12/04/2012. aplicações para o diagnóstico direto em doenças transmissíveis. Identificar um agente pelas características de seus ácidos nucléicos

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(1)12/04/2012. Inferir sobre a presença de um agente pela presença de seus ácidos nucléicos. . •. aplicações para o diagnóstico direto em doenças transmissíveis . Presença de ácidos nucléicos de um agente significa infecção ativa?. Identificar um agente pelas características de seus ácidos nucléicos DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR. 1. ?. 2. ?. 3. 4. 5. 6. Genoma, Genes, DNA, RNA. . Genomas. . • • • • • •. Nuclear Mitocondrial Cloroplastos e apicoplastos Bacteriano Viral Príons e viróides. 1.

(2) 12/04/2012. Cerca de 10.000 minicírculos e 50 maxicírculos por complexo. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 2.

(3) 12/04/2012. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 3.

(4) 12/04/2012. RNA. proteína. Diferentes alvos para objetivos específicos. . • •. •. viróides e prions são moléculas infecciosas. 1 organismo = 1 alvo 1 organismo = “n” alvos SENSIBILIDADE ANALÍTICA alvo exclusivo para um dado organismo ESPECIFICIDADE ANALÍTICA. 19. 20. 21. 22. Mutações. . •. Substituições. •. Inserções e deleções. •. Recombinações. Introdução Técnicas de biologia molecular Diagnóstico de doenças infecciosas. Caracterização de microrganismos Tipificação de microrganismos Divisão de microrganismos em grupos definidos Métodos utilizados. Detecção de agentes etiológicos Caracterização dos agentes etiológicos detectados Métodos fenotípicos. Métodos genotípicos. características observáveis. constituição genética ou carga. resultantes da interação do. genética particular de um. genótipo com o meio ambiente. indivíduo. 4.

(5) 12/04/2012. Métodos fenotípicos. Métodos fenotípicos. Características morfológicas Biotipagem. Sensibilidade a antibióticos. Atividade bioquímica frente a substratos diversos. Métodos fenotípicos. Fagotipagem. Métodos genotípicos Classificação dos organismos de acordo com a variabilidade. •. Sorotipagem Eletroforese protéica. Antibiograma. genética observada Maior capacidade de detecção de variabilidade entre. •. microrganismos •. Diferenças nas seqüências de nucleotídeos. •. Associação a determinadas características fenotípicas do organismo. ou a outras características importantes Marcadores para características de interesse = marcadores moleculares. •. Sensibilidade bacteriana à infecção por vírus bacteriófagos. Determinação do padrão protéico. Variabilidade genotípica. A. T. G. A. A. T. A. T. G. C. C. A. T. G. C. T. A. Deleção T. A. Duplicação. Substituição. A. T. Inserção C. T. A. A. T. G. A. C. T. A. Origem da variabilidade genotípica. A. T. G. C. T. A. T. A. C. G. A. T. A. T. G. G. A. T. T. A. C. C. T. A. Translocação. 5.

(6) 12/04/2012. Variabilidade genotípica. Marcadores moleculares Marcadores para identificação de gênero de. microrganismos. Diferentes regiões do genoma = diferentes taxas de mutação. Regiões conservadas entre diversos indivíduos do gênero do microrganismo de interesse Variabilidade quando comparadas com outros gêneros de. Regiões variáveis x regiões conservadas. microrganismos Marcadores para discriminação de espécies dentro de um gênero de microrganismo. Escolha do marcador: objetivos da caracterização. Variáveis quando se compara indivíduos de diferentes espécies Conservadas entre diferentes cepas de uma mesma espécie. Brucella ovis. Alinhamento do gene codificador da unidade 16S do RNA ribossomal Diversas espécies de Brucella Região conservada. Alinhamento do gene omp2 (Outer Membrane Protein) Diversas espécies de Brucella. Região de variabilidade. Marcadores moleculares. Identificação de diferentes cepas (variantes) dentro de uma mesma espécie de determinado microrganismo. Regiões que apresentem com variabilidade intra-específica Alinhamento gene codificador proteína capsídeo Isolados de Calicivirus felino Região de alta variabilidade. Variabilidade associada a características importantes. 6.

