UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA MESTRADO EM CLÍNICA INTEGRADA
EFEITOS DO TRATAMENTO COM CLORIDRATO DE FLUOXETINA NA MANDÍBULA DA PROLE DE RATAS TRATADAS DURANTE A GESTAÇÃO E
LACTAÇÃO
Priscylla Gonçalves Correia
Catalogação na Publicação Bibliotecária: Mônica Uchôa, CRB4-1010
C824e Correia, Priscylla Gonçalves.
Efeitos do tratamento com Cloridrato de Fluoxetina na mandíbula da prole de ratas tratadas durante a gestação e lactação / Priscylla Gonçalves Correia. – Recife: O autor, 2013.
59 f.: il.; tab.; 30 cm.
Orientadora: Liriane Baratella Evêncio.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco, CCS. Programa de Pós-Graduação em Odontologia, 2013.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Fluoxetina. 2. Serotonina. 3. Antidepressivos. 4. Mandíbula. 5. Osso. I. Evêncio, Liriane Baratella (Orientadora). II. Título.
615.3 CDD (23.ed.) UFPE (CCS2013-042)
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA MESTRADO EM CLÍNICA INTEGRADA
EFEITOS DO TRATAMENTO COM CLORIDRATO DE FLUOXETINA NA MANDÍBULA DA PROLE DE RATAS TRATADAS DURANTE A GESTAÇÃO E
LACTAÇÃO
PRISCYLLA GONÇALVES CORREIA
Dissertação apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Odontologia como requisito para obtenção do grau de Mestre em Odontologia com área de concentração em Clínica Integrada do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco.
Orientador (a): Profª. Drª Liriane Baratella Evêncio Co – Orientador: Prof. Dr. Danyel Elias Cruz Perez
Recife –PE 2013
2013 Ata da 132ª Defesa de Dissertação do Curso de Mestrado em Odontologia com área de Concentração em Clínica Integrada do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco. Recife, 26 de fevereiro de 2013.
Às 14hs (quatorze horas) do dia 26 (vinte e seis) do mês de fevereiro do ano de dois mil e treze, reuniram-se no auditório da Pós-Graduação em Odontologia do Centro de Ciências da Sáude da Universidade Federal de Pernambuco, os membros da Banca Examinadora, composta pelos professores: Profa. Dra. ALESSANDRA DE ALBUQUERQUE TAVARES CARVALHO, atuando como presidente, Prof. Dr. FÁBIO DE SOUZA MENDONÇA, atuando como primeiro examinador, Profa. Dra. JULIANA PINTO DE MEDEIROS, atuando como segundo examinador, para julgar o trabalho intitulado “EFEITO
DO TRATAMENTO COM CLORIDRATO DE FLUOXETINA NA MANDÍBULA DE RATAS TRATADAS DURANTE A GESTAÇÃO E LACTAÇÃO” da CD. PRISCYLLA GONÇALVES
CORREIA, candidata ao Grau de Mestre em Odontologia, na Área de Concentração em CLINICA INTEGRADA, sob orientação do Profa. Dra. LIRIANE BARATELLA EVENCIO, Co-orientador, Prof. Dr. DANYEL ELIAS DA CRUZ PEREZ. Dando inicio aos trabalhos o Profa. Dra. ALESSANDRA DE ALBUQUERQUE TAVARES CARVALHO, membro permanente do Programa de Pós-Graduação em Odontologia abriu os trabalhos convidando os senhores membros para compor a Banca Examinadora, foram entregues aos presentes cópias das Normas do Curso de Mestrado em Odontologia, que trata dos critérios de avaliação para julgamento da Dissertação de Mestrado. A presidente da mesa após tomar posse conferiu os membros, seguindo convidou a candidata para expor sobre o aludido tema, tendo sido concedido trinta minutos. A candidata expôs o trabalho e em seguida colocou-se à disposição dos Examinadores para arguição. Após o término da arguição os examinadores reuniram-se em secreto para deliberações formais. Ao término da discussão, atribuíram a candidata os seguintes conceitos: Prof. Dr. FÁBIO DE SOUZA MENDONÇA, (APROVADA), Profa. Dra. JULIANA PINTO DE MEDEIROS, (APROVADA), Profa. Dra. ALESSANDRA DE ALBUQUERQUE TAVARES CARVALHO,
(APROVADA), a candidata recebeu três conceitos(APROVADA) é considerada (APROVADA),
devendo acatar as sugestões da Banca Examinadora, face a aprovação, fica a candidata, apta a receber o Grau de Mestre em Odontologia desde que tenha cumprido as exigências estabelecidas de acordo com o Regimento Interno do Curso, cabendo a Universidade Federal de Pernambuco através de sua Pró-Reitoria para Assuntos de Pesquisa e Pós Graduação, tomar as providências cabíveis. Nada mais havendo a tratar, A Presidente da Banca Examinadora encerrou a sessão e para constar foi lavrada a presente ata que vai por mim assinada , Oziclere Sena de Araújo e pelos demais componentes da Banca Examinadora e pela recém formada mestre pela UFPE, PRISCYLLA GONÇALVES CORREIA .
Recife, 26 de fevereiro de 2013 Profa. Dra. ALESSANDRA DE ALBUQUERQUE TAVARES CARVALHO Presidente
Prof. Dr. FÁBIO DE SOUZA MENDONÇA Orientador: 1º Examinador
Prof.Dr. JULIANA PINTO DE MEDEIROS Mestrando: 2º Examinador
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO REITOR
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado VICE-REITOR
Prof. Dr. Sílvio Romero Marques
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Prof. Dr. Francisco de Sousa Ramos
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DIRETOR
Prof. Dr. Nicodemos Teles de Pontes Filho
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA Profa. Dra. Jurema Freire Lisboa de Castro
COLEGIADO
Profª. Drª. Alessandra Albuquerque Tavares de Carvalho Prof. Dr. Anderson Stevens Leônidas Gomes
Prof. Dr. Arnaldo de França Caldas Júnior Prof. Dr. Carlos Menezes Aguiar Prof. Dr. Cláudio Heliomar Vicente da Silva
Prof. Dr. Danyel Elias da Cruz Perez Prof. Dr. Edvaldo Rodrigues de Almeida Profª. Drª. Flavia Maria de Moraes Ramos Perez
Prof. Dr. Geraldo Bosco Lindoso Couto Prof. Dr. Jair Carneiro Leão
Profª. Drª. Jurema Freire Lisboa de Castro Profª. Drª. Lúcia Carneiro de Souza Beatrice
Profª. Drª. Liriane Baratella Evêncio Prof. Dr. Luiz Alcino Monteiro Gueiros Profª. Drª. Maria Luiza dos Anjos Pontual
Prof. Dr. Paulo Sávio Angreira Goes Profª. Drª. Renata Cimões Jovino Silveira
Profª. Drª. Silvia Regina Jamelli SECRETARIA
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a todos que torceram por mim e que de alguma forma participaram. Mas, dedico em especial a minha vozinha, Dona Marcimina, que torceu muito por este momento, mas foi morar com Deus pouco antes da concretização desta etapa.
