Aplicações biotecnológicas de preparações de lectinas de sementes de Cratylia mollis

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BILÓGICAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS. Aplicações biotecnológicas de preparações de lectinas de sementes de Cratylia mollis. Flávia Fabianny Barbosa de Araújo. Recife – PE 2007.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BILÓGICAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS. Aplicações biotecnológicas de preparações de lectinas de sementes de Cratylia mollis. FLÁVIA FABIANNY BARBOSA DE ARAÚJO. Tese de doutoramento apresentada ao Doutorado em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco como pré-requisito para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração em Biotecnologia.. Orientadora: Profa. Dra. Vera Lúcia de Menezes Lima Co-orientadora: Profa. Dra. Maria Tereza dos Santos Correia. Banca examinadora: Profa. Dra. Vera Lúcia de Menezes Lima (UFPE) (presidente/ UFPE) Prof. Dr. Antônio Euzébio Goulart Sant’Ana (UFAL/ Maceió, AL) Profa. Dra. Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho (UFPE) Profa. Dra. Maria Tereza dos Santos Correia (UFPE) Profa. Dra. Patrícia Maria Guedes Paiva (UFPE).

(3) Araújo, Flávia Fabianny Barbosa de Aplicações biotecnológicas de preparações de lectinas de sementes de Cratylia mollis. – Recife: A Autora, 2007. 110 folhas : il.. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) – UFPE. CCB.. 1. Lectinas 2 Cratylia mollis Esquistossomose I. Título.. 574.19. 3. Câncer. CDD (22.ed.) 577.112. CDU (2.ed.). 4. Dengue. 5.. UFPE CCB - 2007 - 047.

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(5) AGRADECIMENTOS A Deus pela oportunidade de aprender que Ele está por perto nos momentos mais difíceis e que nos dá forças para conseguirmos nos superar e continuarmos seguindo sempre em frente. À Profa. Dra. Vera Lúcia de Menezes Lima pela acolhida, amizade e orientação. À Profa. Dra. Maria Tereza dos Santos Correia por todo seu apoio, experiência transmitida, incentivo, cooperação e amizade. A Profa. Dra Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho, pela atenção, incentivo, oportunidades e por estar sempre disposta em ajudar com seus ensinamentos científicos tão valiosos. Aos Professores do Departamento de Bioquímica, em especial a À Profa. Dra. Patrícia Maria Guedes Paiva e a Profa. Dra. Maria das Graças Carneiro da Cunha, pela amizade, oportunidades e experiência transmitida. À Coordenação, Professores e aos Funcionários do Doutorado em Ciências Biológicas. A todos os funcionários do Departamento de Bioquímica, em especial Miron. Neide e Djalma. A Maria Barbosa Reis e a João Virgínio, pelo apoio, dedicação e amizade A todos os amigos que fazem ou fizeram parte do Laboratório de Glicoproteínas, por tudo que vivenciamos, pelos conhecimentos compartilhados e companherismo. Em especial à Vanessa, Maria Danielly, Cynthia, Mariana Cristina, Rodrigo, Roberto, Fernando, Romero, Luciana, Lucíola, Juliene, Carina, José Roberto e Raquel pela dedicação, colaboração e confiança. Em especial agradeço a minhas amigas Adriana, Andréa, Jaira, Mariana, Nathálya, Regina, Renata e Vivianne pela força que sempre me deram nos momentos mais difíceis no decorrer destes anos e pelo grande carinho. E a Michele e Neila pela experiência da convivência, incentivo e apoio mútuo. A todos os amigos do curso de Doutorado. Ao Prof. Dr. Antônio Euzébio G. Sant’Ana e a Aldenir Santos e Cenira Carvalho pela oportunidade de desenvolver parte deste trabalho junto a vocês.

(6) a todos que fazem parte do laboratório de bioensaios do Centro de Ciências Exatas e da Natureza da Universidade Federal de Alagoas. Ao Prof. Dr. Aníbal Eugênio Vercesi por ter me acolhido em seu laboratório, pela orientação científica e experiência transmitida e a todos do laboratório de bioenergética da Universidade Estadual de Campinas em especial ao Prof. Jiri Borek, Lêda, Fernando, Renata, Ana Maria, Sandra, Ana Katarina, Ana Luíza, Bruno, Elisângela e Edilene pela amizade e apoio. E a Natalia e Giovanna, que foram de valiosa importância na realização e colaboração deste trabalho, pela confiança e amizade. Aos meus pais, Marcos e Fátima pelo amor, carinho, educação, apoio em todos os momentos e incentivo para seguir sempre em frente e em busca dos meus objetivos. Aos meus irmãos, Erick e Anderson e minhas cunhadas, Fabiany e Jaqueline, por sempre torcerem por mim. Ao meu padrinho, Urbano pelo suporte e amor no decorrer de toda vida. A toda minha família, em especial aos tios Washington, Roseane, Roberto e Semíramis pela força, atenção e carinho. E a Esmeraldina e Maria José pela acolhida em suas famílias, pelo apoio constante e carinho. A Junior pelo incentivo ao longo desta difícil caminhada, pela imensa compreensão, por sempre me dar forças quando acho que não as tenho mais e por todo o amor e carinho que sinto quando estou ao seu lado. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste trabalho. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro..

(7) O rio atinge seus objetivos porque aprendeu a contornar obstáculos. (Lao-Tsé).

(8) A Deus Aos meus pais Marcos e Fátima Ao meu esposo Junior.

(9) SUMÁRIO. Sumário. I. Lista de Figuras. III. Lista de Tabelas. V. Resumo. VI. Abstract. VIII. 1. Introdução. 1. 1.1 Lectinas. 1. 1.1.1 Histórico. 1. 1.1.2 Conceito. 2. 1.1.3 Fontes. 3. 1.1.4 Classificação. 3. 1.1.5 Lectinas de leguminosas. 4. 1.1.6. Funções e aplicações biotecnológicas das lectinas. 5. 1.1.7. Purificação e caracterização. 8. 1.2. Esquistossomose mansônica. 12. 1.2.1 Ciclo biológico da esquistossomose mansônica. 12. 1.2.2. Sintomatologia. 14. 1.2.3. Transmissão e Profilaxia. 14. 1.2.4 Moluscos transmissores. 15. 1.2.5. Compostos moluscicidas. 16. 1.2.6 Cercária. 18. 1.3 Artemia salina. 18. 1.4. Atividade antitumoral. 20. 1.4.1. Câncer. 20. 1.4.1.1 Câncer no Brasil. 22. 1.4.1.2 Câncer de próstata. 23. 1.4.2. Morte celular. 24. 1.4.2.1 Células LNCaP e de Walker 256. 26. 1.4.3. Produção de Espécie Reativa de Oxigênio (EROs). 27. 1.5 Dengue. 29. 1.5.1 Ciclo biológico do dengue. 31 I.

(10) 1.5.2 Sintomatologia do dengue. 33. 1.5. Cratlylia mollis. 35. 2. Objetivos. 37. 3. Referências. 38. 4. Capítulo 1. Activity of Cratylia mollis seed lectin preparations on. 56. Biomphalaria glabrata and Artemia salina 5. Capítulo 2. Antitumoral activity of Cramoll 1,4 on LNcaP and. 73. Walker tumor cells 6. Capítulo 3. Abnormal sera protein from patients Infected by. 89. dengue Virus 5. Conclusões. 109. II.

(11) LISTA DE FIGURAS. Introdução. Figura 1: A. Cromatografia de troca iônica; B. Cromatografia de exclusão molecular; C. Cromatografia de afinidade. Figura 2: Eletroforese bidimensional. A: Proteínas separadas por focalização isoelétrica. B: Gel de poliacrilamida apresentando várias proteínas diferentes. Figura 3: Ciclo biológico da esquistossomose mansônica. Figura 4: A. Verme adulto do Biomphalaria glabrata; B. desova de Biomphalaria glabrata. Figura 5: Cercária Figura 6. Artemia salina. Figura 7: Taxa de mortalidade masculina por câncer no Brasil. Figura 8. A: Indução de apoptose pela via de receptores da morte; B: Indução de apoptose por disfunção mitocondrial. Figura 9: Células LNCaP e de Walker 256 Figura 10: Aedes aegypit Figura 11: Distribuição geográfica global do dengue e dengue clássico e hemorrágico. Figura 12: Distribuição geográfica do Aedes aegypti nas Américas em 1930, 1970 e 2004. Figura 13. Ciclo do Dengue. Figura.14: Classificação da OMS referente aos sintomas da dengue. Figura 15. Exemplo de sintoma da dengue hemorrágica Figura 16. A. Árvore de Cratylia mollis;B. Sementes de Cratylia mollis.. III.