(7) 12/04/2012. Marcadores moleculares Marcador de resistência a antibióticos. Marcadores moleculares Marcadores de fatores de virulência. Mutações ou aquisição de genes relacionados à resistência. Cepas comensais. microbiana a antibióticos. Cepas patogênicas. E coli. Cepas resistentes: presença da mutação / gene Cepas sensíveis: ausência da mutação / gene. Identificação de genes codificadores de fatores de virulência. Marcadores moleculares Marcadores de especificidade de hospedeiros Giardia duodenalis. Fatores de virulência Fímbrias: adesão Toxinas: diarréia. Marcadores moleculares Distribuição de microrganismos no tempo / espaço e transmissão Variantes genotípicas de microrganismos agrupadas em determinadas localidades ou ocorrendo em determinados períodos Comparação de microrganismos oriundos de diferentes localidades e períodos. Determinação de rotas de transmissão de agentes infecciosos numa Gene codificador da enzima da glutamato desidrogenase (gdh). população Identificação de fontes de infecção na ocorrência de surtos. Genótipos A e B: humanos e animais Genótipos E: “livestock” Genótipos F: felinos Genótipos C: cães. Métodos de caracterização. Identificação de fatores de risco Auxílio no controle e prevenção da infecção. Métodos de caracterização Capacidade de tipagem: refere-se a habilidade da técnica em atribuir um “tipo” bem definido para cada isolado. Técnicas que não dependem de conhecimento prévio da seqüência de DNA do organismo a ser caracterizado. Técnicas que dependem de conhecimento prévio da seqüência de DNA do organismo a ser caracterizado. Reprodutibilidade: refere-se a habilidade da técnica em acessar o mesmo perfil de determinada amostra independente da ocasião Estabilidade: refere-se a estabilidade dos marcadores acessados pela técnica que não se alteram com facilidade caracterizando a amostra em questão Poder discriminatório: capacidade de discriminar cepas altamente similares. 7.

(8) 12/04/2012. Métodos de caracterização. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Eletroforese em campo pulsátil Digestão do DNA genômico com enzimas de restrição e posterior. Técnicas que não dependem de conhecimento prévio da seqüência de DNA do organismo a ser caracterizado. eletroforese dos fragmentos de DNA gerados Enzimas de restrição = endonucleases Produzidas por bactérias Clivagem de DNA estranho Proteção contra infecção por bacteriófagos. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Enzimas isoladas de bactérias e produzidas em laboratório Reconhecimento de seqüências de DNA específicas de 4 a 8 bp Sítios de restrição Clivagem da dupla fita de DNA nestes sítios Cada enzima é específica para uma determinada seqüência de DNA Utilizadas em estudos de genotipagem de microrganismos. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). seqüências palindrômicas. Diferentes organismos. Diferenças na localização e no número de sítios de restrição Variabilidade genotípica Fonte: www-math.mit.edu. 8.

(9) 12/04/2012. EcoRI. A. G A A T TC C T TAA G. EcoRI. G TATT C CATAA G. B. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Extração do DNA genômico (total) do microrganismo de interesse. Reação de restrição enzimática. AAT T C G. G TATT C CATAA G. Clivagem do DNA extraído de acordo com a presença de sítios de restrição. G C T TAA. Eletroforese em gel de agarose para visualização dos fragmentos de 2 fragmentos de DNA. 1 fragmento de DNA. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). DNA gerados. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Visualização dos fragmentos gerados Eletroforese em gel de agarose Organismo A. Organismo B. Fragmentos maiores do que 25 kb Não separados pela eletroforese convencional Gel de agarose a 0,8 a 1,2 % Separação de fragmentos de 10 a 800 kb Mudança periódica na orientação do campo elétrico através do gel (pulsos). Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). 9.

