UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
ERIKA RODRIGUES DE OLIVEIRA BORGES
Validação de metodologia para análise de um defensivo agrícola aplicado em cana-de-açúcar (compostos Y e Z) por meio de cromatografia líquida de
alta eficiência acoplada a espectrometria de massas – CLAE-EM/EM
Lorena 2018
ERIKA RODRIGUES DE OLIVEIRA BORGES
Validação de metodologia para análise de um defensivo agrícola aplicado em cana-de-açúcar (compostos Y e Z) por meio de cromatografia líquida de
alta eficiência acoplada a espectrometria de massas – CLAE-EM/EM
Monografia de conclusão de curso apresentada na Escola de Engenheira de Lorena da Universidade de São Paulo como requisito para graduação em Engenharia Química.
Orientador: Prof. MSc. Antonio Carlos da Silva
Lorena 2018
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizado da Escola de Engenharia de Lorena,
com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Borges, Erika Rodrigues de Oliveira
Validação de metodologia para análise de um defensivo agrícola aplicado em cana-de-açúcar (compostos Y e Z) por meio de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas – CLAE-EM/EM / Erika Rodrigues de Oliveira Borges; orientador Antonio Carlos da Silva. -Lorena, 2018.
56 p.
Monografia apresentada como requisito parcial para a conclusão de Graduação do Curso de Engenharia Química - Escola de Engenharia de Lorena da
Universidade de São Paulo. 2018
1. Agrotóxicos. 2. Bpl. 3. Validação. 4. Clae em/em. I. Título. II. da Silva, Antonio Carlos, orient.
Dedico essa monografia a minha avó Celina que logo que iniciei meus estudos me disse como era corajosa por morar fora e cursar Engenharia, fala que me incentivou durante toda minha graduação até aqui.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Mauro e Isabel pelo exemplo de perseverança e dedicação que me fizeram concluir a graduação mesmo com os obstáculos encontrados no caminho. Sem o apoio e carinho deles nada disso seria possível.
Aos meus irmãos pelo companheirismo e presença essencial tanto nos momentos de comemoração quanto nos momentos de anseios.
Ao meu melhor amigo e namorado Frederico que me acompanhou por grande parte da estadia em Lorena me apoiando em todos os momentos e sempre acreditou no meu potencial.
Ao meu orientador Prof. Antonio Carlos pela paciência, compreensão e por todos os conhecimentos oferecidos durante as aulas cursadas e conselhos na orientação. Também a todos os professores e funcionários que de alguma forma contribuíram para a minha formação.
Aos meus tios, primos e sogros por sempre oferecerem uma palavra amiga. Aos amigos feitos na infância até a faculdade e que se tornaram uma família. Em especial Rayana, Joice, Beatriz, Lisa, Bernardo e Denis.
Ao coordenador do laboratório Alvino Rodrigues, que permitiu o uso dos dados obtidos na empresa e auxiliou no entendimento do trabalho.
RESUMO
BORGES, E. R. de. O. Validação de metodologia para análise de um defensivo agrícola aplicado em cana-de-açúcar (compostos Y e Z) por meio de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas – CLAE-EM/EM Monografia de conclusão de curso de Engenharia Química – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, 2018.
A necessidade de fornecer recursos a mais de 7 bilhões de pessoas tem provocado um aumento significativo na busca de soluções para o aumento da produtividade agrícola. Nesse cenário, os agrotóxicos desempenham um papel importante, pois realizam o combate às pragas existentes no campo, reduzindo os desperdícios e permitindo que o alimento chegue à mesa do consumidor com maior qualidade. O uso e comercialização desse tipo de produto é controlado por leis nacionais bastante rígidas. Para uma organização obter o registro do produto, é necessário realizar uma série de testes e estudos que serão avaliados por órgãos do meio ambiente (IBAMA), saúde (ANVISA) e agricultura (MAPA). Dentre esses estudos, pode-se destacar o Estudo de Resíduo, no qual a cultura é analisada após aplicação do produto, com o objetivo de verificar se ainda há a presença de resíduos de agrotóxico no alimento após certo período de tempo. Porém, antes da análise das amostras, é obrigatório realizar a validação que irá demonstrar se a metodologia escolhida é confiável e reprodutível. Os critérios mínimos a serem seguidos nos estudos de resíduo estão dispostos na Resolução de Diretoria Colegiada da ANVISA nº 4, de 18 de janeiro de 2012. Além das exigências mínimas, a norma ressalta que um pleito de registro somente será aceito se o estudo for conduzido segundo os princípios das Boas Práticas de Laboratório (BPL), sistema de qualidade auditado por organismos de acreditação do INMETRO. Por exigir um pensamento crítico elevado, o profissional envolvido nessa área deve ser capacitado e entender as exigências das normas. O objetivo deste trabalho foi realizar uma validação e aplicar conhecimentos da Engenharia Química na interpretação dos dados gerados. No trabalho, foi validada uma metodologia para análise de dois fungicidas (compostos Y e Z) aplicados em cana-de-açúcar por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (CLAE-EM/EM). Todos os critérios mínimos de análise foram atendidos comprovando a robustez e reprodutibilidade do método escolhido.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Percentual de área total de cana-de-açúcar por estado ... 14
Figura 2 - Caminho para registro de um agrotóxico ... 16
Figura 3 - Distribuição das amostras analisadas e irregularidades encontradas .. 17
Figura 4 - Exemplo de elementos contemplados na elaboração de formulários de registro ... 20
Figura 5 - Procedimento de coleta de cana-de-açúcar ... 21
Figura 6 - Critérios para determinação do LOQ ... 25
Figura 7 - Principais componentes de um espectrômetro de massas ... 26
Figura 8 - Esquema de um detector do tipo triplo quadrupolo ... 27
Figura 9 - Esquema de preparo de soluções estoque, trabalho e curva de calibração ... 33
Figura 10 - Esquema resumido da rota analítica... 35
Figura 11 - Resumo das condições usadas para injeção ... 35
Figura 12 - Parte típica de sequência de injeção para validação ... 36
Figura 13 - Resumo de valores de concentração encontrados para as amostras branco de reagentes, branco de matriz e IR para ambos os compostos ... 39
Figura 14 - Branco de reagentes em relação ao composto Y ... 39
Figura 15 - Branco de reagentes em relação ao composto Z ... 40
Figura 16 - Branco de matriz de amostra de cana-de-açúcar em relação ao composto Y ... 40
Figura 17 - Branco de matriz de amostra de cana-de-açúcar em relação ao composto Z ... 41
Figura 18 - Amostra IR de concentração nominal de 0,5 ng/mL em relação ao composto Y ... 41
Figura 19 - Amostra IR de concentração nominal de 0,5 ng/mL em relação ao composto Z ... 42
Figura 20 - Recuperações da amostra IR encontradas para os ativos Y e Z e cálculo de efeito matriz ... 43
Figura 21 - Cromatograma típico de um ponto da curva para o composto Y (P3 - 0,2 ng/mL) ... 44