(12) Capítulo 2 – Antitumoral activity of Cramoll 1,4 on LNCaP and Walker 256 tumor cells. Figure 1. Effect of Cramoll 1,4 on LNCaP and Walker 256 tumor cells. Figure 2. Effect of Cramoll 1,4 in Walker 256 tumor cells apoptosis. Figure 3. Effect of Cramoll 1,4 on Walker 256 (A) and LNCaP (B) ROS Production. Figure 4. Effect of Cramoll 1,4 on Walker 256 (A) and LNCaP (B) tumor cells cytosolic calcium concentration.. Capítulo 3 - Abnormal Sera Protein from Patients Infected by Dengue Virus. Figure 1. 2-DE gel of human serum. Figure 2. Gel diffusion of Cramoll 1,4 against sera from ten pooled: healthy individuals (A), DF patients (B) and DHF patients (C). Figure 3. Elution pattern of human serum. Figure 4. 10 % SDS-PAGE under denaturing and reducing conditions.. IV.

(13) LISTA DE TABELAS. Introdução. Tabela 1: Funções das lectinas Tabela 2: Variações entre países quanto à incidência de alguns cânceres comuns.. Capítulo 1 - Activity of Cratylia mollis Seed Lectin Preparations on Biomphalaria glabrata and Artemia salina. Table 1. Preliminary assay of molluscicidal activity from C. mollis preparations Table 2. Accurate assay of molluscicidal activity from C. mollis preparations Table 3. Accurate assay of F 60-80 with A. salina Table 4. Accurate assay of Cramoll1,4 with A. salina. Capítulo 3 - Abnormal Sera Protein from Patients Infected by Dengue Virus. Table 1. Yield of the adsorbed serum proteins to Cramoll 1,4 Sepharose chromatography.. V.

(14) RESUMO. O caramujo Biomphalaria glabrata é o hospedeiro intermediário mais susceptível ao Schistosoma mansoni, no Brasil. O uso de plantas com propriedades moluscicidas poderia ser uma alternativa para o controle do vetor. Como teste alternativo para determinar a toxicidade de produtos químicos e naturais tem sido usado a Artemia salina, um invertebrado de grande importância na indústria de aqüicultura. Cratylia mollis é uma planta nativa, perene do semi-árido do sertão de Pernambuco. Sementes de C. mollis foram avaliadas quanto à presença de lectinas que são proteínas ou glicoproteínas capazes de ligar-se especificamente e reversivelmente a carboidratos. Três isolectinas foram obtidas a partir de diferentes frações (F) de precipitados salinos (F0-40, F40-60 e F60-80). Cramoll 1,4 foi obtida da F40-60 e purificada por cromatografia de afinidade. Cramoll 1,4 e F 60-80 promoveram a morte de todos espécimes avaliados de B. glabrata em 80 e 100 ppm. Cramoll 1,4 (LC90 = 23.581) apresentou maior toxicidade contra A. salina que F60-80 (LC90 = 62.988), mas nenhuma delas teve atividade na desova e cercária. A toxicidade para A. salina é um indicativo do uso potencial da Cramoll 1,4 e F 60-80 como inibidores do crescimento celular tumoral. Portanto, a partir desse resultado foi investigado o efeito da Cramoll 1,4 sobre as células de tumor de Walker variante AR (sarcoma de rato), e sobre a linhagem de células LNCaP originalmente obtida de carcinoma prostático metastásico humano. Cramoll 1,4 em baixas concentrações (4 µg/ml) induziu apoptose nas células tumorais de Walker e LNCaP, em 4 horas de tratamento. Análises realizadas em 2,5 h de tratamento promoveu elevação do Ca2+ citosólico, mas este efeito não foi visualizado na mitocôndria. Cramoll 1,4 também aumentou a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), as quais foram reduzidas na presença de DPI sugerindo que a produção de EROs ocorreu no citosol. Testes adicionais realizados com as células de Walker demonstraram que a atividade antitumoral da Cramoll 1,4 foi totalmente inibida pelo antioxidante desferal (DFO) e parcialmente inibida pelo inibidor da caspase 8. Os resultados do presente trabalho demonstram que Cramoll 1,4 tem potencial para utilização: 1) no controle da B. glabrata; 2) como composto promissor na terapia alternativa anticancer, haja vista que induz a morte de células tumorais pelo processo de VI.

(15) apoptose resultando na perda irreversível da estrutura e funções vitais dessas células; 3) no diagnóstico laboratorial de anormalidades glicoproteicas em soro de pacientes portadores do dengue. Palavras chaves: Lectinas, Cratylia mollis, esquistossomose, câncer e dengue.. VII.

(16) ABSTRACT. Biomphalaria glabrata is the most susceptible intermediary host to Schistosoma mansoni in Brazil. The use of plants with molluscicidal properties could be an approach to local control of a vector. As alternative test to show chemic and natural products toxicity has been used Artemia salina, an invertebrate with industry and aquiculture importance. Cratylia mollis is a native plant from Semiarid Region of the Northeast of Pernambuco. The presence of lectins in Cratylia mollis seeds was available .Lectins are proteins or glycoprotein with the capacity of binding specifically and reversibly to carbohydrates. Three isolectins were obtained from different fractions (F) from saline precipitated (F0-40, F4060, F60-80). Cramoll 1,4 was obtained from F40-60, purified by affinity chromatograph. Cramoll 1,4 and F60-80 promoted death of all analyzed Biomphalaria glabrata specimen death with 80 and 100 ppm. Cramoll 1,4 (LC90 = 23.581) showed more toxicity against A. salina than F60-80 (LC90 = 62.988), but neither of them had activity with its egg mass and cercaria. The toxicity to A. salina is an indicative of potential use of Cramoll 1,4 and F60-80 as inhibitors of tumor cell growth. Therefore, from these results the effect of Cramoll 1,4 on Walker AR (rat sarcoma) and LNCaP tumor cells line, originally obtained from metastatic human prostate carcinoma, was investigated. Cramoll 1,4 in low concentration (4 µg/ml) induced apoptosis on both tumor cell line, Walker AR tumor and LNCaP with 4 hours of treatment. Analyses realized in 2.5 h of treatment promoted increase in cytosolic Ca2+ but this effect was not sawn in mitochondria. Cramoll 1,4 also increased reactive oxygen species (ROS) production, which was reduced in presence of DPI suggesting that ROS production occur on cytosol. Additional tests realized with walker tumor cells showed that Cramoll 1,4 antitumoral activity was totally inhibited by antioxidant desferal (DFO) and partially inhibited by inhibitor of Caspase 8. This present works results demonstrated that Cramoll 1,4 has potential to be used: 1) on B. glabrata control; 2) As promising compound on alternative anticancer therapy, since induce tumor cells death through apoptosis resulting in a structural and vital functional irreversible lost of these cells; 3) Laboratorial diagnosing of abnormal glycoprotein from dengue patients serum. Keywords: Lectins, Cratylia mollis, schistosomiasis, cancer and dengue. VIII.

(17) 1 INTRODUÇÃO. 1.1 Lectinas. 1.1.1 Histórico. A primeira descrição de uma hemaglutinina foi feita por Peter Herman Stillmark em 1888, quando o mesmo isolou esta hemaglutinina de sementes de mamona (Ricinus communis) chamando-a de ricina. Posteriormente, em 1889 H. Hellin detectou a presença de uma outra hemaglutinina, tóxica, obtida do extrato de Abrus precatorius, denominada abrina. No ano de 1891 Paul Ehrlich utilizou ricina e abrina como modelos antigênicos para estudos imunológicos demonstrando, por exemplo, que camundongos se tornaram imunes a doses letais de ricina após terem recebido, repetidamente, pequenas doses subcutâneas da toxina, (KENNEDY et al., 1995; SHARON e LIS, 2004). Ainda, em 1897, Paul Ehrlich efetuou a primeira determinação quantitativa de um anticorpo in vitro, quando demonstrou que o soro de camundongos imunes poderia neutralizar o efeito tóxico da ricina e que esta ação era específica, uma vez que o soro anti-abrina, de animais imunizados com abrina, não neutralizava os efeitos tóxicos da ricina e vice-versa (SHARON e LIS, 2004). Landsteiner e Raubitschek (1908) observaram que um mesmo extrato de planta apresentava diferentes propriedades de aglutinação quando testado com células sanguíneas de animais distintos. A primeira aglutinina de planta obtida na forma pura foi a concanavalina A (Con A) a partir de sementes de Canavalia ensiformis. Em 1936, Sumner e Howell demonstraram que além da propriedade de aglutinar células, a Con A também precipitava glicogênio e amido a partir da solução e que sua atividade hemaglutinante podia ser inibida pelo açúcar de cana. Eles sugeriram que a aglutinação se dava em conseqüência de uma reação da proteína com carboidratos presentes na superfície dos eritrócitos (LIS e SHARON, 1981), reconhecendo, desta forma, que aglutininas de plantas são específicas a carboidratos. Em 1945, William Boyd relatou que extratos salinos de Phaseolus lunatos ou P. limensis aglutinavam apenas eritrócitos humanos do tipo A e não. 1.