(10) 12/04/2012. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Figure 2. Example of a real PFGE; drug resistant Staphylococcus aureus. The molecular weight markers are digested lambda phage (λ) and are given in kb. Fonte: www.bio.davidson.edu. 10.

(11) 12/04/2012. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Vantagens. Alta reprodutibilidade. Alto poder discriminatório: discriminação de microrganismos relacionados. Extração de DNA. Aplicada para caracterização de grande variedade de organismos. www.icampus.ucl.ac.be. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Desvantagens. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Utilização. Utilização apenas em microrganismos isolados Incubações prolongadas para extração. Staphylococcus aureus: variabilidade intra-específica. Eletroforese prolongada Alto custo do equipamento Dificuldade de comparação de resultados obtidos entre diferentes. Gênero Brucella spp: identificação de espécies de Brucella e baixa variabilidade intra-específica. laboratórios. Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD. Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD. Reação de PCR com primers randômicos, aleatórios. Extração de DNA do organismo de. Único primer com 8 a 10 bp. interesse. Primers não específicos. Reação de amplificação em condições. Sem conhecimento prévio da seqüência alvo. de baixa estringência. Pareamento a diversos loci do genoma. Amplificação em sítios de pareamento. Amplificação de múltiplos produtos. imperfeito. Distância entre sítios de hibridização. Visualização dos produtos amplificados. ACGTCCAG ACGACCAG. ACGTCCAG ACGTCTAG. em eletroforese em gel de agarose. 11.

(12) 12/04/2012. Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD. Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD Cepa 1. Número e localização dos sítios de pareamento variam entre diferentes cepas. Cepa 2. Variabilidade nas seqüências de nucleotídeos. Fingerprinting. Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD Cepa 1. Cepa 2. Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD. Vantagens. Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD Desvantagens Baixa reprodutibilidade. Alto poder discriminatório. Condições de amplificação, equipamentos Bandas de diferentes intensidades: diferentes eficiências de. Caracterização intra-específica de diversos organismos. amplificação em diferentes sítios Concentrações definidas de DNA extraído. Baixo custo. Dificuldade de análise e comparação de resultados Utilização apenas em isolados. 12.

(13) 12/04/2012. Random Amplified Polymorphic DNA - RAPD. Métodos de caracterização. Utilização. Caracterização intra-específica. Staphylococcus e Enterobacteriaceae. Técnicas que dependem de conhecimento prévio da seqüência de DNA do organismo a ser caracterizado. Brucella: variabilidade intra-específica. Seqüenciamento PCR e posterior determinação direta da seqüência de nucleotídeos do produto amplificado Identificação de seqüências variáveis Possibilidade de caracterização de organismos diretamente em materiais clínicos Custo do equipamento e reagentes Banco de dados de seqüências geradas: comparação direta de seqüências. Desenho de primers específicos. Reações de PCR utilizando primers para identificação de marcadores específicos Pesquisa por regiões de interesse: seqüências disponíveis nos bancos de dados Alinhamento das seqüências disponíveis. Identificação das regiões de interesse: grau de variabilidade compatível com o objetivo da caracterização. 13.

(14) 12/04/2012. Primer primer reverse B. ovis. primer foward. Gene omp2 Marcador Brucella ovis. primer reverse demais brucelas. Primer. foward. reverse. Deleção de 50 bp na cepa 2 100 bp. 100 bp Cepa 1 = 250 bp Cepa 2 = 200 bp. Desenho de primers específicos Vantagens. Primers específicos: resultados reprodutíveis. Possibilidade de utilização em materiais clínicos Proteína capsídeo Calicivírus felino. Rápida detecção e caracterização de microrganismos. Desenho de primers específicos. PCR - RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism. Desvantagens Amplificação de um fragmento de DNA de interesse utilizando Conhecimento prévio da seqüência alvo. primers específicos (PCR). Constante atualização. Purificação e digestão do produto amplificado com enzimas de restrição. Análise por eletroforese. 14.

