcados com uma substância elétron-densa com a ferritina ou ouro coloidal; sua distribuição numa micrografia (fotografia obtida por microscopia eletrônica) indica a distribuição da proteína alvo.
As técnicas discutidas acima dão apenas uma visão estática do citoesqueleto, uma visão instantânea da célula no momento da sua fixação. Outras técnicas têm começado a revelar o comportamento do citoesqueleto na célula viva. Pode-se marcar quimicamente uma proteína citoesquelética no tubo de ensaio com um composto fluorescente e então injetá-la diretamente dentro de uma célula usando uma fina agulha de vidro. O sinal fluorescente torna possível seguir a incorporação da proteína dentro da matriz citoplasmática com uma câmera de vídeo intensificadora da imagem. Para se entender o papel de uma proteína em particular da matriz, no comportamento e na fisiologia da célula, pode se injetar um anticorpo contra a proteína. O funcionamento da célula injetada dará, então, uma indicação do papel da proteína em células normais.
Para se determinar as bases moleculares da estrutura e comportamento revelados por tais técnicas microscópicas, as observações precisam ser combinadas com resultados de estudos bioquímicos. Ensaios "in vitro", nos quais proteínas citoesqueléticas são purificadas e suas interações umas com as outras são observadas, levaram a uma descrição bioquímica de muito do que é observado sob o microscópio. As proteínas que participam desta organização e da dinâmica dos microfilamentos, por exemplo, são bem caracterizadas.
A principal entre elas é a actina, a proteína básica dos microfilamentos. Na sua forma purificada, a actina é um monômero (uma simples unidade molecular que pode se combinar com outras unidades iguais para formar um polímero) conhecida como actina globular ou actina-G. Na presença de trifosfato de adenosina (ATP), um composto fornecedor de energia celular, e de um tampão fisiológico, a actina-G se polimeriza para formar uma longa dupla hélice, chamada actina filamentosa ou actina-F. Simultaneamente, o ATP é convertido em difosfato de adenosina (ADP), liberando a energia para o processo. A cadeia de actina-F tem uma polaridade: tende a se polimerizar ou alongar-se no lado positivo e despolimerizar ou encurtar no lado negativo. Actina-F é o principal elemento estrutural dos microfilamentos, mas no citoesqueleto várias outras proteínas conhecidas por se ligarem à actina ("actin binding proteins"), ligam-se à ela.
As proteínas que se ligam à actina governam a configuração e o comportamento da actina-F. Análises de músculo esquelético, do músculo liso e várias células e tecidos não musculares já documentaram muitas dúzias destas proteínas e certamente outras serão descobertas. Algumas são peculiares a tipos específicos de células, mas muitas são comuns a uma série de células e todas são nomeadas pelos seus efeitos "in vitro" sobre o arranjo e a estrutura da actina. Fatores de gelação aumentam marcadamente a viscosidade da actina-F purificada; formam ligações flexíveis porém fortes entre filamentos entrelaçados. Fatores que formam feixes são um conjunto de proteínas compactas que ligam fortemente fibras em paralelo formando feixes densos que podem ser vistos sob o microscópio óptico. Fatores de espaçamento (do tipo bastão) formam pontes entre filamentos paralelos de actina, ligando-os por distâncias de cerca de 200 nanômetrligando-os.
Fatores de separação e de estabilização não se ligam a múltiplos filamentos de actina, mas sim a filamentos únicos, determinando seu comprimento e sua estabilidade.
Fatores de separação parecem se inserir entre subunidades de um filamento, dividindo-o e formando uma cobertura no novo lado positivo. Quando esses fatores são adicionados a um gel de actina-F, a sua viscosidade decai dramaticamente, a medida em que os filamentos são cortados. Fatores estabilizantes opõem-se à ação dos fatores de separação; também conhecidos como proteínas co-filamentosas, estendem-se ao longo dos filamentos e desta forma os protegem. Tropomiosina, uma proteína filamentosa curta, pode funcionar como um fator estabilizante para a actina-F em células não musculares.