(18) os eritrócitos dos tipos B ou O. Estudos com lectinas específicas ao tipo sanguíneo, em meados de 1950, mostraram que a atividade hemaglutinante específica para eritrócitos humanos do tipo A, B e O foi inibida por α–N-acetilgalactosamina, α-galactose e α–L-fucose, respectivamente (SHARON e LIS, 1972; KENNEDY et al., 1995). Em 1960 o estudo sobre lectinas ganhou ímpeto. Nesta década foram realizadas duas grandes descobertas com lectinas; a primeira delas foi feita por Nowell, este detectou que a lectina de Phaseolus vulgaris, conhecida como fitohemaglutinina (PHA), possuia atividade mitogênica. Logo após foi demonstrado que outras lectinas apresentavam a mesma capacidade, dentre elas a Con A. A segunda descoberta foi feita por Joseph C. Aub em 1963, ele observou que a aglutinina de germe de trigo (WGA) era capaz de aglutinar células malignas em concentrações muito mais baixas do que aquelas necessárias para a aglutinação de células normais. Posteriormente, a Con A apresentou a mesma característica (SHARON e LIS, 1987). A partir destas descobertas as lectinas vêm conquistando uma vasta área de aplicações biotecnológicas que abrange desde a diferenciação celular ao câncer (SHARON e LIS, 2001).. 1.1.2 Conceito. O termo lectina (originado do latim “lectus” selecionado) foi introduzido por Boyd e Shapleigh em 1954, em virtude da capacidade de proteínas se ligarem a carboidratos, aglutinando seletivamente eritrócitos de um grupo sangüíneo específico (PEUMANS e VAN DAMME, 1995). Tendo em vista o enorme interesse demonstrado pelas lectinas e por estarem amplamente presentes na natureza, Goldstein et al (1980) definiram lectinas como proteínas de origem não imune, que se ligam específica e reversivelmente a carboidratos através de pelo menos dois sítios de ligação, aglutinam células vegetais e animais e precipitam polissacarídeos e glicoconjugados. Os sítios de ligação a carboidratos estão localizados na superfície da proteína; esta seletividade é obtida através de ligações de hidrogênio e interações de van der Wals entre o açúcar e a molécula protéica (ELGAVISH e SHAANAN, 1997).. 2.

(19) Para KENNEDY et al., (1995) e VIJAYAN e CHANDRA (1999), lectinas são proteínas ubíquas na natureza que exibem considerável diversidade estrutural, são capazes de reconhecer hidrofóbicamente e hidrofilicamente diferentes estruturas sacarídicas com especificidade característica, estando envolvidas em uma variedade de processos biológicos.. 1.1.3 Fontes. As lectinas podem ser encontradas em microorganismos (KAWAGISHI et al., 2001), animais (ANTUNES e COELHO, 1993; ALPUCHE et al., 2005) e plantas (COELHO e SILVA, 2000). Nas plantas, as lectinas estão presentes em todos os tecidos, como por exemplo: casca, bulbo, vagem, raiz, folhas e frutos (YAMASHITA et al., 1992; MO et al., 1993; KOIKE et al., 1995; KAMEMURA et al., 1996a; KAMEMURA et al.,1996b WITISUWANNAKUL et al., 1998). A maioria das lectinas tem sido purificada e caracterizada de sementes de leguminosas, representando cerca de 10 % do conteúdo de proteína total (SPILATRO et al.,1996). Uma lectina específica para galactose foi isolada de feijão (pinto beans), variedade do feijão comum, Phaseolus vulgaris (WONG et al., 2006), e uma outra lectina específica para fetuína foi extraída de feijão (tepary bean) de uma espécie diferente, Phaseolus acutifolius (REYNOSOCAMACHO et al., 2003).. 1.1.4 Classificação. Com base na estrutura geral das proteínas as lectinas de plantas são subdivididas em: merolectina, hololectina, quimerolectina e superlectina (PEUMANS e VAN DAMME, 1998). Merolectinas são proteínas que possuem apenas um domínio de ligação para carboidratos, são monovalentes e por isso não precipitam glicoconjugados ou aglutinam células. Hololectinas possuem pelo menos dois ou mais domínios idênticos ou homólogos ligantes a açúcares, são di ou multivalentes, aglutinam células e/ou precipitam glicoconjugados. A maioria das lectinas de plantas pertence a este grupo. Quimerolectinas são proteínas com um ou mais domínios de ligação a carboidratos e um outro domínio, não relacionado, que pode ter uma atividade enzimática bem definida 3.

(20) ou outra atividade biológica e age independentemente dos domínios de ligação a carboidratos. Superlectinas possuem pelo menos dois domínios de ligação para açúcares diferentes, este pode ser considerado um grupo especial de quimerolectinas (VAN DAMME et al., 1996). As lectinas são também classificadas de acordo com o monossacarídeo que apresente maior ação inibitória da atividade hemaglutinante. Dois novos grupos de especificidade foram incluídos com a descoberta de lectinas de monocotiledôneas, ligantes de manose, e de uma lectina específica à manose/maltose isolada de Calystegia sepium (PEUMANS e VAN DAMME, 1998). Muitas lectinas não se enquadram em nenhum destes grupos de especificidade, por não se ligarem a mono ou dissacarídeos, requerendo glicanos mais complexos para inibição da atividade hemaglutinante, como a lectina de Phaseolus vulgaris (PEUMANS e VAN DAMME, 1998) e a lectina de Pisum sativum (LORIS et al., 1998). Uma outra classificação para lectinas tem como base sua estrutura e evolução (PEUMANS et al.,2001). Nesta, as lectinas de plantas estão divididas em 7 grupos incluindo: amaratinas, lectinas ligadoras de quitina, lectinas do floema de curcubitaceae, lectinas relacionadas a jacalina, lectinas de legumes, lectinas de monocotiledôneas ligantes de manose (MMBL) e proteínas inativadoras de ribossomos tipo 2 (RIP 2).. 1.1.5. Lectinas de leguminosas. Lectinas de legumes representam um grupo heterogêneo da maior e mais estudada família de proteínas desta classe, são exclusivamente encontradas em legumes da família Fabaceae, todas sintetizadas no retículo endoplasmático, são metaloproteínas encontradas em difrentes tipos de tecidos vegetativos como por exemplo; folhas, caules, casca, raízes e em maior quantidade nas sementes (SHARON e LIS, 1990; LORIS et al., 1998; HAMERLYCK et al., 1998; VAN DAMME et al., 1997; KONOZY et al., 2003). Esta é uma família de lectinas bastante heterogênea em relação à especificidade. para. carboidratos,. praticamente. todas. as. classes. de. carboidratos estão representadas nas lectinas de legumes (PEUMANS e VAN DAMME, 1998). As lectinas desta família consistem de duas ou quatro 4.