Figura 22 - Cromatograma típico de um ponto da curva para o composto Z (P3 - 0,2 ng/mL) ... 44 Figura 23 - Curva de calibração obtida para o composto Y ... 45 Figura 24 - Curva de calibração obtida para o composto Z ... 45 Figura 25 - Cromatograma típico de amostra fortificada no nível LOQ para o composto Y (LOQ1) ... 46 Figura 26 - Cromatograma típico de amostra fortificada no nível LOQ para o composto Z (LOQ1) ... 47 Figura 27 - Cromatograma de amostra fortificada no nível 100xLOQ para o composto Y (100xLOQ1 diluída 100 vezes) ... 47 Figura 28 - Cromatograma de amostra fortificada no nível 100xLOQ para o composto Z (100xLOQ1 diluída 100 vezes) ... 48 Figura 29 - Exemplo de cálculo de coeficiente de variação global para o composto Y ... 48 Figura 30 - Exemplo de cálculo de coeficiente de variação global para o composto Z ... 49 Figura 31 - Exemplo de cálculo de recuperação para a amostra fortificada LOQ1 do composto Y ... 50 Figura 32 - Exemplo de cálculo de recuperação para a amostra fortificada LOQ1 do composto Z ... 50 Figura 33 - Resultados das amostras LOQ e 100xLOQ para o composto Y ... 51 Figura 34 - Resultados das amostras LOQ e 100xLOQ para o composto Z ... 52
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária BPL Boas Práticas de Laboratório
CGAA Coordenação Geral de Agrotóxicos e Afins CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CV Coeficiente de variação
DP Desvio padrão
EM Espectrometria de Massas
ENFISA Encontro de Fiscalização e Seminário sobre Agrotóxicos IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia LMR Limite Máximo de Resíduo LOD Limite de Detecção
LOQ Limite de Quantificação
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento PIB Produto Interno Bruto
RDC Resolução de Diretoria Colegiada RET Registro Especial Temporário SDA Secretaria de Defesa Agropecuária
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 11
1.1 Objetivo geral ... 13
1.2 Objetivos específicos ... 13
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 14
2.1 A agricultura no Brasil e a importância da cana-de-açúcar ... 14
2.2 Legislação sobre uso e pesquisa de agrotóxicos no Brasil ... 15
2.3 Programas de monitoramento ... 16
2.4 Condução das fases de campo e de laboratório ... 18
2.4.1 Definições ... 18
2.4.2 Boas Práticas de Laboratório (BPL) ... 19
2.4.3 Fase de campo ... 21
2.4.4 Fase de laboratório ... 21
2.5 Validação do método ... 22
2.5.1 Seletividade / Efeito matriz ... 22
2.5.2 Curva de calibração e linearidade ... 23
2.5.3 Precisão ... 24 2.5.4 Exatidão/recuperação ... 24 2.5.5 LOD e LOQ ... 24 2.6 CLAE-EM/EM ... 25 3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 28 3.1 Metodologia da pesquisa ... 28 3.2 Materiais ... 28
3.2.1 Equipamentos, vidrarias e consumíveis ... 28
3.2.2 Reagentes e solventes ... 29
3.3.1 Avaliação efeito matriz ... 29
3.3.2 Determinação do LOQ, LOD e recuperação de amostras ... 30
3.3.3 Avaliação da precisão do método ... 31
3.3.4 Preparo de soluções estoque, trabalho e curva ... 32
3.3.5 Preparo de soluções diversas ... 33
3.3.6 Rota analítica ... 34
3.3.7 Injeção e quantificação... 35
3.3.8 Interpretação dos dados gerados ... 37
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 38
4.1 Considerações ... 38
4.2 Seletividade / Efeito matriz ... 38
4.3 Curva de calibração e linearidade ... 43
4.4 Precisão e exatidão ... 46 4.4.1 Cromatogramas típicos ... 46 4.4.2 Cálculo de precisão ... 48 4.4.3 Cálculo de exatidão/recuperação ... 49 4.4.4 Recuperações obtidas, DP e CV ... 51 5 CONCLUSÃO ... 53
1 INTRODUÇÃO
É crescente a preocupação em relação ao aumento da população mundial e a disponibilidade de recursos para suprir as necessidades de mais de 7 bilhões de pessoas. A alimentação é uma das principais preocupações atuais. Nesse cenário, a tecnologia exerce um papel essencial pois permite gerar pesquisas, dispositivos modernos, entre outros avanços com o intuito de otimizar o uso de recursos naturais e melhorar sua distribuição. Os estudos nessa área são diversos e englobam desde o plantio de uma determinada cultura até a segurança alimentar do consumidor (identificação da presença de toxinas, microrganismos e defensivos agrícolas, por exemplo). Em particular, há uma grande atenção aos defensivos agrícolas, não somente no sentido de buscar novas soluções de combate às pragas do campo, mas também em relação ao registro desses produtos no mercado.
No Brasil, o setor de agronegócios é responsável por elevadas porcentagens no Produto Interno Bruto (PIB) do país. Isso se deve principalmente ao fato do país possuir condições favoráveis ao plantio de diversas culturas agrícolas, desde aquelas que precisam de climas frios àquelas que se desenvolvem em ambientes muito quentes e úmidos. Por ser capaz de tamanha produção agrícola, o país também ocupa as primeiras posições de exportação de diversos alimentos.
Uma cultura que merece destaque no Brasil é a cana-de-açúcar, conhecida principalmente pelo seu uso na produção de etanol e açúcar. Segundo levantamento feito pela Companhia Nacional de Abastecimento (Conab) em dezembro de 2017, o Brasil ainda detém a posição de maior produtor de cana-de-açúcar além de apresentar índices de exportação de cana-de-açúcar maiores em relação aos anos anteriores (CONAB, 2017).
Devido ao uso em produtos alimentícios, o plantio da cana-de-açúcar assim como todos os alimentos em que houve aplicação de defensivo agrícola, deve ser rigorosamente monitorado. Para comercialização, os produtos utilizados devem ser registrados junto ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais (IBAMA) para garantir que não haja resíduo do ingrediente ativo (presente no agrotóxico) no alimento final que será consumido. No entanto, o tempo necessário para registro de um agrotóxico é extenso e deve seguir
diversas normas estabelecidas por órgãos nacionais e eventualmente internacionais. As etapas obrigatórias incluem estudos de toxicologia feitos quando ainda não há conhecimento da molécula (em relação ao ser humano e meio ambiente), estudos de eficácia do produto no combate à praga (testes da condição ideal), plantio da cultura com aplicação monitorada do produto de que se deseja registrar e por último, análise das amostras em laboratório (verificação da presença de resíduos). Os dados gerados em todas essas etapas são compilados para escrita de um relatório final o qual é submetido junto aos órgãos responsáveis por decidir a aprovação ou não do produto a partir da interpretação do relatório recebido.
Dentre as etapas citadas anteriormente, a análise em laboratório é especialmente rigorosa e deve seguir diversas legislações e normas como a Resolução de Diretoria Colegiada (RDC) n°4, de 18 de janeiro de 2012, que dispõe sobre os critérios para a realização de estudos de resíduos de agrotóxicos para fins de registro no Brasil. Uma das especificações descritas na RDC nº4/2012 explica que qualquer estudo de resíduo de agrotóxico do qual se deseja pleitear um registro deve ser realizado em laboratório com certificação de Boas Práticas de Laboratório (BPL) e deve ser validado, isto é, o método escolhido para análise deve ser robusto e reprodutível.
A validação é desenvolvida para garantir que um novo método analítico gere informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra que será analisada posteriormente. Mas, uma certa atenção deve ser disposta para realizar a validação, pois diversos parâmetros de quantificação devem ser atendidos (seletividade, linearidade, etc.) e os analistas do laboratório devem estar capacitados para garantir que a validação siga todos os critérios estabelecidos. Esse processo pode consistir em validar um método novo ou verificar a eficiência de um método já realizado anteriormente em outro local. De qualquer forma, o método validado deve ser representativo e os parâmetros escolhidos devem ser adequados ao estudo conduzido (RIBANI et al., 2004).
