Desvendando oscilações hipocampais através de comodulações

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE – UFRN PROGRAMA DE PÓS – GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS INSTITUTO DO CÉREBRO LABORATÓRIO DE NEUROFISIOLOGIA COMPUTACIONAL. ROBSON SCHEFFER TEIXEIRA. DESVENDANDO OSCILAÇÕES HIPOCAMPAIS ATRAVÉS DE COMODULAÇÕES. Tese apresentada à Pós-Graduação em Neurociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Neurociências. Orientador: Prof. Doutor Adriano Bretanha Lopes Tort. Natal – Brasil 2016.

(2) Apoio ao Usuário Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Instituto do Cérebro. T266d. Teixeira, Robson Scheffer. Desvendando oscilações hipocampais através de comodulações / Robson Scheffer Teixeira. - Natal, 2016. 255f: il. Tese (Doutorado em Neurociências). Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientador: Profº. Drº. Adriano Bretanha Lopes Tort.. . 1. Neurociências - Tese. 2. Eletrofisiologia. 3. Hipocampo. 4. CA1. 5. Teta. 6. HFO. 7. Acoplamento entre Frequências. I. Título. RN/UF/BSET/ICE. CDU 612.8.

(3) Agradecimentos Aos meus pais, irmãos, primos e tios; À minha namorada e companheira Elenice; Aos amigos Francis, Glauco, Luís e Prof. Benê; À República; A todos os amigos e companheiros de mucha lucha do ICe; Ao Container; Ao Sci-Hub e LibGen; E principalmente ao meu orientador, Adriano..

(4) Que no se trabe mi lengua ni me falte la palabra; el cantar mi gloria labra y, poniéndomé a cantar, cantando me han de encontrar aunque la tierra se abra. José Hernández, Martín Fierro.

(5) SUMÁRIO LISTA DE ABREVIAÇÕES .................................................................................................................. 6 RESUMO ................................................................................................................................................ 8 PARTE I – DA FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA DESTA TESE ...................................................... 12 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 13 Visão geral do sistema hipocampal .............................................................................................. 13 O potencial de campo local .......................................................................................................... 14 Mudanças no pH contribuem para o LFP .................................................................................... 16 O potencial de campo é local ou global? ..................................................................................... 16 Acoplamento efático: interações entre LFP e neurônios .............................................................. 18 LFP hipocampal............................................................................................................................ 20 Oscilações Teta ............................................................................................................................. 20 Propagação de ondas ................................................................................................................... 24 Navegação e memória................................................................................................................... 25 Oscilações Gama .......................................................................................................................... 26 Acoplamento entre frequências..................................................................................................... 28 Quantificação dos acoplamentos .................................................................................................. 29 Múltiplas bandas de gama ............................................................................................................ 37 Variáveis de confusão ................................................................................................................... 39 OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 42 Gerais................................................................................................................................................ 42 Específicos ........................................................................................................................................ 42 PARTE II – DOS RESULTADOS ....................................................................................................... 44 ARTIGO I ......................................................................................................................................... 45 ARTIGO II ........................................................................................................................................ 53 ARTIGO III ...................................................................................................................................... 69 ARTIGO IV .................................................................................................................................... 117 PARTE III – DAS CONCLUSÕES OBTIDAS ................................................................................. 178 DISCUSSÃO GERAL .................................................................................................................... 179 Resumo dos achados: resultados anteriores ............................................................................... 179 Resumo dos achados: reprodução e extensão ............................................................................ 180 Especulações de função .............................................................................................................. 182 Especulações de mecanismo ....................................................................................................... 183.

(6) Outras formas de interação entre frequências............................................................................ 184 Conclusões .................................................................................................................................. 188 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................ 190 APÊNDICE ......................................................................................................................................... 213 INTRODUÇÃO SUPLEMENTAR .................................................................................................... 225.

(7) LISTA DE ABREVIAÇÕES. AAC - Acoplamento amplitude – amplitude (amplitude - amplitude coupling) AFC - Acoplamento amplitude – fase (amplitude - phase coupling) aWK - Vigília ativa (active waking) CA1 - Cornu Ammonis area 1 CA2 - Cornu Ammonis area 2 CA3 - Cornu Ammonis area 3 CFC - Acoplamento entre frequências (cross - frequency coupling) CPP - 3-(2-Carboxypiperazin-4-yl)propyl-1-phosphonic acid DG - Giro denteado (dentate gyrus) EC - Córtex entorrinal (entorhinal cortex) FAC - Acoplamento frequência – amplitude (frequency - amplitude coupling) FFC - Acoplamento frequência – frequência (frequency - frequency coupling) HFO - Oscilações de alta frequência (high frequency oscillations) HG - Gama alto (high gamma) LEA - Área lateral do cortex entorrinal (lateral entorhinal cortex area) LEC - Córtex entorrinal lateral (lateral entorhinal cortex) LG - Gama baixo (low gamma) LTP - Potenciação de longa duração (long term potentiation) MEA - Área medial do cortex entorrinal (medial entorhinal cortex area) MEC - Córtex entorrinal medial (medial entorhinal cortex) MI - Índice de modulação (modulation index) MS-DBB - Septo medial e banda diagonal de Broca (medial septum and diagonal band of Broca) NMDA - N-metil D-Aspartato OLM - oriens – lacunosum – moleculare PAC - Acoplamento fase – amplitude (phase - amplitude coupling) PEPS - Potencial excitatório pós-sináptico PER - Córtex perirrinal (perirhinal cortex) PFC - Acoplamento fase – frequência (phase - frequency coupling). 6.