AGRADECIMENTOS
Meus sinceros agradecimentos, À Deus, por guiar meus passos;
À Universidade Federal de Pernambuco na pessoa do Reitor Anísio Brasileiro de Freitas Dourado;
Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal de Pernambuco, na pessoa da Profª. Drª. Jurema Freire Lisboa de Castro;
À minha orientadora, Profª. Drª. Liriane Baratela Evêncio, por todos esses anos de dedicação de ensinamentos científicos e lições de vida a mim prestados. Obrigada por tudo, Liri;
Ao Prof. Dr. Joaquim Evêncio Neto, pela participação;
À Profª. Drª. Flávia Ramos Perez, que generosamente participou ativamente conosco em todas as etapas do projeto;
Ao Prof. Dr. Danyel Perez, pela co-orientação e por ter gentilmente cedido o laboratório de patologia para realização de parte da pesquisa;
Às minhas amigas Luciana Regueira e Isabela Santiago. Sem elas não daria tão certo; À Profª. Drª. Luciana Maia, pela colaboração;
Ao Prof. Dr. Mário Ribeiro de Melo Júnior por ter cedido gentilmente o laboratório de histotecnologia do Programa de Pós-Graduação em Patologia da UFPE;
À veterinária Adriana Fontes;
Ao Prof. Dr. Marcelo Reis, por ter gentilmente cedido o microscópio petrográfico polarizado;
Á Profª. Drª. Belmira Lara Silveira Andrade da Costa, por ter nos ensinado a perfusão intracardíaca;
Ao doutorando Antônio Gomes; À histotécnica Silvânia Paz; À seu Paulo por toda ajuda;
Ao Sr. Hélio Murillo Duarte Oliveira;
Aos amigos e Mestres em farmácia Alexandre Couto e Luise Lopes pela ajuda na parte farmacológica;
Aos alunos de iniciação científica Priscila Suellen Oliveira Carvalho da Silva e Carlos Enrique de Holanda;
Aos meus amigos do mestrado;
Aos meus pais, Josere e Rubênia, que são meus verdadeiros mestres;
À minha irmã, Pollyanna, e aos meus sobrinhos, Marília e Murilo, pela paciência quanto a minha ausência;
Ao meu namorado, Dário Marcelos, pelos finais de semana no biotério comigo e por toda paciência com meu estresse;
Aos meus amigos, a quem peço também desculpa pela ausência;
E a todos que contribuíram na minha formação e que me proporcionaram o privilégio de me tornar mestre;
EPÍGRAFE
Não deixe que a saudade sufoque, que a rotina acomode, que o medo impeça de tentar. Desconfie do destino e acredite em você. Gaste mais horas realizando que sonhando, fazendo que planejando, vivendo que esperando, porque embora quem quase morre esteja vivo, quem quase vive já morreu.
RESUMO DA DISSERTAÇÃO
Os Inibidores Seletivos da Recaptação da Serotonina (ISRS) podem interferir na formação de estruturas craniofaciais por bloquear a ação da serotonina nos sítios de captação. Estudos sobre ação da fluoxetina no osso têm sido desenvolvidos, mas, pouco se sabe da repercussão deste fármaco no desenvolvimento mandibular. METODOLOGIA: Foram utilizados 24 filhotes de ratas Wistar tratadas durante a gestação e durante a gestação e lactação, divididos em 4 grupos: CG - Controle da gestação; CL - Controle da gestação e lactação, ambos com solução de Cloreto de Sódio 0,9% na dose 10μl/g de peso animal (v.o); FG - Tratado com fluoxetina durante a gestação e FL - Tratado durante a gestação e lactação, ambos com fluoxetina na dose de 20mg/kg de peso animal (v.o). Aos 25 dias de vida após anestesia com xilazina a 20mg/Kg de peso animal (i.m.) e quetamina a 50mg/Kg de peso animal (i.m.), os animais foram perfundidos por via intracardíaca. As hemi-mandíbulas direitas foram removidas e fixadas no mesmo fixador por 24 horas a temperatura ambiente. Os espécimes foram submetidos à radiografia digital, processados convencionalmente para parafina e corados pela Hematoxilina e Eosina, Tricrômico de Masson e Picrosirius Red. Análises radiopacidade radiográfica, histológica, histométrica e microscopia de polarização foram realizadas. Os dados obtidos foram submetidos ao teste de Mann-Whitney com índice de significância de 5%. RESULTADOS: Houve diferença significativa comparando o CL com o FL tanto na histometria quanto na radiopacidade radiográfica, revelando respectivamente uma redução na espessura da cortical óssea inferior, redução no número de osteócitos, redução na radiopacidade óssea, com consequente redução na densidade óssea. Ocorreu também redução no número de osteoblastos do FG. CONCLUSÃO: A fluoxetina diminui a produção de osteócitos e diminui a radiopacidade óssea, com consequente diminuição da densidade óssea nos animais tratados com o fármaco a longo prazo. Mostrando que o uso prolongado da fluoxetina por ratas prenhes e lactantes altera a massa óssea mandibular.
ABSTRACT
The serotonin selective reuptake inhibitors (SSRIs) can interfere on craniofacial development due to the block the serotonin role on sites of absorption. Studies about the effect of fluoxetine on bone tissue have been published, but little is known on the impact of this drug in mandibular development. Methodology: Were used 24 pups of Wistar rats treated with during pregnancy and breastfeeding with fluoxetine. The animals were distributed into 4 groups: CG – pregnancy control group; CL – pregnancy and breastfeeding control group; both treated with sodium chloride solution 0,9% in the dosis of 10μl/g of animal weight (oral); FG – Treated with fluoxetine during pregnancy and FL – Treated with fluoxetine during pregnancy and lactation, both with fluoxetine at a dose of 20mg/kg body weight (oral). At 25 days of life, after anesthesia with xylazine (20mg/Kg) and ketamine (50mg/Kg), the pups were perfused by intracardiac pathway. The rights hemi mandibles were removed and fixed on the same fixer for 24 hours at ambient temperature. The specimens were submitted to the digital radiography, processed for paraffin inclusion and stained for hematoxilin and eosin, Masson trichrome and picrosirius red. Radiopacity radiograph, histological, histometric and polarization analyzes were executed. The data were submitted to the Mann-Whitney test with significance index of 5%. Results: There was significantly difference on the comparison between CL an FL group on the histometric and radiopacity analyzes, revealing a thickness reduction on lower cortical bone, decrease on osteocytes number and decrease of bone radiopacity and density. The number of osteoblasts were significantly lower on FG group. Conclusion: Fluoxetine decreases the development of osteocytes and decreases bone radiopacity with consequent reduction of bone density in the animals treated with fluoxetine for long term. The administration of fluoxetine in pregnant and breastfeeding rats alters the mandible bone mass.