Assim, para ressaltar a importância do setor de pesquisa de agroquímicos, elucidar e explicar os pontos importantes no processo de validação de uma metodologia analítica e confirmar a importância dos conhecimentos de um engenheiro químico no processo de análise em laboratório e na interpretação dos
dados gerados foi escolhido realizar esse trabalho que avalia a reprodutibilidade de um método escolhido para análise de dois fungicidas (compostos Y e z).
1.1 Objetivo geral
Validar uma metodologia (realizada segundo critérios dispostos na RDC nº4/2012) para análise de um defensivo agrícola aplicado em cana-de-açúcar (compostos Y e Z) quantificado por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas – CLAE-EM/EM.
1.2 Objetivos específicos
Demonstrar as etapas mínimas a serem seguidas em validação de metodologia para análise de um defensivo agrícola;
Apresentar a metodologia utilizada para análise; Interpretar os dados gerados na validação;
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 A agricultura no Brasil e a importância da cana-de-açúcar
O Brasil é um país com grande área produtiva devido a sua extensão territorial e climas favoráveis ao plantio de diversas culturas agrícolas. Uma dessas culturas é a cana-de-açúcar, usada como matéria-prima na produção de açúcar e também na produção de etanol (primeira e segunda geração). Na Figura 1, é mostrada uma distribuição dos locais de plantio da cana-de-açúcar (MAPA, 2017).
Figura 1 - Percentual de área total de cana-de-açúcar por estado
Fonte: (GASQUES et al., 2017)(GASQUES et al., 2017)(MAPA, 2017).
Apesar da produção ser elevada, segundo relatório emitido em 2017 pela Companhia Nacional de Abastecimento (Conab), a tendência atual é o direcionamento da cana-de-açúcar para a produção de etanol. Isso se deve em
grande parte a dificuldade dos estabelecimentos em não conseguir renovar seus canaviais, reduzindo a produtividade (CONAB, 2017).
Uma das soluções que pode ser adotada para aumentar a produtividade e continuar direcionando o produto para a alimentação, é o uso de agrotóxicos. Considerando a demanda de alimentos para mais de sete bilhões de pessoas no mundo, as entidades públicas e privadas trabalham no sentido de prover soluções e tecnologias para reduzir o desperdício e conseguir suprir as necessidades da população. Nesse sentido, o uso de agrotóxicos é bastante relevante, uma vez que o produto possui eficiência no combate a diferentes tipos de pragas (insetos, ervas daninhas, fungos) o que acaba contribuindo para o aumento da vida da planta e redução de desperdícios.
No entanto, é importante ressaltar o rigor das leis que envolvem a produção, uso e comercialização de um agrotóxico. Algumas dessas exigências nacionais são demonstradas a seguir.
2.2 Legislação sobre uso e pesquisa de agrotóxicos no Brasil
A legislação que dispõe sobre o uso de agrotóxicos no Brasil é a Lei nº 7.802, de 11 de julho de 1989. Nela são dispostas regras para produção, comercialização, aplicação, descarte de resíduos, entre outros. Para garantir um risco mínimo do agrotóxico, uma das exigências da lei é a de que um produto não será registrado caso o seu efeito no ser humano ou meio ambiente seja comprovadamente danoso (carcinogênico, mutagênico), cuja avaliação é feita por meio de testes em laboratório (BRASIL, 1989). Além disso, qualquer entidade (privada ou pública) que deseje iniciar uma pesquisa de um novo produto deve possuir o Registro Especial Temporário (RET). O RET é um documento temporário solicitado ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) que disponibilizará o registro do produto por um tempo determinado (com possibilidade de renovação) permitindo o uso do agrotóxico somente para fins de pesquisa e experimentação. Mais informações sobre o RET e as competências dos órgãos também podem ser encontradas no Decreto nº 4.074, de 4 de janeiro de 2002, que regulamenta a Lei nº 7.802/1989 (BRASIL; Decreto nº 4074, 2002).
Em posse do RET, a entidade solicitante poderá iniciar os testes de aplicação, de eficácia no combate à praga e de resíduo e, após obtenção dos resultados, os documentos dos estudos são encaminhados para os órgãos responsáveis pelo registro do produto. Apesar da obrigatoriedade de aceitação ser dos três órgãos mostrados na Figura 2, o papel do registro final cabe ao MAPA (MAPA, 2012).
Figura 2 - Caminho para registro de um agrotóxico
Fonte: Adaptado de (MAPA, 2012).
2.3 Programas de monitoramento
Ainda na Lei nº 7.082/1989, discorre-se sobre a responsabilidade do governo de fiscalizar e controlar o uso dos agrotóxicos. Para isso, foram criados programas de coordenação e acompanhamento. A fiscalização estadual do uso e comércio de agrotóxicos, é coordenado pela Coordenação Geral de Agrotóxicos e Afins (CGAA). Órgãos como MAPA e Secretaria de Defesa Agropecuária (SDA) realizam fiscalizações periódicas e geram relatórios que são apresentados em eventos como o Encontro de Fiscalização e Seminário de Agrotóxicos (ENFISA), o qual tem o objetivo de fiscalizar o uso e comércio de agrotóxicos nas unidades federativas do país, apresentar pontos de melhoria e ainda conscientizar a comunidade sobre a importância da atividade (MIYASAKA, 2015).
Já em relação ao monitoramento de resíduos encontrados no alimento do consumidor, há o Programa de Análises de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA). O programa teve início em 2001 e foi criado pela ANVISA com o objetivo de recolher amostras de alimentos para análise de resíduos e verificar se os limites estabelecidos para cada ingrediente ativo estão sendo obedecidos, garantindo a segurança alimentar(ANVISA, 2016).
No relatório dos anos 2013-2015 foram analisadas até duzentos e trinta e dois (232) ativos em mais de dez mil amostras de diferentes culturas (alimentos) representativas da dieta brasileira. Na Figura 3, é possível observar o resultado desse último relatório gerado em que uma porcentagem razoável das amostras analisadas ainda fica acima do limite máximo de resíduo (LMR), que é o valor máximo que pode ser encontrado nas análises para determinado ingrediente ativo. O programa ainda busca aumentar representatividade nas amostras coletadas e estreitar laços com entidades parceiras para controlar a qualidade dos alimentos que chegam na mesa do consumidor (ANVISA, 2016).
Figura 3 - Distribuição das amostras analisadas e irregularidades encontradas
Fonte: Relatório das amostras analisadas no período de 2013 a 2015 (ANVISA, 2016).
Apesar dos programas monitorarem etapas diferentes em relação aos agrotóxicos, eles possuem um objetivo em comum, que é ressaltar a importância do seguimento das regras estabelecidas para uso dos agrotóxicos. As irregularidades encontradas em sua maioria refletem o uso incorreto de determinado produto, seja por aplicar quantidades maiores que a especificada resultando em resíduos acima do LMR ou usar ilegalmente, representado na Figura 3 por 1,68% das amostras analisadas (ANVISA, 2016).
Para auxiliar no cumprimento das exigências e consequentemente evitar irregularidades, a condução dos estudos submetidos ao MAPA deve seguir normas como a Resolução de Diretoria Colegiada nº 4, de 18 de janeiro de 2012 e ainda ser realizada por entidades que possuam todas as certificações exigidas garantindo a rastreabilidade e confiabilidade dos estudos(ANVISA; RDC nº4, 2012).
