Vesículas extracelulares derivadas de macrófagos alteram o potencial de invasão, proliferação e migração de linhagens celulares do carcinoma de células escamosas de língua oral

Texto

(1)0. TIAGO JOÃO DA SILVA FILHO. VESÍCULAS EXTRACELULARES DERIVADAS DE MACRÓFAGOS ALTERAM O POTENCIAL DE INVASÃO, PROLIFERAÇÃO E MIGRAÇÃO DE LINHAGENS CELULARES DO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE LÍNGUA ORAL. NATAL/RN 2018.

(2) 1. TIAGO JOÃO DA SILVA FILHO. VESÍCULAS EXTRACELULARES DERIVADAS DE MACRÓFAGOS ALTERAM O POTENCIAL DE INVASÃO, PROLIFERAÇÃO E MIGRAÇÃO DE LINHAGENS CELULARES DO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE LÍNGUA ORAL. NATAL/RN 2018.

(3) 2. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL. TIAGO JOÃO DA SILVA FILHO. VESÍCULAS EXTRACELULARES DERIVADAS DE MACRÓFAGOS ALTERAM O POTENCIAL DE INVASÃO, PROLIFERAÇÃO E MIGRAÇÃO DE LINHAGENS CELULARES DO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE LÍNGUA ORAL. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para obtenção do título de doutor em Patologia Oral.. Orientadora: Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz. NATAL/RN 2018.

(4) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Alberto Moreira Campos - -Departamento de Odontologia Silva Filho, Tiago João da. Vesículas extracelulares derivadas de macrófagos alteram o potencial de invasão, proliferação e migração de linhagens celulares do carcinoma de células escamosas de língua oral / Tiago João da Silva Filho. - 2018. 126 f.: il. Tese (Doutorado em Patologia oral) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral, Natal, 2018. Orientador: Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz.. 1. Microambiente Tumoral - Tese. 2. Carcinoma de Células Escamosas - Tese. 3. Técnicas de Cultura de Células - Tese. 4. Vesículas Extracelulares - Tese. I. Queiroz, Lélia Maria Guedes. II. Título. RN/UF/BSO. BLACK D61. Elaborado por Hadassa Daniele Silva Bulhões - CRB-313/15.

(5) 3.

(6) 4. DEDICATÓRIA.

(7) 5. Dedico este trabalho a meus pais, João da Silva e Josilene Pereira da Silva, às minhas irmãs, Mara Priscila, Maiara Kézia e Mayane Jéssica e às minhas sobrinhas, Maria Eduarda e Maria Clara..

(8) 6. AGRADECIMENTOS.

(9) 7. AGRADECIMENTOS. Aos meus pais, João da Silva e Josilene Pereira da Silva, que sempre me ensinaram a importância do conhecimento e me apoiaram nas minhas escolhas. São meus grandes mestres nos ensinamentos da vida. Por toda a compreensão, pela forma que guiaram seus conselhos sobre o eu achava que era melhor para mim, fazendo com que a decisão fosse minha, mas sempre dando um toque de sabedoria de vida. Aos meus grandes referenciais, minha eterna gratidão.. Às minhas irmãs Mara, Maiara e Mayane pelo apoio e companheirismo durante toda a vida, por tornarem minha família tão linda.. Às minhas sobrinhas, Duda e Clarinha, que desde os seus nascimentos me fizeram viver o verdadeiro sentido da palavra amor. Difícil é entender como duas crianças conseguem me ensinar tanto. Um dos seus principais ensinamentos é o sentido da palavra “literalmente”. Eu literalmente as amo, pelo bom uso do termo.. À minha irmã dada pela vida, Dacy, uma pessoa que consegue melhorar qualquer ambiente com sua espontaneidade e humor. Os laços de amizade se prenderam tão forte que já simulam laços de sangue. Uma amiga que sei que posso contar.. Às minhas amigas da graduação Alice Helena e Veruska Lima, que apesar de suas vidas terem tomado rumos diferentes após a graduação, participaram ativamente no suporte de cada etapa de realização deste trabalho. Não existe unidade de medida que dimensione o tamanho do meu carinho. A minha felicidade compatilho com vocês.. À minha orientadora Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, que se mostrou uma excelente orientadora nesses seis anos de convívio. A missão de dividir a relação.

(10) 8. orientador/orientando nos foi dada por sorteio quando eu mesmo não poderia ter feito escolha melhor. Uma orientadora sempre presente quando solicitada, que me deu a liberdade de expor e defender minhas opiniões gerando discussões saudáveis e produtivas. A mim foi dada a oportunidade de ter uma grande tutora, a quem sou muito grato.. À Profa Dra Éricka Janine Dantas da Silveira, uma sumidade quando se fala em Patologia Oral. Uma pessoa que emana conhecimento por onde passa. Sou muito agradecido pelas contribuições no exame de qualificação e em outros trabalhos realizados.. À minha companheira de pesquisa, Profa Dra Denise Hélen Imaculada Pereira de Oliveira, que também participou da banca de qualificação. Desde que entrei no Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral foi a pessoa que me deu mais suporte e que me acompanhou em todos os desafios. Foi uma grande amiga durante todos esses anos e quero têla para sempre por perto. É um grande exemplo para mim e sou muito orgulhoso de tê-la como membro da banca de defesa da tese de doutorado. Muito obrigado por todos os ensinamentos sobre a Patologia e sobre os demais aspectos da vida.. Ao Prof. Dr. Cassiano Nonaka e à Prof. Dra Pollianna Muniz, meus colegas de trabalho na Universidade Estadual da Paraíba, por fazerem parte da banca de defesa e pela contribuição na viabilização da escrita deste trabalho.. Aos demais membros da banca de defesa da tese, Profa Dra Márcia Miguel, Prof Dr Carlos Augusto e Profa Dra Roseana Freitas, agradeço pelas colaborações dadas para o enriquecimento da pesquisa.. Aos demais professores do Programa de Pós Graduação em Patologia Oral da UFRN que contribuíram de forma direta e/ou indireta na minha formação como doutor..

(11) 9. Ao Programa de Pós Graduação em Patologia Oral da UFRN por ter me aceito como aluno e ter me dado a oportunidade de absorver uma infinidade de conhecimentos, transcendendo os limites da Patologia Oral.. Ao corpo de funcionários da Patologia Oral, agradeço pelo auxílio e disponibilidade. Cada um tem um nível de importância em fazer a Patologia Oral funcionar.. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Ensino Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo auxílio financeiro que subsidiou minha estadia em Natal e em Oulu, permitindo assim, a realização desta pesquisa.. À professora Tuula Salo e toda sua equipe pelo acolhimento em seu país e em seu laboratório. Serei eternamente grato pelo espaço e pela confiança que me foram dados. Agradeço em especial ao Maurício Dourado e a Johanna Korvala, membros dessa equipe incrível, que me deram todo o suporte para que os trabalhos no laboratório na Universidade de Oulu fossem iniciados e que se tornaram grandes amigos.. Aos meus amigos brasileiros que residiam na Finlândia durante o tempo em que morei em Oulu. Mariana, Maurício, Bia, Fabiana, Hosana, Gi e Faimison, vocês foram de suma importância para tornar a estadia em Oulu mais leve, divertida e segura.. Ao Justus Luokkanen, muito obrigado pela convivência incrível e pelo carinho que me foi ofertado. Sua companhia foi de extrema importância durante minha estadia em Oulu e espero que um dia, independente de onde seja, a gente se encontre de novo e reviva bons momentos. Sou muito grato por quem você foi e continua sendo na minha vida.. Aos meus colegas de turma de doutorado Andréia do Carmo, Marcelo Nascimento, Viviane Alves, Luciana de Castro, Maria Luiza, Laudenice de Lucena e Laura.