(15) 12/04/2012. ATCGGTCAGGGATCGAGCGTTACGGGTCCGATTTCAGCCGGTGCCAGCGGTCTCG Primer foward. Marcador para Brucella canis. Primer reverse. ATCGGTCAGGGATCGAGCGTTACGGGCCCGATTTCAGCCGGTGCCAGCGGTCTCG. Gene omp 31. Primer foward. Primer reverse. GGTCC Sítio de restrição da enzima AvaII. B. canis. demais. B. canis. PCR - RFLP. demais. Vantagens Alta reprodutibilidade: primers específicos Baixo custo. Desvantagens Purificação do produto amplificado. Reação de restrição enzimática. Poder discriminatório: restrito ao lócus amplificado. Alguns casos: necessidade de grande número de enzimas. PCR - RFLP. Elementos repetidos. Utilização - Brucella omp 2. omp 31. omp 25. 13 enzimas. 4 enzimas. 9 enzimas. Seqüências de nucleotídeos que se repetem ao longo do genoma. B. abortus bt. 1, 2 e 4 B. suis bt. 1 e 2 B. suis bt. 5. B. suis bt. 2. B. melitensis bt 1, 2, 3. B. neotomae. B. canis. B. ovis. B. ovis. B. ovis. Mamíferos marinhos. Genoma de eucariotos e procariotos. Diversos arranjos de repetições. Intra-específico: B. melitensis e B. ovis. 15.

(16) 12/04/2012. Seqüências de inserção TTTGCTAT. AGGCTT. Insertion sequences - IS Seqüências de nucleotídeos que se repetem ao longo do genoma de maneira dispersa Diferentes números e localizações de acordo com a espécie. ou cepa Elementos móveis. Seqüências de inserção B. suis bt. 1. IS 711. Vantagens. 285 bp. B. abortus. IS 711. 498 bp. bt. 1, 2, 4. IS 711. B. melitensis. Primers específicos: alta reprodutibilidade Possibilidade de utilização em materiais clínicos. Desvantagens. 731 bp. Elementos móveis B. ovis. IS 711. Objetivo ?. Marcador de espécie ou marcador intra-específico. 976 bp. Microssatélites. Microssatélites: unidade repetida entre 1 e 6 pares de bases Minissatélites: unidade repetida entre 7 e 100 pares de bases. Definição. Satélites: unidade repetida maior que 100 pares de bases Seqüências de nucleotídeos que se repetem ao longo do genoma. TTTTTTTTTT (Poli T) (unidade repetida = 1bp). Repetições arranjadas em tandem. ATATATATATATATATATATAT (unidade repetida = 2bp) GGCGGCGGCGGCGGCGGCGGC (unidade repetida = 3bp). Unidade repetição = CAGC. CAGCCAGCCAGCCAGCCAGCCAGC (unidade repetida = 4bp) ATTCTATTCTATTCTATTCT (unidade repetida = 5bp) 1. 2. 3. 4. 5. 6. ATGGCATAATGTTCAGCCAGCCAGCCAGCCAGCCAGCAAGCGACTGTACATGT. TAGCAATAGCAATAGCAATAGCAATAGCAA (unidade repetida = 6bp) AGGGCAGTAGGGCAGTAGGGCAGTAGGGCAGT (unidade repetida = 8bp). 16.