2.4 Condução das fases de campo e de laboratório
Todos os estudos de resíduos de agrotóxicos realizados no Brasil devem obedecer aos critérios estabelecidos na Resolução de Diretoria Colegiada nº 4 (RDC nº4). Nela, são dispostas diretrizes das fases de campo, laboratório e relatórios para registro. Vale ressaltar que qualquer estudo de resíduo deve ser conduzido em conformidade com os princípios BPL, como é descrito no capítulo I das disposições gerais (ANVISA; RDC nº4, 2012).
“Os Estudos de Resíduos de agrotóxicos somente serão realizados por entidades em conformidade com os princípios de BPL, através de órgãos oficiais de certificação, reconhecidos pela Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico – OCDE” (Parágrafo único, RDC nº 4, de 18 de janeiro de 2012).
Para entender o processo como um todo é importante saber a definição de alguns termos usados na condução dos estudos. Esses termos são relacionados aos princípios de Boas Práticas de Laboratório (INMETRO; NIT-DICLA-035, 2011).
2.4.1 Definições
Amostra-testemunha: parte do plantio não submetido a aplicação de substância-teste. Também pode ser denominado de branco de matriz quando é usado para controle de interferentes.
Amostra-fortificada: amostra com resíduo menor ou igual a 30% o Limite de Quantificação (LOQ) na qual é adicionada uma quantidade conhecida do ativo, permitindo o acompanhamento de possíveis perdas na rota analítica. Boas Práticas de Laboratório (BPL): sistema de qualidade obrigatório para
aceitação dos estudos de resíduo.
Estudo de Resíduo: tem finalidade de estabelecer ou confirmar Limite Máximo de Resíduo (LMR) de um ingrediente ativo em determinado sistema-teste.
Instalação de Teste: local onde o estudo é conduzido, provendo de pessoas, local, instalações e equipamentos necessários para condução do estudo. Limite de Detecção (LOD): limite de concentração detectável de um
ingrediente ativo em uma matriz.
Limite de Quantificação (LOQ): menor concentração de um ingrediente ativo que pode ser quantificada e comprovada por estudo de validação.
Limite Máximo de Resíduo (LMR): nível máximo permitido do ingrediente ativo no alimento que pode ser consultado em monografias autorizadas da ANVISA
Sistema-teste: cultura/matriz onde será aplicada a substância-teste.
Substância-teste: produto aplicado no sistema-teste nos ensaios de campo. É uma formulação que contém os ingredientes-ativos e outros componentes (diluentes, surfactantes, entre outros).
2.4.2 Boas Práticas de Laboratório (BPL)
Os princípios das Boas Práticas de Laboratório são obrigatórios para qualquer estudo que se deseje pleitear um registro e consistem em um sistema de qualidade. Logo, a entidade responsável deve possuir certificação, reconhecida pelo Instituto Nacional de Metrologia (INMETRO). O órgão que realiza as atividades relacionadas à concessão e manutenção da acreditação é a Coordenação Geral de Acreditação do Inmetro (Cgcre) (ANVISA; RDC nº4, 2012).
O documento principal que deve ser seguido é uma Norma Interna Técnica da Divisão de Acreditação de Laboratórios NIT-DICLA-035, tradução do documento
da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE), em inglês: OECD Series on Principles of Good Laboratory Practices. No documento estão dispostos os termos, responsabilidades e requisitos que devem ser usados pela Instalação de Teste (INMETRO; NIT-DICLA-035, 2011).
A documentação onde serão feitos os registros deve conter, mas não se limitar a: nome da instalação de teste, detalhamento do procedimento, assinatura e data do responsável pelo preenchimento da informação, local de arquivamento, assinatura de revisão, entre outros como pode ser melhor detalhado na Figura 4 (RODRIGUES et al., 2012).
Figura 4 - Exemplo de elementos contemplados na elaboração de formulários de registro
Fonte: Adaptado de (RODRIGUES et al., 2012).
Resumindo, esse sistema de qualidade é adotado para garantir a confiabilidade e rastreabilidade de um estudo, o que requer o compromisso de toda a equipe envolvida.
2.4.3 Fase de campo
A fase de campo é descrita no capítulo II da RDC nº 4/2012. Alguns critérios a serem seguidos incluem número de ensaios mínimos a serem conduzidos, forma de aplicação conforme a bula da substância-teste, coleta e armazenamento das amostras, entre outros. No item da RDC nº 4 que fala sobre os procedimentos para amostragem e preparação da amostra para análise, é descrita a quantidade mínima que deve ser coletada para que a análise seja representativa dos ensaios de campo conduzidos como pode ser visto na Figura 5 para a cultura (sistema-teste) de cana-de-açúcar. A coleta deve excluir as extremidades e selecionar amostras grandes e pequenas, exceto as que estiverem danificadas. As amostras colhidas (mínimo 2,0 kg) serão armazenadas em temperatura menor ou igual a -20°C até o momento de preparo para análise (homogeneização com gelo seco) (ANVISA; RDC nº4, 2012).
Figura 5 - Procedimento de coleta de cana-de-açúcar
Fonte: (ANVISA; RDC nº4, 2012).
2.4.4 Fase de laboratório
Após o preparo da amostra, esta também deve permanecer em local refrigerado a temperatura menor ou igual a -20°C até o dia de análise para evitar degradação do ativo ou sistema-teste (ANVISA; RDC nº4, 2012).
A seção II do capítulo III da RDC nº 4/2012 estabelece os requisitos mínimos para a condução do estudo em um laboratório. São alguns deles:
Validação de método para garantir a adequação do procedimento analítico escolhido;
Cálculo dos resíduos com base na curva de calibração;
Amostras-fortificadas devem apresentar recuperação entre 70 e 120%.
A metodologia escolhida para análise irá variar dependendo do tipo de ativo (tamanho de molécula, volatilidade, solubilidade) e do grupo de cultura a qual o sistema-teste pertence (aquoso, oleoso, alto teor de proteína). Isso ocorre devido as diferentes interações com os solventes escolhidos, comportamento na faixa de temperatura selecionada, entre outros, o que irá afetar diretamente na recuperação do ativo ao final da rota analítica e em sua quantificação que também pode variar (cromatografia líquida, cromatografia gasosa, detector de massas, detector ultravioleta, etc.) (SAHU et al., 2018).
2.5 Validação do método
Como dito anteriormente, a validação é a primeira etapa a ser realizada no laboratório, na qual serão avaliados parâmetros de seletividade, curva de calibração, linearidade, sensibilidade, precisão, exatidão/recuperação, limite de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ). Esses critérios mínimos são dispostos na seção III do capítulo III da RDC nº 4/2012 e alguns deles são mais detalhados a seguir (ANVISA; RDC nº4, 2012).
2.5.1 Seletividade / Efeito matriz
A seletividade é a capacidade de identificar os compostos de interesse mesmo que haja a presença de interferentes. Esse parâmetro avalia o grau da interferência, seja ele proveniente de outros ativos, do sistema-teste, dos solventes usados ou outras impurezas e garante que a resposta do equipamento escolhido para análise seja exata. Caso isso não ocorra, outros parâmetros como linearidade e exatidão podem ser prejudicados (RIBANI et al., 2004).