(12) 10. Carvalho. Com vocês, meus amigos, não dividi apenas uma sala de aula, dividi quatro anos da minha vida (com alguns, dividi seis) e vocês foram responsáveis por tornar tudo isso melhor. Muito obrigado pelo suporte e companheirismo.. À Amanda Katarinny pela sua disponibilidade e companhia. Por ter acompanhado de perto grande parte da elaboração desse trabalho e por ser uma grande amiga pessoal. Sempre admirei sua dedicação e me sinto muito honrado em tê-la por perto.. Aos demais doutorandos e mestrandos do Programa, agradeço por tornarem o ambiente de trabalho mais amigável e descontraído e por todos os conhecimentos repassados.. Ao amigo José Rogério, com quem morei durante o período do doutorado. Durante esse tempo morando juntos não dividimos apenas um espaço, mas mas sim uma vida. Mesmo não sendo da Patologia Oral, suas opniões sobre o trabalho sempre foram muito pertinentes e as nossas discussões sempre muito construtivas. Muito obrigado por todo o apoio e por ter “segurado as pontas” quando tive que me ausentar.. Aos meus grandes amigos de Natal Leo Libertino, Diogo Melo, Mozany Júnior, Maria Luiza, Gustavo e Jimmy Moura por todos os encontros, conversas e por toda a motivação para continuar. Muito do que eu sou hoje, devo a vocês e é incrível esse sentimento de pertencer a um grupo que vocês me propiciam.. Aos meus amigos Malu, Clara, Karyna, Samuel, Valcácio, Vevé e Allana por todos os cafés, almoços, lanches, festas, pela companhia de todos os dias. Por serem esses grandes amigos que me motivam e me fazem feliz. Mesmo quando não estamos perto estamos sempre juntos e tê-los na minha vida foi o melhor presente dos últimos anos..

(13) 11. Aos meus amigos Gustavo, Helena, Rosinha, Kleber, João, Ju, Denise e Laerte pelo apoio durante essa fase. O esporte fez vocês entrarem na minha vida e admiração pelo que vocês são me faz querer tê-los para sempre por perto.. A todos os meus alunos, minha maior motivação nessa jornada.. Com vocês compartilho esta conquista e toda minha gratidão.. “... Nada pode o olvido. contra o sem sentido apelo do Não. As coisas tangíveis tornam-se insensíveis à palma da mão Mas as coisas findas, muito mais que lindas, essas ficarão.” (CARLOS DRUMMOND DE ANDRADE).

(14) 12. RESUMO.

(15) 13. RESUMO O câncer é composto pelas células malignas em proliferação associadas às diferentes células circunjacentes, formando o microambiente tumoral (TME), onde há uma constante troca de informações. Uma das formas de comunicação entre os diferentes tipos celulares do TME se dá por meio da liberação de vesículas extracelulares (EVs), um campo de estudo ainda pouco explorado. O presente estudo se propôs a avaliar os efeitos das EVs liberadas por macrófagos do TME, células altamente plásticas em seu fenótipo (M1 – perfil antitumoral; M2 – perfil pró-tumoral), em diferentes linhagens do carcinoma de células escamosas de língua oral (CCELO) no tocante à capacidade invasiva, proliferativa e migratória. Foi observado que as amostras de EVs extraídas dos macrófagos eram relativamente puras em EVs, porém subtipo inespecíficas. No ensaio de invasão em miomas, quando colocadas as células inflamatórias em cocultura com as células HSC-3, as células M1 inibiram a invasão e M2 aumentaram a capacidade invasiva das células malignas. Por outro lado, o tratamento com M1 EVs aumentou a capacidade invasiva das células HSC-3 e o tratamento com EVs de M2 inibiu a invasão dessas células, sendo observado um perfil semelhante nas células SCC-25 e SAS quando submetidas aos mesmos tratamentos. Na análise do marcador Ki-67 nos miomas, tanto as células HSC-3 quanto SCC-25 e SAS apresentaram o mesmo padrão de proliferação independentemente do tratamento utilizado, quando comparados com os respectivos controles negativos. Quando analisada a proliferação das células malignas no IncuCyte®, tratadas com EVs dos diferentes tipos de macrófagos em diferentes concentrações, foi identificado um aumento na capacidade proliferativa de células HSC-3 e SAS tratadas com M1 EVs em um padrão dose dependente. Um aumento da capacidade proliferativa seguindo um padrão dose dependente também ocorreu quando as células SAS foram tratadas com M2 EVs. Nos demais ensaios de proliferação no IncuCyte® também foram identificados efeitos na capacidade proliferativa, no entanto um padrão dose dependente não foi observado. No ensaio de migração no IncuCyte®, foram identificadas diferenças significativas na capacidade migratória de células SCC-25 e SAS tratadas com diferentes tipos de EVs nas diferentes concentrações, quando comparadas ao controle negativo. Os achados deste estudo sugerem que as EVs derivadas de macrófagos são fatores importantes na tumorigênese do CCELO, bem como abre discussões sobre os diferentes efeitos das células inflamatórias no TME a depender do tipo de comunicação celular executada. Palavras chave: Microambiente Tumoral; Carcinoma de Células Escamosas; Técnicas de Cultura de Células; Vesículas Extracelulares..

(16) 14. ABSTRACT.

(17) 15. ABSTRACT Cancer is an entity composed of proliferating malignant cells associated with the different types surrounding cells, forming the tumor microenvironment (TME), where there is a constant exchange of information. One of the ways of communicating between different types of TME cells is through the release of extracellular vesicles (EVs), a field of study that remains poorly understood. The aim of the present study was to evaluate the effects of EVs released from TME macrophages, which are cells highly plastic in their phenotype (M1 showing an anti-tumor profile and M2 exhibiting a pro-tumor profile) in different cell lines of tongue squamous cells carcinoma (TSCC) regarding to invasive, proliferative and migratory capacity. It was observed that EVs samples obtained from macrophages were relatively pure in EVs, although they were non-specific subtypes. In the myoma invasion assay, it was observed that when inflammatory cells were co-cultured with HSC-3 cells, M1 cells inhibited invasion and M2 increased the invasive ability of the malignant cells. On the other hand, treatment with M1 EVs increased the invasive capacity of HSC-3 cells, and treatment with M2 EVs inhibited the invasion of these malignant cells, and a similar profile was observed in SCC-25 and SAS cells when they were submitted to the same treatments. In the analysis of the Ki-67 marker in myomas, HSC-3, SCC-25 and SAS cells showed the same proliferation pattern regardless the type of the treatment used when compared to the respective negative controls. When it was analyzed the proliferation of malignant cells in IncuCyte® treated with EVs derived from different types of macrophages at different concentrations, an increase in the proliferative ability of HSC-3 and SAS cells treated with M1 EVs was observed in a dosedependent pattern. An increase in proliferative ability in dose-dependent profile was also observed when SAS cells were treated with M2 EVs. In the other proliferation assays performed in IncuCyte®, effects on proliferative capacity were also highlighted, however a dose-dependent pattern was not observed. In the IncuCyte® migration assay, significant differences were observed in the migration capacity of SCC-25 and SAS cells treated with different types of EVs at different concentrations when compared to the negative control. The findings of this study suggest that macrophages-derived EVs are pivotal factors in TSCC tumorigenesis, as well as permits discussions on the different effects of inflammatory cells on TME depending on the type of cell communication performed. Key words: Tumor Microenvironment; Carcinoma, Squamous Cell; Cell Culture Techniques; Extracellular Vesicles..

(18) 16. LISTA DE FIGURAS.