(17) 12/04/2012. Microssatélites Definição. Microssatélites Definição. Variable Number of Tandem Repeats (VNTR). CAGCCAGCCAGCCAGCCAGC. TTATCTTATCTTATCTTATC. Número Variável de Repetições em Tandem vntr. vntr. DNA - codificadora. Short Sequence Repeats (SSR). DNA -não codificadora. Pequenas Seqüências Repetidas proteína. Short Tandem Repeats (STR) Pequenas Repetições em Tandem. Microssatélites Variabilidade. Variabilidade. Regiões com elevada taxa de mutação → elevada variabilidade Resultante da variação no número de unidades repetidas. Organismo 1. Variabilidade observada inclusive entre indivíduos de uma mesma espécie Bactérias: variabilidade intra-específica Organismo 2. Humanos: padrões individuais Diferentes loci microssatélites → diferentes taxas de mutação. Microssatélites. Microssatélites Variabilidade. = AGGC. Variabilidade Nova fita. 1. 2. 3. 4. 1. 3. 4. 5. 5. Fita molde. Slipped-strand mispairing (SSM) 2. Pareamento errôneo das fitas de DNA durante a replicação in vivo Mecanismo de reparo da polimerase: adição e deleção de unidades repetidas. Nova fita. 1. 2. 3. 4. Fita molde. 1. 3. 4. 5. 2 1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. 4. 5. 17.

(18) 12/04/2012. Microssatélites. Microssatélites = AGGC. Variabilidade. Função na célula bacteriana. 2. 6. Nova fita. 1. 3. 4. 5. Fita molde. 1. 2. 3. 4. 5. Variabilidade em loci microssatélites = estratégia de adaptação bacteriana. 2. Mutação em loci microssatélites → alteração da expressão de. Nova fita. 1. 3. 4. 5. 6. Fita molde. 1. 2. 3. 4. 5. determinados genes Haemophylus 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 5. Neisseria Staphylococcus 1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Vantagens seletivas a determinadas populações bacterianas. Microssatélites Função na célula bacteriana. Microssatélites Microssatélites e genotipagem. Alteração na expressão de proteínas de superfície, impedindo o reconhecimento imunológico e possibilitando a colonização e sobrevivência bacteriana (E. coli) Expressão de adesinas e fatores de invasão de células do. Identificação de variantes dentro de determinadas espécies bacterianas Resistência a antibióticos. hospedeiro: colonização bacteriana. Diferentes graus de virulência. Aquisição de nutrientes. Loci microssatélites hipermutáveis: rastreamento de infecções. Resistência a antibióticos. Microssatélites. Microssatélites Metodologia para análise. Cepa 1. Microssatélites e genotipagem Primer 1. 8 bp. Região flaqueadora. Testes de paternidade. 8 bp. Primer 2. ATGGGCAT ATGGGCAT. 50 bp. Região flaqueadora 50 bp. 16 bp 116 bp. Estudos forenses. Cepa 2 Primer 1. Associação com determinadas enfermidades: neoplasias. Região flaqueadora 50 bp. 8 bp. 8 bp. 8 bp. ATGGGCAT ATGGGCAT ATGGGCAT 24 bp. Primer 2. Região flaqueadora 50 bp. 124 bp. 18.

(19) 12/04/2012. Microssatélites Metodologia para análise Cepa 1. Cepa 2. 124 bp. 116 bp. Bricker et al. (2003). Lócus 1. Microssatélites. Lócus 1. ATGGGCAT ATGGGCAT ATGGGCAT. Lócus 2. Depende do tamanho da unidade de repetição 2 50 bp. 50 bp. 2. AT. 2. 2. AT AT. 50 bp. TTGC TTGC TTGC. TTGC. 2. AT AT. 2. 2. 2. AT. AT. AT AT. 30 bp. ATGGGCAT ATGGGCAT. Lócus 2. Visualização do produto amplificado. 50 bp. 110 bp. 2 108 bp. 50 bp. 30 bp. GGCAATCGAT.... GGCAATCGAT.... Genoma. Genoma Cepa 1. Cepa 2. Brucella abortus. Brucella abortus. 160 bp. 50 bp. 30 bp 50 bp. GGCAATCGAT..... Lócus 3. 130 bp. 50 bp. Lócus 3 AAT. AAT. AAT. AAT. AAT. AAT. AAT. AAT. Cepas de Brucella abortus. ATGGGCAT ATGGGCAT ATGGGCAT. TTGC. ATGGGCAT ATGGGCAT. TTGC. Locus 1. cepa 1. TTGC. cepa 2 TTGC. Rastreamento do genoma para identificação de microssatélites Tandem Repeats Finder (http://tandem.bu.edu/trf/trf.basic.submit.html). Locus 2. Cepa de Brucella Cepa 1 Cepa 2. Número de alelos em cada lócus VNTR analisado Lócus 1 Lócus 2 3 1 2 3. Bancos de dados internacionais. 19.