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1. Fotomicrografias do corpo mandibular na região do diastema direito de ratos com 25 dias de vida dos grupos CPG e FG. As imagens A e B mostram a espessura total da mandíbula; as imagens C e D mostram a extensão da cortical superior e as imagens E e F, a extensão da cortical inferior nos grupos CPG e FG respectivamente. CS = cortical superior, CI = cortical inferior, OB = osteoblastos, O = osteócitos, V = vasos sanguíneos, TM = tecido medular hematopoiético. Col. HE...38
Figura 2. Fotomicrografias do corpo mandibular na região do diastema direito de ratos com 25 dias de vida dos grupos CPL e FL. As imagens A e B mostram a espessura total da mandíbula; as imagens C e D mostram a extensão da cortical superior e as imagens E e F, a extensão da cortical inferior nos grupos CPL e FL respectivamente. CS = cortical superior, CI = cortical inferior, OB = osteoblastos, O = osteócitos, V = vasos sanguíneos, TM = tecido medular hematopoiético. Col. HE...39
Figura 3. Fotomicrografias do corpo mandibular na região do diastema direito de ratos com 25 dias de vida. As imagens A, C, E e G mostram a extensão da cortical superior nos grupos CPG, CPL, FG e FL respectivamente e as imagens B, D, F e H, a extensão da cortical inferior nos grupos CPG, CPL, FG e FL respectivamente. (*) Áreas com menor quantidade de fibras maduras de colágeno. Col. Tricrômico de Masson...40
Figura 4. Fotomicrografias do corpo mandibular na região do diastema de ratos com 25 dias de vida CPG e FG. As imagens A e C mostram o colágeno da cortical superior; as imagens E e G mostram o colágeno da cortical inferior; as imagens B e D mostram o colágeno da cortical superior e as imagens F e H, o colágeno da cortical superior através da microscopia de polarização nos grupos CPG e FG respectivamente. (*) Áreas com maior quantidade de fibras de colágeno tipo III. (SETA) Áreas com maior quantidade de fibras de colágeno tipo I...41
Figura 5. Fotomicrografias do corpo mandibular na região do diastema de ratos com 25 dias de vida CPL e FL. As imagens A e C mostram o colágeno da cortical superior; as imagens E e G mostram o colágeno da cortical inferior; as imagens B e D mostram o
colágeno da cortical superior através da microscopia de polarização e as imagens F e H, o colágeno da cortical inferior através da microscopia de polarização nos grupos CPL e FL respectivamente. Coloração Picrosirius Red. (*) Áreas com maior quantidade de fibras de colágeno tipo III. (SETA) Áreas com maior quantidade de fibras de colágeno tipo I...42
Figura 6. Avaliação do valor médio do pixel da região do diastema da hemi-mandíbula direita através do software IMAGE PRO PLUS...43
Tabela 1. Avaliação dos valores médios e do desvio padrão da análise estatística de Mann-Whitney entre os grupos CPG e FG...43
Tabela 2. Avaliação dos valores médios e do desvio padrão da análise estatística de Mann-Whitney entre os grupos CPL e FL...45
Tabela 3. Avaliação dos valores médios da radiopacidade em mmAl (desvio padrão) e da análise estatística de Mann-Whitney entre os grupos CPG e FG e os grupos CPL e FL...46
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA... 13
OBJETIVOS DO TRABALHO ... 19 ARTIGO ORIGINAL ... 20 RESUMO ... 21 INTRODUÇÃO ... 22 MATERIAIS E MÉTODOS ... 24 RESULTADOS ... 28 DISCUSSÃO ... 30 AGRADECIMENTOS... 33 REFERÊNCIAS ... 34 FIGURAS E TABELAS ... 38
LEGENDAS DAS FIGURAS E TABELAS ... 47
CONCLUSÃO ... 49
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA DA INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA ... 50
ANEXOS ... 54
CARTA DO COMITÊ DE ÉTICA ... 55
13 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
Os tecidos da face são compostos de células de todas as três camadas germinativas de origem: ectodérmica, endodérmica e mesenquimal. Como visto no desenvolvimento de vários órgãos, a morfogênese craniofacial depende de interações contínuas e recíprocas tecido a tecido, tendo o desenvolvimento do dente, do palato e da mandíbula como exemplos clássicos. O desenvolvimento mandibular depende da interação entre as células do ectoderma oral e as células mesenquimais derivadas da crista neural presentes no primeiro arco branquial (Chai e Maxson, 2006). As células da crista neural fazem parte de uma população de células migratórias específicas dos vertebrados que se originam da parte dorsal do tubo neural em desenvolvimento. Após a indução, as células da crista neural migram para diferentes regiões do embrião, onde se diferenciam em uma gama de tipos celulares. Na região craniana, participam da formação da maior parte das cartilagens e ossos do crânio, do esqueleto facial e da faringe (Minoux e Rijli, 2010). Essa população de células-tronco surge a partir das bordas dorsais da placa neural, através de uma série de interações com a ectoderme. O mesênquima e o mesoderma derivados das células da crista neural se combinam para formar o mesênquima das saliências faciais (Richman e Lee, 2003).
O início da formação do osso mandibular ocorre no período intra-uterino através do primeiro arco branquial formando os processos mandibulares. Quando formados, os processos mandibulares sofrem ossificação intramembranosa no interior de membranas conjuntivas dando origem ao corpo mandibular (Ramaesh e Bard, 2003). Já o processo coronóide, a sínfise e o côndilo mandibular formam-se por ossificação endocondral. A ossificação inicial da mandíbula começa no mesênquima facial fibroso, ao redor da cartilagem de Meckel e ocorre por aposição óssea (Lee et al., 2001).
Interações recíprocas entre mesênquima e ectoderma derivado do epitélio parecem desempenhar um papel importante em vários aspectos da morfogênese. Essas interações são mediadas pelo neurotransmissor serotonina (5-HT) (Lauder et al., 1988).
A 5-HT é uma monoamina que foi inicialmente chamada de serotonina por ter sido encontrada no soro e por desempenhar ação no tônus vascular. Hoje, esta monoamina é mais apropriadamente chamada de 5-HT, pois este nome reflete sua estrutura química, 5-hidroxitriptamina, e não apenas as circunstâncias da sua descoberta (Warden e Haney, 2008). Ela pode ser obtida por uma variedade de fontes alimentares, além de ser
14 sintetizada endogenamente a partir do triptofano através da ação da enzima triptofano hidroxilase e ácido L-amino aromático descarboxilase, sendo sua síntese realizada pelo monamina oxidase. Pode ser encontrada em três áreas principais do corpo: na parede intestinal (onde aumenta a motilidade), nos vasos sanguíneos (onde causa constricção) e no Sitema Nervoso Central (SNC) (Nebigil et al., 2001). Por sua vez, a 5-HT participa da regulação do humor, sono, atividade sexual, apetite, ritmo circadiano, sensibilidade à dor, atividade motora e as funções neuroendócrinas (Buznikov et al., 2001). Também está implicada da etiologia de várias desordens, incluindo ansiedade, depressão, transtorno obsessivo-compulsivo, esquizofrenia, acidente vascular cerebral, obesidade, dores, hipertensão, doenças vasculares, enxaqueca e náusea tem a ligação com 5-HT (Nebigil et al., 2001).
A importância da 5-HT durante o desenvolvimento ósseo humano é particularmente significativa. Quando produzida perifericamente, atua como um hormônio para inibir a formação óssea. Quando produzida no cérebro, age como um neurotransmissor que exerce um efeito positivo e dominante no acúmulo da massa óssea através do reforço da formação e limitação da reabsorção óssea (Ducy e Karsenty, 2010). Células osteoblásticas expressam tanto um mecanismo responsivo quanto um mecanismo regulatório da absorção de 5-HT e, portanto, representam um sistema funcional de 5-HT no osso (Bliziotes et al., 2001). Além de participar do metabolismo e na mecano-regulação óssea (Westbroek et al., 2001).
Para desempenhar sua função, conta com o auxílio dos seus transportadores e receptores (Busnikov et al., 2001). O transportador de serotonina (5-HTT) foi encontrado e mostrou-se altamente específico para a recaptação de serotonina nas células do osso (osteoblastos e osteoclastos) (Mortazavi et al., 2009). O 5-HTT age como um regulador-chave da sinalização da serotonina. Através da regulação da recaptação de serotonina liberada, o 5-HTT controla a duração e a intensidade da atividade serotoninérgica na sinapse (Holmes et al., 2002).
Existem pelo menos 15 diferentes receptores HT que pertencem a família 5-HT1/5, 5-HT2, 5-HT3 e 5-HT4/6/7. A família de receptores 5-HT2 compreende três subtipos intimamente relacionados, 5-HT2A, 5-HT2B e 5-HT2C. No entanto, esses subtipos são diferentemente expressos em tempo e formam tecidos específicos (Nebigil et al., 2001). De todos os subtipos dos receptores da 5-HT investigados até o momento, pelo menos um representante se expressa no desenvolvimento de estruturas
15 craniofaciais. Os subgrupos mais intensamente estudados são o 5-HT1, 5-HT2 e os receptores 5-HT3. Os receptores 5-HT2 são expressos em vários estágios de desenvolvimento craniofacial, e cada um dos antagonistas seletivos produzem um resultado diferente (Moiseiwitsch, 2000). O receptor 5-HT2B é um dos principais mediadores das funções da 5-HT durante o desenvolvimento. Sua sinalização é suficiente e necessária para modular a forma e funcionalidade de elementos distintos da mandíbula, incluindo a articulação mandibular (Reisoli et al., 2010).