Para isso, é analisada uma amostra isenta (em teoria) da substância teste de interesse (branco de matriz) juntamente com outra pesagem da mesma amostra-testemunha na qual é adicionada ao final da rota analítica uma quantidade conhecida do ativo (amostra Instrument Recovery). Esse procedimento é realizado para avaliação do efeito matriz, no qual a porcentagem de interferentes não deve ser superior a 30% do LOQ (ANVISA; RDC nº4, 2012).
Uma forma de reduzir o número de interferentes é a etapa de purificação do método analítico, que pode diminuir a carga de matriz presente no extrato final por meio de diluições, uso de membranas filtrantes, colunas de cromatografia com recheio específico, entre outros. Outra maneira de garantir a seletividade é optando pelo uso de equipamentos com alta especificidade, como o espectrômetro de massas triplo quadrupolo. O equipamento consegue avaliar o ativo de interesse e ainda quebrar a molécula principal em fragmentos menores que também podem ser acompanhados como forma de confirmação (RIBANI et al., 2004).
2.5.2 Curva de calibração e linearidade
A faixa escolhida da curva de calibração deve ser capaz de fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração do ativo analisado e cobrir os níveis de quantificação escolhidos para a validação. Para isso, o equipamento gera uma relação entre o sinal medido (área do pico, por exemplo) e a concentração, que deve ser conhecida. Essa faixa é representada por uma reta (composta por no mínimo cinco pontos em triplicata) que após injeção, o equipamento fornece sua equação característica de modelo geral y= a + bx (onde y é a resposta medida da área e x é a concentração do ativo) e o coeficiente de correlação, o qual deve ser maior ou igual a 0,99 (ANVISA; RDC nº4, 2012).
2.5.3 Precisão
A precisão representa a dispersão dos resultados obtidos e é garantida por meio de injeções repetidas de uma mesma amostra ou ponto da curva. (RIBANI et al., 2004). Esse parâmetro é avaliado pelo coeficiente de variação, que deve ser menor ou igual a 20% (ANVISA; RDC nº4, 2012).
2.5.4 Exatidão/recuperação
A exatidão avalia se o valor encontrado está próximo do valor real. Para isso, as recuperações das amostras fortificadas devem estar na faixa de 70% a 120% para serem aceitas (ANVISA; RDC nº4, 2012).
2.5.5 LOD e LOQ
O limite de detecção corresponde ao valor limite em que um resultado pode ser quantificado. Abaixo desse valor, o resultado é apenas qualitativo, ou seja, é possível verificar a presença do ativo, mas não há garantia do valor de concentração fornecido pelo equipamento (RIBANI et al., 2004).
Já em relação ao LOQ, devem ser conduzidos no mínimo dois níveis de fortificação com pelo menos cinco repetições, com desvio padrão menor ou igual a 20%. A determinação do LOQ também é prevista na RDC nº4/2012, que estabelece o valor máximo permitido de acordo com o LMR (Limite Máximo de Resíduo) dos compostos analisados conforme pode ser visto na Figura 6. Como já dito anteriormente, os valores de recuperação das amostras fortificadas (LOQ e 100xLOQ) devem ficar no intervalo de 70% a 120% (ANVISA; RDC nº4, 2012).
Figura 6 - Critérios para determinação do LOQ
Fonte: Adaptado de (ANVISA; RDC nº4, 2012).
2.6 CLAE-EM/EM
O método de quantificação escolhido (cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas) é uma das técnicas mais utilizadas na análise de ativos de defensivos agrícolas e também de outros compostos como farmacêuticos e proteínas. A escolha dos equipamentos se deve ao alto desempenho, pois combina a alta seletividade fornecida pelo cromatógrafo líquido e a precisão do detector de massas. Outras combinações também podem ser utilizadas como a cromatografia gasosa, mas essa escolha irá depender do tipo de composto que será analisado (CHIARADIA; COLLINS; CL-EM, 2008).
A primeira etapa de injeção é feita no cromatógrafo líquido, que é dividido em módulos: bomba, injetor e forno de coluna. A bomba conduz os eluentes (fases móveis) em direção à coluna. No caminho, a amostra é introduzida por um injetor na fase móvel e arrastada para a coluna onde ocorrerá a interação com a fase estacionária (recheio da coluna) e a separação do composto de interesse. A fase estacionária a ser escolhida irá depender do ativo analisado e pode ser reversa ou normal, sendo que a fase reversa é aquela que a fase estacionária é mais apolar que a fase móvel escolhida. (LANÇAS, 2009).
Após a passagem do ativo pela coluna, ele é levado ao detector de massas. A espectrometria de massas acoplada à espectrometria de massas (EM-EM) utiliza dois estágios, sendo que o primeiro (Q1) separa o íon de interesse e o segundo (Q3) estabelece uma relação entre esse primeiro íon e outros gerados a partir de
sua quebra induzida. Essa dupla fragmentação garante resultados ainda mais confiáveis (CHIARADIA et al., 2008).
Após os dois estágios, os fragmentos do íon são detectados e podem ser manipulados no software onde são obtidos os cromatogramas (espectros de massas) e outras informações. Pode existir mais de um fragmento de massa com boa intensidade de sinal. Algumas empresas escolhem acompanhar duas transições diferentes, o que chamamos de transição de quantificação (normalmente a de maior intensidade) e transição de confirmação (intensidade elevada, mas ainda assim menor que a de quantificação). As duas transições podem ser quantificadas de forma a confirmar os resultados obtidos, como o próprio nome sugere, mas não é obrigatório (CHIARADIA et al., 2008).
Um esquema dos principais componentes de um espectrômetro de massas é demonstrado na Figura 7 e o de um triplo quadrupolo na Figura 8, na qual m/z significa a relação massa/carga do íon formado (LANÇAS, 2009).
Figura 7 - Principais componentes de um espectrômetro de massas
Figura 8 - Esquema de um detector do tipo triplo quadrupolo
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Metodologia da pesquisa
A pesquisa tem abordagem quantitativa. Para isso, foi utilizada a metodologia de pesquisa experimental Ex-post Facto, pois os dados utilizados para análise já haviam sido gerados anteriormente à escrita da monografia.
Os dados obtidos na realização da validação do método analítico foram avaliados e interpretados nesse trabalho.
3.2 Materiais
3.2.1 Equipamentos, vidrarias e consumíveis
Agitador mecânico
Balança analítica e semi-analítica Balões volumétricos calibrados Banho de ultrassom
Béquer e proveta graduados Centrífuga
Coluna de cromatografia líquida (C18 – octadecil) Cromatógrafo líquido de alta eficiência
Detector de massas – Triplo quadrupolo 5500 Dispensador analógico
Espátula metálica
Frascos de vidro de diversos volumes Homogeneizador para laboratório Mesa agitadora
Sistema concentrador de amostras Sistema de exaustão
Sistema de purificação de água Tubos de plástico de 15 mL e 50 mL Vias cromatográficas âmbar de 2 mL
3.2.2 Reagentes e solventes
Ácido clorídrico Ácido fórmico Água purificada
Ciclohexano de grau cromatográfico Hidróxido de sódio sólido
Metanol de grau cromatográfico
Padrões de referência dos ativos Y e Z.
3.3 Método analítico
3.3.1 Avaliação efeito matriz
Para verificar se a amostra testemunha escolhida para ser fortificada pode ser usada, ou seja, se está livre de contaminantes e interferentes, foi injetado um branco de matriz e uma amostra IR. O efeito matriz deve ser menor que 30%, cujo valor será calculado segundo a Equação 1 (elaborada pela empresa fornecedora dos dados da monografia).