Outras proteínas ainda regem a formação de fibras individuais de actina-F. Isso ocorre porque as fibras de actina tendem adicionar subunidades de actina-G num lado e desprender o monômero no outro lado, há um fluxo d subunidades através da cadeia quando está em equilíbrio com actina-G livre. O processo é chamado de " treadmilling", e é regulado por fatores de cobertura ("capping"). Cada molécula de cobertura é específica para o lado negativo ou positivo do filamento. Assim, um fator de cobertura detém a adição de subunidades ao filamento ou a sua remoção, e deste modo, regula a quantidade de actina na forma polimerizada.
Outra série de proteínas que se ligam a actina e que afetam o equilíbrio entre actina-G e F, se ligam ao monômero e não ao polímero. Esses tão falados fatores de sequestro formam um complexo com a actina-G, impedindo-a de se polimerizar. Eles fornecem um reservatório de actina monomérica, que a célula pode usar quando precisar formar novos filamentos.
Como uma célula controla a formação, a ligação, a cobertura e separação dos seus microfilamentos? Pelo menos algumas proteínas que se ligam à actina especialmente as de separação e algumas de cobertura e de espaçamento são reguladas por fluxos de íons cálcio, que é conhecido como um importante mensageiro celular. Os fatores de separação podem
responder a certos lipídeos; "in vitro" os lipídeos fazem com que os fatores de separação desprendam seu complemento de actina-G. Parece que algumas células também controlam a arquitetura dos seus microfilamentos, alterando as proporções relativas das várias proteínas que se ligam a actina.
Proteínas que se ligam a actina influenciam a organização da rede de actina, mas também a sua atividade. As proteínas de cobertura e de separação, por exemplo, podem participar de alguns tipos de locomoção da célula e em movimentos dentro da célula, através do controle de encurtamento e do alongamento local dos filamentos de actina. O motor de reconhecimento do movimento celular e, provavelmente, de certos aspectos do transporte intracelular é ainda outra proteína que se liga a actina, a miosina. Junto com a actina, a miosina pode converter a energia química do ATP em movimento contrátil. A miosina é de fato uma ATPaze, enzima que quebra o ATP transformando-o em ADP. A sua atividade é estimulada quando ele está ligado a actina-F.
A associação de miosina com actina-F está bem estabelecida em células musculares, onde as 2 proteínas formam ordenadamente unidades contráteis, conhecidas como sarcômeros. O citoplasma de células não-musculares contém uma quantidade bem menor de miosina, numa disposição bem menos ordenada. Ao invés de formar os filamentos grossos e bipolares, típicos do músculo, a miosina está morfologicamente solta no meio da organização citoesquelética, que é visível em elétron-micrografias comuns. A microscopia de imunofluorescência, contudo, confirma a sua presença entre os microfilamentos.
A importância da miosina na contração pode ser demonstrada "in vitro", e a provável bioquímica do processo já foi revelada. Novamente, um fluxo de íons cálcio atua como gatilho. A quinase de miosina, outra proteína associada com microfilamentos, junto com a calmodulina, uma substância que controla muitos efeitos do cálcio, altera a
configuração das moléculas de miosina. Estas se esticam e se agrupam em pequenos filamentos bipolares. Os íons de cálcio também ativam fatores de separação, os quais cortam áreas da rede de actina. Os filamentos bipolares de miosina, então, ligam-se a ambos os lados dos filamentos de actina corretamente alinhados e, na presença de ATP, cada filamento desliza ao longo do ooutro. Também é possível que as moléculas de miosina, apropriadamente ancoradas, se liguem em filamentos simples de actina.
Uma prova direta de que, juntas, actina-F e miosina convertem a energia química armazenada como ATP em movimento, vem de um experimento recente feito com proteínas purificadas. Um sistema de filamentos de actina, correndo em paralelo, e tendo polaridade idêntica foi ligado a um filme de carbono. Pequenas bolas de poliestireno, às quais moléculas de miosina foram ligadas, então, foram colocadas sobre actina. Quando ATP foi adicionado ao sistema, foi observado o movimento das bolas ao longo dos filamentos. A taxa de movimento foi compatível com a velocidade de contração do músculo e de certas formas de movimentos da célula. Exatamente como uma célula viva traduz este movimento ao nível molecular, em locomoção da célula e em movimento intracelular de organelas, ainda não se sabe.