Resultados consistentes para os efeitos ao longo do desenvolvimento craniofacial têm sido visto para o receptor 5-HT3. Isso porque o bloqueio desse receptor inibe o desenvolvimento do primeiro arco branquial e do prosencéfalo na cultura de embriões inteiros (Lauder, 1993). Os efeitos vistos com os antagonistas dos receptores 5-HT3 são provavelmente um reflexo da natureza completamente diferente deste receptor. Todos os receptores 5-HT são conhecidos pelos receptores de proteína-G-ligante com exceção dos receptores 5-HT3, que são ligante-bloqueadores dos canais iônicos (Moiseiwitsch, 2000).
A composição óssea é feita por três tipos celulares e pela matriz extracelular, que se torna mineralizada pela deposição de cálcio hidroxiapatita, dando resistência e força necessária ao osso. Os tipos celulares são: os osteoblastos, os osteoclastos e os osteócitos. Células precursoras originadas da medula óssea dão origem aos osteoblastos e osteoclastos (Manolagas, 2000).
Os osteoblastos são as células responsáveis pela formação óssea e têm um papel muito importante na criação e manutenção da arquitetura do esqueleto, são responsáveis pela deposição de matriz óssea (Caetano-Lopes et al., 2007). A matriz é posteriormente mineralizada sob o controle também destas células. Um dos principais produtos dos osteoblastos é o colágeno tipo I, mas outras proteínas também são sintetizadas e incorporadas a matriz óssea, como a osteocalcina e a osteonectina (Manolagas, 2000).
Os osteoclastos, uma das poucas células multinucleadas do corpo humano, possuem uma capacidade única de reabsorver tecidos mineralizados, como o osso (Everts et al., 2006). A ação desta célula é integrada com os osteoblastos para permitir a remoção e substituição contínua de massa óssea que ocorre ao longo da vida. A renovação celular é feita através de um mecanismo de apoptose (morte celular programada), utilizado pelo organismo para remover as células indesejáveis e atingir um controle preciso da função
16 reabsortiva (Xing e Boyce, 2005). O excesso ou deficiência da função osteoclástica leva a uma série de doenças ósseas, como a osteoporose (Fuller et al., 2010).
Os osteócitos são osteoblastos maduros que ficam aprisionados na matriz óssea mineralizada após diminuírem a síntese da matriz. São células não proliferativas que são terminalmente diferenciadas. Compõem o tipo celular mais comum no tecido ósseo e representam cerca de 90-95% das células do esqueleto adulto (Busse et al., 2010). Investigações têm apontado para mecano-transdução como uma função primária de osteócitos, já que mantêm uma rede extensa e interligada através de vários processos citoplasmáticos dentro dos canalículos e junções funcionais, ideal para um sistema de detecção de tensão ou uma rede de regulação mineral, fazendo a manutenção do osso (Cullinane, 2002). Em resposta a estímulos mecânicos, essas células desempenham um papel-chave na regulação da remodelação óssea, ativando os osteoblastos e osteoclastos (Busse et al., 2010).
Em condições normais, os mecanismos serotoninérgicos apresentam um equilíbrio entre si dentro das células. O rompimento desse equilíbrio com a utilização de medicações, como os antidepressivos Inibidores Seletivas da Recaptação da Serotonina pode interferir com o metabolismo de alguns tecidos, incluindo o ósseo (Mortazavi et al., 2009).
A fluoxetina é um antidepressivo pertecente a classe dos Inibidores Seletivo da Recaptação da Serotonina (ISRS) amplamente utilizado na prática clínica para o tratamento da depressão (De Fátima et al., 2005) e outros transtornos de humor como, por exemplo, a depressão pós-parto (Nomura e Silva, 2007). Os ISRSs inibem de forma potente e seletiva a recaptação de serotonina, resultando em potencialização da neurotransmissão serotonérgica na fenda sináptica (Moreno et al., 1999). Devido à existência dos receptores e transportadores para a 5-HT no osso, acredita-se que a fluoxetina possa interferir na formação óssea (Mortazavi et al., 2009).
A fluoxetina é uma droga largamente prescrita para o tratamento da depressão durante a gravidez por ser um ISRS considerado seguro quando comparado com outra classe de antidepressivos como os tricíclicos. Entretanto, efeitos secundários podem ocorrer (Gupta et al., 1998). A exposição a antidepressivos durante o terceiro trimestre da gravidez foi associada com um risco aumentado de resultados adversos no nascimento, incluindo o nascimento prematuro, desconforto respiratório, e hipoglicemia (Källén, 2004).
17 Exposição infantil de antidepressivos através do leite materno é geralmente baixa. Entretanto, a fluoxetina possui concentração plasmática detectável nos lactentes, em alguns chega até 80% e 30% das concentrações terapêuticas administradas na mãe. Felizmente concentrações acima de 10% são incomuns (Berle and Spigset, 2011).
Estudos in vitro relataram que a fluoxetina pode interferir no período de morfogênese, resultando em um potencial aumentado para reduzir o tamanho dos ossos gnáticos de ratos (Shuey et al., 1992). Warden et al. (2005) relataram que este fármaco pode interferir no desenvolvimento do disco epifisário de camundongos, reduzindo o crescimento ponderal, a massa corporal e a massa femoral em ratos neonatos. Além disso, por inibir a ação dos transportadores de 5-HT, a fluoxetina reduz o acúmulo de osso mineral. O que implica que o 5-HTT tem um papel na regulação do acúmulo de osso no esqueleto em crescimento.
A fluoxetina também é capaz de inibir in vitro a proliferação de osteoblastos de maneira dose-dependente (Gustafsson et al., 2006a). Entretanto, neste estudo não apresentou maiores efeitos na arquitetura anatômica ou nas propriedades mecânicas ósseas das ratas tratadas. Sabe-se também que pode ocorre uma redução evidente na espessura do osso trabecular e na densidade óssea mineral radiológica de ratas sugerindo decréscimo na formação e/ou aumento na reabsorção óssea (Westbroek et al., 2007).
O uso de micro matrizes genéticas, ajudou a descobrir que o transportador de serotonina (5-HTT) é fortemente expresso nos osteoclastos induzidos por RANKL e exibem atividade típica de recaptação da 5-HT que foi inibida por fluoxetina. Esta droga reduz a a diferenciação dos osteoclastos, mas não inibe sua ativação em células maduras (Battaglino et al., 2004).
Estudo em camundongos, utilizando fluoxetina por via subcutânea, na dosagem de 10mg/Kg de peso animal, evidenciou que o fármaco pode causar efeitos deletérios na arquitetura, microarquitetura e biomecânica de fêmures de ratos tratados com fluoxetina, sem evidenciar maiores alterações celulares (Bonnet et al., 2007).
O estudo in vitro de Hodge et al. (2012) mostrou que a fluoxetina inibe a proliferação celular e mineralização óssea pelos osteoblastos bem como a formação dos osteoclastos e reabsorção óssea de forma dose-dependente.