(20) 12/04/2012. Microssatélites Vantagens. Microssatélites Desvantagens. Alto poder discriminatório (Le Fleche et al.,2006) Caracterização: amplificação de vários sítios microssatélites Espécie de Brucella B. canis (n = 17) B. abortus (n = 52) B. suis (n = 117) B. melitensis (n = 42) B. ovis (n = 24). Número de genótipos 8 41 99 33 19. Brucella: 15 microssatélites. Escolha dos sítios microssatélites que permitam a identificação adequada da característica desejada. Comparação de resultados obtidos entre diferentes laboratórios. Microssatélites Desvantagens. Microssatélites Desvantagens. “ Shadow bands ”. Estabilidade dos microssatélites Isolados mantidos em laboratório Variabilidade no número de repetições após repiques sucessivos. Microssatélites Utilização Caracterização de isolados de campo de Brucella abortus (Bricker et al 2003) Rastreamento epidemiológico: cepas com padrões iguais = origem comum 22 isolados de campo B. abortus provenientes de 10 rebanhos bovinos e 4 reservatórios silvestres (bisões e alces) (Bricker et al 2003) Relação entre isolados Localização geográfica  Isolados. provenientes do mesmo rebanho: padrão semelhante.  Padrões. únicos para cada rebanho.  Amostras. de B. abortus isoladas de bisões e alces: padrões únicos 12 0. 20.

(21) 12/04/2012. Epidemiologia Molecular  Conceitos e definições  Objetivos  Exemplos de estudos   . Giardia intestinalis Toxoplasma gondii Sarcocystis spp.. 12 1. Epidemiologia Molecular. Epidemiologia Molecular.  Conceitos e definições. Epidemiologia Molecular. Epidemiologia molecular não trata apenas de questões taxonômicas, filogenéticas ou de genética de populações, mas da aplicação destas áreas de conhecimento em questões epidemiológicas. Epidemiologia Molecular Técnicas moleculares NÃO substituem métodos “convencionais” (consagrados). Apenas tem maior poder de resolução pois permitem a identificação de maior número de caracteres. 21.

(22) 12/04/2012. Epidemiologia molecular X Análises de dados genéticos.  Traços geneticamente adquiridos que variam entre. indivíduos  Itens de uma seqüência gênica ou protéica que. variam entre indivíduos. Análises de dados genéticos  Identificação de “grupos genéticos”. Análises de dados genéticos  Correlações entre genótipo e fenótipo. Análises de dados genéticos  Objetivos  Identificação de “grupos genéticos”  Correlações entre genótipo e fenótipo  Reconstruções de histórias evolutivas  Inferências de “rotas de migração”. Análises de dados genéticos  Identificação de “grupos genéticos”. Análises de dados genéticos  Reconstruções de histórias evolutivas. 22.

(23) 12/04/2012. Análises de dados genéticos  Inferências de “rotas de migração”. Análises de dados genéticos Objetivos: marcadores moleculares  Itens de uma seqüência gênica ou protéica que. variam entre indivíduos  Diferentes regiões do genoma = diferentes taxas de. mutação. Análises de dados genéticos marcadores moleculares. Análises de dados genéticos Variação de sequência gênica  SNPs, inserções, deleções.  Genes nucleares (ribossômicos, constitutivos,. estruturais)  Introns  Genes extra nucleares (mitocôndria e outras. organelas com genoma próprio). Análises de dados genéticos Variação de sequência gênica  SNPs, inserções, deleções. 23.