Sendo:
REC: Recuperação (%)
3.3.2 Determinação do LOQ, LOD e recuperação de amostras
O composto Y analisado tem um LMR de 0,1 mg/kg em cana-de-açúcar e o composto Z um LMR de 0,2 mg/kg.
Logo, foi considerado o menor LMR de forma a obter um resultado mais crítico. O valor máximo permitido de LOQ nesse caso seria 0,05 mg/kg, se seguirmos a Figura 6. Para uma análise ainda mais crítica, optou-se por um LOQ de 0,01 mg/kg. Como deve ser feita a validação em dois níveis de concentração, optou-se por realizar o outro nível cem vezes maior que o LOQ (100xLOQ - 1,0 mg/kg). Para garantir a obtenção desse valor na rota analítica, é necessário fixar uma quantia de solução contendo os compostos de interesse que será adicionada a um valor de massa conhecido da amostra.
Em relação ao LOD, foi admitido nesse projeto considerar o valor do LOD como 20% do valor do LOQ (correspondente ao primeiro ponto da curva de calibração).
Ao final da análise, a via cromatográfica contendo o extrato purificado e diluído possui determinada concentração em ng/mL que será determinada pelo equipamento (CLAE-EM/EM). Esse valor em ng/mL pode ser convertido para o valor de resíduo em mg/kg por meio da Equação 2 (elaborada pela empresa fornecedora dos dados da monografia). Já a recuperação pode ser calculada pela Equação 3 (elaborada pela empresa fornecedora dos dados da monografia) e como já dito anteriormente, deve estar entre 70% e 120%. Por meio desse valor de recuperação é avaliada a exatidão da análise.
Equação 2 – Cálculo de resíduo em mg/kg
Sendo:
R: Resíduo encontrado em mg/kg VF: Volume final
VE: Volume de extração
C: Concentração encontrada no Analyst em ng/mL m: massa pesada da amostra
VA: Volume de alíquota
Equação 3 – Cálculo de recuperação
REC= R teóricoR obtido X100 (3) Sendo:
REC: Recuperação
R obtido: Resíduo obtido em mg/kg
R teórico: Valor teórico do LOQ ou 100xLOQ em mg/kg
3.3.3 Avaliação da precisão do método
Como diz a norma, a precisão é avaliada segundo o coeficiente de variação dos valores de fortificação das amostras o qual deve ser menor que 20%. O cálculo é feito segundo a Equação 4 (Excel) em que a média de valores considera todos os LOQs ou 100xLOQs analisados que ficaram dentro da faixa de 70-120%.
Equação 4 – Cálculo do coeficiente de variação
Sendo:
CV: Coeficiente de variação
DP: Desvio padrão (calculado em planilhas do Excel)
3.3.4 Preparo de soluções estoque, trabalho e curva
Seguindo o método de referência disponibilizado pelo cliente solicitante da análise, as soluções estoque (SE) e trabalho (ST) foram preparadas em metanol. Para o preparo da SE, os padrões de referência foram pesados em balança analítica e transferidos para balões volumétricos calibrados de forma a garantir a exatidão da concentração desejada. Essa primeira solução obtida é a mais concentrada e deve ser preparada separadamente para cada ativo evitando interferência entre eles. A partir dela foram tiradas alíquotas para o preparo das soluções trabalho que contêm a mistura dos dois ativos.
Ao final, ainda foi preparada uma curva de calibração (faixa de 0,04 ng/mL a 2,0 ng/mL) com seis pontos de concentração diferentes, sendo o primeiro deles (P1) correspondente a 20% do LOQ. A equação da curva deve obter coeficiente de correlação maior ou igual a 0,99. Vale ressaltar que a curva foi feita a partir de duas soluções de origem distintas, para garantir que o preparo de todas foi feito corretamente. Um esquema de preparo de soluções pode ser observado na Figura 9. Todas as soluções foram levadas ao banho de ultrassom para garantir completa dissolução do padrão de referência.
A validade das soluções é de 30 dias se armazenada em local refrigerado e já havia sido determinada em estudo de estabilidade de soluções em metanol ou metanol/água dos ativos Y e Z.
Figura 9 - Esquema de preparo de soluções estoque, trabalho e curva de calibração
Fonte: Elaborado pela autora.
3.3.5 Preparo de soluções diversas
Foi preparada uma solução de extração (metano/água/solução de ácido clorídrico), uma solução de diluição (metanol/água) e uma solução aquosa de hidróxido de sódio (NaOH).
Para a injeção das amostras no equipamento foram preparadas as fases móveis A (água purificada acidificada com ácido fórmico) e B (solvente orgânico acidificado com ácido fórmico).
SE Origem Solvente Concentração (μg/mL)
ST Origem Solvente Concentração (μg/mL)
Ponto da curva Origem Solvente Concentração (ng/mL)
P1 ST III 0,04 P2 ST III 0,1 P3 ST III 0,2 P4 ST II 0,5 P5 ST III 1,0 P6 ST III 2,0 Solução de diluição (metanol/água) Soluções trabalho ST I ST II ST III 10 0,1 0,01 SE Y e SE Z ST I ST II Soluções estoque Curva de calibração 1000 SE Z 1000 Padrão de referência Y Padrão de referência Z Metanol Metanol SE Y
3.3.6 Rota analítica
A primeira etapa em laboratório é realizar a pesagem em frascos de vidro de uma quantidade específica da amostra previamente homogeneizada. Após a pesagem das amostras, as amostras controles são fortificadas nos níveis LOQ e 100 vezes o LOQ (100xLOQ). Aguarda-se 10 minutos para garantir a eficácia da fortificação e então inicia-se a etapa de extração.
A solução de extração é adicionada e os frascos são levados em homogeneizadores por alguns minutos. O extrato obtido é transferido para um tubo de plástico de 50 mL e então, centrifugado.
Para a etapa de purificação é tirada uma alíquota do sobrenadante para tubos de plástico de 15 mL contendo solução de NaOH e a essa mistura é adicionado ciclohexano. Os tubos são levados em mesa agitadora para realizar a etapa de partição líquido-líquido e depois centrifugados. Uma alíquota do sobrenadante é retirada para tubos de vidro, os quais são levados a um sistema concentrador de amostras onde ocorre a completa evaporação do solvente. Ao final, é feita a ressuspensão da amostra adicionando-se solução de diluição. Esses tubos são agitados e o volume final obtido é transferido para vias cromatográficas âmbar. Para as amostras no nível 100xLOQ deve ser feita a diluição de forma que a amostra permaneça dentro da faixa de concentração da curva preparada. As vias são analisadas por CLAE-EM/EM, sistema no qual a coluna escolhida para separação é de recheio octadecil (hidrofóbica). Dessa maneira, os analitos ficam retidos na coluna quando injetados com fase aquosa e são removidos após a entrada da fase orgânica. Um esquema resumido da rota analítica pode ser observado na Figura 10.
Figura 10 - Esquema resumido da rota analítica
Fonte: Elaborado pela autora.
3.3.7 Injeção e quantificação
O extrato final obtido será analisado por CLAE-EM/EM. Os modelos dos equipamentos utilizados e condições escolhidas para análise são resumidas na Figura 11.
Figura 11 - Resumo das condições usadas para injeção
Fonte: Elaborado pela autora.
