ISABELE CARDOSO VIEIRA DE CASTRO
Avaliação da utilização das fototerapias Laser (
780
nm) e LED (
850 ± 10 nm) no processo inflamatório
induzido por carragenina na articulação
temporomandibular de rato
PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
Área de Concentração: Laser em Odontologia
Salvador 2014 UFPB - UFBA
ISABELE CARDOSO VIEIRA DE CASTRO
Área de concentração: Laser em Odontologia Linha de pesquisa: Biomodulação do reparo tecidual
Orientador: Prof. Dr. Jean Nunes dos Santos
Co-orientador: Prof. Antônio Luiz Barbosa Pinheiro, PhD
SALVADOR 2014
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Odontologia UFPB-UFBA, como um dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Odontologia.
AVALIAÇÃO DA UTILIZAÇÃO DAS FOTOTERAPIAS LASER (λ 790 nm) E LED (λ 850 ± 10 nm) NO PROCESSO INFLAMATÓRIO INDUZIDO POR CARRAGENINA NA ARTICULAÇÃO TEMPOROMANDIBULAR DE RATO
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Universitária de Saúde, SIBI - UFBA.
D278 De Castro, Isabele Cardoso Vieira
Avaliação da utilização das fototerapias Laser (λ 790 nm) e LED (λ 850 ± 10 nm) no processo inflamatório induzido por carragenina na articulação temporomandibular de rato. / Isabele Cardoso Vieira De Castro – Salvador, 2014.
101 f.
Orientador: Prof. Dr. Jean Nunes dos Santos.
Co-Orientador: Prof. Dr. Antônio Luiz Barbosa Pinheiro. Tese (Doutorado) – Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Odontologia, 2014.
1. Articulação temporomandibular. 2. Carragenina. 3. Inflamação. 4. Terapia a Laser. 5. Fototerapia. I. Santos, Jean Nunes dos. II. Pinheiro, Antônio Luiz Barbosa. III. Universidade Federal da Bahia. IV. Título.
ISABELE CARDOSO VIEIRA DE CASTRO
Avaliação da utilização das fototerapias Laser (λ 790 nm) e LED (λ 850 ± 10 nm) no processo inflamatório induzido por carragenina na articulação
temporomandibular de rato
Salvador, 12 de fervereiro de 2014.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________________ Prof. Doutor Jean Nunes dos Santos – Orientador – UFBA
_________________________________________________________ Profa. Doutor Luciana Maria Pedreira Ramalho – Membro – UFBA
_________________________________________________________ Profa. Doutor Lélia Batista de Souza – Membro – UFRN
________________________________________________________ Prof. Doutor Aldo Brugnera Júnior – Membro – UNICASTELO
________________________________________________________ Profa Doutor Manoel Sant’Ana Filho – Membro – UFRGS
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho...
Aos meus pais, Dicélia e Israel, por estarem sempre ao meu lado e pelo apoio e amor incondicionais.
À minha irmã Larissa, pela sua amizade, carinho e dedicação e por sempre me fazer acreditar que tudo é possível.
AGRADECIMENTOS
A Deus, onipresente e onipotente, por caminhar sempre ao meu lado mostrando os caminhos a serem seguidos e também por me confortar quando eu mais preciso.
Ao meu orientador, grande mestre, Prof. Jean Nunes dos Santos, pela sua atenção, disponibilidade, confiança e também pelos sábios ensinamentos, os quais guardarei para sempre. Muito obrigada.
Ao meu co-orientador, grande mestre, Prof. Antônio Pinheiro, por estar sempre presente, por sempre orientar o meu vôo e por tornar tudo mais claro através da sua grande experiência e sábias palavras. Muito obrigada.
A Profa. Carolina Montagn, pelo carinho, pelas suas brilhantes sugestões e pela sua valiosa contribuição para este trabalho. Obrigada por sempre ter acreditado e confiado em mim.
A Profa. Maria Cristina Cangussú, pela sua disponibilidade e pela
paciência na realização da análise estatística deste trabalho.
A Profa. Aparecida Marques, sempre atenciosa e acessível desde a minha iniciação científica. Admiro sua sabedoria e competência.
Aos docentes do Programa Integrado de Pós-graduação
UFPB-UFBA, pelos ensinamentos e por proporcionar uma nova visão sobre os temas
abordados.
Aos meus colegas de Doutorado Cristiane Becher, Fabíola Carvalho,
Luis Guilherme Soares, João Reis e Jouber Aciole, pelo carinho, amizade e
Um agradecimento especial à colega Fabíola Carvalho pela sua ajuda na edição das fotos para a tese.
Ao colega Artur Barbosa, sempre prestativo e acessível. Obrigada pela grande ajuda na fase experimental.
Aos estagiários do Centro de Biofotônica, Aline, Ana Carolina, Brunna,
Luiz Galdêncio e Renan, pela dedicação e grande auxílio durante a fase
experimental deste trabalho. Muito obrigada.
À estagiária e bolsista, Juliana Aragão, pela sua amizade, competência dedicação e interesse. Sempre disponível quando eu mais precisava. Muito obrigada.
Às pós-doutorandas Nicole Ribeiro, Priscila Chagas, Ana Paula
Cavalcanti, Juliana Monteiro e Susana Sampaio, pela amizade,
companheirismo, ajuda e sugestões.
À Arthur Edgard Ferreira Jr., pela realização da revisão deste trabalho e também pelo carinho e companheirismo.
Aos funcionários da FOUFBA, em especial a Dona Lourdes, Srta.
Suely Paixão, Sra. Mirian e Sr. Edilson que contribuíram de forma direta e
indireta para realização deste trabalho. Muito obrigada.
Ao CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - pelo auxílio finaceiro que possibilitou a realização deste trabalho.
Meus sinceros agradecimentos a todos que, de alguma maneira, contribuíram para que este trabalho se tornasse realidade...
E Deus disse: “Faça-se a Luz !” E a Luz foi feita.
SUMÁRIO
LISTA DE QUADROS E TABELAS LISTA DE FIGURAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO 17
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 20
2.1 Disfunção temporomandibular 20
2.2 Inflamação e Disfunção temporomandibular 22
2.3 Processos inflamatórios induzidos por carragenina 27
2.4 Anatomia e histologia da articulação temporomandibular de rato 29 2.5 Processos inflamatórios na articulação temporomandibular de rato 31 2.5 Fototerapias Laser e LED 34 2.7 Fototerapias Laser e LED na inflamação 37 2.8 Fototerapias Laser e LED na disfunção temporomandibular 40 3. PROPOSIÇÃO 42 3.1 Objetivo geral 42
3.2 Objetivos específicos 42
4. MATERIAS E MÉTODOS 43 4.1 Respaldo ético da pesquisa 43 4.2 Delineamento 43
4.3 Amostra 43
4.4 Distribuição dos grupos 44
4.5 Procedimentos 45 4.5.1 Anestesia 45 4.5.2 Indução da inflamação 45 4.5.3 Fototerapia 46 4.5.3.1 Laser 46 4.5.3.2 LED 47
4.6 Morte dos animais e obtenção das amostras 49
4.7 Histomorfometria 51
5. RESULTADOS 53 5.1 Análise histológica 53
5.1.1 Análise descritiva - côndilo e cápsula articular 53
5.1.2 Análise estatística 72
5.2 Histomorfometria- Membrana Sinovial 77
6. DISCUSSÃO 79
7. CONCLUSÃO 88
REFERÊNCIAS 89
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 01 Estudos clínicos utilizandos as fototerapias Laser ou LED (DE CASTRO, 2014).
41 Quadro 02 Distribuição dos grupos de estudo (DE CASTRO,
2014).
44 Quadro 03 Parâmetros das fototerapias utilizados na
metodologia (DE CASTRO, 2014).
47 Tabela 01
Tabela 04
Critérios semi-quantitativos usados para análise de microscopia de luz (DE CASTRO, 2014).
Graduação da espessura das camadas de células da membrana sinovial (DE CASTRO, 2014).