A relação da rede de microfilamentos com a arquitetura da célula é melhor conhecida do que o papel da rede no movimento. Microfilamentos dominam a parte mais periférica do citoplasma, portanto têm uma forte influência nas características da superfície de célula. Um esqueleto especializado baseado em actina existe próximo a membrana plasmática de algumas células. Em certas células é possível purificar e isolar todo esse esqueleto. Técnicas imunológicas e bioquímicas revelaram a constituição bioquímica da estrutura da proteína isolada.
Exatamente abaixo da membrana plasmática de células vermelhas do sangue, filamentos mais curtos de actina e uma proteína que se liga à actina formam uma rede bidimensional que parece ser a responsável pela flexibilidade da célula, uma característica que permite a estas células passarem através de capilares extremamente finos. As cadeias de actina que provavelmente contêm apenas cerca de uma dúzia de monômeros de actina, situam-se nas junções de rede, sendo interconectadas por longas moléculas de um fator de espaçamento, a espectrina. Uma terceira proteína, a anquirina, liga os cruzamentos de espectrina a uma proteína transmembrana majoritária (proteína que atravessa a membrana plasmática) e ancora a rede, outras proteínas ajudam a estabilizar a arquitetura básica.
A superfície exposta de uma célula epitelial intestinal tem topografia mais complexa, e uma armação citoesquelética mais intrincada a sustenta. Uma única célula carrega umas mil projeções na forma de dedos conhecidas como microvilosidades, que se adicionam a área de superfície através da qual nutrientes são absorvidos. As microvilosidades são carregadas com enzimas digestivas e sistemas bioquímicos de transporte que processam os nutrientes. Cada microvilosidade é estabilizada por um feixe de actina-F, no qual as proteínas vilina e fimbrina atuam como fatores de formação de feixes. Uma série de pontes arranjadas em forma de hélice ligam o feixe à membrana plasmática da microvilosidade. A proteína das pontes não foi completamente caracterizada, mas pode ser uma proteína transmembrana que se extende para alcançar o feixe de actina. Na base do feixe, os filamentos são enraizados numa rede horizontal que parece ser dominada por um fator de espaçamento do tipo espectrina. A rede mantém o núcleo dos filamentos no lugar e, desse modo, estabiliza a microvilosidade.
Micrografias eletrônicas têm mostrado muitos outros tipos de interação entre microfilamentos e membranas da superfície celular. Muitas destas interações têm,
certamente, significância estrutural, como em células vermelhas do sangue e no epitélio intestinal; os detalhes moleculares desta interações não são tão bem entendidos em outras células.
Também é provável que a rede de microfilamentos sob a membrana plasmática tenha uma importante atuação na fisiologia da célula. Na célula vermelha do sangue, a proteína transmembranar, conhecida com banda III, por sua posição em géis eletroforéticos fornece uma ancoragem para certas enzimas glicolíticas que medeiam a quebra da glicose. A banda III também atua como um canal, permitindo a troca de íons através da membrana, proporcionando às células vermelhas descarregar dióxido de carbono, à medida que passam através do tecido do pulmão, onde também adquirem oxigênio. Em outros tipos de células, certas proteínas quinases (substâncias que têm papel regulador na fisiologia da célula) estão presentes na rede localizada sob a superfície. Além disso, sinais recebidos na superfície externa da membrana, co-receptores que se ligam às moléculas mensageiras, podem afetar diretamente a rede próxima à superfície.
Certos vírus de tumores também podem agir na rede próxima à superfície. Em células transformadas, proteínas codificadas por oncogenes (genes que induzem câncer) de vírus podem se localizar dentro da rede. Tais proteínas podem causar mudanças dramáticas no citoesqueleto, em algumas situações mostrou-se que agem por fosforilação (adicionando um grupo fosfato à proteínas citoesqueléticas específicas).