(21) subunidades, que podem ser idênticas ou semelhantes, cada subunidade possui o seu sítio de ligação para carboidrato, e estes sítios presentes em cada subunidade, são específicos para o mesmo carboidrato. Os sítios são pequenas depressões na superfície das lectinas, os quais se localizam no topo de cada subunidade e estão acessíveis tanto para monossacarídeos como para oligossacarídeos (SHARON e LIS, 2002). Uma importante razão do interesse por essas lectinas é a sua similaridade estrutural com lectinas de outras fontes, como lectinas de animais (galectinas) (SHARON e LIS, 2002). Alguns exemplos bem conhecidos destas lectinas são Con A, a PHA, a soybean agglutinin (SBA), peanut agglutinin (PNA) e a lectina de Erythrina coralladendron (ECorL). As lectinas de legumes são extremamente úteis como modelo para o entendimento da base molecular de interações proteína-carboidrato porque são fáceis de serem purificadas, após definição do protocolo, e exibem uma grande variedade de especificidade para açúcares (SHARON e LIS, 2002).. 1.1.6. Funções e aplicações biotecnológicas das lectinas. As lectinas de plantas são bastante estudadas, mas o seu papel fisiológico ainda é pouco esclarecido (tabela 1). Acredita-se que as lectinas atuam no mecanismo de defesa da planta inibindo o crescimento de algumas bactérias. fitopatogênicas. (RATANAPO. et. al.,. 2001),. na. interação. parasito/hospedeiro (PIAZZA et al., 1996) e na adesão de agentes infecciosos às células hospedeiras (HIRSCH, 1999). A maioria das lectinas de leguminosas age protegendo as plantas contra a ação predatória dos insetos (SHARON e LIS, 2004), como a lectina de Bauhinia monandra (Bmoll) que apresentou atividade inseticida contra Anagasta kuehniella, Zabrotes subfasciatus e Callosobruchus maculatus (MACEDO et al., 2006). As lectinas são inestimáveis ferramentas para investigação estrutural e funcional de carboidratos complexos e glicoproteínas, bem como para examinar mudanças que ocorrem na superfície celular durante os processos fisiológicos e patológicos (SHARON e LIS, 2001). Dentre as aplicações biotecnológicas das lectinas podem ser citadas: a atividade mitogênica da Con A que foi inibida por baixas concentrações de 5.

(22) monossacarídeos, como manose. Esta inibição da atividade mitogênica levou a conclusão que a estimulação mitogênica resultou da ligação da lectina a carboidratos da superfície dos linfócitos (SHARON e LIS, 1987; SHARON, 1989). Uma lectina galactose específica de uma variedade do feijão comum (P. vulgaris) possui a capacidade de induzir a resposta mitogênica (WONG et al., 2006). Essas duas lectinas inibem a trasncriptase reversa do HIV-1 com perspectivas de aplicação clínica KAUR et al. (2005) purificaram uma lectina de rizoma Arundo donase com atividade anti-proliferativa para linhagens de células cancerígenas e atividade mitogênica para células mononucleares periféricas. Outras lectinas com atividade mitogênica foram identificadas, destacando-se além da Con A, as lectinas de Ulex europeus e de Vicia faba (JANEWAY et al., 2000).. Tabela 1. Funções das lectinas. Lectinas Microorganismos Ameba Bactéra Vírus influenza Plantas Várias Legumes Animais Calnexina, calreticulina, ERGIC-53 Colectinas Detectina-1 Galectinas. Efeitos. Infecção Infecção Infecção Defesa Simbiose bactérias. na. fiação. de. nitrogênio. das. Controle da biossíntese de glicoproteínas Imunidade inata Imunidade inata Regulação do crescimento celular e apoptose; regula o ciclo celular; modulação da interação célula-célula e célula-substrato. (Adaptada de SHARON E LIS, 2004). A lectina de alho (Allium sativum) reduziu eficientemente o crescimento de células tumorais humanas e, portanto apresenta, também, perspectivas de aplicação clínica (KARASAKI et al., 2001); esta propriedade de ligação a células tumorais torna as lectinas potenciais ferramentas bioadesivas na entrega de drogas (GABOR et al., 2001). Lectina de sementes de Salvia 6.

(23) bogotensis mostrou alta afinidade por antígenos de células tumorais e pode ser usada como ferramenta para estudos imunohistoquímicos e celulares (VEGA e PÉREZ, 2006). Apesar da afinidade dos carboidratos por lectinas não se mostrar tão alta quanto a afinidade apresentada por carboidratos específicos para anticorpos, as. lectinas. quando. imobilizadas. e. empregadas. na. purificação. de. glicoconjugados, oferecem vantagem por serem utilizadas em condições amenas para eluíção de proteínas de interesse, ao contrário dos anticorpos carboidratos específicos que utilizam condições mais severas e não fisiológicas, para eluíção das proteínas que ficaram aderidas a matriz durante a purificação. Além do mais, não é difícil obtê-las quando comparado ao árduo trabalho de obter anticorpos monoclonais específicos, mostrando que a cromatografia de afinidade utilizando lectinas imobilizadas pode ser uma poderosa ferramenta na purificação de glicoconjugados de membrana (SATISH e SUROLIA, 2001). A glicosilação é uma modificação pós-traducional complexa que pode resultar em uma heterogeneidade extensiva para produção de glicoproteínas em sistemas eucarióticos. A porção carboidrato de uma proteína pode afetar a imunogenicidade, a meia-vida, a bioatividade, e estabilidade de um produto terapêutico potencial (HOOKER e JAMES, 2000). As glicoproteínas estão entre os produtos mais desafiadores para caracterizar devido à natureza delicada e extrema e da microheterogeneidade da amostra. A microheterogeneidade de glicoformas aparece por si em organismos sadios e algumas delas são alteradas em condições clínicas. Este fato é de grande importância para o entendimento não só de como elas são geradas, mas também na perspectiva de uso no diagnóstico e tratamento de condições patológicas (SATISH e SUROLIA, 2001). Glicoconjugados de superfícies celulares controlam e determinam as interações célula-ligante e células-célula através da sinalização celular ou transdução intercelulares. Os estudos dos mecanismos moleculares destes processos dependem da elucidação das estruturas dos glicoconjugados de membrana. Para esta finalidade será necessária uma grande quantidade de glicoconjugados e, seu isolamento por métodos convencionais é difícil (OSAWA e TSUJI, 1987). 7.

(24) 1.1.7. Purificação e caracterização. A purificação de lectinas segue os métodos utilizados para separar as proteínas que exploram as propriedades exibidas pelas mesmas, como a carga elétrica, o tamanho e a solubilidade, as quais variam de uma proteína para outra. Como muitas proteínas se ligam a outras biomoléculas, também podem ser separadas em função dessas propriedades de ligação. A fonte protéica pode ser de origem animal, vegetal ou microbiana. As células são rompidas e as proteínas extraídas com solução salina ou tampão (KAWAGISHI et al., 2001). Após a extração ocorre o fracionamento salino. Etapas iniciais do fracionamento em uma purificação utilizam diferenças na solubilidade das proteínas, que gralmente é diminuída a medida que a concentração salina aumenta, um efeito chamado Salting out. A adição de sal na quantidade correta pode seletivamente precipitar algumas proteínas, enquanto outras permanecem em solução (NELSON e COX, 2006). O sulfato de amônio, (NH4)2SO4, é o sal mais usado para precipitar proteínas, porque a sua alta solubilidade permite a precipitação protéica em soluções com elevada força iônica (HEU et al., 1995). Após o fracionamento salino, diálise é feita para separar as proteínas de moléculas menores através de uma membrana de celulose semipermeável (KABIR et al., 1998). A cromatografia é um método físico-químico de separação de uma mistura através da distribuição dos componentes em duas fases, que estão em contato íntimo. Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra se move através dela. Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um deles é seletivamente retido na fase estacionária, resultando em migrações diferenciais (ZENTENO et al., 2000) O uso de técnicas cromatográficas convencionais é bastante utilizado para a purificação de lectinas (RATANAPO et al., 2001; VEGA e PÉREZ, 2006), tais como, cromatografia de troca iônica (figura 1A), gel filtração (figura 1B) e afinidade (figura 1C). Na cromatografia de troca iônica a ligação da proteína ocorre com os grupos de carga de sinal contrário imobilizados na matriz. A coluna é lavada com solução tampão e as proteínas que não interagem com o trocador de íons 8.

(25) são eluídas. As proteínas adsorvidas à matriz podem ser eluídas pelo aumento da força iônica ou alteração do valor do pH do meio (DATTA et al., 2001). São exemplos de trocadores catiônico e aniônico Carboximetil (CM) celulose e Dietilaminoetil (DEAE) celulose, respectivamente.. A. B. C. Figura 1. A: Cromatografia de troca iônica; B: Cromatografia de gel filtração; C: Cromatografia de afinidade. (LEHNINGER et al., 1995).. A cromatografia de gel filtração ou peneira molecular é um método simples e baseia-se na separação de biomoléculas de acordo com a diferença dos seus tamanhos. A mistura protéica passa através de uma coluna contendo esferas de gel cujos poros possuem intervalos de tamanhos relativamente estreitos. As moléculas maiores que não penetram nos poros do gel são eluídas primeiro, enquanto que as moléculas de tamanhos menores capazes de penetrar nos poros do gel vão passando mais lentamente, de modo que a separação ocorre na ordem decrescente da massa molecular (HEU et al., 1995). Este tipo de cromatografia é utilizado tanto para obter preparações protéicas homogêneas (BEZERRA et al., 2001) como para definição da massa molecular da proteína (KAWAGISHI et al., 2001).. 9.