(8) pH - Potencial de hidrogênio PIPS - Potencial inibitório pós-sináptico POR - Córtex pós-rinal (postrhinal cortex) PPC - Acoplamento fase – fase (phase - phase coupling) PSC - Acoplamento fase – disparo (phase - spike coupling) REM - Sono de movimento rápido dos olhos (rapid eye movement sleep) SLHFO - Oscilações de alta frequência por vazamento de disparos (spike - leaked high frequency oscillations) SWS - Sono de ondas lentas (slow wave sleep). 7.

(9) RESUMO Análises espectrais de registros eletrofisiológicos extracelulares têm revelado que a atividade elétrica produzida pelo cérebro é comumente organizada em padrões rítmicos, conhecidos como oscilações neuronais. Mais recentemente, descobriu-se que as oscilações neuronais de frequências distintas não são independentes, mas podem interagir entre si. Ao longo das últimas duas décadas, diversas ferramentas de análises foram desenvolvidas, amadurecidas e incorporadas de outras áreas para se estudar os chamados acoplamentos entre frequências de oscilações neuronais observadas nestes registros. Oscilações neuronais são ditas acopladas se houver uma relação de dependência entre suas características, como fase, amplitude ou frequência instantâneas. Dentre elas, o acoplamento fase-amplitude é caracterizado por um aumento da amplitude instantânea de uma banda de frequência condicionado a uma fase instantânea de uma oscilação de outra banda, enquanto que o acoplamento fase-fase do tipo n:m é caracterizado pela relação fixa entre m ciclos de uma frequência em nciclos de outra.. O hipocampo é uma região cerebral envolvida na formação de memórias e navegação espacial. Assim como em outras estruturas, as redes neuronais do hipocampo produzem diversos padrões oscilatórios, que variam de acordo com os estados do ciclo sono-vigília. Entre estes padrões, classicamente destacam-se os ritmos teta (4-12 Hz) e gama (30-100 Hz), que caracterizam estados comportamentais de locomoção e sono REM. No entanto, o estudo dos padrões de acoplamento oscilatório no hipocampo tem revelado subtipos oscilatórios distintos dentro da definição tradicional da banda gama. Mais ainda, trabalhos recentes têm mostrado a existência de oscilações acopladas ao ritmo teta em frequências mais altas (>100 Hz), embora haja uma divergência na literatura atual sobre até aonde estas oscilações de altas frequências representariam atividade oscilatória genuína de redes neuronais ou se seriam. 8.

(10) derivadas de efeitos espúrios oriundos de contaminações por resquícios de potencias de ação registrados extracelularmente.. A presente tese de doutorado visa contribuir para o maior entendimento dos padrões oscilatórios produzidos por redes neuronais do hipocampo, com particular foco nas relações de acoplamento entre oscilações de diferentes frequências. Através de dados próprios e compartilhados de terceiros de animais implantados cronicamente com matrizes de múltiplos eletrodos, obtivemos registros da atividade elétrica da região CA1 de ratos durante a exploração de ambientes familiares e períodos de sono. Investigamos a existência conjunta de distintos padrões oscilatórios do hipocampo em diferentes frequências através de marcadores eletrofisiológicos, anatômicos e comportamentais de cada oscilação neuronal que, quando combinados, levaram a um perfil único para cada banda de frequência. Nossos resultados mostram a existência de múltiplas bandas de frequência moduladas pelo ritmo teta hipocampal.. As. modulações. são. dotadas. de. diversos. mecanismos. separatórios,. provavelmente de forma a minimizar interferências. Demonstramos ainda que padrões oscilatórios espúrios e genuínos podem co-existir numa mesma faixa de frequência, e que, ao contrário de trabalhos recentes, não há evidência para acoplamentos do tipo fase-fase n:m no hipocampo. A capacidade de uma oscilação neural interagir com outras oscilações, aparentemente independentes, levanta questionamentos naturais sobre sua significância biológica, que, apesar de diversos avanços na área, ainda permanece um mistério na sua essência.. PALAVRAS – CHAVE: ELETROFISIOLOGIA. HIPOCAMPO. CA1. TETA. HFO. ACOPLAMENTO ENTRE FREQUÊNCIAS.. 9.