Tabela 04 T
50 78
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Agulha G30 conectada a uma Microseringa Hamilton de 50µl através de uma cânula de polietileno (PE 50) (DE CASTRO, 2014). 48
Figura 02 Injeção de carragenina na ATM esquerda do animal (DE CASTRO,
2014). 48
Figura 03 Aparelho de Laser de diodo (GaAlAs, λ 780nm, Twinflex Evolution®, MMoptics,São Carlos,SP,Brasil) (DE CASTRO, 2014). 48
Figura 04 Irradiação com o Laser λ 780nm na ATM esquerda do animal (DE
CASTRO, 2014). 48
Figura 05 Aparelho de LED de diodo (GaAlAs, λ 850nm ± 10, FISIOLED®, MMoptics,São Carlos,SP,Brasil) ( DE CASTRO, 2014). 48
Figura 06 Irradiação com o LED λ850nm±10 na ATM esquerda do animal (DE
CASTRO, 2014). 48
Figura 07 Campos padronizados para a contagem das camadas celulares da membrana. Campo interno (I) e campo externo (E), HE (DE CASTRO, 2014).
52 Figura 08 Campo interno de observação, HE (DE CASTRO, 2014). 52
Figura 09 Campo externo de observação, HE (DE CASTRO, 2014). 52
Figura 10 Fotomicrografia do grupo experimental G1 aos dois dias: Observa-se presença de infiltrado inflamatório crônico na lateral do côndilo estendendo-se no tecido muscular adjacente, HE (DE CASTRO, 2014).
55 Figura 11 Fotomicrografia do grupo experimental G1 aos dois dias: Observa-se
presença de discreta reabsorção óssea na lateral do côndilo, HE (DE CASTRO, 2014).
55 Figura 12 Fotomicrografia do grupo experimental G1 aos três dias: Observa-se
presença de infiltrado inflamatório crônico na lateral do côndilo, HE (DE CASTRO, 2014).
56
Figura 13 Fotomicrografia do grupo experimental G1 aos três dias: Presença de discreta reabsorção óssea na lateral do côndilo, HE (DE CASTRO, 2014).
56 Figura 14 Fotomicrografia do grupo experimental G1 aos sete dias: Observa-se
espessamento da zona de fibrocartilagem do côndilo, HE (DE CASTRO, 2014).
57 Figura 15 Fotomicrografia do grupo experimental G1 aos sete dias: Observação
de osteoclasto e área de reabsorção óssea na lateral do côndilo, HE (DE CASTRO, 2014).
57 Figura 16 Fotomicrografia do grupo G1 aos dois dias: Moderada expressão de
colágeno no côndilo e intensa no disco articular, Picrosírius (DE CASTRO, 2014).
58 Figura 17 Fotomicrografia do grupo G1 aos três dias: Intensa expressão de
colágeno para ambos côndilo e disco articular, Picrosírius (DE CASTRO, 2014).
58 Figura 18 Fotomicrografia do grupo G1 aos sete dias: Moderada expressão de
colágeno no côndilo, Picrosírius (DE CASTRO, 2014). 59
Figura 19 Fotomicrografia do grupo experimental G2 aos dois dias: Observa-se presença de discreta inflamação crônica na lateral do côndilo, HE (DE CASTRO, 2014).
62 Figura 20 Fotomicrografia do grupo experimental G2 aos três dias: Observa-se
presença de discreto infiltrado inflamatório crônico no interior do côndilo, HE (DE CASTRO, 2014).
62 Figura 21 Fotomicrografia do grupo experimental G2 aos sete dias: Observa-se
presença de discreto infiltrado inflamatório crônico na lateral do côndilo, HE (DE CASTRO, 2014).
Figura 22 Fotomicrografia do grupo G2 aos dois dias: Moderada expressão de colágeno no côndilo e intensa no disco articular, Picrosírius (DE CASTRO, 2014).
63 Figura 23 Fotomicrografia do grupo G2 aos três dias: Intensa expressão de
colágeno para ambos côndilo e disco articular, Picrosírius (DE CASTRO, 2014).
64 Figura 24 Fotomicrografia do grupo G2 aos sete dias: Moderada expressão de
colágeno no côndilo e intensa no disco articular, Picrosírius (DE CASTRO, 2014).
64 Figura 25 Fotomicrografia do grupo experimental G2 aos dois dias: Presença de
vilosidades na membrana sinovial, HE (DE CASTRO, 2014). 65
Figura 26 Fotomicrografia do grupo experimental G2 aos sete dias: Presença de discreto tecido de granulação na membrana sinovial, HE (DE CASTRO, 2014).
65 Figura 27 Fotomicrografia do grupo experimental G3 aos dois dias: O côndilo
apresenta spectos de normalidade e ausência de inflamação HE (DE CASTRO, 2014).
68 Figura 28 Fotomicrografia do grupo experimental G3 aos três dias: Presença de
discreto infiltrado inflamatório na lateral do côndilo e espessamento da zona de fibrocartilagem espessa, HE (DE CASTRO, 2014).
68 Figura 29 Fotomicrografia do grupo experimental G3 aos sete dias: Presença de
discreto infiltrado inflamatório e de reabsorção óssea na lateral do côndilo, HE (DE CASTRO, 2014).
69 Figura 30 Fotomicrografia do grupo G3 aos dois dias: Intensa expressão de
colágeno no côndilo e discreta no disco articular, Picrosírius (DE CASTRO, 2014).
69 Figura 31 Fotomicrografia do grupo G3 aos três dias: Discreta expressão de
colágeno no côndilo, Picrosírius (DE CASTRO, 2014). 70
Figura 32 Fotomicrografia do grupo G3 aos sete dias: Moderada expressão de colágeno no côndilo e discreta no disco articular, Picrosírius (DE CASTRO, 2014).
70 Figura 33 Fotomicrografia do grupo experimental G3 aos três dias: Presença de
tecido de granulação e vilosidades na membrana sinovial, HE (DE CASTRO, 2014).
71 Figura 34 Representação gráfica da deposição de colágeno no côndilo:
comparação entre os grupos G1, G2 E G3 aos dois dias (DE CASTRO, 2014).
74 Figura 35 Representação gráfica da deposição de colágeno no côndilo:
comparação entre os grupos G1, G2 E G3 aos três dias (DE CASTRO, 2014).
74 Figura 36 Representação gráfica da deposição de colágeno no côndilo:
comparação entre os grupos G1, G2 E G3 aos sete dias (DE CASTRO, 2014).
75 Figura 37 Representação gráfica da deposição de colágeno no disco articular:
comparação entre os grupos G1, G2 E G3 aos dois dias (DE CASTRO, 2014).
75 Figura 38 Representação gráfica da deposição de colágeno no disco articular:
comparação entre os grupos G1, G2 E G3 aos três dias (DE CASTRO, 2014).
76 Figura 39 Representação gráfica da deposição de colágeno no disco articular:
comparação entre os grupos G1, G2 E G3 aos sete dias (DE CASTRO, 2014).