Mais recentemente, foi descoberta uma função anti-inflamatória da fluoxetina no osso. Branco-de-Almeida et al. (2012) mostraram que fluoxetina usada em periodontite
18 induzida por ligadura em ratos provoca uma redução na perda óssea alveolar quando comparado com o grupo controle. Eles sugeriram que o fármaco modula para baixo a geração de PGE2 por suprimir a produção da COX-2, contribuindo assim para a redução da perda óssea alveolar. Sendo a primeira revelação do possível efeito anti-inflamatório da fluoxetina sobre a inflamação óssea alveolar.
Alterações na espessura e na morfologia da margem endosteal do córtex mandibular podem ser utilizadas como ferramentas simples e disponíveis para a detecção radiográfica da redução da densidade mineral óssea, sendo possível a avaliação através da densitometria (Khojastehpour et al., 2011). A avaliação da densidade óssea pode ser realizada em várias situações clínicas. A densitometria pode ser útil no rastreio da osteoporose (Dural et al., 2005), na avaliação do osso previamente à colocação de implante (Aranyarachkul et al., 2005) e para avaliar a terapia medicamentosa envolvendo o osso (Horner et al., 1998). Outra forma de se avaliar a densidade óssea é por meio do estudo da radiopacidade, onde o espécime a ser avaliado será radiografado juntamente com um material de referência, como um controle de qualidade. Por conseguinte, a comparação na radiografia pode ser feita entre a densidade produzida pelo osso e a produzida pelo material de referência, o degrau de alumínio (Nackaerts et al., 2007). Este material de referência é utilizado com segurança porque as propriedades de absorção e de dispersão são semelhantes as do osso (Trouerbach et al., 1984).
19 OBJETIVOS DO TRABALHO
Geral:
Este trabalho teve por objetivo avaliar os aspectos histológicos, histométricos e radiológicos do desenvolvimento do osso mandibular de filhotes de ratas tratadas com fluoxetina durante a gestação e lactação.
Específicos:
Avaliar a densidade óssea mandibular através de radiologia digital nos ratos expostos a droga durante a gestação e gestação e lactação;
Verificar alterações qualitativas na matriz óssea do corpo da mandíbula de filhotes de ratas tratadas com fluoxetina durante a gestação e gestação e lactação;
Analisar histometricamente a organização estrutural do corpo mandibular, a disposição das células, matriz óssea e tecido conjuntivo dentro do diastema mandibular;
Analisar o tipo de colágeno presente no osso mandibular, por meio da birrefringência emitida pelo tecido nas preparações, utilizando um microscópio petrográfico polarizado.
20 ARTIGO ORIGINAL
EFEITOS DO TRATAMENTO COM CLORIDRATO DE FLUOXETINA NA MANDÍBULA DA PROLE DE RATAS
CORREIA, Priscylla Gonçalves
Estudante do mestrado de Odontologia da Universidade Federal de Pernambuco
Endereço: Av. Prof. Moraes Rego, 1235 – Recife - PE 50670-901-
priscyllagcorreia@hotmail.com REGUEIRA, Luciana Silva
Estudante do mestrado de Odontologia da Universidade Federal de Pernambuco
Endereço: Av. Prof. Moraes Rego, 1235 – Recife - PE 50670-901-
regueiraluciana@hotmail.com
SANTIAGO, Isabela Maria de Albuquerque
Estudante do doutorado de Odontologia da Universidade Federal de Pernambuco
Endereço: Av. Prof. Moraes Rego, 1235 – Recife - PE 50670-901-
isabelasantiago1@yahoo.com.br PEREZ, Danyel Elias Cruz
Prof. Dr. Adjunto do Departamento de Prótese e Cirurgia Buco-Maxilofacial – Universidade Federal de Pernambuco
Endereço: Av. Prof. Moraes Rego, 1235 – Recife - PE 50670-901- danyel.perez@ufpe.br
RAMOS-PEREZ, Flavia Maria de Moraes
Profª. Drª. Adjunto do Departamento de Prótese e Cirurgia Buco-Maxilofacial – Universidade Federal de Pernambuco
Endereço: Av. Prof. Moraes Rego, 1235 – Recife - PE 50670-901- flavia.ramosperez@ufpe.br
EVÊNCIO - NETO, Joaquim
Prof. Dr. Adjunto do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal – Universidade Federal de Pernambuco
Endereço: R. dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos – Recife – PE 52171-900
evencioneto@bol.com.br
BARATELLA-EVÊNCIO, Liriane
Profª. Drª. Adjunta do departamento de Histologia e Embriologia - Universidade Federal de Pernambuco
Endereço: Av. Prof. Moraes Rego, 1235 – Recife - PE 50670-901- liriane@uol.com.br
Título curto: EFEITO DA FLUOXETINA NA MANDIBULA DE RATOS
Endereço para correspondência:
Profª. Drª. Liriane Baratella Evêncio
Endereço: Rua Marques de Tamandaré, nº 62, apt 802 – Recife – PE – CEP:52061-170 Fone/Fax: + 81 32655948
21 RESUMO
Estudos sobre ação da fluoxetina no osso têm sido desenvolvidos, entretanto, pouco se sabe sobre sua repercussão no desenvolvimento mandibular. O presente trabalho objetivou verificar se o uso de cloridrato de fluoxetina na gestação e lactação interfere na formação óssea do corpo mandibular na prole de ratas. METODOLOGIA: Foram utilizados 24 filhotes de ratos Wistar divididos em 4 grupos: CG - Controle da gestação; CL - Controle da gestação e lactação, ambos com solução de Cloreto de Sódio 0,9% na dose 10μl/g de peso animal (v.o); FG - Tratado com fluoxetina durante a gestação e FL - Tratado durante a gestação e lactação, ambos com fluoxetina na dose de 20mg/kg de peso animal (v.o). Aos 25 dias de vida após anestesia com xilazina a 20mg/Kg de peso animal e quetamina a 50mg/Kg de peso animal (i.m.), perfusão e decaptação, as mandíbulas foram removidas. Os espécimes foram radiografados, processados convencionalmente para histologia, incluídos em parafina e corados por HE, Tricrômico de Masson e Picrosirius Red. Análises da radiopacidade radiográfica, histológica, histométrica e microscopia de polarização foram realizadas. Os dados estatísticos foram obtidos com índice de significância de 5%. RESULTADOS: Houve diferença significativa comparando o CL com o FL tanto na histometria quanto na radiopacidade, revelando respectivamente uma redução na espessura da cortical inferior, redução no número de osteócitos, com consequente redução na densidade óssea radiográfica. Ocorreu também redução no número de osteoblastos do FG. CONCLUSÃO: A fluoxetina interfere no desenvolvimento mandibular, diminuindo a radiopacidade e a massa óssea a longo prazo.
22 INTRODUÇÃO
A depressão é um problema de saúde com repercussão mundial e é observada com frequência durante a gravidez, sendo até 14,5% das mulheres acometidas pelos sintomas de depressão durante a gestação (Sit et al., 2011) e 10 a 15%, no período pós-parto (Pawluski et al., 2012). Quando desenvolvida na gestação e estendida até o período pós-parto tem efeitos negativos sobre a mãe, a criança, e toda a família (Bener et al., 2012), além de afetar o desenvolvimento cognitivo e emocional da criança (Berle e Spigset, 2011).
O tratamento das gestantes depressivas ou das mães no período pós-parto pode ser realizado com psicoterapia e/ou tratamento farmacológico. No tratamento quimioterápico, a classe de droga mais utilizada é a dos Inibidores Seletivos da Recaptação da Serotonina (ISRS), sendo o Cloridrato de Fluoxetina largamente prescrito (Jimenez-Solem et al., 2012), devido não apenas à sua eficácia, mas também a sua alta tolerância (De Fátima et al., 2005). Estes medicamentos bloqueiam de forma seletiva e potente o transportador e receptores de serotonina no SNC para efetivamente aumentar os níveis extracelulares da serotonina e aliviar os sintomas de depressão (Chau et al., 2012).