(24) 12/04/2012. Proteína capsídeo Calicivírus felino. Análises de dados genéticos Variação de sequência gênica. Análises de dados genéticos Variação de sequência gênica.  Microssatélites.  Microssatélites. Análises de dados genéticos. Análises de dados genéticos. Variação de sequência gênica. Variação de sequência gênica.  Microssatélites.  Microssatélites. 24.

(25) 12/04/2012. Análises de dados genéticos. Análises de dados genéticos.  Microssatélites.  Microssatélites. Análises de dados genéticos. Análises de dados genéticos.  Microssatélites.  Microssatélites. Análises de dados genéticos. Giardia spp.: caracterização molecular. Marcadores para identificação de gênero de microrganismos Regiões conservadas entre diversos indivíduos do gênero do microrganismo de interesse Variabilidade quando comparadas com outros gêneros de microrganismos Marcadores para discriminação de espécies dentro de um gênero de microrganismo Variáveis quando se compara indivíduos de diferentes espécies Conservadas entre diferentes cepas de uma mesma espécie Marcadores para discriminação de indivíduos dentro de uma espécie de microrganismo Variáveis quando se compara indivíduos de diferentes espécies. forma ativa: divisão binária flagelada: móvel disco adesivo: adesão às células intestinais. 25.

(26) 12/04/2012. Giardia spp.: fase parasitária. Giardia spp.: ciclo de vida. desenvolvimento clínico assintomáticos cistos. ou sintomáticos. Encistamento: na luz intestinal, após soltar-se dos enterócitos. eliminados com as fezes. Giardia spp.: taxonomia. Giardia spp.: taxonomia. • + 40 espécies nomeadas de acordo com o hospedeiro: G. canis, G. bovis, G. caprae, etc. • FILICE (1952)  3 grupos distintos de acordo com o formato dos corpos medianos:  G. agilis  G. muris  G. duodenalis (G. intestinalis ou G. lamblia). Giardia spp.: taxonomia. Giardia duodenalis: diversidade. • • • • •. tpi gdh 16S β-giardin ef-1a. 26.

(27) 12/04/2012. cães. humanos + animais. felídeos. humanos humanos + animais. Giardia duodenalis: diversidade. Giardia duodenalis: diversidade. Grupos genotípicos assemblages. Tipo A. Tipo B. Tipo C. Hospedeiro. Assemblage A (Grupo I). Humanos e outros mamíferos:. Assemblage A (Grupo II). Principalmente humano:. Assemblage B. Humanos e outros mamíferos:. Assemblage C/D. Cães:. G. canis. Assemblage E. “Ungulados”:. G. bovis. Assemblage F. Gatos:. G. felis. Tipo A. Tipo B. Zoonótico. Zoonótico (?) Zoonótico. Tipo C. ?. 27.

(28) 12/04/2012. Toxoplasma gondii: genética evolutiva  Evolução clonal x Evolução panmítica  Depende de atividade sexual do parasito  Isolamento do parasito: clonalidade epidêmica. Tipo A. Tipo B. Tipo C. Tipo A. Tipo B. Tipo C. Tipo B x C. Tipo A x B Tipo A x C. Aplicações em Epidemiologia Rastreabilidade Dinâmica de infecções. 28.