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AINES AsGaAl
Anti-inflamatorios não esteróides Arseneto de Gálio e alumínio ATP Adenosina-trifosfato
CEEA Comissão de Ética na Experimentação Animal COX COX-1 COX-2 Cicloxigenase Cicloxigenase um Cicloxigenase dois CW Modo contínuo DNA DTM Ácido desoxirribonucléico Disfunção Temporomandibular HE IL-1α IL-1β IL-1ra IL-6 IL-8 iNOS J/cm2 Hematoxilina-Eosina Interleucina 1 alfa Interleucina 1 beta
Antagonista do receptor de IL-1 Interleucina seis
Interleucina oito
óxido nítrico sintase induzível Joule por centímetro quadrado Laser
LED LTB4
Amplificação da Luz por Emissão Estimulada de Radiação Diodo emissor de luz
Leucotrieno B quatro MMP MMP-1 MMP-3 MMP-13 Metaloproteinase Metaloproteinase 1 Metaloproteinase três Metaloproteinase treze NO NO2 PG PGE2 ROS RT-PCR SAEF SIL-1RII sTNFR-I sTNFR-II TGF-β TNF TRPA1 UFBA UFPB µm Φ Óxido nítrico Dióxido de nitrogênio Prostaglandina Prostaglandina E dois Espécie reativa de oxigênio
Reação em cadeia pela polimerase precedida de transcrição reversa
Fluência de energia média espacial Receptor Solúvel de Interleucina 1 dois Receptor solúvel para TNF-I
Receptor solúvel para TNF dois
Fator de transformação do crescimento beta Fator de necrose tumoral
Receptor de Potencial Transitório Ankirina 1 Universidade Federal da Bahia
Universidade Federal da Paraíba Comprimento de onda
Micrometro Spot
RESUMO
As disfunções temporomandibulares (DTMs) são frequentes na população e geralmente envolvem processos inflamatórios. Trabalhos prévios têm evidenciado efeitos positivos das fototerapias Laser e LED (diodos emissores de luz) nas DTMs, porém sua ação e mecanismo no infiltrado inflamatório da articulação temporomandibular ainda são pouco conhecidos. O objetivo deste trabalho foi avaliar, através da análise histológica, a eficácia das luzes Laser (10 J/cm2, λ 780 nm, 70 mW, CW) e LED (10 J/cm2, λ 850 ± 10 nm,100 mW,CW) na inflamação da articulação temporomandibular de ratos induzida por carragenina. Quarenta e cinco animais foram divididos em três grupos com cinco animais por subgrupo de acordo com os tempos experimentais de dois, três e sete dias: Inflamação; Inflamação + Fototerapia Laser e Inflamação + Fototerapia LED. A primeira irradiação foi realizada 24 horas após a indução com intervalo de 48 horas entre as sessões. Após a morte animal, os espécimes foram processados e corados com HE e Picrosirius. Em seguida, as amostras foram examinadas histologicamente. Os dados foram submetidos à análise estatística. No decorrer dos tempos experimentais, no grupo inflamação, foi observado infiltrado inflamatório crônico discreto a moderado entre as trabéculas ósseas do côndilo. No grupo tratado com Laser, a região do côndilo apresentou intensa vascularização e presença de discreta inflamação crônica na maioria dos espécimes. No grupo LED, o côndilo apresentou aspectos de normalidade e ausência de inflamação em alguns espécimes, ao longo dos tempos experimentais. O grupo irradiado com Laser apresentou maior quantidade de colágeno no côndilo (p=0,04) e disco (p=0,03) quando comparado aos grupos inflamação e LED, respectivamente. Os grupos irradiados com Laser ou LED apresentaram um menor número de camadas da membrana sinovial quando comparados aos grupos não irradiados. Concluiu-se que as fototerapias LaConcluiu-ser e LED apreConcluiu-sentaram de modo geral efeitos positivos em relação à redução do processo inflamatório na articulação temporomandibular de rato.
Palavras-chave: Articulação Temporomandibular, Carragenina, Inflamação,
ABSTRACT
Temporomandibular disorders (TMD) are commonly found in the population and usually involve inflammatory processes. Previous studies have shown positive effects of Laser and LED (Ligth emitting diodes) phototherapies on TMD but their action and mechanism in the inflammatory infiltrate of the temporomandibular joint are still poorly understood. The aim of this study was to assess through histological analysis the effectiveness of Laser light (10 J/cm2, λ 780 nm, 70 mW,CW) and LED (10 J/cm2, λ 850 nm, 100 mW,CW) on the inflammation of the temporomandibular joint of rats induced by carrageenan. Forty-five animals were divided in three groups with five animals per subgroup according to the experimental times of two, three and seven days: Inflammation, Inflammation + Laser phototherapy and Inflammation + LED phototherapy. The first irradiation was performed 24 hours after induction with an interval of 48 hours between sessions. After animal death, specimens were processed and stained with HE and Picrosirius. Then the samples were examined histologically. Data were statistically analyzed. The inflammation group showed mild to moderate chronic inflammatory infiltrate among the bone trabecules of the condyle. Over the time-course of the study in the Laser group the region of the condyle presented mild chronic inflammation and intense vascularization. In the LED group, the condyle showed aspects of normality and absent inflammation in some specimens. In all the time-points, the Laser irradiated groups showed greater amount of collagen in the condyle (p = 0.04) and disc (p = 0.03) when compared to the inflammation and LED groups, respectively. Laser and LED treated groups demonstrated a smaller number of the layers of the synovial membrane when compared to the non-irradiated groups. It was concluded that, in general, Laser and LED phototherapies resulted in a reduction of the inflammatory infiltrate in the temporomandibular joint of rat.
Keywords: Temporomandibular Joint, Carrageenan, Inflammation,Laser Therapy ,Phototherapy
1. INTRODUÇÃO
Desordens Temporomandibulares (DTMs) são um conjunto de distúrbios articulares e/ou musculares na região orofacial, que envolve os músculos da mastigação, a ATM e as estruturas adjacentes à articulação. Frequentemente um componente inflamatório está associado a casos de DTMs. Entretanto, o entendimento do processo inflamatório na articulação temporomandibular tem sido baseado em outras articulações sinoviais (HUTCHINS et al., 2000).
As características especiais da ATM, como sua densa cobertura de tecido fibroso, podem influenciar a sua resposta como uma articulação sinovial (MEIKEL,1992). Além disso, concentrações de algumas substâncias inflamatórias na ATM diferem de outras articulações, como os níveis de substância P, peptídeo relacionado a calcitonina, e o neuropeptídio Y, que apresentam níveis mais elevados nas artrites das ATMs em humanos que na articulação do joelho, provavelmente devido à densa inervação das ATMs (TOMINAGA et al.,1999).
As ATMs são suscetíveis a uma variedade de alterações inflamatórias, incluindo as osteoartrites e a artrite reumatoide (BOULOUX et al., 2009). Os sintomas mais frequentes são: dor ao movimentar, sensibilidade à palpação, rigidez, crepitação e tumefação (SILVA et al.,2011). Os objetivos do tratamento incluem a manutenção da função aliviando a sintomatologia dolorosa e rigidez das ATMs (DURANDO et al., 2002). Tratamentos não-cirúrgicos para DTMs constituem a primeira opção e frequentemente consistem de medicações, como AINES (anti-inflamatórios não esteroides), relaxantes musculares e antidepressivos (OKENSON, 2008).
A carragenina é um mucopolissacarídeo sulfatado, utilizado como agente de indução da inflamação experimental e dor inflamatória na pata de ratos, sendo um modelo utilizado extensivamente no desenvolvimento de AINES e inibidores seletivos da cicloxigenase-2 (PETER-SZABO et al., 2007). Diferentemente de outras substâncias, a carragenina causa uma inflamação do tipo não-neurogênica, não é antigênica, não produz efeitos sistêmicos e proporciona um alto grau de reprodutividade (WINTER et al. 1962).
Estudos recentes têm demonstrado bons resultados quanto à utilização da fototerapia Laser em condições inflamatórias na ATM (CARVALHO et al., 2011), pata (SILVA et al., 2011) e joelho de ratos (PALLOTA et al., 2012), revelando-se como uma alternativa no tratamento de desordens articulares inflamatórias crônicas, uma vez que não produz complicações como nefrotoxicidade e úlceras gástricas, as quais são comuns com o uso de AINES (ALBERTINI et al., 2004).
A fototerapia com LED (Diodo Emissor de Luz), assim como o Laser, pode causar a diminuição da intensidade da dor e até analgesia, através da inibição da ação da enzima cicloxigenase e interrompendo a conversão de ácido araquidônico em prostaglandinas (ALBERTINI et al., 2007). Entretanto, os efeitos terapêuticos do LED são específicos e por ser uma tecnologia relativamente nova, ainda se encontram em fase de investigação a respeito dos seus reais resultados (MEYER et al., 2010).
Tendo em vista que para o avanço do tratamento da DTM com a utilização de fototerapias na prática clínica são necessários mais estudos experimentais que descrevam a ação da fotobiomodulação Laser e, em
especial, do LED na ATM, o objetivo desse estudo foi avaliar, através da análise histológica, os efeitos das fototerapias Laser e LED no processo inflamatório induzido por carragenina na articulação temporomandibular de rato.
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1- Disfunção Temporomandibular
A articulação temporomandibular (ATM) é uma articulação sinovial bilateral que permite movimentos mandibulares em torno do osso temporal. A ATM difere-se das demais articulações do corpo por ser revestida de fibrocartilagem e não cartilagem hialina, sendo também composta por um disco articular localizado entre as faces articulares (côndilo mandibular, eminência articular e fossa mandibular do osso temporal) (MADEIRA, 2008).
