2019
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL
Produção de lípidos através da levedura Rhodosporidium
toruloides NCYC 921 a partir de biomassa lenhocelulósica de
Miscanthus sp.
Joana Isabel Alves Martins
Mestrado em Microbiologia Aplicada
(Versão Pública)
Dissertação orientada por:
Doutora Maria Teresa Saraiva Lopes da Silva
O
trabalho
apresentado
nesta
Dissertação de Mestrado foi realizado no
Laboratório Nacional de Energia e
Geologia – Unidade de Bioenergia sob a
orientação direta da Investigadora Maria Teresa Saraiva Lopes da Silva
A Professora Doutora Ana Maria de Fátima da Silva Martins Gonçalves Reis foi a
orientadora interna, designada no âmbito do Mestrado em Microbiologia Aplicada da
Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa
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Agradecimentos
Estarei eternamente grata para com a Dra. Teresa Lopes da Silva em me ter aceitado para fazer parte deste projeto, pela orientação, carinho e sobretudo extrema paciência, e por me ter dado oportunidade para demonstrar o meu potencial, olhando para além das aparências.
Um grande agradecimento à Dra. Ana Reis, a minha orientadora interna, pela sua disponibilidade para me ajudar, mesmo estando em diferentes estabelecimentos.
À Dra. Susana Marques e Dr. João Tavares, pela orientação da componente da hidrólise enzimática, e pela disponibilidade, acompanhamento, e ajuda neste procedimento, bem como o fornecimento da lama de indústria papeleira.
Agradecimento especial à Dra. Luísa Roseiro e a colega Cláudia, pela disponibilidade, ajuda e fornecimento dos dados dos compostos fenólicos.
À minha mãe, por me fazer rir, e me acompanhar nos momentos bons e menos bons, mas particularmente por ser graças a ela que estou onde cheguei.
Ao meu avô, pelo apoio e carinho, e por ter a porta sempre aberta quando eu precisei.
À minha colega de curso, Ana Sofia, pelos momentos de bom humor e incentivo, e porque se não fosse ela, nunca teria ido ao e-mail de turma, e teria perdido esta oportunidade.
Aos colegas Ana Carolina, Joana, Mariana, Marta, e Tiago, pela vossa amizade, mas também pela ajuda profissional ao longo de toda esta viagem.
Ao Dr. Alberto Reis, Dr. Luís Alves, Dr. Luís Silva, Dra. Susana Alves, técnica Margarida Monteiro, técnica Céu Penedo, Dra. Cristina Oliveira, e técnica Natércia Santos pela orientação nos laboratórios, equipamentos, e paciência em geral.
Aos colegas Bruno, Carolina, Diogo, Pedro e Vanmira pela ajuda em alguns procedimentos e orientação nos laboratórios do edifício K2.
À Dra. Florbela Carvalheiro, Dr. Luís Duarte e Dr. Rafal Lukasik, pela orientação na componente dos pré-tratamentos.
Ao Dr. Henrique, que apesar da presença temporária, sempre se assegurava que eu realizasse o meu dia com um sorriso.
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O presente trabalho insere-se no âmbito do projeto BRISK II (Biofuels Research Infrastructure for
Sharing Knowledge II, Proposal number: 731101, Horizonte 2020).
O presente trabalho foi realizado na Infraestrutura de Investigação para a Biomassa e a Bioenergia (BBRI - Biomass and Bioenergy Research Infrastructure)- LISBOA-01-0145-FEDER-022059,
financiada pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) através do Programa Operacional para a Competitividade e Internacionalização (PORTUGAL2020), do Programa Operacional Regional Lisboa Portugal (Lisboa 2020) e do Programa Operacional Regional Norte
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Resumo
O presente trabalho teve por objetivo a produção de lípidos pela levedura Rhodosporidium toruloides NCYC 921, utilizando hidrolisado da planta Miscanthus sp. (HM) como fonte de carbono.
Em ensaios prévios, utilizando meio semi-definido, estudou-se a tolerância das leveduras a concentrações crescentes de glucose (10 - 200 g/L), tendo-se constatado que a máxima concentração de biomassa (2,70 g/L) e o teor máximo em ácidos gordos totais (11,05 % p/p) foram obtidos no ensaio realizado com a concentração de 90 g/L de glucose.