(19) 17. LISTA DE FIGURAS. Página Figura 1 -. Esquema de distribuição dos diferentes grupos de tratamento nas placas de 96 poços utilizadas nos ensaios de proliferação e migração no IncuCyte®..................................................................... Figura 2 -. 54. Poço F6 do ensaio de proliferação com células SCC-25 – 5µg/mL M2 Mf fotografado a cada 18 horas mostrando os níveis de proliferação celular através do tempo................................................ Figura 3 -. 55. Poço B6 do ensaio de migração com células SCC-25 – 5µg/mL M1 Mf fotografado a cada três horas mostrando os níveis de migração celular através do tempo..................................................... Figura 4 -. Imunomarcação para CD63 demonstrando vesículas isoladas de células M1 Mfs contendo exossomos e outras EVs........................... Figura 5 -. 59. Representação gráfica da relação de tamanho e concentração de EVs em amostras derivadas de M1 Mf, M2 Mf e THP-1.................. Figura 8 -. 59. Imunomarcação para CD63 demonstrando vesículas isoladas de células THP-1 contendo exossomos e outras EVs............................. Figura 7 -. 58. Imunomarcação para CD63 demonstrando vesículas isoladas de células M2 Mfs contendo exossomos e outras EVs........................... Figura 6 -. 56. 60. Comparação dos padrões de invasão das células HSC-3 tratadas com EVs oriundas de THP-1, M1 e M2 Mfs e com os respectivos sobrenadantes versus tratadas com o controle negativo (pancitoqueratina AE1/AE3; 100x)........................................................... Figura 9 -. Representação gráfica da MPI (à esquerda) e da AI (à direita) de células HSC-3 frente aos diferentes tipos de tratamento.................... Figura 10 -. 61. 62. Comparação dos padrões de invasão das células HSC-3 tratadas com EVs oriundas de THP-1, M1 e M2 Mfs versus quando colocadas em cocultura com as células inflamatórias (pancitoqueratina AE1/AE3; 100x)........................................................... Figura 11 -. 63. Comparação da MPI (esquerda) e AI (direita) de células HSC-3 frente aos diferentes tipos de tratamento realizados com EVs e em cocultura (*p < 0,05; ** p < 0,001).................................................... Figura 12 -. Comparação dos padrões de invasão das células SCC-25 tratadas. 63.

(20) 18. com EVs oriundas de THP-1, M1 e M2 Mfs e com os respectivos sobrenadantes versus tratadas com o controle negativo (pancitoqueratina AE1/AE3; 100x).......................................................... Figura 13 -. 64. Comparação da MPI (esquerda) e AI (direita) de células SCC-25 frente aos diferentes tipos de tratamento realizados com EVs e sobrenadante, em relação ao controle negativo (*p < 0,05; **p < 0,001).................................................................................................. Figura 14 -. 64. Comparação dos padrões de invasão das células SAS tratadas com EVs oriundas de THP-1, M1 e M2 Mfs e com os respectivos sobrenadantes versus tratadas com o controle negativo (pancitoqueratina AE1/AE3; 100x)........................................................... Figura 15 -. 65. Comparação da MPI (esquerda) e AI (direita) de células SAS frente aos diferentes tipos de tratamento realizados com EVs e SUP, em relação ao controle negativo (*p < 0,05; **p < 0,001)....... Figura 16 -. 65. Fotomicrografias demonstrando a imunoexpressão de Ki-67 em cortes de miomas contendo células HSC-3 submetidas aos diferentes tipos de tratamento com EVs e quando colocadas em cocultura com células THP-1 e M1 e M2 Mfs (200x)....................... Figura 17 -. 66. Fotomicrografias demonstrando a imunoexpressão de Ki-67 em cortes de miomas contendo células SCC-25 submetidas a diferentes tipos de tratamento (200x)................................................. Figura 18 -. 67. Fotomicrografias demonstrando a imunoexpressão de Ki-67 em cortes de miomas contendo células SAS submetidas a diferentes tipos de tratamento (200x).................................................................. Figura 19 -. 67. (A) Representação gráfica porcentagem de confluência de células HSC-3 tratadas com vesículas oriundas de M1 Mfs (azul claro), M2 Mfs (azul escuro) e THP-1 (rósea) para cada uma das diferentes concentrações utilizadas e SUPs ao longo do tempo. (B) Comparação dos grupos realizada nos pontos de tempo de 12, 24 e 36h (*p < 0,05; ** p < 0,001)............................................................. Figura 20 -. (A) Representação gráfica porcentagem de confluência de células SCC-25 tratadas com vesículas oriundas de M1 Mfs (azul claro), M2 Mfs (azul escuro) e THP-1 (rósea) para cada uma das diferentes concentrações utilizadas e SUPs ao longo do tempo. (B). 73.

(21) 19. Comparação dos grupos realizada nos pontos de tempo de 12, 24 e 36h (*p < 0,05; ** p < 0,001)............................................................ Figura 21 -. 79. (A) Representação gráfica porcentagem de confluência de células SAS tratadas com vesículas oriundas de M1 Mfs (azul claro), M2 Mfs (azul escuro) e THP-1 (rósea) para cada uma das diferentes concentrações utilizadas e SUPs ao longo do tempo. (B) Comparação dos grupos realizada nos pontos de tempo de 12, 24 e 36h (*p < 0,05; ** p < 0,001)............................................................. Figura 22 -. 85. (A) Representação gráfica da comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células HSC-3 tratadas com vesículas oriundas de M1 Mfs (azul claro), M2 Mfs (azul escuro) e THP-1 (rósea) para cada uma das diferentes concentrações utilizadas e SUPs ao longo do tempo. (B) Comparação dos grupos realizada em três diferentes pontos de tempo (*p < 0,05; **p < 0,001)............ Figura 23 -. 91. (A) Representação gráfica da comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células SCC-25 tratadas com vesículas oriundas de M1 Mfs (azul claro), M2 Mfs (azul escuro) e THP-1 (rósea) para cada uma das diferentes concentrações utilizadas e SUPs ao longo do tempo. (B) Comparação dos grupos realizada em três diferentes pontos de tempo (*p < 0,05; **p < 0,001)............ Figura 24 -. 97. (A) Representação gráfica da comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células SAS tratadas com vesículas oriundas de M1 Mfs (azul claro), M2 Mfs (azul escuro) e THP-1 (rósea) para cada uma das diferentes concentrações utilizadas e SUPs ao longo do tempo. (B) Comparação dos grupos realizada em três diferentes pontos de tempo (*p < 0,05; **p < 0,001)............ 103.

(22) 20. LISTA DE GRÁFICOS.

(23) 21. LISTA DE GRÁFICOS Página Gráfico 1 -. Comparação da porcentagem de confluência de células HSC-3 tratadas com M1EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), M1SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo..................................... Gráfico 2 -. Análise. comparativa. entre. os. efeitos. das. 68. diferentes. concentrações de M1 EVs em relação ao controle negativo e SUP no potencial proliferativo de células HSC-3 nos intervalos de tempo de 12, 24 e 36h (*p < 0,05, **p < 0,001)...................... Gráfico 3 -. 69. Comparação da porcentagem de confluência de células HSC-3 tratadas com M2 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), M2 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo..................................... Gráfico 4 -. Análise. comparativa. entre. os. efeitos. das. 70. diferentes. concentrações de M2 EVs em relação ao controle negativo e SUP no potencial proliferativo de células HSC-3 nos intervalos de tempo de 12, 24 e 36h (*p < 0,05, **p < 0,001)...................... Gráfico 5 -. 70. Comparação da porcentagem de confluência de células HSC-3 tratadas com THP-1 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), THP-1 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo.................................. Gráfico 6 -. Análise. comparativa. entre. os. efeitos. das. 71. diferentes. concentrações de THP-1 EVs em relação ao controle negativo e SUP no potencial proliferativo de células HSC-3 nos intervalos de tempo de 12, 24 e 36h (*p < 0,05, **p < 0,001)...................... Gráfico 7 -. 72. Comparação da porcentagem de confluência de células SCC-25 tratadas com M1 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), M1 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo..................................... Gráfico 8 -. Análise. comparativa. entre. os. efeitos. das. diferentes. concentrações de M1 EVs em relação ao controle negativo e SUP no potencial proliferativo de células SCC-25 nos. 74.