(26) A técnica mais utilizada atualmente é a cromatografia de afinidade que tem como princípio de separação a capacidade de proteínas se ligarem especificamente a outras moléculas através de ligações não covalentes. Desde que lectinas têm a propriedade de ligação a carboidratos, colunas contendo suportes polissacarídicos tais como Sephadex (polímero de glicose), Sepharose (polímero de galactose) e quitina (polímero de N-acetil glicosamina), têm sido usadas (PEREZ et al., 1990; UMETSU et al.,1991; SATO et al., 1991; CORREIA e COELHO, 1995; CAVADA et al., 1998; ANURADHA e BHIDE, 1999; JIMBO et al., 2000; Santi-Gadelha et al., 2006). Os métodos eletroforéticos são utilizados para a caracterização estrutural de proteínas, assim como para o estabelecimento do grau de pureza. Eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes (presença de sulfato sódico de dodecila - SDS) e redutoras (presença de βmercaptoetanol ou ditiotreitol - DTT) revelam o grau de pureza, a composição de subunidades (PAJIC et al., 2002) e através de coloração específica, a natureza glicoprotéica (COELHO e SILVA, 2000). A eletroforese em gel de poliacrilamida para proteínas sob condições não desnaturantes é uma técnica utilizada para analisar a pureza de estruturas moleculares nativas. A combinação da focalização isoelétrica seguida da eletroforese em SDS (figura 2A) em um processo chamado de eletroforese bidimensional (2D) permite a resolução de misturas complexas de proteínas (NELSON e COX, 2006). Na focalização isoelétrica uma mistura protéica é submetida a ação de agentes desnaturantes não-carregados em uma tira em gel de poliacrilamida e as proteínas são separadas de acordo com sua capacidade de protonação, através de seu ponto isoelétrico (pI) em uma primeira dimensão (figura 2A). A separação por peso molecular (figura 2B) é realizada por eletroforese em um gel de poliacrilamida com sulfato sódico de dodecila (SDS-PAGE) na segunda dimensão (NELSON e COX, 2006). Esta é uma ferramenta de extrema valia para a proteômica que se caracterizou pelo estudo do proteoma, conjunto de todas as proteínas expressas por uma única célula ou organismo, mas com ênfase na quantificação, na localização, nas modificações, nas interações, nas atividades e na identificação (VOET, 2006). Proteínas com pesos moleculares muito altos ou muito baixos, não são bem separadas nas eletroforeses 2D. Além disso, proteínas com um pequeno número de cópias dentro da célula, 10.

(27) como. as. proteínas. sinalizadoras,. não. são. reveladas. pelo. método. convencionais de coloração, tais como nitrato de prata e azul brilhante de Comassie. Com base nestas dificuldades, algumas estratégias para identificar um maior número de proteínas foram propostas: o pré-fracionamento das amostras, a utilização de tiras com faixas estreitas de pH, além de técnicas de colorações específicas (GÖRG et al., 2000; HERBERT et al., 2001).. A. B. Figura 2. Eletroforese Bidimensional. A: Proteínas separadas por focalização isoelétrica. O gel é colocado horizontalmente, e as proteínas são separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida; B: Gel de poliacrilamida apresentando várias proteínas diferentes (NELSON e COX, 2006).. 11.

(28) 1.2. Esquistossomose mansônica. A esquistossomose é uma doença, também conhecida como bilharzíase devido a Theodore Bilharz, que em 1852 descreveu um parasito intravascular para o qual deu o nome de Distoma haematobia, posteriormente conhecido como Schistosoma (NEVES et al., 1995; HMAMOUCHI et al., 1998). Esquistossomose é conhecida há mais de 3.500 anos sendo causada pela presença do verme Schistosoma mansoni no fígado da pessoa infectada. É endêmica e atinge as regiões tropical e sub-tropical do mundo, afetando pessoas na África, América do Sul e Extremo Oriente (AGRAWAL e SINGH, 1988; SANTOS et al., 2007). De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), no início da década de 90, aproximadamente 200 milhões de pessoas foram infectadas por espécies do Schistosoma (WHO, 1993). A esquistossomose continua sendo uma das infecções parasitárias mais freqüentes (CHITSULO et al., 2000). No Brasil, aproximadamente 8 milhões de pessoas foram infectadas, e a doença é distribuída desde o Belém do Pará ao norte do Paraná, com 2 focos isolados ao sul de Santa Catarina. As principais áreas endêmicas estão localizadas no Nordeste e no estado de Minas Gerais (SANTOS e SANT´ANA, 1999). Com exceção do foco de Fordlândia, Para, não se tem notificação de extinção de outros focos importantes de transmissão no país. A expansão geográfica da doença é preocupante, considerando que no estado com melhores condições, como no Estado de São Paulo, verificou-se nestas últimas décadas um aumento alarmante do número de focos de transmissão (Neves, 2002).. 1.2.1 Ciclo biológico do S.mansoni. O ciclo biolóico do S. mansoni envolve o homem e o caramujo da espécie Biomphalaria glabrata (figura 3). O S. mansoni, ao atingir a fase adulta no sistema vascular do homem e de outros mamíferos, alcança as veias mesentéricas; as fêmeas fazem a postura ao nível da submucosa. Os ovos podem ficar presos à mucosa intestinal ou serem arrastados para o fígado. Os ovos que conseguirem chegar à luz intestinal vão para o exterior junto com o bolo fecal e alcançando a água, liberam o miracídio. O miracídios ao penetrar 12.

(29) em seu molusco vetor (Biomphalaria glabrata), transforma-se em esporocisto I; esse, por poliembrionia, dá 150 a 200 esporocistos II, cada esporocisto dá origem a numerosas larvas denominadas cercárias, através de reprodução assexuada. As primeiras cercárias emergem cerca de um mês após a infecção do caramujo. As cercárias vão para o exterior (água), nadam ativamente e ao alcançarem a pele do homem se fixam, promovem a penetração do corpo cercariano e a concomitante perda da cauda. Após a penetração, as larvas resultantes, denominadas esquistossômulos, migram pelo tecido subcutâneo e, ao penetrarem num vaso, são levadas passivamente da pele até os pulmões. A partir das arteríolas pulmonares, os esquistossômulos chegam ao coração e de lá seguem para diversas partes do corpo até atingirem à rede capilar terminal; aqueles que conseguem chegar ao sistema porta intra-hepático permanecem vivos; os demais ou reiniciam o ciclo ou perecem. Uma vez no sistema porta intra-hepático, os esquistossômulos se alimentam e se desenvolvem e transformam-se em machos e fêmeas 30 dias após a penetração. Daí migram acasalados, para o território da veia mesentérica inferior onde farão ovoposição (NEVES et al., 1995).. Cercária. Hospedeiro vertebrado Verme adulto. AB.glabrata Ovo Miracídeo. Figura 3: Ciclo biológico da esquistossomose mansônica 13.

(30) 1.2.2. Sintomatologia. Na fase aguda da doença pode ocorrer uma disseminação dos ovos principalmente na parede do intestino e fígado, e formação de granulomas. O paciente apresenta mal-estar, febre alta, emagrecimento, fenômenos alérgicos, tosse, diarréia, hepatoesplenomegalia e linfadenomegalia. Pode haver morte do paciente nesta fase ou evolução para esquistossomose crônica (NEVES et al., 1995). A forma crônica apresenta grandes variações clínicas, como por exemplo, alterações predominantemente intestinais, hepatointestinais ou hepatoesplênicas. A maioria dos casos crônicos é benigna, com predominância de alguns granulomas nodulares, dores abdominais, com fases de diarréia mucossanguinolenta e outras de constipação, intercaladas de longos períodos normais. As alterações hepáticas típicas surgem a partir do início da ovoposição e formação de granulomas. Em conseqüência, o quadro evolutivo depende do número de ovos que chega a esse órgão. São comuns aumento do fígado e bastante dor à palpação (NEVES et al., 1995).. 1.2.3. Transmissão e profilaxia. A transmissão da esquistossomose ao homem ocorre através da penetração ativa das cercárias mais freqüentemente nos pés e pernas. O horário em que são encontradas em maior quantidade na água e com maior atividade é entre 10 e 16 h, quando a luz solar e o calor são mais intensos (NEVES et al., 1995). A água é o principal veículo de transmissão. Esta doença encontra-se em expansão devido à situação precária de saneamento básico e ao baixo nível sócio econômico de algumas regiões (PRATA, 1987; NARVAÉZ, 1993). O aumento do número de pessoas infectadas pelo parasito está diretamente relacionado ao contato humano com águas naturais infestadas por cercarias (PRATA, 1987). O controle da esquistossomose pode ser feito de dois modos: direcionado para a morbidade dos infectados pela redução na ocorrência de casos hepatoesplênicos críticos, através do diagnóstico e tratamento cirúrgico dos pacientes ou atuação na profilaxia da doença pela interrupção do ciclo 14.