A membrana sinovial consiste de uma porção superficial de células conjuntivas, denominada camada íntima, que está presente sobre uma camada de tecido conjuntivo densamente vascularizado e inervado, denominada camada subíntima. A camada íntima apresenta diferentes tipos celulares e apesar de compacta, não é contínua, e geralmente pode ser visualizada em contato com o espaço articular. A camada subíntima é constituída por um tecido conjuntivo frouxo que contém vasos sanguíneos, linfáticos e nervos, além de uma escassa população de células como fibroblastos, macrófagos e mastócitos. A superfície da membrana sinovial pode apresentar pregas e projeções (DIJKGRAAF et al., 1996).
As características especiais das ATMs podem influenciar sua resposta como articulação sinovial. A sua superfície, por exemplo, apresenta uma cobertura de tecido fibroso denso, enquanto que a maioria das demais articulações sinoviais são cobertas apenas por cartilagem hialina. Essa é uma característica importante, pois o tecido conjuntivo fibroso possui uma maior
capacidade de autorreparação do que a cartilagem hialina. Dessa forma, o tratamento das condições artríticas da ATM pode ser diferente de outras articulações sinoviais (MEIKEL,1992).
A disfunção temporomandibular (DTM) possui origem multifatorial caracterizada por quadros agudos e principalmente crônicos, além de abranger inúmeros problemas clínicos envolvendo a musculatura mastigatória, a ATM e estruturas associadas, ou ambos. Essa desordem é considerada a causa mais frequente de dor orofacial crônica (MANFREDINI et al., 2004). Os diversos aspectos etiológicos da DTM são incertos. Os principais fatores comumente relacionados são modificações na oclusão dentária, ausência de unidades dentárias, modificações na morfologia interna da ATM como relação anormal do disco articular com o côndilo mandibular, a fossa e a eminência articular (HIRATA at al., 2007). Problemas psicológicos, ansiedade, depressão e estresse possuem correlação com os pacientes que apresentam DTM (CELIĆ et al.,2011), além de mastigação unilateral e hábitos parafuncionais (MANFREDINI et al.,2003). Normalmente um único fator não é responsável pelo desencadeamento da DTM e sim a associação entre eles (OKENSON, 2008).
Os principais sintomas para a DTM incluem: estalido, crepitação, movimento limitado ou travamento da mandíbula, dor na face, colo ou ombros, dores de cabeça, dores de ouvido, tonturas e problemas auditivos (TANAKA, DETAMORE, MERCURI, 2008).
As ATMs são suscetíveis a uma variedade de alterações inflamatórias, as quais são consideradas como a principal causa de dor em pacientes
portadores de DTM (BOULOUX et al., 2009). Tal inflamação pode ocorrer na membrana sinovial (sinovite) e/ou na cápsula (capsulite), podendo resultar de um trauma localizado, infecção ou degeneração ou ainda ser parte de uma alteração na formação do colágeno ou poliartrite sistêmica, como por exemplo a artrite reumatoide (SESSLE et al., 2010). Os objetivos terapêuticos do tratamento incluem a manutenção da função, aliviando a sintomatologia dolorosa e rigidez das ATMs (DURANDO et al., 2002).
Tratamentos não-cirúrgicos para DTMs constituem a primeira opção e frequentemente consistem de medicações, como AINES, relaxantes musculares e antidepressivos. Os AINES podem reduzir a inflamação, mas também podem aumentar o risco de complicações, como úlceras gástricas e nefrotoxidade (ISHIMARU et al., 2003). Outros tratamentos indicados são: splints oclusais; fisioterapia e tratamento de atividades parafuncionais (CETINER et al., 2006), TENS (neuroestimulação elétrica transcutânea), Laserterapia (NÚÑEZ et al.,2006) e acupuntura/eletroacupuntura (GODDARD et al., 2002).
2.2 - Inflamação e disfunção temporomandibular
A inflamação é uma resposta inespecífica do corpo a diferentes tipos de agressões, constituindo-se, essencialmente, de uma resposta protetora que inicia o processo de reparo tecidual (KHALIL et al., 1992).
A inflamação se caracteriza pelos seguintes sinais: rubor, calor, tumor, dor e perda da função, refletindo os efeitos das citocinas e de outros
mediadores inflamatórios nos vasos sanguíneos locais (JANEWAY et al., 2007; KUMAR et al., 2010). A inflamação pode ser dividida em fase inicial e tardia, dependendo do tempo e duração da resposta e do tipo de célula inflamatória envolvida. A fase inflamatória inicial dura de 1 a 2 dias e inicia-se com a ativação do sistema imunológico pelas vias clássica e alternativa da cascata do sistema complemento. Isso leva à infiltração da ferida pelos neutrófilos granulócitos (leucócitos polimorfonucleares), que são atraídos para o local da ferida dentro de 24 a 48 horas após a lesão por inúmeros quimiotáxicos como: Fragmentos proteicos da matriz extracelular; Fator de crescimento transformador β (TGF-β); Componentes do sistema complemento (C3a e C5a); Peptídeos formil-metionina e produtos bacterianos. Dentro de um curto tempo, os leucócitos polimorfonucleares aderem-se às células endoteliais na periferia dos vasos sanguíneos (marginação) e começam a moverem-se ativamente através da parede vascular (diapedese). Uma vez no sítio inflamatório, eles fagocitam a bactéria e outras partículas estranhas ao organismo, liberando enzimas degradantes e radicais livres derivados de oxigênio, o que minimiza a contaminação bacteriana da ferida e favorece o processo cicatricial nas próximas fases (KUMAR et al., 2010).
As inflamações agudas caracterizam-se pelo predomínio de fenômenos exsudativos, consequentes a alterações da permeabilidade vascular, permitindo o acúmulo na região inflamada de líquido (edema), fibrina (que se forma no interstício pela interação entre componentes do plasma e fatores dos tecidos), leucócitos, especialmente neutrófilos e hemácias. Nas inflamações crônicas, além destes elementos, ocorrem no local fenômenos
produtivos, ou seja, proliferação de vasos, fibroblastos (com consequente deposição de colágeno), como também migração e proliferação local de monócitos e linfócitos (KUMAR et al., 2010).
Os mediadores envolvidos na origem da dor inflamatória também exercem um papel essencial na ativação de outros eventos inflamatórios, incluindo edema e migração leucocitária. As prostaglandinas podem ser essenciais para a formação de edema, enquanto as citocinas pró-inflamatórias (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 e TNF), além de atuar no crescimento celular, na remodelação de tecidos e na manutenção da homeostase, também podem mediar funções destrutivas, como inflamação e reações autoimunes (WHITE et al., 2005). Em adição, diversos estudos que analisaram o líquido sinovial de pacientes com DTM têm encontrado altos níveis de citocinas inflamatórias, o que sugere a associação destas a mecanismos patológicos. A interleucina-1 (IL-1) é produzida em grandes quantidades pela membrana sinovial durante a inflamação, assim como por monócitos e macrófagos, não estando presente em tecidos normais (TATAKIS,1993). Kubota et al. (1997) mostraram haver relação entre a presença de IL-1β e o desenvolvimento de osteoartrite na ATM. Alstergreen et al. (1999) observaram aumento da dosagem de IL-1β em ATMs acometidas por processo inflamatório quando comparado a articulações normais, e sugeriram relação entre IL-1β e sintomatologia dolorosa, limitação do movimentos mandibulares e destruição articular. Ijima et al. (2001) demonstraram que IL-1α é capaz de induzir síntese de metaloproteinases (MMPs) por condrócitos e células do
disco articular ocasionando quebra da estrutura na matriz extracelular e consequente aumento do processo de degeneração articular.
O fator de necrose tumoral alfa (TNFα) é produzido pela membrana sinovial da ATM na fase crônica da inflamação e também por monócitos e macrófagos ativados, estando envolvido na etiopatogênese da sinovite e da degeneração cartilaginosa em pacientes com DTM (HIROTA et al.,2006). Além disso, sabe-se que o TNFα ativa a síntese de citocinas como as IL-1 e IL-6 e linfócitos assim como os osteoclastos, estimula a produção de prostaglandinas (PG) e também condrócitos, sinoviócitos do tipo B e fibroblastos da cavidade articular a sintetizarem colagenases (ALSTERGREEN, 2000).