Modelo do cromatógrafo líquido CLAE: 1260 Agilent
Modelo do detector de massas EM/EM: Triplo quadrupolo 5500
Fase estacionária (recheio coluna - fase reversa):
Betasil C18
100 mm de comprimento x 2,1 mm de diâmetro e tamanho de partícula 5 μm
Água acidificada com ácido fórmico Metanol acidificado com ácido fórmico
Tempo total de corrida: 9 minutos
A sequência de injeção contém pelo menos cinco pontos da curva injetados em triplicata, um branco de reagentes (avalia possível contaminação dos solventes utilizados e não possui carga de matriz), um branco de matriz, uma amostra
Instrument Recovery (IR) que avalia o efeito de matriz e dois níveis de fortificação
com pelo menos cinco repetições cada (LOQ validado de menor concentração e 100xLOQ). Entre as injeções, é também injetado um solvente para limpeza. Na Figura 12 é exemplificado o início de uma sequência de injeção típica de validação. Para realização dessa etapa é usado o software Analyst que faz a comunicação entre todos os módulos e permite a quantificação dos resultados em tabelas próprias do programa. O programa gera uma tabela com os resultados das injeções, cromatogramas das amostras, curva de calibração (equação da reta e coeficiente de correlação), coeficiente de variação das injeções dos pontos da curva e relatório de informações do equipamento.
O tempo de retenção na coluna dos compostos analisados será determinado com base nos pontos da curva. É possível determinar em qual intervalo de tempo cada ativo será detectado ao realizar a comparação com os padrões de referência.
Figura 12 - Parte típica de sequência de injeção para validação
Fonte: Elaborado pela autora.
Nome da amostra SOLVENTE P1 INJEÇÃO 1 P2 INJEÇÃO 1 P3 INJEÇÃO 1 P4 INJEÇÃO 1 P5 INJEÇÃO 1 P6 INJEÇÃO 1 SOLVENTE BRANCO DE REAGENTES BRANCO DE MATRIZ IR SOLVENTE LOQ 1 LOQ 2 LOQ 3 LOQ 4 LOQ 5 LOQ 6 SOLVENTE
3.3.8 Interpretação dos dados gerados
Todos os dados gerados na realização dessa validação de metodologia analítica foram analisados para verificar se todos os critérios exigidos foram atingidos tais como seletividade, linearidade da curva, precisão e exatidão.
Para isso são mostrados os dados gerados pelo software Analyst como curva de calibração com a respectiva equação da reta e os cromatogramas típicos de branco de reagentes, branco de matriz, IR, pontos da curva de calibração, amostra-fortificada no nível LOQ e no nível 100xLOQ.
Esses dados foram interpretados e avaliados segundo a robustez e reprodutibilidade do método escolhido.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Considerações
Nesse estudo, foram analisadas duas transições de massa para cada composto (íon de quantificação e íon de confirmação). No entanto, foi decidido apresentar os dados apenas da transição de quantificação que já é suficiente para a validação.
Os valores de concentração demonstrados a seguir são calculados pelo
Software Analyst após injeção da amostra. O programa faz o cálculo com base na
equação da reta obtida pela curva de calibração, que deve possuir coeficiente de correlação maior ou igual a 0,99 como já detalhado anteriormente.
A intensidade da altura apresentada nos cromatogramas é medida em contagens por segundo (cps) e sua escala é mostrada de forma proporcional a cada amostra. Além disso, apesar do tempo total de corrida ser de 9 minutos, foi escolhido mostrar apenas o intervalo mais próximo em que os compostos são retidos na coluna (de 3 a 3,6 minutos aproximadamente, sendo que o valor exato do tempo de retenção também é mostrado nos cromatogramas). Qualquer pico que esteja antes ou após o tempo de retenção dos compostos não interfere nos cálculos realizados.
4.2 Seletividade / Efeito matriz
A Figura 13 mostra um resumo dos valores de concentração encontrados para as amostras usadas para verificar qual o efeito matriz provocado. Os valores encontrados são menores que 30% o LOQ (30%LOQ - 0,06 ng/mL). Logo, os resultados obtidos são válidos, pois comprovam que não houve contaminação durante a rota analítica uma vez que o branco de reagentes estava limpo e que a amostra testemunha usada para fortificação também estava limpa. Além disso, os valores encontrados para os brancos também são menores que o LOD (0,04
ng/mL), ou seja, ficam no intervalo do equipamento em que apenas é possível verificar a presença do ativo, mas não é possível quantificar com certeza. Assim, o valor obtido para o IR não necessita de correção e consequentemente, as amostras fortificadas também não precisam.
Além disso, foi verificado que não há a presença de interferentes no mesmo tempo de retenção dos compostos, o que garante a seletividade do método.
Figura 13 - Resumo de valores de concentração encontrados para as amostras branco de reagentes, branco de matriz e IR para ambos os compostos
Fonte: Elaborado pela autora.
As Figuras 14 e 15 correspondem respectivamente aos cromatogramas obtidos do branco de reagentes analisado em relação ao composto Y e em relação ao composto Z.
Figura 14 - Branco de reagentes em relação ao composto Y
Fonte: Elaborado pela autora utilizando o Software Analyst 1.6.3.
Branco de reagentes (ng/mL) Branco de matriz (ng/mL) IR (ng/mL)
0,00992 0,00552 0,456
Branco de reagentes (ng/mL) Branco de matriz (ng/mL) IR (ng/mL)
0,0196 0,014 0,512
Composto Z (30%LOQ - 0,06 ng/mL) Composto Y (30%LOQ - 0,06 ng/mL)
Figura 15 - Branco de reagentes em relação ao composto Z
Fonte: Elaborado pela autora utilizando o Software Analyst 1.6.3.
As Figuras 16 e 17 são típicas da análise de um branco de matriz da amostra de cana-de-açúcar.
Figura 16 - Branco de matriz de amostra de cana-de-açúcar em relação ao composto Y
Figura 17 - Branco de matriz de amostra de cana-de-açúcar em relação ao composto Z
Fonte: Elaborado pela autora utilizando o Software Analyst 1.6.3.
As Figuras 18 e 19, correspondem a amostra Instrument Recovery (IR).
Figura 18 - Amostra IR de concentração nominal de 0,5 ng/mL em relação ao composto Y
Figura 19 - Amostra IR de concentração nominal de 0,5 ng/mL em relação ao composto Z
Fonte: Elaborado pela autora utilizando o Software Analyst 1.6.3.
Como pode ser observado na Figura 20, os valores encontrados para a amostra IR de ambos os compostos estão dentro da faixa aceitável de recuperação (70-120%) e apresentam um efeito matriz negativo de aproximadamente 1,5%, ou seja, uma supressão de sinal. Esse valor de efeito matriz é bem abaixo do máximo estabelecido, logo, a amostra testemunha escolhida para fortificação pode ser usada sem haver a necessidade de corrigir os valores obtidos das amostras LOQs e 100xLOQs.
Além disso, é possível garantir que os pontos da curva preparados em solvente não causam essa supressão de sinal nas amostras fortificadas, excluindo a necessidade de preparar a curva em extrato de matriz para nivelar os dados obtidos.
Figura 20 - Recuperações da amostra IR encontradas para os ativos Y e Z e cálculo de efeito matriz
Fonte: Elaborado pela autora.
4.3 Curva de calibração e linearidade
Foram injetados seis pontos da curva em triplicata com concentração diferentes variando de 0,04 ng/mL a 2,0 ng/mL, preparados no mesmo dia da análise das amostras da validação.