(31) evolucionário do verme com a destruição de seu hospedeiro intermediário, o caramujo B. glabrata (PRATA, 1987; KATZ, 1997; LARDANS e DISSOUS, 1998).. 1.2.4 Moluscos transmissores. Os moluscos transmissores da esquistossomose pertencem à subclasse Pulmonata,. ordem. Basommatophora,. família. Planorbidae. e. gênero. Biomphalaria. No Brasil, três espécies pertencentes ao gênero Biomphalaria foram encontradas eliminando cercárias em condições naturais: B. glabrata, B. tenagophila e B. straminea. Os caramujos do gênero Biomphalaria são hermafroditas capazes de autofecundação, entretanto, a reprodução cruzada é a preferida (figura 4 A). A partir de 30 dias de idade, o caramujo atinge a maturidade sexual e ovipõe. Os ovos estão presentes em massas gelatinosas (desovas), que podem conter até mais de 100 ovos (figura 4 B). As posturas são realizadas quase que diariamente e as desovas são depositadas em superfícies flutuantes, tais como folhas de plantas e recipientes de plástico, ou submersas no meio aquático. São necessários cerca de sete dias para ocorrer a eclosão dos pequenos caramujos. B. glabrata é a espécie mais susceptível e pode ser infectada com todas as linhagens geográficas do S. mansoni. Um exemplar pode eliminar até 17 mil cercárias por dia.. A. B. Figura 4. Biomphalaria. glabrata. A: Verme adulto; B: Desova. (www.morgenwelt.de/typo3temp/68a9396243.jpg) 15.

(32) 1.2.5. Compostos moluscicidas. A utilização de compostos moluscicidas constitui um meio para controlar a multiplicação e a propagação dos caramujos. Niclosamida é um composto sintético. efetivamente. usado. como. moluscicida. no. controle. da. esquistossomose (PERETT e WHITFIELD,1996). Este composto pode matar B. glabrata adultos a uma concentração menor que 1,5 ppm (partes por milhão) após 2 h de exposição. O principal inconveniente no uso de niclosamida é que sua formulação causa alta mortalidade em organismos não-alvo, como os peixes, nas concentrações utilizadas para matar os caramujos. O alto custo deste produto, junto aos seus efeitos tóxicos e o risco potencial de resistência, tem estimulado fortemente a pesquisa por novos moluscicidas (PERETT e WHITFIELD,1996). Extratos de plantas têm sido avaliados para o controle da população do caramujo com a vantagem de serem menos tóxicos além de poderem ser degradados mais rapidamente que moluscicidas sintéticos (AGRAWAL e SINGH, 1988; SANTOS et al., 2007). Por estas razões a pesquisa por moluscicidas de fontes vegetais foi impulsionada (BILIA et al., 1999; LUNA et al., 2005; KUMAR e SINGH, 2006). Para ser efetivo como moluscicida, o produto deve ter uma alta seletividade ao alvo nocivo (LIMA et al., 2002); o custo também deve ser avaliado. Muitos extratos vegetais de diferentes espécies com atividade contra o caramujo têm sido encontrados e são propostos para o controle do vetor da esquistossomose. A introdução destas plantas ou de suas partes no ambiente aquático requer a investigação precedente dos seus efeitos tóxicos em mamíferos e em outros organismos não-alvo (SANTOS et al., 2007). Sementes e raízes de A. precatorius e sementes de Argemone mexicana mostraram atividade moluscicida contra o caramujo Lymnea acuminata (hospedeiro intermediário) pertencente ao ciclo biológico do parasito Fasciola hepática responsável pela fasciolíase (processo inflamatório crônico do fígado e ductos biliares). Foi sugerido que o efeito moluscicida da semente de A. precatorius pode ser devido à presença da lectina abrina, um heterodímero que consiste de uma cadeia-A e uma cadeia-B. A cadeia-A inibe a síntese protéica pela inativação da subunidade ribossomal e a cadeia-B se liga a receptores de 16.

(33) galactose na superfície celular; sua toxicidade é devida a ligação da cadeia A e B por uma única ponte dissulfeto (FUNATSU et al., 1988; EVENSEN et al., 1991). A ação moluscicida de sementes de A. mexicana é devido à presença de alcalóides (SINGH e SINGH, 1998). Das. folhas. de. Stryphnodendron. adstringens,. Stryphnodendron. poluphylum, Caryocar brasiliensis e Eugenia dysenterica foram obtidos extratos altamente tóxicos ao B. glabrata a 100 ppm (BEZERRA et al., 2002). Extratos de plantas, em clorofórmio e metanol, da família Euphorbiacea (Jatropha glauca, Euphorbia helioscopiane e Euphorbia schimperiana) foram promissores contra Biomphalaria pfeifferi com dose letal para 50 % dos caramujos (DL50) variando de 10 a 100 ppm (AL-ZANBAGI et al., 2000). Extrato de cascas das raízes de Caryopteris x clandonensis apresentou atividade moluscicida contra o caramujo. Bulinus. truncatus,. hospedeiro. intermediário. do. Schistosoma. haematobium, com uma DL100 menor que 4 ppm (HANNEDOUCHE et al., 2002). O fracionamento guiado pela atividade do látex de Euphorbia conspícua mostrou uma Concentração letal de 90 % (CL90) com 4,87 µg/mL contra B. glabrata, uma atividade muito maior que a relatada para extratos de outras espécies de Euphorbia (SANTOS et al., 2007). Ensaios adicionais são necessários para ter uma visão mais detalhada da toxicidade dos compostos utilizados como moluscicidas, levando em consideração a aplicação no ambiente onde se encontram os caramujos, com perspectivas de serem utilizados em larga escala. Extratos de folhas de Licania carii, Licania pittieri, e Licania pyrifolia foram seletivos para caramujos, com nenhuma toxicidade para peixes (BILIA et al., 1999). Extratos aquosos de sementes de Millettia thonningii mostraram atividade moluscicida e cercaricida (SQUIRE e WHITIFIELD, 1989), sendo também efetivo contra a desova do B. glabrata (TANG et al., 1995) e com baixa toxicidade para peixe (PERRETT e WHITFIELD, 1996). O sal de lapachol (2-hidroxil-1,4-naftoquinona), apresentou maior toxicidade para B. glabrata e cercária, que para peixes (Tilapia nilotica) e A. salina, organismos não-alvo (LIMA et al., 2002).. 17.

(34) 1.2.6. Cercária. O S. mansoni na fase cercária apresenta-se dividida em duas partes corpo e cauda (figura 5), medindo cerca de 500 µm no total. O corpo apresenta-se com cutícula recoberta de pequenos espinhos e com duas ventosas: oral (anterior) e ventral (posterior). No seu interior encontra-se um esboço do tubo digestivo e as glândulas cefállicas de adesão e de penetração. O corpo cercariano mede 190 por 70 µm e a cauda mede cerca de 230 por 50 µm e termina em uma bifurcação (NEVES et al., 2002). A formação cercariana inicia-se com a disposição das células germinativas em uma mórula. As células externas da mórula vão originar as duas camadas celulares da cercaria, constituídas de fibras longitudinais e circulares. Ao mesmo tempo observa-se a formação de um cutícula acelular, bem como das duas ventosas (NEVES et al., 2002).. Cabeça Cauda. Figura 5. Cercária www.biology.unm.edu/.../pi/SchistoEvolHistory.htm. 1.3. Artemia salina. Para avaliação da toxicidade de compostos ou extratos de plantas é utilizada a larva de camarão de água salgada, Artemia salina. Através de sua sensibilidade a A. salina indica os compostos com menor toxicidade e, portanto, menos nocivos a organismos não-alvo. As substâncias, assim previamente selecionadas podem ser utilizadas em ensaios futuros utilizando. 18.