Tem sido sugerido que a IL-6 participa na fisiopatologia da DTM, não estando presente, entretanto, em articulações normais. IL-6 está envolvida no desenvolvimento de sinovite, de destruição óssea e cartilaginosa, de hiperalgesia nos tecidos articulares, sendo possível a sua utilização como marcador bioquímico de DTM crônicas (KANEYAMA et al., 2004).
Níveis elevados de IL-8 foram encontrados no fluido sinovial de pacientes com DTM, sendo também demonstrado que a principal fonte de IL-8 em ATMs são as células sinoviais e células inflamatórias, como neutrófilos e macrófagos que participam na fase aguda da inflamação ATM (SUKEDAI et al., 2004).
As sínteses de prostaglandinas (PG) e de leucotrienos pelo metabolismo do ácido araquidônico e ação das enzimas ciclooxigenase
(COX) e lipoxigenase, respectivamente, estão envolvidas na patogênese da fase aguda da inflamação (KUMAR et al., 2010). Três isoformas da COX são conhecidas: COX-1, sintetizada constitutivamente expressa no estômago, rins e plaquetas, e considerada importante na proteção da mucosa estomacal. A COX-2, inicialmente tida como induzida pelo processo inflamatório, foi constatada como sendo constitutiva no endotélio vascular, rins, pulmão e cérebro. A COX-3 é uma isoforma encontrada principalmente no sistema nervoso central e seu papel é ainda desconhecido (BOTTING, 2006). As ações da prostaglandina E2 (PGE2) na inflamação incluem mediar vasodilatação, aumentar a permeabilidade vascular e sensibilizar nociceptores periféricos. Tem sido demonstrada a presença de PGE2 em ATMs com desordem inflamatória e sintomatologia dolorosa (ALSTERGREN, KOOP, 2000), assim como a presença de leucotrieno B4(LTB4) e PGE2em pacientes apresentando desarranjos internos na ATM (NISHIMURA et al. 2002) e em articulações com sinovite (ARINCI et al. 2005).
Tanimoto et al. (2011) demonstraram in vitro que a expressão de COX-2/PGE2 foi aumentada devido a IL-1β em condrócitos articulares do côndilo mandibular, e que a MMP-1, -3, e -13 foram induzidas por PGE2, sugerindo que a indução de COX- 2 / PGE2 pela IL-1β desempenha um papel crucial nos processos catabólicos da cartilagem condilar mandibular sob condições inflamatórias.
2.3 - Processos inflamatórios induzidos por carragenina
A carragenina é originada da parede celular principalmente de algas vermelhas como a Chondrus crispus, também conhecida por Irish Moss, ocorrendo em Carragheen (Waterford, Irlanda), local em que cresce em abundância. Material de composição semelhante foi isolado de outras algas como Gigartina stellata e Rhodymenia palmata. A carragenina é um mucopolissacarídeo sulfatado que pode ser separado em dois compostos. Uma fração se transforma em gel sob a ação do íon potássio e é designada como kappa (κ), e a outra é insensível ao potássio denominada lambda (λ). As frações κ e λ representam 40 e 60% do extrato não fracionado (DI ROSA, 1972).
A carragenina não gelatinosa (λ) é utilizada para induzir inflamação e dor inflamatória em modelos de roedores, especialmente na pata. O uso da carragenina como agente irritante para indução de edema na pata de rato foi introduzido por Winter, Risley e Nuss (1962). Logo em seguida, o efeito da indometacina foi avaliado através deste modelo, que é um dos métodos mais utilizados para o teste e avaliação de drogas e terapias anti-inflamatórias. A primeira fase (1-2h) do edema de pata induzido por carragenina é caracterizada pela liberação de histamina, serotonina e bradicinina, ao passo que na segunda fase (2-4h) tem sido correlacionada com elevada produção de prostaglandinas, sendo este processo mediado por bradicininas, leucotrienos, células polimorfonucleares e prostaglandinas produzidas por macrófagos teciduais (GUPTA et al., 2006; DI ROSA et al., 1971). A presença
de infiltrado de neutrófilos também é uma característica desse modelo (DI ROSA, SORRENTINO, 1968; VINEGAR et al.,1971). Além disso, utilizando a carragenina como agente flogógeno, diversos mediadores inflamatórios já foram descritos no tecido da pata de rato, como PGE2, leucotrienos (LTD4), IL-1 e IL-6, NO e espécies reativas de oxigênio, os quais apresentam potencial para perpetuar a estimulação da resposta inflamatória (GUAY et al., 2004).
Para Moilanen et al. (2012), o receptor de potencial transitório TRPA1 é ativado durante a indução da inflamação aguda por injeção de carragenina, gerando uma maior expressão de COX e um consequente aumento de prostaglandinas, podendo ser um alvo potencial para o desenvolvimento de novos agentes inflamatórios não-esteroides e inibidores seletivos da COX-2 (PETER-SZABO et al., 2007) incluindo produtos terapêuticos derivados de plantas medicinais (CHOU et al., 2003).
Debprasad et al.(2012) analisaram o efeito da inibição da expressão de NO2, PGE2, TNF-α, e iNOS através da utilização do extrato da folha de
Shorea robusta. Inflamação aguda foi induzida através da injeção subplantar de 0.1mL de carragenina diluída a 1% de solução salina e observaram que houve redução do diâmetro do edema da pata quando compararam os grupos tratados com os extratos aquoso e alcoólico (400 mg / kg) aos grupos controle negativo (solução salina) e positivo (diclofenaco de sódio), além de redução significativa de NO2, PGE2, TNF-α, IL-1β,IL-6 e iNOS.
Uzkeser et al. (2012) também relataram a indução de inflamação aguda e edema através da utilização de injeção subplantar de 0.1 mL de carragenina
diluída a 1% de solução salina e observaram que o salbutamol nas doses utilizadas (1 e 2 mg/kg) impediria as respostas inflamatória e nociceptiva estimulando os receptores adrenérgicos β-2 e da prevenção da geração de radicais de livres de oxigênio (ROS) durante o processo de inflamação aguda em ratos.
2.4 - Anatomia e histologia da articulação temporomandibular
de rato
A ATM normal do rato foi descrita anatômica e histologicamente em alguns estudos. Anatomicamente a ATM é envolvida por uma fina cápsula, formada por tecido fibroso e cobertura sinovial. O espaço articular é separado em dois outros espaços: discotemporal superior e disco mandibular inferior. O ângulo mandibular tem uma forma proeminente. A porção anterior do disco articular contem fibras de ligação do músculo pterigoideo lateral. Essa porção gradualmente se torna mais fina anteroposteriormente, até a porção intermediária. O disco é semelhante ao humano, porém a fossa articular é convexa. Posterior à porção intermediaria, o disco gradualmente aumenta em espessura e conecta-se posteriormente ao tecido gorduroso retrodiscal (MUTO et al.,1998; PORTO et al., 2010). A posição dos côndilos é divergente de acordo com o eixo axial e a fossa glenoide é plana, sem eminências (MUTO et al., 2010).
Histologicamente, no côndilo, existe uma área que compreende uma camada espessa de cartilagem, principalmente do tipo hialina, com camadas de condrócitos sobrepostas que amadurecem a medida em que a área de
transição para o tecido ósseo é observada na superfície articular do côndilo mandibular (PORTO et al., 2010). Luz (1995) ainda observou no côndilo as seguintes camadas: zona fibrosa, composta de feixes colágenos entrecruzados; zona de mitose, delgada; zona cartilaginosa, correspondente a cartilagem de crescimento; zona de ossificação, que apresenta trabéculas em formação e zona óssea, correspondente a parte de maior volume.