Estudou-se também a tolerância das leveduras à enzima Cellic® CTec2, utilizada na hidrólise enzimática da matéria-prima lenhocelulósica, tendo-se testado o crescimento celular no meio de cultura suplementado com a solução da enzima, em duas proporções (3:7 e 1:9 (v/v)). Constatou-se que geralmente a presença da enzima no meio de cultura favoreceu o crescimento de R. toruloides, mas o teor máximo de biomassa (13,05 g/L) e lípidos (34,77 % p/p) foram obtidos no ensaio com a diluição 1:9. Também se observou que a presença da enzima atrasou a produção de carotenoides, sendo esse atraso proporcional à concentração da enzima.
Estudaram-se dois métodos de pré-tratamento da planta Miscanthus sp.: ácido diluído, e hidrotérmico, em que ambos originaram uma fração líquida, ou licor, e uma fração sólida.
Escolheu-se o licor obtido do pré-tratamento em ácido diluído para a fermentação de R. toruloides, devido à presença da xilose resultante da solubilização total da hemicelulose. Constatou-se que as leveduras não cresceram neste licor, suplementado com sais e extrato de levedura, possivelmente devido à presença de compostos inibidores (ácido acético, furfural) resultantes do pré-tratamento. O sólido proveniente do pré-tratamento hidrotérmico, por ter preservado o xilano, possuir maior per-centagem de celulose, e resultar numa maior concentração de glucose em solução, após hidrólise enzimática da celulose na presença da enzima Cellic® CTec2, foi utilizado para a obtenção de um hidrolisado final contendo os monossacáridos, fonte de carbono utilizada pelos microrganismos. Todas as fermentações foram monitorizadas por citometria de fluxo, que revelou o impacto das condi-ções de cultivo nas células de R. toruloides em termos de integridade da membrana celular.
Palavras-chave: Biocombustível, Rhodosporidium toruloides NCYC 921, Miscanthus sp., ácidos
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Abstract
The present study aimed for lipid production by the yeast Rhodosporidium toruloides NCYC 921, us-ing hydrolysate from the plant Miscanthus sp. (HM) as carbon source.
In previous assays, using semi-defined medium, the yeasts’ tolerance towards increasing glucose con-centrations (10 - 200 g/L) was studied, being stated that the highest biomass concentration (2.70 g/L) and total fatty acid content (11.05 % p/p) were obtained in the assay using 90 g/L glucose concentra-tion.
It was also studied the yeasts’ tolerance towards the enzyme Cellic® CTec2, used in enzymatic hydrol-ysis of lignocellulosic feedstock, having tested the cell growth using medium supplemented with en-zyme solution, in two proportions (3:7, and 1:9 (v/v)). It was stated that the presence of the enen-zyme in the growth medium solution in general favoured R. toruloides’ growth, but the highest biomass (13.05 g/L) and lipid (34.77 % p/p) contents were obtained in the assay using 1:9 dilution. It was also ob-served that the enzyme’s presence delayed carotenoid production, it being proportional to enzyme’s concentration.
Two pretreatment methods for the plant Miscanthus sp. were studied: diluted acid, and hydrothermal, in which both originated a liquid fraction, or liquor, and a solid fraction.
The liquor obtained from diluted acid pretreatment was used in R. toruloides fermentation, due to the resulting xylose presence from total hemicellulose solubilization. It was stated that the yeasts didn’t grow in this liquor, supplemented with salts, and yeast extract, possibly due to inhibitory compounds (acetic acid, furfural) formed during pretreatment.
The solid from hydrothermal pretreatment, due to its preservation of xylan, higher cellulose percent-age, and resulting in higher glucose concentrations in solution, after enzymatic hydrolysis of cellulose in the presence of the enzyme Cellic® CTec2, was used to obtain a final hydrolysate containing monosaccharides, the carbon source used by microorganisms.
All fermentations were monitored using flow cytometry, which revealed the impact of growth condi-tions in R. toruloides cells regarding cell membrane integrity.
Keywords: Biofuel, Rhodosporidium toruloides NCYC 921, Miscanthus sp., fatty acids, flow