(24) 22. intervalos de tempo de 12, 24 e 36h (*p < 0,05, **p < 0,001)..... Gráfico 9 -. 75. Comparação da porcentagem de confluência de células SCC-25 tratadas com M2 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), M2 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo..................................... Gráfico 10 -. Análise. comparativa. entre. os. efeitos. das. 76. diferentes. concentrações de M2 EVs em relação ao controle negativo e SUP no potencial proliferativo de células SCC-25 nos intervalos de tempo de 12, 24 e 36h (*p < 0,05, **p < 0,001)..... Gráfico 11 -. 76. Comparação da porcentagem de confluência de células SCC-25 tratadas com THP-1 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), THP-1 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo.................................. Gráfico 12 -. Análise. comparativa. entre. os. efeitos. das. 77. diferentes. concentrações de THP-1 EVs em relação ao controle negativo e SUP no potencial proliferativo de células SCC-25 nos intervalos de tempo de 12, 24 e 36h (*p < 0,05, **p < 0,001)..... Gráfico 13 -. 78. Comparação da porcentagem de confluência de células SAS tratadas com M1 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), M1 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo..................................... Gráfico 14 -. Análise. comparativa. entre. os. efeitos. das. 80. diferentes. concentrações de M1 EVs em relação ao controle negativo e SUP no potencial proliferativo de células SAS nos intervalos de tempo de 12, 24 e 48h (*p < 0,05, **p < 0,001)...................... Gráfico 15 -. 81. Comparação da porcentagem de confluência de células SAS tratadas com M2 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), M2 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo..................................... Gráfico 16 -. Análise. comparativa. entre. os. efeitos. das. 82. diferentes. concentrações de M2 EVs em relação ao controle negativo e SUP no potencial proliferativo de células SAS nos intervalos de tempo de 12, 24 e 48h (*p < 0,05, **p < 0,001).......................... Gráfico 17 -. Comparação da porcentagem de confluência de células SAS. 82.

(25) 23. tratadas com THP-1 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), THP-1 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo................................. Gráfico 18 -. Análise. comparativa. entre. os. efeitos. das. 83. diferentes. concentrações de THP-1 EVs em relação ao controle negativo e SUP no potencial proliferativo de células SAS nos intervalos de tempo de 12, 24 e 48h (*p < 0,05, **p < 0,001)...................... Gráfico 19 -. 84. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células HSC-3 tratadas com M1 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), M1 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo............. Gráfico 20 -. 86. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células HSC-3 tratadas com M1 EVs nas concentrações de 1, 5, 10 e 20µg/mL e SUP, em três diferentes pontos de tempo (*p < 0,05; **p < 0,001)........................................................................ Gráfico 21 -. 87. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células HSC-3 tratadas com M2 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), M2 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo............. Gráfico 22 -. 88. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células HSC-3 tratadas com M2 EVs nas concentrações de 1, 5, 10 e 20µg/mL e SUP, em três diferentes pontos de tempo (*p < 0,05; **p < 0,001).................................................................. Gráfico 23 -. 88. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células HSC-3 tratadas com THP-1 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), THP1 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo.......... Gráfico 24 -. 89. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células HSC-3 tratadas com THP-1Vs nas concentrações de 1, 5, 10 e 20µg/mL e SUP, em três diferentes pontos de tempo (*p < 0,05; **p < 0,001)...................................................................... Gráfico 25 -. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células SCC-25 tratadas com M1 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), M1. 90.

(26) 24. SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo............ Gráfico 26 -. 92. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células SCC-25 tratadas com M1 EVs nas concentrações de 1, 5, 10 e 20µg/mL e SUP, em três diferentes pontos de tempo (*p < 0,05; **p < 0,001)...................................................................... Gráfico 27 -. 93. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células SCC-25 tratadas com M2 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), M2 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo............. Gráfico 28 -. 94. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células SCC-25 tratadas com M2 EVs nas concentrações de 1, 5, 10 e 20µg/mL e SUP, em três diferentes pontos de tempo (*p < 0,05; **p < 0,001)...................................................................... Gráfico 29 -. 94. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células SCC-25 tratadas com THP-1 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), THP-1 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo.. Gráfico 30 -. 95. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células SCC-25 tratadas com THP-1 EVs nas concentrações de 1, 5, 10 e 20µg/mL e SUP, em três diferentes pontos de tempo (*p < 0,05; **p < 0,001)................................................................ Gráfico 31 -. 96. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células SAS tratadas com M1 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), M1 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo...................... Gráfico 32 -. 98. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células SAS tratadas com M1 EVs nas concentrações de 1, 5, 10 e 20µg/mL e SUP, em três diferentes pontos de tempo (*p < 0,05; **p < 0,001).......................................................................... Gráfico 33 -. 99. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células SAS tratadas com M2 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), M2 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo...................... Gráfico 34 -. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo. 100.

(27) 25. células SAS tratadas com M2 EVs nas concentrações de 1, 5, 10 e 20µg/mL e SUP, em três diferentes pontos de tempo (*p < 0,05; **p < 0,001)......................................................................... Gráfico 35 -. 100. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células SAS tratadas com THP-1 EVs nas concentrações de 1 (azul claro), 5 (azul escuro) 10 (rósea) e 20µg/mL (roxo), THP1 SUP (cinza) e Opti-Mem (vermelho) ao longo do tempo.......... Gráfico 36 -. 101. Comparação da densidade relativa da ferida em poços contendo células SAS tratadas com THP-1 EVs nas concentrações de 1, 5, 10 e 20µg/mL e SUP, em três diferentes pontos de tempo (*p < 0,05; **p < 0,001)...................................................................... 102.

(28) 26. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.

(29) 27. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS µL. Microlitro;. µm. Micrômetro;. AI. Área de invasão;. CAFs. Do inglês, cancer-associated fibroblasts, traduzido como fibroblastos associados ao câncer;. CCELO CCEO CEP CONEP. Carcinoma de células escamosas de língua oral; Carcinoma de células escamosas oral; Comitê de Ética e Pesquisa; Comissão Nacional de Ética em Pesquisa;. DMEM/F12 Do inglês, Dulbecco’s modified Eagle’s Medium / Ham’s nutrient mixture F-12; DMSO. Do inglês, Dimethyl sulfoxide, traduzido como dimetilsufórido;. EV. Do inglês, extracellular vesicle, traduzido como vesícula extracelular;. FBS. Do ingês, fetal bovine serum, traduzido como soro fetal bovino;. g. Força centrífuga relativa ou força gravitacional (100x g significa que a força centrífuga que está sendo aplicada é 100 vezes maior que a força gravitacional da Terra);. h HSC-3 IL. Hora; Linhagem de células do carcinoma de células escamosas de língua; Interleucina;. ImmunoEM Do inglês, immuno-electron microscopy, traduzido como imunomicroscopia eletrônica; M1 Mf. Macrófago do tipo M1;. M2 Mf. Macrófago do tipo M2;. Mf. Macrófago;. mg. Miligrama;. min. Minutos;. mL. Mililitro;. mM. Milimolar;. MPI. Máxima profundidade de invasão;. MVB. Do inglês multivesicular body, traduzido como corpo multivesicular;.

(30) 28. ng. Nanograma;. NK. Natural Killer;. nm. Nanômetro;. NTA. Do inglês, Nanoparticle Tracking Analysis, traduzido como Análise de Rastreamento de Nanopartículas;. ºC PBS. Graus Celsius; Do inglês Phosphate-Buffered Saline, tratuzido como solução fosfato salina;. SAS. Linhagem de células do carcinoma de células escamosas de língua;. SCC-25. Linhagem de células do carcinoma de células escamosas de língua;. SUP. Sobrenadante da última ultracentrifugação realizada (120.000x g por 90min a 4ºC);. TAM. Do inglês, tumor associated macrophages, traduzido como macrófagos associados ao tumor;. Th1. Do inglês, type 1 T helper cells, traduzido como células Th1;. Th2. Do inglês, type 2 T helper cells, traduzido como células Th2;. THP-1 TME. Linhagem celular de monócitos indiferenciados Do inglês, tumor microenvironment, traduzido como microambiente tumoral;. UFRN. Universidade Federal do Rio Grande do Norte..