No osso temporal, assim como na superfície articular do côndilo, há uma camada fibrosa que aumenta em espessura de uma posição anterior para uma mais posterior sobre a superfície articular do osso temporal. Há também camadas de condrócitos sobrepostas, mas em menor número do que no côndilo (PORTO et al., 2010). É observado um disco que divide a cavidade articular em superior e inferior. As superfícies articulares condilar e temporal são cobertas por tecido fibrinoso, compacto e avascular, com o colágeno constituindo o componente mais predominante. A porção anterior da membrana sinovial na cavidade superior consiste em uma ou duas camadas de células e apresenta uma superfície lateral lisa, onde medialmente apresenta uma superfície irregular ou formação vilosa. O ligamento posterior é composto principalmente de fibras colágenas e elásticas (MUTO et al., 1998).
2.5-Processos
inflamatórios
na
articulação
temporomandibular de rato
A dor orofacial é mais comumente causada por inflamação, seja aguda ou crônica, e geralmente esta dor é refratária aos tratamentos existentes. Para que ocorram evoluções nessa área é necessária uma melhor compreensão dos mecanismos inflamatórios. Existem poucos estudos específicos nos tecidos orais ou faciais. Um modelo orofacial satisfatório tem a vantagem de permitir o estudo da inflamação de uma maneira geral, assim como os mecanismos que podem ser específicos deste tecido, como algumas formas de DTMs (HAAS et al. 1992). Segundo Puzas (2003), ainda não existe um modelo experimental que esclareça a fisiopatologia das DTMs em todos os estágios, da fase aguda à fase crônica. Essa limitação na fisiopatologia da inflamação e da dor na ATM se deve em parte à limitação de modelos experimentais e à dificuldade em mensurar parâmetros inflamatórios na região (ROVERONI et al, 2001). Desta forma, modelos de inflamação provenientes de outras regiões do organismo têm sido utilizados, mesmo por aqueles com interesse específico nos mecanismos relacionados à região orofacial (HARGREAVES et al., 1989; HYLDEN et al., 1991).
Os mecanismos do desenvolvimento e progressão das DTMs ainda não foram completamente elucidados. Diversos modelos experimentais têm sido desenvolvidos para o estudo de alterações inflamatórias na ATM. Para este propósito, autores sugerem procedimentos cirúrgicos (HELMY et
al.,1989), mecânicos (MUTO et al 1998 a, b) ou injeção intra-articular de substâncias (HAAS et al.,1992; TOMINAGA et al.,1999).
Haas et al. (1992) injetaram óleo de mostrada na ATM de ratos e, através de parâmetros inflamatórios como extravasamento plasmático com azul de Evans e infiltração de neutrófilos polimorfonuclares observaram inflamação aguda nos tecidos articulares. Este fato também foi observado por Boleta-Ceranto et al. (2005), os quais concluíram que o pico de extravasamento plasmático induzido pela administração periarticular de carragenina (300 μg / 50 μL) na ATM de ratos ocorreu em 60 minutos, o qual pode ser inibido pelos anti-inflamatórios dexametasona e meloxicam.
Processos inflamatórios na ATM são frequentemente acompanhados por sinovite, que é uma doença inflamatória da membrana sinovial caracterizada por hiperemia, angiogênese, edema, e proliferação de capilares. Ainda inclui a presença de inflamação aguda ou crônica, o que pode gerar hiperplasia das camadas da membrana sinovial (DIJKGRAAF, LIEM, DE BONT, 1997).
Diversos estudos avaliaram o padrão de reação inflamatória e proliferação de células da membrana sinovial promovidos pelo uso da carragenina. No estudo de Goulart et al. (2005) foi observado que uma injeção local única de 20 µl de carragenina a 1% na região da ATM foi suficiente para induzir reação inflamatória na articulação e nos tecidos moles periarticulares de ratos, sendo observado infiltrado inflamatório agudo seguido de infiltrado crônico, além da hiperplasia da membrana sinovial.
Lee et al. (2010) observaram que uma injeção de 0.01 ml de carragenina a 3% na ATM de rato induzia inflamação e proliferação de
células, especialmente na membrana sinovial e que o ácido hialurônico melhorava a inflamação, diminuindo as células inflamatórias na membrana sinovial.
Carvalho et al. (2011) observaram que a injeção em dose única de 20 µl de carragenina 1% resultou em resposta inflamatória na ATM. Aos três dias foi observado infiltrado inflamatório misto intenso e aos sete dias houve inflamação crônica intensa, com predominância de linfócitos, principalmente na região próxima à cápsula articular e ao colo do côndilo. Áreas de proliferação celular da membrana sinovial e vilosidades foram observadas após a indução da inflamação. Resultados semelhantes, aos três e sete dias, para a membrana sinovial, foram observados por Barreto et al., 2013, além de inflamação crônica intensa na região de tecidos retrodiscais, utilizando dose única de 50 µl de carragenina 1%.
Muto et al. (1998a;1998b), através da indução de sinovite na ATM de ratos por meio de trauma por hiper-extensão de abertura bucal, criaram um sistema de gradação das camadas da membrana sinovial: Grau 0 (1 a 3 camadas), Grau 1 (4 a 6 camadas) e Grau 2 (7 ou mais camadas). Este sistema foi adotado por Carvalho (2008), que após indução do processo inflamatório na ATM de ratos com carragenina, observou hiperplasia da membrana sinovial resultante do processo inflamatório apresentando grau 1, nos períodos de três e sete dias de observação.
No estudo de Ozaki et al. (2008), foram observadas histologicamente alterações inflamatórias na ATM de ratos, ocasionadas por hiper-extensão mandibular e ressecção do masseter. Em adição, foi avaliada a expressão da
COX-2 e iNOS na membrana sinovial por meio de imuno-histoquímica. Segundo os resultados, o grupo em que houve associação entre a abertura mandibular e ressecção do masseter apresentou maiores alterações inflamatórias, incluindo hiperplasia sinovial, vascularização dilatada, deposição de fibrina e intensa imunorreatividade para COX-2 e iNOS.
2.6 - Fototerapias Laser e LED
O Laser (Amplificação da luz por emissão estimulada de radiação) é uma forma de radiação altamente concentrada, que em contato com diferentes tecidos resulta, de acordo com o tipo de Laser, em efeitos térmicos, fotoquímicos e não lineares. Sendo uma forma de energia não ionizante, ao contrário dos raios X, gama e de nêutrons, a radiação Laser não é invasiva na maioria dos comprimentos de onda utilizados com finalidade terapêutica, sendo muito bem tolerada pelos tecidos (PINHEIRO, BRUGNERA, ZANIN, 2010).
O LED (Diodo Emissor de Luz) é uma fonte de luz contínua com alta eficiência luminescente. Constitui-se de um diodo semicondutor (junção P-N). A luz monocromática é produzida quando uma diferença de potencial positiva é aplicada no lado P e negativa no lado N, tornando o diodo polarizado. Acontece a recombinação de elétrons e lacunas na região da junção (p-n) gerando a emissão espontânea de energia sob forma de fótons (SEEGER, 1997). Este aparelho emite uma estreita faixa de radiação eletromagnética que varia de comprimentos de onda que vão do ultravioleta ao visível e infravermelho (TÚNER, HODE, 2004). Este tipo de fonte de luz apresenta
vantagens em relação à luz Laser. Possui longa durabilidade, baixo custo, circuitos eletrônicos mais simples e confiáveis, pode irradiar uma maior área de superfície, além de gerar menor impacto ambiental, pois requer menos energia para sua operação. Uma outra vantagem seria a sua alta eficiência energética, ou seja, toda energia fornecida é transformada em luz e apenas uma pequena fração é perdida sob a forma de calor (SEEGER,1997).
A diferença básica entre Lasers e LED é que este último não apresenta dispositivo ressonador, o qual é responsável pela emissão estimulada de radiação e amplificação de luz, como ocorre nos Lasers (KARU, 2003). Dessa forma, no LED predomina a emissão espontânea de radiação. Essa fonte de luz é monocromática, emitida em uma faixa espectral pequena, porém relativamente maior que a do Laser. É também uma luz não coerente, não colimada, menos concentrada em relação à radiação Laser, porém mais concentrada que a luz comum. A polarização obtida nos Lasers não é uma característica comum aos LEDs. Todavia, já se observa na literatura aparelhos LED que emitem luz polarizada (SCHUBERT et al., 2007). Quanto ao modo de emissão, atualmente já existem equipamentos LED que podem emitir tanto no modo contínuo (CW) quanto no pulsátil (PINHEIRO, BRUGNERA, ZANIN, 2010).