(35) vertebrados como, por exemplo, peixes (CALDWELL et al., 2003; FAVILLA et al., 2006). A A. salina possui de 8 a 10 mm de comprimento, pertence à classe Brachiopoda, subclasse Sasostraca e ordem Anostraca (figura 6). Nada sempre de dorso, com o ventre para cima, para a luz ou claridade do ambiente em que se encontra (telotaxia ventral) e em direção à luz (orientação fotopositiva). Reproduz-se com bastante facilidade e rapidez. Seus ovos, quando secos, podem ser conservados durante 10 anos, estando sempre aptos a eclodirem, desde que sejam colocados em água. O camarão de água salgada é um dos melhores alimentos para alevinos e peixes novos, pois é muito rico em proteínas, sendo freqüentemente cultivado para este fim. Este crustáceo pode tolerar salinidades que variam dos 10% de sal da água marinha ao ponto de saturação para o cloreto de sódio. A pressão osmótica interna só varia ligeiramente com as condições externas. A regulação iônica é mantida pela absorção ou excreção dos sais através das brânquias (BARNES e RUPPERT, 1996).. Figura 6. Artemia salina www.geocities.com/.../Crustaceos/artemia.html. A. salina é um invertebrado de grande importância na indústria de aqüicultura e tem sido usado, como teste alternativo para determinar a toxicidade de produtos químicos e naturais (MCLAUGHIIN et al., 1991; BARAHONA e SÁNCHEZ-FÓRTUN, 1996; PARRA et al., 2001). O método é rápido, simples e barato e, sendo ideal para a seleção inicial de um grande 19.

(36) número de amostras, detectando simultaneamente toxicidade e fototoxicidade, sendo utilizado como prognóstico para atividade antitumoral e pesticida (SÁNCHEZ et al., 1993; OJALA et al., 1999). A toxicidade de vários tipos de saponinas foi testada contra a Artemia, e a maioria delas não foi tóxica para o crustáceo em concentrações suficientemente altas (ZHAO et al., 1999). Estudos comparativos dos efeitos de microcistinas e nodularina em A. Salina mostraram que estas toxinas elevaram os níveis de glutation S-transferase para testes in vivo (BEATTIE et al., 2003). Um levantamento utilizando vinte e um extratos de plantas da Amazônia Venezuelana foi efetuado e observou-se que dezessete apresentaram toxicidade significante contra A. salina (JIMÉNEZ et al., 2001). A. salina em três estágios de idades (24, 48 e 72 h) foram utilizadas para testar a toxicidade de inseticidas organofosfóricos (IOF). Em geral, as com 24 h foram menos sensíveis para IOF que as com 48 h; estas foram significativamente mais tolerantes que àquelas com 72 h (SÁNCHEZ-FORTÚN et al., 1996).. 1.4. Atividade antitumoral. 1.4.1. Câncer. O câncer resulta de alterações genéticas especificas nas células. Os tipos de mudanças genéticas que podem dar origem a malignidade incluem a geração de proteínas e seqüências reguladoras alteradas, a perda de sinais de degradação, rearranjos cromossômicos, a inserção de um vírus em um cromossomo, a ativação ou inativação inapropriada de enzimas de modificação da cromatina e a perda ou inativação de genes supressores tumorais. As mutações que causam alterações nestes genes muitas vezes são geradas a partir da ação de carcinógenos sobre o DNA celular (VOET, 2006). A cada ano, nos Estados Unidos, mais de 1 milhão de indivíduos descobrem que são portadores de algum tipo de câncer. Muitos desses tumores podem ser curados. Contudo, de acordo com as estimativas da “American Cancer Society”, o câncer causou aproximadamente 564.000 mortes em 1998, sendo responsável por cerca de 20 % de todas as mortes (ROBBINS et al., 2000). 20.

(37) Tabela 2. Variações entre países quanto à incidência de alguns cânceres comuns. Local de origem do câncer Pulmão Mama Próstata Cérvix do útero Estômago. Populações com alta incidência. Local Estados Unidos (Nova Orlens, negros) Havaí (havaianas) Estados Unidos (Atlanta, negros) Brasil (Recife) Japão (Nagasaki). Fígado. China (Shangai). Cólon. Estados Unidos (Connecticut, brancos) Austrália (Queensland) Hong Kong. Melanoma Nasofaringe Esôfago Bexiga Útero. Ovário Reto. Laringe Pâncreas Lábio Rim Cavidade bucal Leucemia Testículos. Incidência* 110 94 91 83 82 34 34 31 30. França (Calvados). 30. Suíça (Basiléia) Estados Unidos (região da Baía de São Francisco, brancas) Nova Zelândia (ilhéus da Polinésia) Israel nascidos na Europa e nos Estados Unidos) Brasil (São Paulo). 28. Populações com baixa incidência Local Índia (Madras). Incidência* 5,8. Israel (não judeus) China (Tianyin). 14 1,3. Israel (não judeus) Kuwait (kuwaitianos) Canadá (Nova Escócia Índia (Madras). 3,0 3,7. Japão (Osaka) Reino Unido (Sudoeste) România (região urbana de Cluj) Índia (Nagpur) Índia (Nagpur). 0,2 0,3. Kuwait (kuwaitianos) Kuwait (kuwaitianos). 3,3. Japão (área rural de Miyagi) Índia (Poona). 2,1. Japão (Osaka). 0,1. Índia (Poona) Índia (Poona) Índia (Nagpur) China (Tianyin). 0,7 0,4 2,2 0,6. 0,7 1,8. 1,1 1,7 1,2. 26 26 23 18. Estados Unidos (Los Angeles, coreanos) Canadá (Newfoundland) Canadá (NWT e Yukon) França (Baixo Reno) Canadá (Ontário) Suíça (Vaud, urbano). 16 15 15 14 12 10. 3. 1,5. *Incidência = número de casos novos por ano por população de 100.000 habitantes, corrigido para a padronização da distribuição da faixa etária da população (de modo a eliminar os efeitos devidos meramente a diferenças na distribuição da idade da população). Os dados de câncer de mama, de cérvix do útero e de ovário são para mulheres, os demais são para homens. (adaptado de V.T. DeVita, S. Hellman e S.A.Rosemberg (ed), Câncer: Priciples and Practice of Oncology, 4ª ed., Filadélfia: Lippnicott, 1993; baseado em C. Muir et al., Câncer Incidence in Five Continents, vol. 5. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 1987).. Adaptado de (ALBERTS, 2004).. 21.

(38) Existem evidências de que alguns fatores ambientais e não fatores genéticos são responsáveis pelo aparecimento do câncer em determinadas populações. Para praticamente todo câncer muito comum em um país, existe um outro país onde esta incidência é muito menor (tabela 2). Este fato foi constatado quando populações de migrantes têm a tendência a adotarem o padrão de incidência de câncer característico do novo país (ALBERTS, 2004), como por exemplo, o ocorrido com os imigrantes japoneses nos Estados Unidos, a mortalidade por câncer para a primeira geração de imigrantes são intermediárias entre as de nativos do Japão e nativos da Califórnia (ROBBINS et al., 2000).. 1.4.1.1. Câncer no Brasil. Foi estimada para 2006 uma ocorrência de 472 mil casos novos de câncer no Brasil – ou 355 mil, se excluídos os casos de tumores de pele nãomelanoma – o que corresponde a quase 2 casos novos por ano para cada 1.000 habitantes. Os cânceres mais incidentes, à exceção do de pele nãomelanoma, são os de próstata, pulmão e estômago no sexo masculino (figura 7); mama, colo do útero e intestino no sexo feminino (INCA,2007).. Figura 7. Taxa de mortalidade masculina por câncer no Brasil (INCA, 2006).. 22.