(31) 29. SUMÁRIO.

(32) 30. SUMÁRIO Página 1. INTRODUÇÃO..................................................................................... 33. 2. REVISÃO DA LITERATURA............................................................ 36. 2.1. CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE LÍNGUA ORAL – CONSIDERAÇÕES GERAIS............................................................. 36. 2.2. MACRÓFAGOS ASSOCIADOS A TUMORES................................... 39. 2.3. VESÍCULAS EXTRACELULARES..................................................... 41. 3. OBJETIVOS.......................................................................................... 46. 3.1. OBJETIVOS GERAIS............................................................................ 46. 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................. 46. 4. METODOLOGIA................................................................................. 48. 4.1. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS................................................................. 48. 4.2. CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO..................................................... 48. 4.3. CARACTERIZAÇÃO DAS LINHAGENS CELULARES................... 48. 4.4. CULTURA DE CÉLULAS.................................................................... 49. 4.5. ISOLAMENTO DAS VESÍCULAS EXTRACELULARES................. 50. 4.6. CARACTERIZAÇÃO DAS VESÍCULAS EXTRACELULARES....... 51. 4.7. ENSAIOS DE INVASÃO 3D EM MIOMAS........................................ 52. 4.8. ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO E MIGRAÇÃO NO IncuCyte®....... 53. 4.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA..................................................................... 56. 5. RESULTADOS...................................................................................... 58. 5.1. AS SOLUÇÕES OBTIDAS APÓS ULTRACENTRIFUGAÇÃO ERAM RELATIVAMENTE PURAS EM EVs E SUBTIPO INESPECÍFICAS.................................................................................... 5.2. 58. M1 E M2 MFs APRESENTAM AÇÃO DUAL NA INVASÃO DE CÉLULAS DO CCELO DE ACORDO COM O TIPO DE COMUNICAÇÃO CELULAR............................................................... 5.3. CÉLULAS HSC-3, SCC-25 E SAS APRESENTARAM PERFIL DE IMUNOMARCAÇÃO CONTROLE. PARA. NEGATIVO. KI-67. SEMELHANTE. AO. INDEPENDENTEMENTE. DO. TRATAMENTO SUBMETIDO............................................................ 5.4. 61. AS. EVs. APRESENTAM. EFEITOS. NA. CAPACIDADE. 66.

(33) 31. PROLIFERATIVA DE LINHAGENS DE CCELO QUANDO ANALISADAS NO INCUCYTE®........................................................ 67. 5.4.1. Células HSC-3....................................................................................... 68. 5.4.2. Células SCC-25...................................................................................... 74. 5.4.3. Células SAS............................................................................................ 80. 5.5. ANÁLISE DA MIGRAÇÃO CELULAR NO INCUCYTE®................ 86. 5.5.1. Células HSC-3....................................................................................... 86. 5.5.2. Células SCC-25...................................................................................... 92. 5.5.3. Células SAS............................................................................................ 98. 6. DISCUSSÃO.......................................................................................... 105. 7. CONCLUSÕES..................................................................................... 115. REFERÊNCIAS.................................................................................... 117. ANEXO.................................................................................................. 125.

(34) 32. INTRODUÇÃO.

(35) 33. 1 INTRODUÇÃO. A cada ano, 11 entre 100 mil adultos são diagnosticados com câncer na cavidade oral (JOSEPH et al., 2015) e, dentre eles, mais de 90% dos casos correspondem ao carcinoma de células escamosas oral (CCEO) (DAVIDSON; ROOT; TROCK, 2001; RETHMAN et al., 2010; EDWARDS et al., 2014). O que acomete a língua, o carcinoma de células escamosas de língua oral (CCELO), é o tipo mais comum e, frequentemente, leva à invasão local e metástase nos linfonodos regionais e à distância (DAYAN et al., 2012; LIN et al., 2014; LE CAMPION et al., 2017). Apesar dos avanços na terapêutica do CCEO, a taxa de sobrevida em cinco anos continua baixa (DAYAN et al., 2012; ZHOU et al., 2014). Tradicionalmente, o tratamento tem sido focado nas células tumorais. No entanto, estudos tem demonstrado que o câncer, uma entidade de vasta complexidade, também envolve variados tipos de células mesenquimais e inflamatórias, além da matriz extracelular, formando, coletivamente, o denominado microambiente tumoral (TME), que desempenha um importante papel no comportamento biológico dos tumores (JOYCE; POLLARD, 2009; ZHOU et al., 2014; MATSUOKA et al., 2015). Vered, Dayan e Salo (2011) demonstraram que os componentes do TME possuem um papel crucial na biologia molecular do CCELO, em relação à invasão e propagação dos tumores, com impacto direto na sobrevida dos pacientes. Fibroblastos e células inflamatórias são os principais componentes celulares do TME e se relacionam com as células malignas via adesão célula-célula ou pela liberação de variados tipos de fatores solúveis (MATSUOKA et al., 2015; PIRILÄ et al., 2015). O infiltrado inflamatório do TME constitui uma fonte essencial de citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, fatores angiogênicos e enzimas (DAYAN et al., 2012). Dentre os componentes do infiltrado inflamatório tumoral, existem os macrófagos (Mfs), denominados macrófagos associados ao tumor (TAMs), células que alteram suas propriedades a partir da sua interação com o tumor. São altamente plásticas no que diz respeito ao seu fenótipo, podendo estar presentes no microambiente em duas formas diferentes, os macrófagos classicamente ativados do tipo M1 (M1 Mfs) e os macrófagos alternativamente ativados do tipo M2 (M2 Mfs), de acordo com seus receptores de superfície, produção de citocinas e reatividade (MATSUOKA et al., 2015; PIRILÄ et al., 2015). É sabido que a resposta imune ao câncer pode ter um efeito pró-tumoral ou antitumoral a depender do tipo de mecanismo ativado. Seus componentes podem ser grosseiramente divididos em células imunes antitumorigênicas representadas por células Th1 (type 1 T helper.

(36) 34. cells), linfócitos T CD8+, células natural killer (NK) e M1 Mfs, e células imunes prótumorigênicas como as células Th2, M2 Mfs e células T regulatórias (AL-SAMADI et al., 2017). Uma forma de modulação do TME dá-se através da sinalização parácrina e/ou sistêmica entre as células. Esse tipo de comunicação intercelular pode ser feito pela liberação de fatores solúveis no meio extracelular através da troca de fragmentos celulares, como as vesículas extracelulares (EVs), ou pelo contato direto entre as células através de junções celulares e moléculas de adesão. Tais vesículas são pequenos fragmentos circulares (de 40nm a 5µm) com características das células de origem, que podem ser categorizadas em exossomos, microvesículas ou ectossomos, corpos apoptóticos ou vesículas de Golgi, baseadas em seu tamanho, origem, morfologia e forma de liberação (TEIXEIRA et al., 2014). Ambos os tipos M1 e M2 Mfs liberam EVs no meio extracelular, no entanto, apesar de haver diferenças em relação à origem dos diferentes tipos de EVs, os tamanhos das vesículas podem se sobrepor e ainda não há disponível marcadores subtipo específicos, sendo difícil, senão impossível, purificar e distinguir os tipos de vesículas presentes em uma amostra (PRINCIPE et al., 2013; VADER et al., 2016). Tem-se sugerido que as células neoplásicas comunicam-se com as outras células componentes do TME, como os TAMs, através da liberação de EVs (AL-SAMADI et al., 2017), no entanto, o conhecimento acerca das EVs liberadas pelos TAMs no TME ainda é escasso. Dessa maneira, este estudo pretendeu avaliar através de ensaios funcionais de proliferação, migração e invasão, a ação das EVs oriundas de Mfs no comportamento biológico de três diferentes linhagens de células de CCELO, in vitro..