A aplicação do LED como recurso terapêutico vem se destacando nas últimas décadas, sendo evidenciado que sua eficiência em processos de fotobiomodulação celular é semelhante à dos Lasers de baixa potência (VINCK et al., 2003).
O mecanismo biomolecular de interação dos Lasers de baixa potência e LEDs, consiste em quatro processos: fotoquímico, fototérmico, fotomecânico e fotoelétrico. A fotobiomodulação está incluída no grupo dos efeitos fotoquímicos, nos quais a luz atua em processos moleculares e bioquímicos que ocorrem nos tecidos, como por exemplo na cicatrização de feridas e reparo ósseo (PINHEIRO, BRUGNERA JR, ZANIN, 2010). Tem sido demonstrado que, no nível celular, a luz vermelha estimularia o fotorreceptor
citocromo-C-oxidase, localizado nas mitocôndrias, levando a incrementos de ATP mitocondrial e consequente aumento do metabolismo oxidativo. A luz infravermelha, em um caminho adicional, poderia ativar diretamente os canais de Ca2+ na membrana celular pelas modificações fotofísicas, desta maneira induzindo o influxo celular de Ca2+ (KARU,1999). Dessa forma, se inicia uma cascata de reações celulares que modulam o comportamento biológico, modulando a angiogênese, macrófagos e linfócitos (KARU; PYATIBRAT; AFANASYEVA, 2005); a proliferação de fibroblastos e síntese de colágeno (VINCK et al.,2003); diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos, entre outros, acelerando assim o processo de reparação (PINHEIRO et al.,2011a).
Além do efeito biomodulador, as fototerapias laser e LED tem ação analgésica, pelo aumento da síntese de beta-endorfina, diminuição da liberação de transmissores nociceptivos, e por dificultar condução do estímulo doloroso pela atuação na estabilização do potencial elétrico da membrana (WALSH, 1997).
Além disso, a resposta celular à fotoestimulação pode não estar associada a propriedades específicas da luz Laser, como a coerência, pois essa propriedade se perde nas primeiras camadas do tecido biológico. Isto permitiu o trabalho com fontes emissoras de luz não coerentes como os diodos emissores de luz – LEDs. (SCHUBERT, 2006).
Segundo Karu (1989), não é necessária a alta monocromaticidade da luz, uma vez que ela apresente uma largura de banda (comprimento de onda) dentro da faixa de absorção da molécula receptora. Alguns estudos demonstram que a fotobiomodulação de baixa intensidade na faixa do vermelho ao infravermelho próximo (λ630 – λ1000nm), utilizando Lasers ou LEDs, pode influenciar diversos processos biológicos in vitro e in vivo, gerando efeitos positivos (WHELAN et al., 2002; KARU, 2003; AL-WATABAN, 2009).
2.7- Fototerapias Laser e LED na inflamação
Tem sido sugerido que a irradiação do Laser de baixa intensidade e o diodo emissor de luz podem modular os processos inflamatórios (LIM et al., 2007). Para isto, alguns parâmetros dos equipamentos Laser e LED, tais como comprimento de onda, duração do tratamento, densidade de energia (fluência), densidade de potência (irradiância), número de tratamentos, e o modo de irradiação podem ser importantes para se obterem bons resultados terapêuticos dessas fototerapias. Por outro lado, existe pouco consenso na literatura acerca da padronização de tais parâmetros (MORAIS et al., 2010).
Desde o inicio de 1960, diferentes comprimentos de onda e diferentes doses da radiação Laser têm sido utilizados, especialmente na redução da duração da inflamação aguda, na estimulação do reparo tecidual e alívio da dor (TUNER, HODE, 2004). Apesar de os mecanismos de sinalização celular da fototerapia Laser ainda serem pouco compreendidos, acredita-se envolver uma ação anti-inflamatória, embora a maioria dos estudos avalie apenas as propriedades analgésicas do mesmo (ALBERTINI et al., 2004). A ação anti-inflamatória é exercida mediante a aceleração da microcirculação, originando alterações na pressão hidrostática capilar, com reabsorção do edema e eliminação do acúmulo de catabólitos intermediários, tais como o ácido purínico e o láctico, assim como na redução da síntese de PGE2, TNFα, IL-1β COX-2 e ativador de plasminogênio (ALBERTINI et al.,2007; MAYAHARA et al., 2010).
Para Albertini et al. (2007) ambos os comprimentos de onda de λ 660 nm e λ684 nm do Laser foram eficazes na redução da formação do edema na pata de rato assim como na inibição da migração de células inflamatórias do músculo plantar para o tecido conjuntivo adjacente, quando uma dose de 7,5 J/cm2 era utilizada.
Pires et al (2010) demonstraram a eficiência da fototerapia Laser (780 nm, 22 mW, 7.7 J/cm2, 75 s, Φ 0.2 cm2) no tratamento de ratos com tendinite crônica induzida por colagenase aos 7 e 14 dias. Os autores observaram, através do PCR dos espécimes, que o Laser em fases agudas e crônicas diminuía a expressão de IL-6, COX-2 e TGF-β quando comparado aos grupos não irradiados. Todavia, não houve alteração na expressão de IL-1β
independente do tempo experimental. A redução da expressão de TNF-α, no entanto, ocorreu apenas na fase crônica. Os autores concluíram que a irradiação Laser pode modular a produção de mediadores anti-inflamatórios.
A terapia com LED, assim como o Laser, pode causar a diminuição da intensidade da dor e até analgesia, tendo como atuação a inibição a ação da enzima cicloxigenase (COX), interrompendo a conversão de ácido araquidônico em prostaglandina (LIM et al.,2007). Entretanto, os efeitos terapêuticos do LED são específicos e por ser uma tecnologia relativamente nova, ainda se encontram em fase de investigação a respeito dos seus reais resultados (MEYER et al., 2010).
Xavier et al (2010) investigaram o efeito do LED (880 ±10 nm, 7.5 J/cm2, 22mW, 170s Φ 0.5cm2
), através da análise RT- PCR, no processo inflamatório em tendões de ratos induzido por colagenase, e observaram que houve diminuição da quantidade de células anti-inflamatórias e de RNAm para IL-1b, IL-6 e TNF-a nas fases aguda e crônica, e de COX-2 apenas na fase aguda. Os autores sugeriam que o LED pode ser eficaz em processos inflamatórios. Morais et al. (2010) avaliaram a ação das fototerapias Laser (685 nm e 830 nm) e LED (628 nm) em artrite de joelhos de ratos induzida por zimosan e compararam aos grupos controle e controle positivo (tratado com dexametasona). O edema foi avaliado pela diferença entre peso úmido e peso seco da membrana sinovial, o aumento da permeabilidade vascular pelo extravasamento do corante azul de Evans, e a incapacitação articular pelo tempo de elevação da pata. Segundo os autores, o Laser reduziu os sinais inflamatórios de forma mais eficaz do que o LED mesmo com tempo de
irradiação (100 s), potência (20 mW) e dose de energia (2 J) semelhantes. A justificativa para esse resultado se dá pelo fato do LED possuir uma maior faixa espectral (30 nm) que o Laser, que dessa forma pode não ser bem absorvido pelo cromóferos dos tecidos biológicos.
2.8
-
Fototerapias
Laser
e
LED
na
disfunção
temporomandibular
Diversos estudos anteriores comprovaram a efetividade da fototerapia Laser na melhora da amplitude dos movimentos mandibulares assim como na redução da sintomatologia dolorosa em pacientes com DTM utilizando o Laser diodo, porém alguns resultados ainda são conflitantes e não existe um consenso na literatura sobre quais parâmetros dessa terapia devem ser utilizados (Quadro 1). Por outro lado, apenas dois estudos experimentais em ratos Wistar avaliam o efeito da fototerapia Laser em processo inflamatório na ATM (CARVALHO et al., 2011; BARRETO et al., 2013)
A fototerapia LED, segundo alguns estudos, tem se demonstrado eficaz em diversas situações: tratamento de lesões de acne (GOLD et al., 2011), de úlceras diabéticas crônicas (MINATEL et al., 2009), mucosites (LANG-BICUDO et al., 2008), processos inflamatórios (XAVIER et al., 2010, MORAIS et al., 2010), cicatrização de feridas (SOUSA et al., 2009; DE CASTRO et al., 2011) e alívio da sintomatologia dolorosa (VINCK et al., 2006). Até o presente momento, apenas um trabalho na literatura avalia clinicamente o uso do LED em casos de DTM (Quadro 01).