Um cromatograma típico de um ponto da curva de cada composto é visto nas Figuras 21 e 22 com tempo de retenção igual a 3,08 minutos para o composto Y e 3,46 minutos para o composto Z.
A curva de calibração obtida do composto Y tem coeficiente de correlação igual a 0,9959 conforme pode ser visto na Figura 23 e a do composto Z, coeficiente de correlação igual a 0,9989 como pode ser visto na Figura 24, maior do que o valor de 0,99 exigido pela norma. Logo, a equação linear obtida para ambos os ativos pode ser usada para os cálculos das amostras que foram injetadas na mesma sequência que os pontos da curva.
Composto Y Composto Z Composto Y Composto Z
93,8 104,2 90,8 104,8 93,6 102,4 Média de injeções: 92,7 103,8 IR (nominal 0,5 ng/mL) 91,2 102,4 Transição 1 Recuperação (%) Ponto da curva de calibração (nominal 0,5 ng/mL) -1,53 -1,40 Efeito matriz (%)
Figura 21 - Cromatograma típico de um ponto da curva para o composto Y (P3 - 0,2 ng/mL)
Fonte: Elaborado pela autora utilizando o Software Analyst 1.6.3.
Figura 22 - Cromatograma típico de um ponto da curva para o composto Z (P3 - 0,2 ng/mL)
Figura 23 - Curva de calibração obtida para o composto Y
Fonte: Elaborado pela autora utilizando o Software Analyst 1.6.3.
Figura 24 - Curva de calibração obtida para o composto Z
4.4 Precisão e exatidão
4.4.1 Cromatogramas típicos
Existem seis amostras fortificadas para cada nível (LOQ e 100xLOQ) de forma a comprovar a precisão e exatidão do método. No entanto, para demonstrar o tempo de retenção dos compostos Y e Z e o cromatograma típico será demonstrado apenas uma amostra representativa de cada nível. São elas: LOQ1 do composto Y e do composto Z, 100xLOQ1 do composto Y e do composto Z. Os cromatograma típicos são apresentados nas figuras 25 a 28.
Figura 25 - Cromatograma típico de amostra fortificada no nível LOQ para o composto Y (LOQ1)
Figura 26 - Cromatograma típico de amostra fortificada no nível LOQ para o composto Z (LOQ1)
Fonte: Elaborado pela autora utilizando o Software Analyst 1.6.3.
Figura 27 - Cromatograma de amostra fortificada no nível 100xLOQ para o composto Y (100xLOQ1 diluída 100 vezes)
Figura 28 - Cromatograma de amostra fortificada no nível 100xLOQ para o composto Z (100xLOQ1 diluída 100 vezes)
Fonte: Elaborado pela autora utilizando o Software Analyst 1.6.3.
4.4.2 Cálculo de precisão
A precisão do método foi comprovada pelo coeficiente de variação menor que 20% para ambos os compostos. Um exemplo de cálculo de coeficiente de variação global para o composto Y pode ser visto na Figura 29 e um exemplo de cálculo de coeficiente de variação para o composto Z pode ser visto na Figura 30.
Figura 29 - Exemplo de cálculo de coeficiente de variação global para o composto Y
Figura 30 - Exemplo de cálculo de coeficiente de variação global para o composto Z
Fonte: Elaborado pela autora.
4.4.3 Cálculo de exatidão/recuperação
Como já explicado anteriormente, para um método ser exato, o valor analisado deve ser próximo do real. Assim, as amostras devem apresentar resultado dentro de um intervalo.
Nessa validação, todas as amostras fortificadas (seis repetições em cada nível) ficaram dentro da faixa esperada de recuperação (70-120%).
Um exemplo de cálculo usado para os resultados obtidos pode ser visto nas Figuras 31 e 32.
Figura 31 - Exemplo de cálculo de recuperação para a amostra fortificada LOQ1 do composto Y
Fonte: Elaborado pela autora.
Figura 32 - Exemplo de cálculo de recuperação para a amostra fortificada LOQ1 do composto Z
4.4.4 Recuperações obtidas, DP e CV
Todos os resultados das amostras LOQ (0,01 mg/kg) e 100xLOQ (1,0 mg/kg) dos compostos Y e Z podem ser verificados nas Figuras 33 e 34 respectivamente. As recuperações ficaram dentro da faixa esperada (70-120%). Além disso, o coeficiente de variação das amostras também ficou dentro do permitido (menor que 20%).
Figura 33 - Resultados das amostras LOQ e 100xLOQ para o composto Y
Fonte: Elaborado pela autora. Concentração adicionada (mg/kg) Concentração encontrada (mg/kg) Recuperação (%) Média das recuperações (%)
Desvio padrão Coeficiente de variação (%) 0,00795 79,5 0,00830 83,0 0,00790 79,0 0,00730 73,0 0,00805 80,5 0,00700 70,0 0,825 82,5 0,795 79,5 0,795 79,5 0,740 74,0 0,755 75,5 0,740 74,0 5,27 Coeficiente de variação global (%)
Média global das recuperações (%) 77,5 4,08 Desvio padrão global
0,01 77,5
1,0
4,94 6,37
Figura 34 - Resultados das amostras LOQ e 100xLOQ para o composto Z
Fonte: Elaborado pela autora. Concentração adicionada (mg/kg) Concentração encontrada (mg/kg) Recuperação (%) Média das recuperações (%)
Desvio padrão Coeficiente de variação (%)
0,0111 111 0,0101 101 0,00895 89,5 0,00900 90,0 0,00875 87,5 0,00785 78,5 0,800 80,0 0,850 85,0 0,735 73,5 0,810 81,0 0,765 76,5 0,735 73,5
Média global das recuperações (%) 85,6
Desvio padrão global 11,3
Coeficiente de variação global (%) 13,2
0,01 92,9 11,4 12,3
5 CONCLUSÃO
O método escolhido para a análise dos compostos Y e Z mostrou-se eficiente e robusto, uma vez que as seis amostras preparadas em cada nível (LOQ e 100xLOQ) apresentou variação menor que 20%, valor máximo permitido pela norma RDC nº4 /2012 (ANVISA). Além disso, o valor encontrado das amostras fortificadas também foi próximo do teórico estabelecido (entre 70-120% de recuperação), o que demonstrou a reprodutibilidade do método.
Assim, foi possível provar que os dados encontrados são confiáveis e robustos, uma vez que pequenas variações de condições no equipamento utilizado não prejudicaram os resultados obtidos.
Dessa forma, os resultados permitem afirmar que o método pode ser usado para posterior análise de resíduos dos compostos estudados na pesquisa, ou seja, para análise de amostras cujo valor de resíduo de agrotóxico se deseja descobrir.
REFERÊNCIAS
AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Resolução da Diretoria Colegiada - RDC nº 4, de 18 de janeiro de 2012. Disponível em: <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2012/res0004_18_01_2012.htm l> Acesso em:24/03/2018
AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA): Relatório das Análises de Amostras de Monitoradas no Período de 2013 a 2015 - Novembro/2016.
Disponível em:
<http://portal.anvisa.gov.br/documents/111215/0/Relatório+PARA+2013-2015_VERSÃO-FINAL.pdf/494cd7c5-5408-4e6a-b0e5-5098cbf759f8> Acesso em:24/03/2018
BRASIL, Congresso Nacional. Lei nº 7802, de11 de julho de 1989. Diário Oficial da União, república Federativa do Brasil, Brasília, 11/07/1989. Disponível em:
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