(37) 35. REVISÃO DA LITERATURA.

(38) 36. 2 REVISÃO DA LITERATURA. 2.1 CARCINOMA. DE. CÉLULAS. ESCAMOSAS. DE. LÍNGUA. ORAL. –. CONSIDERAÇÕES GERAIS. O câncer é um evidente problema de ordem pública mundial. A Organização Mundial de Saúde estimou que, no ano de 2030, pode-se esperar 27 milhões de casos incidentes de câncer, além de 75 milhões de pessoas vivas com essa doença. No Brasil, a estimativa para o ano de 2014, válida também para o ano de 2015, foi de 576 mil novos casos, incluindo os casos de pele não melanoma (INCA, 2014). A estimativa para a incidência no biênio 20162017, no entanto, aumentou para mais de 596 mil casos por ano, incluindo os casos não melanoma (INCA, 2016). O câncer oral é um termo genérico que inclui tumores de diferentes origens (WARNAKULASURIYA, 2009). É uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo (CASAL et al., 2010), cuja incidência pode variar de acordo com a localização geográfica (BATISTA et al., 2010). Na América do Sul, a maior incidência é no Brasil, apresentando-se numa proporção de 8,3 a cada 100.000 habitantes. Trata-se do sexto tumor mais comum, representando 2,6% de todas as malignidades, bem como é o nono mais letal (MAROCCHIO et al., 2010). O tipo mais comum de câncer oral é o carcinoma de células escamosas, também chamado de carcinoma epidermoide, carcinoma escamocelular ou carcinoma espinocelular oral e corresponde a aproximadamente 90% dos casos de câncer que acomete a cavidade oral (BRENER et al. 2007; OGBUREKE et al., 2007; WOLFF; FOLLMAN; NAST, 2012). Tem sido relatado que o CCEO é o quinto tipo de câncer mais comum no sexo masculino e o nono em relação ao sexo feminino (BRENER et al., 2007; INCA, 2016). Dados epidemiológicos mostram que os pacientes acima de 40 anos são os mais acometidos pelo CCEO, apresentando maior incidência com o decorrer da idade (BATISTA et al., 2010; INCA, 2014). A incidência dessa neoplasia, em adultos jovens e mulheres, vem crescendo, segundo levantamentos feitos nas últimas décadas (CASAL et al., 2010). O CCEO caracteriza-se por apresentar altas taxas de invasão local e metástase, possuindo, portanto, grande agressividade. Muitos pacientes morrem em decorrência da disseminação local ou regional da doença (OGBUREKE et al., 2007). O principal sítio de acometimento é a língua, seguido do assoalho bucal (SANTOS; BATISTA; CANGUSSU, 2010; PATEL et al., 2011; FRONIE et al., 2013; SANTOS et al., 2016)..

(39) 37. As localizações geográficas influenciam nos sítios anatômicos de acometimento, visto que isso reflete os diferentes fatores a que uma determinada população está exposta (ANTUNES et al., 2007; SANTOS et al., 2016). A língua tem sido o principal sítio de acometimento na Inglaterra, Estados Unidos e Coréia, provavelmente pelo consumo associado de tabaco e álcool (SASAKI et al., 2005; CHOI et al., 2006). Na Ásia, a mucosa jugal é a localização mais comum devido ao hábito de mascar o sachê de betel (FRITZ et al., 2000; IAMAROON et al., 2004). Em países tropicais, a população é bastante exposta à radiação solar, levando à alta incidência de carcinoma de células escamosas de lábio inferior (COSTA et al., 2002; SANTOS et al., 2016). Clinicamente, a apresentação do CCEO é variada, podendo aparecer como uma lesão exofítica ou endofítica, que pode ser leucoplásica, eritroplásica ou eritroleucoplásica em estágios mais iniciais (SILVA; AMARAL; BULHOSA, 2010). Porém, há evidências clínicas que auxiliam no diagnóstico do CCEO, tais como: lesões de início indolor que não cicatrizam espontaneamente em quinze dias, além de lesões ulceradas de bordas endurecidas e evertidas e sem halo eritematoso (GAETTI-JARDIM et al., 2010). A cavidade oral, por ser de fácil acesso para exame, permite visualização direta de alterações suspeitas, principalmente nos estágios iniciais, o que facilita o diagnóstico prévio de qualquer entidade patológica. Porém, ainda assim, o diagnóstico do CCEO muitas vezes é realizado tardiamente. Isso ocorre não só porque o paciente demora a procurar tratamento especializado, visto que a lesão inicialmente é assintomática, mas também, devido à apresentação clínica variada, o que exige preparo do cirurgião-dentista para a realização do diagnóstico (SANTOS; BATISTA; CANGUSSU, 2010). Assim sendo, muitos pacientes morrem por disseminação local ou regional da doença (OGBUREKE et al., 2007). Diante disso, o tempo decorrido entre a percepção dos sintomas, o diagnóstico e o tratamento correto interfere não só no prognóstico, mas também na qualidade de sobrevida dos pacientes (SCOTT; MCGURK; GRUNFELD, 2008). Em relação à etiologia do CCEO, sabe-se que ela é complexa e multifatorial, visto que pode ser induzida por uma combinação de vários fatores, dentre eles: hábitos pessoais, atividade profissional, local de habitação do indivíduo, problemas nutricionais, radiação, imunossupressão, presença de oncogenes e susceptibilidade genética. Entretanto, o consumo de fumo e álcool são os principais fatores de risco para essa doença (MANNARINI et al., 2009; PETTI, 2009; JOHNSON; JAYASEKARA; AMARASINGHE, 2011; WOLFF; FOLLMAN; NAST, 2012)..

(40) 38. Histopatologicamente, o CCEO caracteriza-se por uma desordem proliferativa de células da camada espinhosa do epitélio, que expressa graus variados de similaridade com suas células de origem. As células exibem citoplasma bastante eosinofílico, núcleo vesicular de tamanho aumentado com hipercromatismo, pontes intercelulares proeminentes, aumento do número de figuras de mitoses típicas ou atípicas, pleomorfismo celular e nuclear e pérolas de ceratina. Essas células invadem o tecido conjuntivo de forma isolada ou em grupos, formando cordões, ninhos e lençóis (BATISTA et al., 2010; NEVILLE et al., 2016). A localização anatômica do CCEO é fator de influência no prognóstico, considerandose que os tumores apresentam comportamento clínico diferente conforme sua localização (COSTA et al., 2002; LE CAMPION et al., 2017). Dentre os intraorais, os CCELOs tendem a ser mais agressivos e infiltrativos, possuindo, portanto, pior comportamento biológico e taxa de sobrevivência, em cinco anos, de somente 37% em tumores no estágio IV (ACS, 2014). O potencial para invasão e metástase das células tumorais está relacionado a várias etapas, como a degradação da membrana basal e matriz extracelular, alterações na adesividade celular, movimento celular e angiogênese (CURRAN, MURRAY, 2000). As recentes descobertas têm aumentado o conhecimento acerca dos processos biológicos que levam ao desenvolvimento do câncer. É sabido que a maioria das células cancerosas é derivada da expansão clonal de uma única célula-tronco ou de algumas células tumorais que readquirem sua capacidade de auto renovação (LOBO et al., 2007). As células normais proliferam apenas quando necessário, reguladas por um delicado equilíbrio entre a promoção do crescimento por fatores de crescimento e são inibidas pela influência de sinais bioquímicos oriundos das células vizinhas e de fatores circulantes. As células cancerosas ultrapassam esses programas de controle e seguem seu próprio programa interno para o sincronismo de reprodução (MOLINOLO et al., 2009). A carcinogênese dos CCEOs é um processo de múltiplas etapas, onde ocorrem alterações genéticas que levam à desregulação do metabolismo celular (LOBO et al., 2007). As células malignas podem escapar à senescência celular e apoptose, tornando-se imortais, aumentando seu suprimento de nutrientes e oxigênio, promovendo angiogênese e adquirindo a capacidade de migrar do seu local de origem para invadir tecidos próximos, ou provocar metástases à distância (MOLINOLO et al., 2009). No ano 2000, Hanahan e Weinberg publicaram um importante estudo onde tentaram categorizar as principais características do câncer dentro de seis aspectos: autossuficiência em sinais de crescimento, insensibilidade aos sinais anti crescimento, evasão da apoptose, potencial de replicação ilimitado, angiogênese continuada e capacidade de invadir e de.