3
.PROPOSIÇÃO
3.1. Objetivo geral
Avaliar, descritiva e semi-quantitativamente, através da análise histológica, o efeito da luz Laser (MMoptics®, São Carlos – SP), λ 780 nm, 70 mW, 4 mm2 Φ, (CW) , 10 J/cm2) e do diodo emissor de luz - LED (MMoptics®, São Carlos – SP, λ 850±10 nm, 100 mW, 50 mm2 Φ, (CW) , 10 J/cm2) no processo inflamatório induzido por carragenina na articulação temporomandibular de rato.
3.2. Objetivos específicos
Descrever e comparar por meio de análise histológica alterações na cápsula articular e no côndilo através da caracterização do infiltrado inflamatório;
Observar alterações morfológicas e expressão de fibras colágenas no disco articular e no côndilo;
Avaliar alterações na membrana sinovial através da contagem das camadas de células;
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1- Respaldo ético da pesquisa
Este experimento em animais seguiu as normas de conduta de experimentação animal da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia (FOUFBA) e foi realizado após a aprovação pela Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEEA) desta Instituição (Anexo 01), sob o protocolo de número 04/10, de acordo com a LEI Nº 11.794, de 8 de outubro de 2008.
4.2- Delineamento
Este foi um estudo do tipo transversal, descritivo e comparativo.
4.3 – Amostra
O modelo experimental utilizado foi o rato Wistar da espécie Rattus norvegicus, classe Mammalia, ordem Roedentia, da linhagem Wistar, adultos jovens, machos, com idade aproximada de dois meses, pesando entre 200 e 250 gramas cada, provenientes do Centro de Criação de Animais da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia. Os procedimentos e a manutenção dos animais ocorreram no Laboratório de Experimentação Animal da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas apropriadas forradas com maravalha autoclavada trocada diariamente, contendo um rato em cada, em local livre de ruídos, mantidos em condições
ambientais de temperatura, umidade e luminosidade, com períodos iguais de exposição a luz e a escuridão. Os animais receberam ração comercial para roedores Labina (Purina® do Brasil, São Paulo-SP, Brasil) e água ad libitum
.
4.4 - Distribuição dos grupos
Quarenta e cinco ratos foram aleatoriamente divididos em três grupos principais e subdivididos, após a indução da inflamação, em nove grupos de com de acordo com os períodos experimentais de dois, três e sete dias. A distribuição dos grupos pode ser vista no Quadro 02.
Quadro 02 - Distribuição dos grupos de estudo (DE CASTRO,2014).
Grupo Descrição Nº de animais Período experimental (dias) Nº de sessões G1 Inflamação 5 5 5 2 3 7 - - -
G2 Inflamação+ Fototerapia Laser
5 5 5 2 3 7 1 2 4
G3 Inflamação+ Fototerapia LED
5 5 5 2 3 7 1 2 4
4.5 - Procedimentos
4.5.1- Anestesia
Os ratos foram submetidos à anestesia geral com injeção intraperitonial de cloridrato de quetamina 10 % (Cetamin®,Syntec,Cotia, SP,Brasil) e cloridrato de xilazina 2 % ( Xilazina®, Syntec, Cotia,SP,Brasil) na posologia de 0,06 ml / 100 g e 0,03 ml / 100 g respectivamente.
4.5.2- Indução da Inflamação
A técnica de indução utilizada foi a proposta por Haas et al.(1992), sendo que primeiramente foi realizado um adequado treinamento para padronização do local da injeção (ATM esquerda) através da utilização do corante Azul de Evans. Foi realizada uma tricotomia por arrancamento na região da ATM esquerda e os ratos foram submetidos a indução da inflamação através da injeção de 20µl de carragenina (C1867, Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, USA), diluída a 1% em solução salina. Uma agulha de calibre G30 foi conectada a uma microsseringa Hamilton de 50µl através de uma cânula de polietileno (PE 50), sendo aquecida e moldada para se adaptar na seringa sem vazamentos (Fig. 1). Esta foi inserida posteriormente ao processo zigomático do osso temporal e movimentada anteriormente através do espaço articular superior até contatar a parede póstero-lateral do côndilo (Fig. 2).
4.5.3 - Fototerapia
As fontes de luz, Laser e LED, apresentam valores diferentes com relação a potência e área de saída do feixe (spot). Dessa forma, foi adotado o SAEF (Spatial Average Energy Density) como parâmetro de modo a equiparar a densidade de energia de 10J/cm2 a ser fornecida para o tecido por ambas as fontes luminosas, conforme recomendam Barolet et al.(2008). O valor do SAEF é dado pela fórmula: J/cm2=P(W) x t(s) x n/A(cm2), sendo que foi considerada a área de 1 cm2 ao invés da área do spot. Além disso, ambos os aparelhos utilizados foram calibrados pelo fabricante considerando a área de 1 cm2 no cálculo da dose a ser fornecida ao tecido,por sua vez, possibilitando a comparação dos efeitos de ambas as fototerapias.
4.5.3.1- Laser
O aparelho utilizado foi o diodo de Arseneto de Gálio e Alumínio (GaAlAs), (Twinflex Evolution®, MMoptics,SãoCarlos,SP,Brasil) (Fig. 3), nos parâmetros observados no no Quadro 03. Após 24 horas da indução da inflamação, uma dose de 10 J/cm2 foi aplicada no grupo G2 aos dois, três e sete dias, com intervalo de 48 horas entre as aplicações para cada período experimental. A irradiação foi realizada por contato na ATM esquerda em um ponto, identificado por palpação de forma perpendicular (Fig. 4).
4.5.3.2 – LED
O aparelho utilizado foi o diodo de Arseneto de Galio e Aluminio (GaAlAs) (FISIOLED®,MMoptics,SãoCarlos,SP,Brasil) (Fig.5), nos parâmetros observados no Quadro 03. Após 24 horas da indução da inflamação, uma dose de 10 J/cm2 foi aplicada no grupo G3 aos dois, três e sete dias, com intervalo de 48 horas entre as aplicações para cada período experimental. A irradiação foi realizada por contato na ATM esquerda em um ponto, identificado por palpação de forma perpendicular (Fig. 6).
Quadro 03 – Parâmetros das fototerapias utilizados na metodologia (DE CASTRO, 2014).
Parâmetros LASER LED
Comprimento de onda (nm) 780 850±10 SAEF (J/cm2) 10 10 Enegia (J) 10 10 Potência output (mW) 70 100 Potência output (W) 0,07 0,100 Área iluminada (cm2) 1 1 Modo CW CW
Aplicação Contato Contato
Área de saída do feixe- Spot (cm2) 0,04 0,5 Densidade de Enegia (J/cm2) 250 20 Densidade de Potência (W/cm2) 1,75 0,2 Tempo de exposição por sessão (s) 143 100
Figura 1- Agulha G30 conectada a microseringa Hamilton através da cânula PE50 (DE CASTRO,2014).
Figura 2- Injeção de carragenina na ATM esquerda do animal (DE CASTRO,2014).
Figura 3- Aparelho de Laser de diodo (GaAlAs), λ 780nm (Twinflex Evolution®
, MMoptics, São Carlos ,SP, Brasil) (DE CASTRO,2014).
Figura 4 - Irradiação com o Laser λ 780nm na ATM esquerda do animal (DE CASTRO,2014).
Figura 5- Aparelho de LED de diodo (GaAlA), λ 850±10 nm (Fisioled®
, MMoptics, São Carlos, SP, Brasil) (DE CASTRO,2014).
Figura 6- Irradiação com o LED λ850nm±10 na ATM esquerda do animal (DE CASTRO,2014).