(29) 12/04/2012. Caracterização molecular de isolados de Sarcocystis spp. obtidos de fezes de marsupiais do gênero Didelphis pela análise de fragmentos gênicos de seqüências codificadoras de antígenos de superfície dos parasitos. Esquema simplificado do ciclo de vida dos protozoários do gênero Sarcocystis. Gamogonia (fase sexuada) e esporogonia são etapas que ocorrem exclusivamente nos hospedeiros definitivos, enquanto a merogonia (fase assexuada) acontece apenas nos hospedeiros intermediários.. amostra 3 7 11 13 18 24 26 36 2 10 28 22 4 21 32 33 34 19 29 31 16 27 17 23 25 30 Sfa 37 38 Sne Sne. A análise das seqüências gênicas obtidas gerou os seguintes resultados: SAG-2: 279 nucleotídeos e 8 alelos para 26 amostras SAG-3: 357 nucleotídeos e 7 alelos para 21 amostras SAG-4: 279 nucleotídeos e 12 alelos para 25 amostras. amostra 3 7 11 13 18 24 26 36 2 10 28 22 4 21 32 33 34 19 29 31 16 27 17 23 25 30 Sfa 37 38 Sne Sne. sag2 IIc Ia2 Ia2 IIc # # deg Ia1 IIc Ia1 Ia1 Ia1 IIc IIc IIc IIc IIc IIc Ia2 III IIa Ia2 Ia1 Ia1 Ia1 Ia1 Ia1 IIb Ib Ib Ic Ic. sag3 III # # # # # # # deg III III III III III III III III III III III III IIa IIa IIc IIc IIc IIc IIb Ia2 Ia2 Ia1 Ia3. sag4 # IIa IId # IIa # deg Ib1 Ic3 Ic1 Ib2 Ib1 III Ic3 Ic2 Ic3 Ic3 Ic3 IId IIa IIc IId Ic3 IIa IIa IIa IIa IIb Ia2 Ia2 Ia1 #. sag2 IIc Ia2 Ia2 IIc # # deg Ia1 IIc Ia1 Ia1 Ia1 IIc IIc IIc IIc IIc IIc Ia2 III IIa Ia2 Ia1 Ia1 Ia1 Ia1 Ia1 IIb Ib Ib Ic Ic. sag3 III # # # # # # # deg III III III III III III III III III III III III IIa IIa IIc IIc IIc IIc IIb Ia2 Ia2 Ia1 Ia3. sag4 # IIa IId # IIa # deg Ib1 Ic3 Ic1 Ib2 Ib1 III Ic3 Ic2 Ic3 Ic3 Ic3 IId IIa IIc IId Ic3 IIa IIa IIa IIa IIb Ia2 Ia2 Ia1 #. grupo. 0. grupo. 0. 29.

(30) 12/04/2012. amostra 3 7 11 13 18 24 26 36 2 10 28 22 4 21 32 33 34 19 29 31 16 27 17 23 25 30 Sfa 37 38 Sne Sne. sag2 IIc Ia2 Ia2 IIc # # deg Ia1 IIc Ia1 Ia1 Ia1 IIc IIc IIc IIc IIc IIc Ia2 III IIa Ia2 Ia1 Ia1 Ia1 Ia1 Ia1 IIb Ib Ib Ic Ic. sag3 III # # # # # # # deg III III III III III III III III III III III III IIa IIa IIc IIc IIc IIc IIb Ia2 Ia2 Ia1 Ia3. sag4 # IIa IId # IIa # deg Ib1 Ic3 Ic1 Ib2 Ib1 III Ic3 Ic2 Ic3 Ic3 Ic3 IId IIa IIc IId Ic3 IIa IIa IIa IIa IIb Ia2 Ia2 Ia1 #. grupo. 0. amostra 3 7 11 13 18 24 26 36 2 10 28 22 4 21 32 33 34 19 29 31 16 27 17 23 25 30 Sfa 37 38 Sne Sne. sag2 IIc Ia2 Ia2 IIc # # deg Ia1 IIc Ia1 Ia1 Ia1 IIc IIc IIc IIc IIc IIc Ia2 III IIa Ia2 Ia1 Ia1 Ia1 Ia1 Ia1 IIb Ib Ib Ic Ic. sag3 III # # # # # # # deg III III III III III III III III III III III III IIa IIa IIc IIc IIc IIc IIb Ia2 Ia2 Ia1 Ia3. sag4 # IIa IId # IIa # deg Ib1 Ic3 Ic1 Ib2 Ib1 III Ic3 Ic2 Ic3 Ic3 Ic3 IId IIa IIc IId Ic3 IIa IIa IIa IIa IIb Ia2 Ia2 Ia1 #. grupo. 0. FIM. 30.

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