A serotonina quando absorvida pela célula através dos seus transportadores, se liga ao citoesqueleto, reduzindo sua motilidade, aumentando assim o tempo de interação tecido a tecido (Moiseiwitsch, 2000). Esse evento marca sua participação na morfogênese das estruturas craniofaciais devido à presença de sítios de captação de 5-HT em estruturas da face (Lauder et al., 1988).
Em condições normais, os mecanismos serotoninérgicos apresentam um equilíbrio entre si. O rompimento desse equilíbrio com a utilização de ISRS pode interferir com o metabolismo de alguns tecidos, incluindo o ósseo (Mortazavi et al., 2009). O bloqueio da 5-HT no sítio de captação por medicações durante a formação óssea pode interferir no desenvolvimento dessas estruturas (Westbroek et al., 2007; Bonnet et al., 2007), visto que embriões de camundongos expostos a ISRS exibiram malformações craniofaciais possivelmente provocadas pelo efeito dessa classe de droga sobre a interação epitélio-mesenquima (Shuey et al., 1992).
23 Na formação óssea, a 5-HT participa devido à presença de seus múltiplos receptores e transportadores que são expressos nos osteoblastos, osteócitos e osteoclastos (Bliziotes et al., 2001; Westbroek et al., 2001; Battaglino et al., 2004). Estas descobertas indicam que as células ósseas possuem vias funcionais tanto para responder a regulação e quanto a absorção de 5-HT (Bliziotes et al., 2010). Este neurotransmissor participa do crescimento e desenvolvimento de diversos tecidos mineralizados (Bliziotes et al., 2006).
A fluoxetina pode atravessar a barreira placentária e ser encontrada no soro de animais dentro do útero materno, quando a genitora é exposta a essa droga durante a gestação, em um nível sérico menor que o materno (Capello et al., 2011).
Relatos clínicos mostraram que recém-nascidos expostos a ISRS durante a gestação têm um risco aumentado para desenvolver efeitos adversos como baixo peso ao nascer, menor idade gestacional, perturbações neurocomportamentais e frequência cardíaca reduzida (Oberlander et al., 2009). Além disso, neonatos expostos à fluoxetina possuem níveis plasmáticos da concentração da droga detectáveis de até 80% (Berle e Spigset, 2011).
Entretanto, a ação da fluoxetina durante o desenvolvimento ósseo ainda é controversa. Sendo a literatura escassa para as possíveis alterações que possam ocorrer nos ossos gnáticos quando expostos ao fármaco durante a formação e desenvolvimento. Mais especificamente, nada em relação à formação do osso basal da mandíbula in vivo ou in situ tem sido descrito.
Pesquisas nesta área são de grande importância visto que as células ósseas possuem receptores para serotonina, além disso, são elementos sensíveis a variações metabólicas, podendo sofrer danos e influenciar na formação óssea de forma indesejável. Baseando-se no exposto, o preBaseando-sente trabalho objetivou verificar Baseando-se o uso de cloridrato de fluoxetina na gestação e lactação interfere na formação óssea do corpo mandibular na prole de ratas submetidas ao tratamento farmacológico com essa droga.
24 MATERIAIS E MÉTODOS
Após submissão e aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco (protocolo número 23076.017680/2011-83), foi realizado um estudo experimental randomizado cego, conduzido no Biotério de Cirurgia Experimental, no Laboratório de Patologia Oral, no Laboratório de Histotécnica do Programa de Pós-Graduação em Patologia, todos localizados na Universidade Federal de Pernambuco, e no Laboratório de Histologia do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal da Universidade Federal Rural de Pernambuco, no período de julho de 2011 a agosto de 2012.
Foram utilizados 24 filhotes provenientes de 12 ratas prenhas (Rattus novergicus, albinus, Wistar), hospedados em biotério onde receberam a dieta padrão do mesmo (Presence Ratos e Camungongos® – Presence - Paulinea - SP - Brasil S/A) e água ad libitum. Foram mantidos em sala com temperatura de 23 ± 2ºC e ciclo de claro e escuro de 12:12 horas (claro das 06 às 18 horas e escuro das 18 às 06 horas). Para a obtenção dos neonatos, foram realizados acasalamentos entre animais adultos na proporção de um macho para três fêmeas, colocados na mesma gaiola durante a noite. A prenhez foi diagnosticada através do método de esfregaço vaginal, sendo detectada a presença de espermatozoide pela análise em microscopia de luz, considerou-se este dia como o dia 1 da gestação. Nasciam em média de 9 filhotes por rata, entretanto eram retirados 2 filhotes de cada mãe para compor o n de 6 filhotes por grupo: Grupo Controle da Gestação (CG); Grupo Controle da Gestação e Lactação (CL); Grupo Tratado com Fluoxetina durante a Gestação (FG) e Grupo Tratado com Fluoxetina durante a Gestação até o final da Lactação (FL).
Tratamento farmacológico
Todas as ratas prenhas receberam tratamento via oral (gavagem), uma vez ao dia, aplicado rigorosamente no horário pré-determinado (7h00 – 07h30), durante o tempo referente a cada grupo de estudo.
As mães dos grupos controles receberam solução de Cloreto de Sódio a 0,9% na dose de 10μl/g de peso de animal. O grupo CG recebeu a solução durante a gestação (do 1º
25 ao 20º dia de prenhez) e o grupo CL, durante toda gestação e lactação (do 1º da prenhez até o 21º dia após o nascimento). As mães dos grupos tratados receberam Cloridrato de Fluoxetina (Pharma Nostra – Rio de Janeiro – Brasil) na dose de 20mg/kg de peso animal, sendo o grupo FG tratado durante a gestação (do 1º ao 20º dia de prenhez) e o grupo FL, durante toda gestação e lactação (do 1º dia da prenhez até o 21º dia após o nascimento).
Obtenção dos espécimes
Os filhotes foram desmamados com 21 dias de vida e aos 25 dias de vida foram anestesiados com xilazina a 20mg/Kg de peso animal (i.m.) e quetamina a 50mg/Kg de peso animal (i.m.) e eutanasiados por perfusão por via intracardíaca com formaldeído a 4% (obtido a partir do paraformaldeído – Sigma Aldrich - São Paulo - Brasil) em tampão fosfato de sódio (tampão PBS) (pH = 7). Posteriormente, foram decapitados e tiveram suas mandíbulas desarticuladas e seccionadas na sua porção medial. As hemi-mandíbulas direitas foram fixadas no mesmo fixador por 24 horas a temperatura ambiente.
Avaliação da radiopacidade dos espécimes
A área onde foram realizadas todas as análises desenvolvidas neste estudo foi a área diastema do corpo da hemi - mandíbula direita anterior ao primeiro molar e logo após o término do ramo mandibular.
O exame radiográfico dos espécimes foi realizado utilizando-se um aparelho de raios X intraoral Dabi Atlante (Dabi Atlante, Ribeirão Preto, Brasil) operando a 70 kVp e 10 mA fixas, e placas de fósforo Digora Optime® (Soredex, Helsinki, Finlândia) para realização de radiografias digitais.
Padronizou-se o tempo de exposição (TE) em 0,2 segundos. Para padronizar a distância, foi utilizado um dispositivo de acrílico foco-sensor para todos os exames radiográficos, sendo utilizada a altura de 30 cm. Os espécimes, o bloco de chumbo e o penetrômetro (contendo 10 degraus, com intervalo de 1 milímetros entre eles) foram colocados sobre a placa de fósforo sempre na mesma posição.