O segundo sistema de filamentos, os microtúbulos, difere dos microfilamentos na sua organização geral, como mostram as micrografias de imunofluorescência. Também tem um conjunto diferente de funções. Parece ser um fator importante na organização e transporte intracelular, assim como na arquitetura da célula como um todo. Microtúbulos assemelham-se aos microfilamentos, no fato de terem uma única proteína estrutural
majoritária. Uma substância chamada de tubulina é o conteúdo dos microtúbulos e também das organelas relacionadas aos mesmos, como os cílios e flagelos (dois tipos de apêndices com os quais certas células se propagam ou se movem circundando líquidos ou partículas), os corpos basais aos quais os cílios e flagelos estão ligados, e os centríolos.
Como a actina dos microfilamentos, a tubulina também forma polímeros. A tubulina é uma proteína globular que consiste de dois polipeptídeos similares porém distintos, α-tubulina e β-α-tubulina. A polimerização da α-tubulina pode ser observada “ in vitro”. Na presença de trifosfato de guanosina (GTP), um composto carregador de energia similar ao ATP, os dímeros de tubulina (as moléculas de duas partes feitas de α-tubulina e β-tubulina) se juntam para formar um tubo com o centro oco (É impressinante que vinte anos depois da estrutura dos microtúbulos ter sido observada através do microscópio eletrônico, ainda não se sabe se o espaço central, que tem em torno de dez nanômetros de diâmetro, tem alguma função).
Estudos microscópicos e bioquimicos sugerem que os microtúbulos, como os microfilamentos, estão associados a outras proteínas que influenciam a sua organização e atividade. A microscopia eletrônica mostra que várias proteínas associadas se projetam da parede dos microtúbulos para o citoplasma, às vezes, por dezenas de nanômetros, a sua função pode ser ligar os microtúbulos com outros componentes citoplasmáticos ou definir uma zona protegida ao redor de cada microtúbulo.
As propriedades bioquímicas da tubulina apontam para a existência de outras proteínas associadas. Como a actina-F, os microtúbulos apresentam uma polaridade “in vitro”: uma ponte tende a se extender por polimerização, enquanto a outra tende a se encurtar, levando a um processo de polimerização similar ao demonstrado para a actina-F. Assim, certas proteínas ou substâncias mais complexas podem atuar como fatores de
cobertura (“capping”), exercendo efeitos pronunciados na formação e quebra dos microtúbulos. “In vitro” centrossomos parecem coordenar a montagem de microtúbulos que crescem e encolhem. A instabilidade dinâmica pode explicar certos aspectos do comportamento dos microtúbulos “in vivo”, particularmente no fuso mitótico. De forma interessante, pontas de microtúbulos contendo GTP (a forma rica em energia) parecem ser mais resistentes ao encutamento por despolimerização do que pontas com uma grande proporção de GDP.
Algumas proteínas associadas à tubulina podem estar presentes apenas em estágios específicos na existencia de uma célula ou em compartimentos específicos da célula, o que sugere que estas devem ter funções únicas. Há indicações, por exemplo, de proteínas associadas, que são únicas para a tubulina do fuso mitótico. Em neurônios, diferentes proteínas parecem estar associadas com microtúbulos nos dendritos e nos axônios. Em cílios e flagelos, a tubulina se liga a uma proteína flexível conhecida como dineína. Como a miosina, a dineína é uma ATPase, e dá força ao movimento de batimento de cílios e flagelos.
Dineína ou outros análogos de miosina dependentes de ATP, podem também se ligar a tubulina no citoplasma. Se tal associação realmente ocorrer, um sistema citoplasmático de tubulina e dineína pode fornecer uma base extra para o movimento celular. A tubulina também pode suportar algum movimento através de fatores de cobertura (“capping”) e o encurtamento ou crescimento dos microtúbulos.
Um mecanismo diferente baseado na tubulina e numa suposta proteína associada à tubulina pode transportar vesículas ao longo do axônio de células nervosas, e talvez, mover outras organelas dentro do citoplasma. Um recente estudo “in vitro”, mostrou que vesículas isoladas de axônios gigantes de lula se movem ao longo de microtúbulos purificados, a
velocidades acima de 1 μm/s quando ATP e uma mistura bruta de proteínas celulares são adicionadas. Pensa-se que uma proteína na mistura, ainda não identificada, atua como translocador, provavelmente se ligando tanto a vesículas como a microtúbulos. O translocador hipootético atuaria como uma ATPase, quebrando o ATP para liberar energia necessária para a translocação de vesículas.