(41) 39. desenvolver metástazes. Onze anos depois, os mesmos autores (HANAHAN; WEINBERG, 2011) revisaram tais características e adicionaram mais duas, reprogramação do metabolismo energético e evasão da resposta imune, além de duas peculiaridades: instabilidade e mutação do genoma e inflamação pró-tumoral. Nesse mesmo estudo também foi defendido que o comportamento biológco dos tumores só pode ser entendido pelo estudo individual das células específicas que os compõem, bem como do “microambiente tumoral” que elas controem durante os vários estágios da tumorigênese (HANAHAN; WEINBERG, 2011; SONNENSCHEIN; SOTO, 2013; YE et al., 2016; FOUAD; AANEI, 2017).. 2.2 MACRÓFAGOS ASSOCIADOS A TUMORES. Nos últimos anos, tem sido considerado que para o tratamento efetivo do câncer, o tumor deve ser tratado como uma entidade que engloba tanto as células malignas quanto o tecido circunjacente, os quais, juntos, formam o TME. Em determinados tipos de câncer, incluindo os carcinomas de células escamosas, o TME pode ser considerado um fator dominante na malignidade das células cancerosas (MARSH et al., 2011). O TME apresenta um conteúdo variado de células, tais como fibroblastos associados ao câncer (CAFs), células musculares lisas, células endoteliais, neutrófilos, Mfs e linfócitos (BALKWILL; MANTOVANI, 2001). Dentre essas, especialmente CAFs e Mfs já tem sua relação na estimulação tumoral do CCEO reconhecida (VERED; DAYAN; SALO, 2011; SALO et al., 2014). O infiltrado inflamatório do TME é uma fonte essencial de citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, fatores angiogênicos e enzimas produzidas pelas células inflamatórias em associação ao crescimento e progressão tumoral. Esse tipo de infiltrado inflamatório representa uma “inflamação ruim”, em contraste ao infiltrado inflamatório que representa uma força antitumorigênica, uma “inflamação boa” (DAYAN et al., 2012). A existência simultânea de ambas, células imunes pró-tumorais e antitumorais, pode ser explicada pelo papel diverso do sitema imune: por um lado, o sistema imune detecta e elimina os agentes infecciosos com a resposta imune adaptativa, que é suportada pelas células do sistema imune inato. Por outro lado, o sistema imune inato está envolvido na cicatrização de feridas e remoção de células mortas e debris celulares. Essa tarefa especializada é cumprida pelas subclasses distintas de células inflamatórias, os Mfs convencionais e neutrófilos (envolvidas no suporte à imunidade adaptativa), e subclasses de Mfs “alternativamente.

(42) 40. ativados”, neutrófilos e células mieloides progenitoras que são encarregadas da cura de feridas e limpeza tecidual (HANAHAN; WEINBERG, 2011; YE et al., 2016). Essas informações permitem novas possibilidades prognósticas e terapêuticas, uma vez que as células estromais associadas ao tumor são geneticamente mais estáveis do que as células malignas e, dessa maneira, devem ser menos propensas a desenvolver resistência à quimioterapia. No entanto, em algumas situações, as células estromais do tumor também podem contribuir para a quimiorresistência tumoral, assim sendo, tomar como alvo as células estromais e/ou seus produtos pode conferir uma estratégia viável de tratamento (UDAGAWA; WOOD, 2010; DE PALMA; LEWIS, 2011). Os Mfs constituem uma população heterogênea de células mieloides inatas derivadas de precursores monocíticos no sangue, que são submetidas a uma diferenciação específica, a depender dos tipos de sinalizadores presentes nos tecidos (GENIN et al., 2015; PIRILÄ et al., 2015). Estão envolvidos em vários aspectos dos mecanismos de defesa do hospedeiro e condições patológicas, como doenças inflamatórias e câncer, demonstrando competência funcional após serem expostos a estímulos do microambiente tecidual (GENIN et al., 2015; BENITO-MARTIN et al., 2015). Dois fenótipos distintos de Mfs são relatados na literatura. Os Mfs do tipo M1 (M1 Mf), que estão relacionados a uma resposta inflamatória com função de eliminação de patógenos, destruição tecidual e ação antitumoral, e os Mfs do tipo M2 (M2 Mf), que participam de uma resposta inflamatória com propriedades imunorregulatórias. Eles são relacionados à cicatrização, remodelação de tecidos, angiogênese e também à progressão tumoral (MANTOVANI et al., 2013; WEBER et al., 2014; GENIN et al., 2015; YE et al., 2016). Na inflamação associada ao câncer é observada a presença dos TAMs, os quais estão geralmente associados a um fenótipo semelhante ao tipo M2 Mfs (PIRILÄ et al., 2015; GAO et al., 2016). Os TAMs suprimem a resposta imune Th1, possuem efeitos anticitotóxicos, promovem angiogênese e, consequentemente, beneficiam a sobrevivência e disseminação das células tumorais (WYCKOFF et al., 2007; SICA; MANTOVANI, 2012). Além disso, liberam no TME espécies reativas de oxigênio, fator de necrose tumoral e interleucinas (IL-6 e IL-1β), promovendo danos no DNA, transformações genotípicas e fenotípicas, além de possibilitar a sobrevivência das células cancerosas (PIRILÄ et al., 2015). A abundância de TAMs no TME está associada a um pobre prognóstico em casos de câncer de ovário, mama, bexiga, próstata e rins (BISWAS; ALLAVENA; MANTOVANI, 2013), bem como nos casos de câncer oral e de orofaringe (MARCUS et al., 2004; DAYAN.

(43) 41. et al., 2012; COSTEA et al., 2013). No entanto, essa associação não é observada em casos de câncer de cólon e gástrico (BISWAS; ALLAVENA; MANTOVANI, 2013). Tem sido observada uma maior porcentagem de TAMs em CCEO metastáticos em contraste com casos não metastáticos e, além disso, a. contribuição dessas células no. decréscimo do tempo de sobrevida dos pacientes (COSTEA et al., 2013). A relação entre a inflamação e o TME nos CCELOs, apesar de ainda não muito bem conhecida, é de crítica importância para o desenvolvimento de metástases (HADLER-OLSEN et al., 2010).. 2.3 VESÍCULAS EXTRACELULARES. O interesse clínico e científico nas EVs tem aumentado rapidamente desde que evidências demonstraram que elas podem constituir um novo paradigma de sinalização celular (XU et al., 2016). Tratam-se de vesículas de tamanho nanomérico secretadas pela maioria dos tipos celulares, senão todos, e podem carregar consigo proteínas, RNA, DNA e lipídeos que podem ser transportados ou trocados entre células como uma forma de comunicação celular, podendo ser parácrina ou a nível sistêmico (PRINCIPE et al., 2013; BENITO-MARTIN et al., 2015; VADER et al., 2016; XU et al., 2016). As EVs estão relacionadas com a manutenção de condições normais e patológicas, incluindo o câncer (XU et al., 2016). Células de mamíferos podem liberar tipos distintos de EVs, incluindo microvesículas, exossomos e corpos apoptóticos. Essa classificação é feita baseada na sua origem intracelular (VADER et al., 2016). As microvesículas, também chamadas de ectossomos, são heterogêneas em tamanho e podem variar de 50nm a 1µm e são formadas pelo brotamento direto da membrana plasmática para o meio extracelular. Esse processo captura componentes citosólicos no lúmen neoformado e receptores de membrana na membrana circunjacente (PRINCIPE et al., 2013; VADER et al., 2016). Quando as células são submetidas ao processo de apoptose, uma população heterogênea de vesículas, que varia de 50nm a 5µm, é liberada e são chamadas de corpos apoptóticos (VADER et al., 2016). Nos anos 1980, dois grupos de pesquisadores, estudando a maturação de reticulócitos (eritrócitos imaturos), descreveram uma forma mais complexa de excreção de EVs no meio intercelular. Eles demonstraram que pequenas vesículas são formadas por brotamento dentro de um endossomo intracelular conduzindo a formação de um corpo multivesicular (MVB),.