As imagens foram salvas em extensão JPEG e importadas para o software IMAGE PRO PLUS 6.0 (Macintosh computers - Maryland - USA), onde se mensurou o valor de pixel de cada degrau do penetrômetro e da área do diastema do corpo mandibular (Fig.
26 6). Confeccionou-se uma curva através de um gráfico de dispersão com valores de pixel x mmAl correspondente. A equação matemática foi escolhida de acordo com o valor de R obtido no gráfico de dispersão. Então, foram obtido os valores do diastema em mmAl.
Os dados foram tabulados no programa Microsoft Office Excel 2007 em uma planilha para cada imagem radiográfica. As avaliações da radiopacidade foram realizadas por um por um único avaliador previamente calibrado.
Estudo histológico
Após a obtenção das radiografias, as peças foram descalcificadas em solução de EDTA (VETEC – Rio de Janeiro - Brasil) a 4% a temperatura ambiente, durante 30 dias, com troca da solução descalcificadora uma vez por dia. Foram processadas convencionalmente para a microscopia de luz com inclusão em parafina (Michallany, 1990). Cortes histológicos semi-seriados foram obtidos com aproximadamente 5 μm cada, através de um micrótomo LEICA© RM 2125 RT (Biosystems Nussloch GmbH – Nussloch – Alemanha). Os cortes foram estirados em banho – maria histológico (ANCAP – Equipamentos Eletro-eletrônicos Ltda.), dispostos em lâminas untadas com albumina de Mayer, colocados em estufa (J PROLAB 102 – São José dos Pinhais – Paraná - Brasil) por aproximadamente 30 minutos a 37ºC para secagem do material. Posteriormente, os mesmos foram corados pela Hematoxilina e Eosina (HE), Tricrômico de Masson e Picrosirius Red, montados em Entellan® (Merck KGaA – Darmstadt – Alemanha), observados e fotografados em um microscópio ECLYPSE 51 (NIKON – Tokyo - Japão). Foi analisada a organização estrutural do corpo mandibular, a disposição das células, matriz óssea e tecido conjuntivo dentro do diastema mandibular.
Estudo histométrico
Foram utilizados os cortes corados em HE, fotografados em microscópio de luz ECLYPSE 51 (NIKON – Tokyo - Japão) com uma microcâmera acoplada, conectado a um computador contendo placa de captura de imagem (ATI). Foram selecionados 10 campos de cada animal na coloração HE, fotografados em microscópio de luz ECLYPSE 51 (NIKON – Tokyo - Japão) nas objetivas de 2x, 4X e 10X com uma microcâmera acoplada, conectada a um computador contendo placa de captura de imagem (ATI). As imagens foram capturadas, importadas em formato JPEG para o
27 software IMAGE PRO PLUS 6.0 (Macintosh computers - Maryland - USA) para realização das medidas.
Sendo realizadas medidas da espessura total do osso mandibular, da espessura da cortical superior, da espessura da cortical inferior, do número de osteócitos da cortical superior e do número de osteócitos da cortical inferior.
Microscopia de polarização
As preparações coradas com Picrosirius Red foram observadas pela microscopia de polarização para determinar o tipo de colágeno presente no osso mandibular, por meio da birrefringência emitida pelo tecido nas lâminas, utilizando um microscópio petrográfico polarizado (Olympus BX40 - Olympus Corporation – Tokyo - Japão).
Análise estatística
Os dados obtidos na histometria e na avaliação radiopacidade foram tabulados no programa Microsoft Office Excel 2007, importados para o software SPSS 13.0 e submetidos ao teste não paramétrico de Mann-Whitney. As variáveis numéricas foram representadas pelas medidas de tendência central e medidas de dispersão. Valores de p<0,05 foram considerados significantes.
28 RESULTADOS
Análise da radiopacidade
Houve uma diferença significante na comparação da radiopacidade dos grupos CL com o FL (p = 0,007). Entre o grupo CG e FG, não houve diferença significante (p = 0,203) (Tabela 3).
Análise histológica
A análise microscópica dos cortes histológicos em HE dos grupos mostrou um tecido ósseo maduro e completamente formado, exibindo uma cortical óssea compacta superior e outra inferior separadas por uma área entreposta constituída pela raiz e tecido de formação dos incisivos inferiores. As corticais apresentaram osteoblastos na superfície voltada para o periósteo e também na intersecção com o tecido conjuntivo medular onde foi observado tecido conjuntivo frouxo contendo vasos sanguíneos e também áreas com medula vermelha hematógena. Osteócitos encontravam-se engolfados na matriz óssea acidófila e distribuídos por toda a massa do tecido (Fig 1 e 2). As margens das corticais ósseas exibiram contornos uniformes. Entretanto, no grupo FL áreas mais volumosas de tecido medular hematopoiético foram evidentes entremeando ambas as corticais (Fig 2). Cortes corados pelo método de Tricrômico de Masson mostraram fibras colágenas tipo I na matriz óssea em ambas as corticais de todos os grupos estudados. Entretanto, áreas com menor quantidade de fibras maduras foram evidentes nos grupos CPL e FL (Fig 3).
Análise histométrica
Na tabela 1, diferença significante foi apresentada no número dos osteócitos da cortical inferior do grupo FG quando comparado com o CG (p = 0,010). Na tabela 2, diferença significante foi observada na espessura da cortical inferior (p = 0,037), no número dos osteócitos da cortical superior (p = 0,004), no número dos osteócitos da cortical inferior (p = 0,010) e na espessura total da mandíbula (p = 0,016) do grupo FL quando comparado ao CL.
29 Microscopia de polarização
Foram observadas fibras grossas de colágeno tipo I e fibras finas de colágeno tipo III em ambas as corticais. Entretanto, houve predomínio de fibras grossas de colágeno tipo I nas corticais superiores dos grupos CG e FG, sendo que a cortical inferior mostrou predomínio de fibras finas de colágeno tipo III no grupo CG e colágeno tipo I no grupo FG (Fig. 4). Entre os grupos CL e FL observamos predomínio de fibras colágenas tipo I no grupo CL e fibras de colágeno tipo III no grupo FL, em ambas as corticais (Fig. 5).
30 DISCUSSÃO
Sítios de captação e de síntese da serotonina (5-HT) são expressos nos epitélios de desenvolvimento do palato, cavidade oral (língua e septo nasal) e na face (processos maxilares e proeminência mandibular) bem como na papila dental (Lauder e Zimmerman, 1988). A literatura diverge sobre a ação da fluoxetina no osso. Alguns relatam um efeito estimulador da 5-HT na formação óssea (Westbroek et al., 2001; Bliziotes et al., 2006; Gustafsson et at., 2006a), outros, um efeito inibitório (Yadav et al., 2008).
Mais especificamente na mandíbula, sabe-se que o receptor 5-HT2B é um dos principais mediadores das funções da 5-HT durante o desenvolvimento. Sua sinalização é suficiente e necessária para modular a forma e funcionalidade de elementos distintos da mandíbula (Reisoli et al., 2010). Entretanto, nada mais específico sobre a possível interferência da formação óssea mandibular pela fluoxetina foi relatado.
Estudos anteriores foram realizados utilizando a dosagem de 10mg/Kg por via subcutânea para investigar possíveis alterações na articulação temporomandibular e no esmalte dentário e nada foi evidenciado (Cavalcanti et al., 2009; Silva et al., 2010). Por isso, o presente estudo utilizou a dose de 20mg/Kg por via oral.
O presente trabalho evidenciou alterações no osso mandibular na prole exposta ao tratamento com a fluoxetina, sendo o grupo exposto por mais tempo o mais acometido. A diminuição significante na quantidade de osteócitos tanto da cortical superior quanto da inferior da mandíbula dos dois grupos tratados com a fluoxetina encontrada na pesquisa evidencia uma interferência na atividade das células ósseas e está de acordo com o estudo de vários autores.