Os detalhes da dinâmica microtubular no citoplasma permanecem desconhecidas, a evidência para o seu papel estrutural é forte. As polaridades de todos os microtúbulos irradiando do centrossomo são provavelmente idênticas. Se uma célula é tratada com a droga chamada colcemide, os seus microtúbulos se despolimerizam e praticamente desaparecem. Quando a droga é retirada através de lavagem, os microtúbulos reaparecem numa maneira unidirecional, se alongando para fora do centrossomo numa taxa de aproximadamente 1 μm/min (temperatura de 37º C), que é a mesma taxa observada quando a tubulina se polimeriza “in vitro”. Com 75 minutos, reaparece um arranjo microtubular similar ao de uma célula normal. A natureza direcional dos microtúbulos sugere que poderiam atuar como guias para o transporte radial dirigido dentro da célula.
Os microtúbulos também parecem ter uma participação no estabelecimento de uma forma distinta e na orientação de certas células. Um fibroblasto (célula do tecido conjuntivo), por exemplo, é assimétrico e exibe uma margem pregueada e uma cauda delgada, a medida que se move através de um substrato. Quando tal célula é tratada com a droga colcemida, causando o desaparecimento de microtúbulos, se torna mais simétrica e a sua locomoção pára.
Tal tratamento também causa distúrbios visíveis aos trabalhos da célula. O movimento característico de organelas e certas visículas intracelulares (movimentos direcionados e intermitentes) pára. As membranas do Aparelho de Golgi se tornam
desordenadas e afastam-se da sua localização normal, perto do centrossomo, e o sistema de canais interconectados que fazem o retículo endoplasmático parece retrair. Alterações nos microtúbulos de células não-epiteliais também parecem afetar outro sistema de fibras, os filamentos intermediários (estes se retraem para o interior da célula e se enrolam ao redor do núcleo).
Experimentos com outras drogas que causam distúrbios no arranjo normal dos microtúbulos forneceram mais evidencias de que os microtúbulos definem a ordem espacial dentro da celula. Taxol, uma droga que promove a polimerização da tubulina, faz com que os microtúbulos de uma célula formem feixes que não mais se conectam ao centrossomo, efeitos similares resultam da injeção de anticorpos específicos para a tubulina.
Microtúbulos, então, parecem estabilizar a geometria da célula atuando como trilhos que orientam outros fenômenos celulares. Em células de dimensões limitadas, tal direcionamento pode não ser necessário, ao menos, para o transporte intracelular: o movimento “Browniano” aleatório deve ser suficiente para levar vesíulas e outras organelas para seus sítios próprios dentro da célula. Entretanto, em células altamente assimétricas, como os neurônios, cujos axônios se extendem por vários metros em alguns animais, o direcionamento pode ser essencial para o transporte dentro da célula.
Sabe-se menos sobre a função dos filamentos intermediários, o terceiro elemento do citoesqueleto. Também é mais difícil se generalizar sobre a sua bioquímica. As proteínas básicas dos filamentos intermediários são codificadas por uma única família de genes, mas diferentes genes da família são expressos em diferentes tipos de células e tecidos. Por volta do final dos anos 70, estudos bioquímicos e imunológicos mostraram que os genes para proteínas dos filamentos intermediários são expressos de acordo com o caminho (linhagem) seguido pelo tecido durante a embriogênese.
A diversidade de caminhos da origem a 5 tipos de filamentos intermediários bioquimicamente distintos: queratinas em células epiteliais, neurofilamentos nos neurônios, desmina no músculo, filamentos gliais em células gliais (células-suporte do cérebro, medula espinhal e sistema nervoso periférico) e vimentina em células de origem mesenquimal, como as do tecido conjuntivo e de vasos sanguíneos e linfáticos. Existem subtipos dentro das queratinas epiteliais, mais de 20 diferentes moléculas foram catalogadas no tecido humano, algumas das quais específicas para epitélios distintos morfologicamente.