(39) Estudos mostram que os tipos de câncer variam de região para região. Entre as capitais brasileiras, o câncer de mama aparece mais em São Paulo, onde alguns fatores de risco são comuns. Muitas mulheres ou não tem filhos ou só têm após os 30 anos de idade. E consomem mais álcool do que em outras cidades. O câncer de pulmão tem maior incidência em Porto Alegre, por causa do tabagismo. Recife, São Luís e Belém são as capitais que mais registram câncer de pênis, por causa das más condições de higiene (INCA,2007).. 1.4.1.2. Câncer de Próstata. No adulto normal, a próstata pesa cerca de 20 g e é um órgão retroperitoneal que circunda o colo da bexiga e uretra (ROBBINS et al., 2000). Foi estimada a ocorrência de 47.280 casos deste tipo de câncer no Brasil em 2006 (INCA, 2007). A incidência de câncer de próstata latente é ainda mais alta. Aumenta de 20 % em homens na sexta década de vida para aproximadamente 70 % em homens entre 70 e 80 anos de idade (ROBBINS et al., 2000). Sabe-se pouco sobre as causas do câncer de próstata. Suspeita-se que vários fatores de risco, como a idade, raça, história familiar, níveis hormonais e influências ambientais, estão implicados (ROBBINS et al., 2000). Assim como em outros cânceres, a idade é um fator de risco importante principalmente neste tipo de câncer, ganhando um significado especial, uma vez que tanto a incidência como a mortalidade aumentaram exponencialmente após 50 anos de idade. Os principais sintomas são: o hábito de levantar várias vezes à noite para urinar com dificuldades e dor. O diagnóstico é realizado pelo exame clínico (toque retal) e pela dosagem do antígeno prostático específico (PSA), que podem sugerir a existência da doença e indicarem a realização de ultrasonografia pélvica (ou prostática transretal). Esta ultra-sonografia, por sua vez, poderá mostrar a necessidade de se realizar a biopsia prostática transretal. O tratamento depende do estágio do quadro clínico que o indivíduo se encontra. Para doença localizada, cirurgia, radioterapia e acompanhamento constante podem ser indicados. Para doença localmente avançada, radioterapia ou cirurgia em combinação com o tratamento hormonal têm sido frequentemente. 23.

(40) utilizados. Em caso de doença metastática, o tratamento de escolha geralmente é hormonioterapia (INCA, 2007).. 1.4.2. Morte Celular. A morte celular é a perda irreversível da estrutura e funções vitais da célula que ocorre por dois processos morfologicamente distintos: necrose e apoptose (PAROLIN e REASON, 2001). Necrose se caracteriza tanto pela perda da integridade da membrana plasmática quanto pela alteração de sua permeabilidade. Neste processo de necrose ocorre a liberação dos constituintes intracelulares para o meio extracelular estimulando a resposta inflamatória e ampliando a lesão tecidual. Este fenômeno é facilmente reconhecido em material de biopsia porque os restos celulares permanecem por longo período antes de serem removidos pelas células inflamatórias (PATEL, 2000). O número de células nos organismos multicelulares é regulado tanto pelo controle de taxa de divisão celular como também pelo controle de morte celular. Esta morte celular programada é denominada de apoptose (ALBERTS, 2004). Apoptose é um processo ativo que tem como principal característica a autodigestão controlada dos constituintes celulares, devido a ativação de proteases endógenas que comprometem a integridade do citoesqueleto. Este é um processo bem definido no qual as células encolhem, formam vesículas na sua superfície e a cromatina nuclear se apresenta dispersa (STELLER, 1995). Os restos celulares serão fagocitados pelos macrófagos teciduais ou células adjacentes. A apoptose pode ser deflagrada por estímulos externos ou por estímulos internos. Essas diferentes vias culminam com a ativação de protesases conhecidas como caspases, as quais têm um papel fundamental no processo de morte celular. O homem expressa onze caspases (cysteine-aspartic-acid-proteases. = caspase), seis das quais participam da apoptose. Caspases são cisteínoproteases (“C”), ou seja, têm no centro ativo resíduos de cisteína. São sintetizadas sob a forma de precursores que necessitam ser clivados ao nível de resíduos contíguos de ácido aspártico para adquirirem atividade proteolítica (VOET, 2006). 24.

(41) As caspases são sintetizadas nas células como precursores inativos, ou procaspases, os quais são normalmente ativados pela clivagem do ácido aspártico por outras caspases. Uma vez ativada, as caspases clivam e então ativam outras procaspases, resultando em uma cascata de amplificação proteolítica. De acordo com VOET (2006) a cascata de caspase não é somente destrutiva e auto-estimulada como também irreversível. Há duas classes de caspases apoptóticas: as caspases iniciadoras (caspases 8, 9, e 10) e as caspases efetoras (caspases 3, 6 e 7). A ativação da procaspase pode ser desencadeada de fora da célula por ativação dos receptores da morte na superfície da célula (Alberts, 2004). Na rota extrínseca (figura 8A), uma proteína transmembrana de passagem única, membro da família do fator de necrose tumoral (TNF, de tumor necrosis factor), chamada de ligante de Fas (FasL), se projeta a partir da membrana plasmática da célula indutora da morte para ligar-se a uma proteína transmemembrana de passagem única, conhecida como Fas (alternativamente, CD 95 e APO 1) que se projeta a partir da membrana da célula apoptótica. A ligação de FAS com FASL desencadeia a rota extrínseca da apoptose (figura 8A) através do recrutamento dos adaptadores de proteínas intracelulares que ligam e agregam moléculas procaspase-8, estas ativam as moléculas de caspase-8 que consequentemente ativam as próximas caspases até as caspases efetoras (ex: caspase-3), para induzirem apoptose (ALBERTS, 2004; VOET, 2006). Na rota intrínseca (figura 8B) ocorre uma variedade de estímulos por sinais de estresse intracelular, tais como lesão do DNA, alterações nas vias metabólicas (aumento do cálcio intracelular, redução do pH, estresse oxidativo) os quais fazem com que a mitocôndria libere citocromo c. Esse processo é ativado por membros pro-apoptóticos da família Bcl-2, como Bid (proteína proapoptótica). O citocromo c liberado liga-se ao fator ativador da apoptose 1 (Apaf-1 ou faa-1), que irá ativar a procaspase-9 e esta ativa as caspases iniciadoras até gerar as caspases efetoras que catalisam clivagens proteolíticas e resultam em apoptose (VOET, 2006).. 25.

(42) (A). (B). ROTA EXTRÍNSECA. Célula indutora. ROTA INTRÍNSECA. da morte. Ligante FasL, TNF. Sinais de estresse intracelular Proteínas pro-apoptóticas (bid). Receptores da morte (Fas). MITOCÔNDRIA Procaspase- 8. + ATP Citocromo-c Faa-1. Caspase-8 Proteínas pro-apoptóticas (bid). Procaspase-9. Caspases iniciadoras. Caspases efetoras (3,6,7) Célula apoptótica. Apoptose. Figura 8. A: Indução de apoptose pela via de receptores da morte; B: Indução de apoptose por disfunção mitocondrial. (Adaptado de KAPLOWITZ, 2000).. 1.4.2.1 Células LNCaP e de Walker 256. As células LNCaP (figura 9) foram isoladas pela primeira vez por Horoszewicz em 1977, a partir de um material de biopsia de linfonodo supra clavicular de um homem caucasiano de 50 anos com diagnóstico confirmado de carcinoma metastásico prostático (HOROSZEWICZ, et al.,1983). O tumor de Walker foi observado pela primeira vez por George Walker em 1928, na região da glândula mamária de rata albina grávida. O exame histopatológico revelou adenocarcinoma. É uma neoplasia que através de passagens sucessivas em animais de laboratório, são identificadas três variantes histopatológicas do tumor: carcinoma, carcinosarcoma e sarcoma. O tumor é facilmente transplantável, ou seja, uma vez inoculado no animal a 26.

(43) probabilidade deste desenvolver o tumor é de até 100 %. A forma ascítica do tumor apresenta evolução rápida, com alta taxa de mortalidade entre 7 e 10 dias após implante. Quanto à forma muscular, o tempo médio de sobrevida varia de 25 a 30 dias (STEWART et al, 1959; IWAMA et al, 1971). As células do tumor de Walker têm sido bastante usadas no estudo fisiopatológico do câncer. Duas variantes desse tumor têm sido relatadas, variante A e B (GUAITANI et al., 1982). Quando inoculada subcutaneamente a variante A produz um tumor sólido, invasivo, altamente metastásico que causa severos efeitos sistêmicos e morte. É sabido que as variantes tumorais podem ser obtidas por sucessivas passagens através do meio original (TANNOCK, 1983; CAVALCANTI et al., 2003). Depois de 60 sucessivas passagens via intraperitonial foi obtida uma variante menos agressiva chamada de Walker AR proveniente da Walker A, e em 70-80% das regressões tumorais são acompanhadas do desenvolvimento da imunidade contra ambas as variantes A e AR (CAVALCANTI et al., 2003).. Figura 9. Células Tumorais. A: LNCaP, B: Walker 256. 1.4.3. Produção de Espécie Reativa de Oxigênio (EROs). A formação das espécies reativas de oxigênio (EROs) foi inicialmente demonstrada por McCord e Fridovich (1968), que estudaram a formação do radical ânion superóxido (O2.-) pela enzima xantina oxidase. Posteriormente, estes mesmos autores observaram, ainda, que as EROs são causadoras de danos oxidativos aos tecidos em organismos vivos e que certos antioxidantes. 27.