O estudo in vitro de Gustafsson et al. (2006a) mostrou haver um aumento no número total de osteoclastos humanos diferenciados e na atividade osteoclástica na presença de fluoxetina e serotonina. Entretanto, em concentrações mais elevadas a fluoxetina teve uma ação inibitória de maneira dose-dependente. O estudo in vitro de Hodge et al. (2012) mostrou que a fluoxetina inibe a proliferação celular e mineralização óssea pelos osteoblastos bem como o processo de formação dos osteoclastos e reabsorção óssea de forma dose-dependente, relatando uma interferência nas células ósseas formadoras e reabsortivas. Acredita-se que o efeito negativo da droga sobre os osteócitos encontrado
31 no presente estudo, refletido através da redução do número, se explica pela inibição dos transportadores de serotonina dentro das células ósseas (Bliziotes et al., 2001).
A presença da serotonina nas células ósseas permite uma produção correta de matriz óssea, reduzindo a reabsorção e/ou aumentando a deposição óssea. Com isso, o aumento da massa óssea gera um aumento na densidade óssea mineral na presença da 5-HT (Gustafsson et al., 2006b). De acordo com esse relato, o presente estudo revelou haver uma redução na radiopacidade óssea através da radiografia digital no grupo FL, representando uma diminuição na densidade óssea. Essa alteração ocorreu no grupo exposto à fluoxetina por maior tempo, não sendo encontrada uma diferença significante no grupo FG, que recebeu a droga apenas na gestação.
Os achados da radiopacidade estão de acordo com os descritos por Westbroek et al. (2007), que encontraram uma menor densidade óssea mineral através da análise radiológica dos animais tratados com fluoxetina em comparação com os animais do grupo controle. Do mesmo modo, alguns autores analisando pacientes usuários de ISRS, relataram uma diminuição da densidade do quadril quando comparados com os integrantes do grupo controle (Haney et al., 2007; Diem et al., 2007). Estes estudos suportam a hipótese de que os transportadores de serotonina, expressos em células de osso têm um papel funcional para a determinação da massa, a arquitetura e força óssea (Haney et al., 2007).
Relatos clínicos de maior risco para fratura óssea tem sido associado ao uso dos ISRS (Richards et al., 2007; Vestergaard et al., 2008; Ceylan e Maner, 2010). Além disso, o grau de mineralização do osso (Renders et al., 2007) e a espessura do córtex mandibular influenciam na radiopacidade óssea (Khojastehpour, 2011).
Mesmo com a inibição da proliferação dos osteócitos, foi encontrado um aumento estatisticamente significante na espessura da cortical inferior do grupo FL. Esses dados se opõem ao relato de Westbroek et al. (2007) que estudaram in vivo o efeito da fluoxetina sobre o fêmur de ratos e encontraram que a espessura da metáfise do fêmur foi significativamente menor nos animais tratados com fluoxetina quando comparados com os animais do grupo controle, sugerindo a formação óssea reduzida e/ou aumento da reabsorção óssea. Se opõem também a Bonnet et al. (2007) que estudaram fêmur de ratas tratadas com antidepressivos, incluindo a fluoxetina e não encontraram diferença estatisticamente significante quanto a medida da espessura do fêmur. Entretanto, este estudo mostrou que a fluoxetina tem um efeito deletério sobre a arquitetura óssea,
32 microarquitetura e propriedades mecânicas do osso, sugerindo uma inibição do crescimento ósseo. Mas, foi utilizada fluoxetina por via sub-cutânea a 10mg/Kg de peso animal.
Recentemente Branco-de-Almeida et al. (2012) mostraram que fluoxetina usada em periodontite induzida por ligadura em ratos provoca uma redução na perda óssea alveolar quando comparado com o grupo controle. Eles sugeriram que o fármaco modula para baixo a geração de PGE2 por suprimir a produção da COX-2, contribuindo assim para a redução da perda óssea alveolar. Sendo a primeira revelação do possível efeito anti-inflamatório da fluoxetina sobre a inflamação óssea alveolar.
Contudo, acredita-se que o aumento de espessura encontrado na cortical inferior foi devido ao tecido mieloide, encontrado no centro da cortical inferior, que apareceu em quase todos os animais em maior quantidade no grupo FL. Não se acredita, portanto, que tenha sido por influência da droga e sim, pela variação anatômica da espécie. Chegou-se a esta conclusão através da análise histológica realizada em todos os grupos e a comparação entre eles. Da mesma forma, a diminuição na espessura total da mandíbula pode ter sido resultado da possível alteração na raiz do incisivo que passa no centro do osso mandibular, dividindo a mandíbula em cortical superior e cortical inferior. Entretanto, o dente não foi analisado metricamente.
O estudo do colágeno através da microscopia de polarização das lâminas coradas com picrosirius red revelou um predomínio de fibras de colágeno tipo III no grupo FL quando comparado com o grupo controle CL, onde predominou o colágeno tipo I. O mesmo resultado foi encontrado por Branco-de-Almenida et al. (2012) estudando a influencia da fluoxetina no periodonto. Evidenciando que esta substância pode interferir na qualidade da matriz óssea formada. Entretanto, o resultado encontrado por esses autores se refere ao osso alveolar e não ao osso mandibular.
Pelo exposto, o presente trabalho mostrou que a fluoxetina diminui a produção de osteócitos e a radiopacidade óssea, com consequente diminuição da densidade óssea nos animais tratados com o fármaco a longo prazo. Mostrando desta forma, que o uso prolongado de fluoxetina por via oral por ratas prenhes e lactantes altera a massa óssea mandibular.
33 AGRADECIMENTOS
Agradecemos a CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo apoio financeiro concedido para realização do presente trabalho.
34 REFERÊNCIAS
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38 FIGURAS E TABELAS
39 Figura 2
40 Figura 3
41 Figura 4
42 Figura 5
43 Figura 6
44 Tabela 1 Grupo Variáveis CPG FG p-valor Média ± DP Média ± DP ESPESSURA C.SUP 192,01 ± 26,99 191,26 ± 13,00 0,749 ESPESSURA C. INF 128,86 ± 44,14 90,59 ± 34,16 0,078 ESPESSURA TOTAL 420,90 ± 55,18 428,48 ± 35,05 0,873 Nº OSTEÓCITOS C.SUP 182,70 ± 41,14 140,58 ± 15,95 0,109 Nº OSTEÓCITOS C.INF 107,90 ± 24,59 70,85 ± 12,46 0,010* (*) Médias diferem para valores de p < 0,05
45 Tabela 2 Grupo Variáveis CPL FL p-valor Média ± DP Média ± DP ESPESSURA C.SUP 226,87 ± 26,23 194,01 ± 42,73 0,337 ESPESSURA C. INF 102,86 ± 24,21 142,79 ± 38,08 0,037* ESPESSURA TOTAL 483,09 ± 23,37 434,55 ± 27,17 0,016* Nº OSTEÓCITOS C.SUP 175,18 ± 15,90 122,17 ± 20,99 0,004* Nº OSTEÓCITOS C.INF 112,03 ± 17,43 76,13 ± 18,28 0,010* (*) Médias diferem para valores de p < 0,05
46 Tabela 3
Grupo
Grupo CPG Grupo FG p-valor
Média ± DP Média ± DP
0,84 ± 0,18 1,08 ± 0,36 0,203 Grupo
Grupo CPL Grupo FL p-valor
Média ± DP Média ± DP
1,01 ± 0,21 0,70 ± 0,07 0,007* (*) Médias diferem para valores de p < 0,05