Todas as moléculas das proteínas dos filamentos intermediários têm uma região central em forma de bastão e de comprimento invariável. Dentro dessa região, as proteínas são muito similares ( de 30 a 70% dos aminoácidos constituintes é idêntica). A região em forma de bastão é a base estrutural de montagem dos filamentos intermediários. Uma secção transversal através de um único filamento de 10 nm, mostraria em torno de 30 moléculas num arranjo entrelaçado. Diferente da polimerização de microfilamentos e microtúbulos que se dá a partir de subunidades globulares, a montagem dos filamentos intermediários não requer ATP ou GTP.
As regiões terminais das proteínas dos filamentos intermediários são muito mais variáveis em tamanho e na composição de aminoácidos do que as regiões centrais. Em geral, as regiões terminais não participam da ligação de moléculas ao filamento. Essas regiões provavelmente se extendem do filamento para o citoplasma, onde podem funcionar ligando o filamento com outros componentes estruturais. Uma ponta da maior proteína dos neurofilamentos, por exemplo, é a responsável pelas pontes intercruzadas que são vistas ligando neurofilamentos axonais vizinhos em eletromicrografias.
Como os outros sistemas de filamentos, os filamentos intermediários têm um conjunto de proteínas associadas, das quais apenas algumas são conhecidas. O papel e a
função da rede inteira continuam um pouco evasivo. Quando anticorpos contra proteínas dos filamentos intermediários são injetados em células em cultura, a locomoção e a divisão celular não parecem ser afetadas. Filamentos intermediários podem ter um papel na dinâmica celular que seja difícil de se identificar em células isoladas crescidas numa cultura de laboratório.
Em algumas células e tecidos parece que filamentos intermediários têm um papel estrutural. Acredita-se que uma das pontas dos filamentos intermediários se liga à membrana que envolve o núcleo, e sabe-se que nas células epiteliais muitos dos filamentos de queratina estão ancorados em regiões especializadas da membrana da superfície da célula, conhecidas como desmossomos. Estes são um tipo de junção intercelular que serve para manter células vizinhas juntas. Num desmossomo, proteínas especializadas em cada célula se extendem através da membrana e projetam a ponta de uma glicoproteína para a superfície externa, estas interagem com outras similares na outra metade do desmossomo para unir as células. Juntos, as fibras de queratina e os desmossomos integram o epitélio, dando-lhe estabilidade e resistência. Em algumas células não-epiteliais os filamentos intermediários podem se ligar a uma rede de actina e espectrina que fica sob a membrana.
Os 3 sistemas de filamentos não são unidades completamente separadas independentes da arquitetura da célula. As semelhanças no arranjo dos microtúbulos e dos filamentos intermediários e os efeitos que os filamentos intermediários sofrem quando os microtúbulos de células não-epiteliais são rompidos, sugere que os dois sistemas são ligados, provavelmente por proteínas associadas. Também parece que os microtúbulos podem atuar como um esqueleto no qual a estrutura mais permanente dos filamentos intermediários está erguida. Eletromicrografias também sugerem conexões entre microtúbulos e filamentos intermediários. Na verdade, a noção de que os três sistemas de
filamentos formam uma rede integral com a qual organelas e talvez enzimas e proteínas solúveis podem estar associadas é amplamente discutida.
Alguns investigadores propuseram que um quarto sistema fibroso integra os outros sistemas de filamentos. Essa “rede microtrabecular”, cuja existência surgiu a partir de certas eletromicrografias de alta voltagem, parece ser uma rede irregular de fibras finas cujo diâmetro varia de menos de 2 nm até mais de 10 nm, todos os outros elementos fibrosos na célula, assim como suas organelas, poderiam estar embebidos na “microtrabécula”, que atuaria como a substância de base da célula. O conjunto de proteínas da “microtrabécula” seria diferente dos outros três sistemas, mas é improvável a existência de uma proteína principal adicional.