(44) 42. que pode então se fundir à membrana plasmática e ser liberado para o meio extracelular (HARDING; HEUSER; STAH, 1983; PAN et al., 1985). Em 1987, o termo exossomo foi então proposto para essas EVs de origem endossomal (JOHNSTONE et al., 1987). Em investigações posteriores, a identificação de mRNA e miRNA nos exossomos despertou um forte interesse nessas vesículas (VALADI et al., 2007). Considerando que fragmentos de mRNA também foram observados em microvesículas derivadas da membrana plasmática, atualmente acredita-se que as células utilizam EVs como uma forma de comunicação extracelular e troca de proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos com outras células (RAPOSO; STOORVOGE, 2013). Estudos iniciais proteômicos indicaram que os exossomos possuem um conjunto de proteínas derivadas de endossomos, da membrana plasmática e do citosol, porém muito poucas derivadas de outras organelas citoplasmáticas. Essa informação confirma que os exossomos são, na verdade, um compartimento subcelular específico, uma vez que não apresentam um conjunto aleatório de proteínas, caracterizando resíduos celulares, como era pensado até então (KOWAL; TKACH; THÉRY, 2014). Os exossomos foram pensados inicialmente para designar as EVs que variavam, em tamanho, entre 40 a 100nm, que eram liberadas por uma variedade de células em cultura, e eram definidos como “vesículas membranares exfoliadas que podem desempenhar uma função fisiológica”. No entanto, esse termo foi posteriormente adotado para designar vesículas menores (30-100nm), de origem endossomal, que eram liberadas em consequência da fusão de MVBs com a membrana plasmática e expressam marcadores, como o CD63, CD81 e CD69 (JOHNSTONE et al., 1987; COLOMBO; RAPOSO; THERY, 2014). O termo “exossomo” é o mais comumente usado para designar qualquer tipo de EV e tem se tornado um termo popular entre os grupos que estudam vesículas. A maioria das publicações especifica que os exossomos são formados em compartimentos multivesiculares endossomais e são secretados quando esses compartimentos se fundem à membrana. No entanto, o material isolado das culturas de células geralmente possui uma mistura de EVs de diferentes tipos (LÖTVALL et al., 2014). Até o momento, ainda não há uma lista de marcadores específicos para distinguir, em uma amostra, cada tipo de EV. Por exemplo, distinguir as EVs produzidas pelo brotamento da membrana plasmática das vesículas produzidas por compartimentos endossomais (PRINCIPE et al., 2013; LÖTVALL et al., 2014). A falta de uma distinção completa entre exossomos e microvesículas tem levado à sobreposições nas estratégias de isolamento, levando alguns estudos a considerarem as.

(45) 43. microvesículas como um composto contendo ambos os tipos de vesículas. No entanto, juntos, exossomos e microvesículas têm sido demonstrados como promissores alvos de estudos sobre a descoberta de biomarcadores em câncer, particularmente devido ao seu potencial impacto na fisiologia tumoral e na patogênese e progressão de diferentes tipos de cânceres (PRINCIPE et al., 2013). Lötvall et al. (2014) listaram em seu estudo os requerimentos mínimos que comprovam a presença de EVs nas amostras a serem utilizadas nas pesquisas:  O primeiro critério é que sejam isoladas a partir de fluidos extracelulares, ou seja, a partir de meio de cultura condicionado ou fluidos corporais. A ruptura mecânica de células e tecidos pode resultar no isolamento de vesículas que são originadas de compartimentos intracelulares, o que obviamente reduz a pureza da amostra de EVs. Dessa maneira, o uso do termo EV pode não ser apropriado para amostras isoladas nessas condições.  Apesar de análises proteômicas terem demonstrado diversas proteínas comumente encontradas em amostras de exossomos, essas proteínas não são específicas. Na verdade, os exossomos são enriquecidos com determinadas proteínas que podem estar presentes em uma variedade de EVs. No entanto, a proporção relativa de diferentes proteínas parece variar em diferentes tipos de vesículas. Dessa maneira, é interessante que seja reportado a presença de algumas proteínas, no mínimo três (CD9, CD63, CD81 e TSG101, por exemplo), para cada preparo de EVs. As proteínas utilizadas na caracterização devem ser proteínas que espera-se estar presente no tipo de EV de interesse.  Como regra geral, pelo menos duas tecnologias devem ser utilizadas para caracterizar as EVs, tais como, Western Blots, citometria de fluxo, análise da proteômica usando técnicas de espectometria de massa, microscopia eletrônica de transmissão e/ou força atômica, análise de rastreamento de nanopatículas, entre outras.  Deve-se fazer uso de um controle negativo sistemático que pode ser composto por EVs obtidas a partir do meio de cultura que não foi condicionado pelas células de interesse ou o líquido remanescente do isolamento das EVs (sobrenadante). Atualmente, não há consenso sobre um padrão ouro para para os métodos de isolar e/ou purificar EVs, não podendo ser afirmado que há um método ótimo para ser uniformemente utilizado. No entanto, o método de extração e isolamento das vesículas deve ser descrito nos estudos, permitindo assim a interpretação e reprodução do método por outros pesquisadores (LÖTVALL et al., 2014)..

(46) 44. Os tumores podem fazer uso de exossomos derivados de Mfs (tanto M1 Mfs quanto M2 Mfs) para reforçar o escape de células da vigilância imunológica e, nesse sentido, os derivados de Mfs regulam a expressão da integrina-β1 em células endoteliais in vitro, eventualmente promovendo a sua migração (LEE et al., 2014).. Suas contribuições no. extravasamento do conteúdo intravascular e invasão tumoral são plausíveis, no entanto esse mecanismo ainda não está muito bem estabelecido (BENITO-MARTIN et al., 2015). De acordo com um estudo realizado por Ismail et al. (2013), os exossomos secretados por Mfs podem regular o potencial invasivo em casos de câncer de mama através da distribuição de miRNAs oncogênicos. Em cânceres, a estimulação contínua do tumor primário geralmente potencializa a vigilância imunológica mediada por Mfs. Uma potencial consequência da excreção em massa dos exossomos pelos Mfs, em cenários patológicos, poderia ser a formação de um microambiente inflamatório que, em última análise, resultaria em um aumento da capacidade de metástase tumoral (BENITO-MARTIN et al., 2015). A identificação de biomarcadores das EVs pode ser útil no diagnóstico precoce e para determinar o prognóstico dos tumores. Assim sendo, a liberação, tanto pelas células tumorais quanto pelas outras células presentes no TME, pode ser um novo alvo de terapia, podendo representar um veículo de entrega seletiva de drogas quimioterápicas, pequenas moléculas terapêuticas ou agentes para terapia gênica contra as células tumorais (ZHU et al., 2012)..

(47) 45. OBJETIVOS.