Ao invés de ser um quarto sistema, a rede vista nas micrografias provavelmente reflete as intrincadas interconexões e interdigitações dos três sistemas estabelecidos bem como alguns artefatos técnicos artificiais das estruturas do citoesqueleto. Também é possível que durante a preparação de espécimes para microscopia eletrônica de alta voltagem, proteínas dissolvidas no citoplasma se fixem sobre os arranjos filamentosos, aumentando a sua aparente complexidade. De fato, as técnicas de fixação resultaram em eletromicrografias de alta voltagem nas quais o sistema microtrabecular está essencialmente ausente.
Exatamente porque ainda não é possível descrever a matriz celular como uma estrutura única, um entendimento geral do seu papel na dinâmica da célula está emergindo tão vagarosamente. Microfilamentos são cruciais para locomoção da célula e movimento de superfície, e os microtúbulos são cruciais para mitose, mas os detalhes moleculares dos seus papéis são totalmente desconhecidos. Na verdade, não está claro se a matriz é necessária, ou se somente melhora, uma determinada função celular. É possível concluir,
por exemplo, que o processo fundamental para locomoção da célula é a extensão da sua borda através da adição de membrana; a contração dos microfilamentos mediada pela miosina serviria, então, como um mecanismo de avanço necessário para empurrar o resto da célula para trás da membrana em movimento.
As técnicas de genética molecular podem ajudar a clarear a função das proteínas do citoesqueleto. Já foi mostrado que certas mutações no gene que codifica a actina de levedura atrapalham a síntese, a montagem e a integridade da membrana plasmática e o movimento de vesículas secretórias para a superfície da célula, estes dados levam a conclusão que os microfilamentos participam de ambos os processos. A criação de mutações em sítios específicos nos genes que codificam os elementos citoesqueléticos, e a introdução, em células, de DNA clonado (que codifica proteínas citoesqueléticas alteradas) deveria tornar possível a observação dos efeitos de não apenas uma simples alteração na matriz, como também de múltiplas mudanças. Tais técnicas deveriam elucidar as interrelações estruturais e dinâmicas entre as proteínas do citoesqueleto.
Ainda resta muito a se aprender sobre a matriz celular. O que é sabido já contribuiu para o diagnóstico e pesquisa em patologia humana. Já que certas proteínas da matriz, e em particular aquelas dos filamentos intermediários, variam de tecido para tecido, as proteínas fornecem uma base para a distinção de tipos celulares. A habilidade para classificar células corretamente é crucial para o diagnóstico do câncer, que pode gerar metástase (ir para outros tecidos) regiões que ficam longe do tecido a partir do qual se originou. O tratamento apropriado pode depender do conhecimento da origem celular do tumor.
A tipagem dos filamentos intermediários através da microscopia de imunofluorescência distingue os principais grupos de tumores. Desse modo, queratinas são encontradas em carcinomas (tumores de origem epitelial), a proteína de filamento glial em
tumores de origem glial, desmina em sarcoma de células musculares, vimentina em linfomas e sarcomas não-musculares, e as proteínas dos neurofilamentos em tumores originados no sistema nervoso simpático. No caso de carcinomas, as várias formas de queratinas tornam possíveis distinções diagnósticas mais exatas (exemplo, entre carcinomas de células escamosas e adenocarcinomas). A técnica permite a patologistas caracterizar rapidamente e sem ambiguidade de 5 a 10% dos tumores que são difíceis de diagnosticar usando colorações patológicas convencionais. Já que o método é extremamente sensível, também pode ser usado para detectar desde micro-metástases de poucas células até nódulos linfáticos ou medula espinhal.
A tipagem dos filamentos intermediários tem outras aplicações médicas.. Combinado com amniocentese pode revelar certas mal-formações congênitas. A presença no líquido amniótico de células contendo filamentos gliais ou neurofilamentos, por exemplo, pode indicar um feto com mal-formação do sistema nervoso central. A técnica também revelou anormalidades dos filamentos intermediários no músculo de pacientes sofrendo de certos tipos de desordem no coração e no sistema músculo esquelético, no fígado dos alcólicos e no cérebro de pessoas com a Doença de Alzheimer. Tais aplicações ilustram como a pesquisa básica em biologia celular pode contribuir para o diagnóstico e entendimento de doenças humanas.