(11) ABSTRACT Spectral analysis of extracellular electrophysiological recordings revealed that the brain electrical activity is often organized in rhythmic patterns, known as neuronal oscillations. Recently, it was discovered that oscillations of distinct frequencies are not independent, but can interact to each other. In the last two decades, several analysis tools were developed or incorporated from other fields to study cross-frequency coupling between neural oscillations. Neural oscillations are said to be coupled if there is a dependency between their features, such as phase, amplitude or frequency. Among them, phase – amplitude coupling is characterized by an increase in the instantaneous amplitude of one frequency band conditioned to the instantaneous phase of another frequency band, whereas n:m phase – phase coupling is characterized by a fixed relation between m cycles of one frequency to n cycles of another one. The hippocampus is a brain region involved in memory formation and spatial navigation. As in other brain structures, hippocampal neural networks generate several oscillatory patterns, which vary according to the stage of the sleep-waking cycle. Among these patterns, theta (4 – 12 Hz) and gamma (30 – 100 Hz) oscillations are prominent during active waking and REM sleep. However, the study of coupling patterns in the hippocampus has revealed distinct sub-types of oscillatory activity inside the traditional gamma band. Moreover, recent studies have shown the existence of even faster oscillations coupled to theta in the hippocampus (> 100 Hz), although there is a current divergence in the literature about whether they represent genuine network activity or spurious by-products from incomplete filtering of extracellular spikes. This thesis investigates oscillatory patterns generated by hippocampal neural networks, focusing in the coupling relation among oscillations of different frequencies. Using. 10.

(12) our own data and shared third-party ones of chronically implanted animals with multisite electrodes, we recorded electrical activity in the CA1 region of rats while exploring a familiar environment and during sleep stages. We investigated the existence of simultaneous but distinct oscillatory patterns in the hippocampus separated by electrophysiological, anatomic and behavioral markers, which, once taken together, can lead to a unique profile for each frequency band. Our results point to the existence of several frequency bands coupled to the hippocampal theta rhythm. All modulations are found to be separated by mechanisms that can potentially avoid interferences. We also demonstrate that a spurious oscillatory patterns can emerge and co-exist in the same frequency band of genuine oscillations and, contrary to recent work, we show that there is lack of evidence for n:m phase – phase coupling in the hippocampus. The capacity of neural oscillations to interact with one another raises questions about the biological significance of such phenomenon; despite recent progress in the field, however, its essence remains a mystery.. KEYWORDS: ELECTROPHYSIOLOGY. HIPPOCAMPUS. CA1. THETA. GAMMA. HFO. CROSS-FREQUENCY COUPLING. 11.

(13) PARTE I – DA FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA DESTA TESE. 12.

(14) INTRODUÇÃO. Visão geral do sistema hipocampal O hipocampo é uma estrutura encefálica bastante característica, preservada nos mamíferos e facilmente reconhecível (Amaral et al., 1990; Manns and Eichenbaum, 2006). É especialmente estudado em roedores (porquinho-da-Índia, ratos e camungondos) e lagomorfos (coelhos), e as informações coletadas nesta tese provêm principalmente de estudos realizados nestas duas ordens de mamíferos. O hipocampo, ao longo de sua extensão, possui o formato de uma banana: parte da região medial e dorsal do encéfalo e curva-se na direção lateral e ventral. Este eixo, denomiado de eixo septo – temporal, é criado pelo cruzamento de duas lâminas celulares (Cornu Ammonis [CA] e giro denteado) e dá o aspecto de C’s intercruzados quando seccionado transversalmente (Figura 1). A região CA subdividese em CA1 e CA3, com uma zona de transição chamada de CA2. Já o giro denteado (dentate gyrus – DG) apresenta-se como uma região única, subdividido em lâmina superior (entre a curvatura de CA1 e CA3) e lâmina inferior (abaixo de CA3). Tradicionalmente a principal via de entrada hipocampal se dá pela via perfurante. Esta via inicia-se na camada II do córtex entorrinal (lateral e medial) e perfura o subiculum antes de chegar no DG. Do DG parte para CA3 as fibras musgosas (mossy fibers), e de CA3 parte para CA1 as colaterais de Schaffer. Estas três conexões (EC – DG, DG – CA3 e CA3 – CA1) é conhecida como a via trisináptica do hipocampo (Teyler and Discenna, 1984; Amaral and Witter, 1989; Insausti, 1993). Paralelamente a esta via, do EC também parte uma outra via originária da camada III e que se conecta diretamente a CA1, chamada de via temporoamônica. As duas vias de entrada para CA1 (colaterais de Schaffer e via temporoamônica) são segregadas espacialmente na sua chegada: enquanto que a primeira, vinda de CA3, estabelece conexões no stratum radiatum de CA1 (e em menor grau no stratum oriens), a última, vinda do EC, conecta-se preferencialmente ao stratum lacunosum-moleculare (Figura 1). Em ambos os casos, as vias são excitatórias e atingem os dendritos apicais das células piramidais de CA1. Todavia, também estabelecem conexões com uma extensa rede de interneurônios locais, os quais juntamente com as piramidais de CA1 formam uma complexa rede celular cuja trama aponta para a presença de uma fina regulação excitatória e inibitória (Klausberger and Somogyi, 2008; Leão et al., 2012; Aksoy-Aksel and Manahan-Vaughan, 2013).. 13.

(15) Figura 1. Formação hipocampal do rato. (A) Seção horizontal do hipocampo mostrando giro denteado, CA1 e CA3. Flechas indicam vias de entrada e saída de conexões. Note que neste caso a circuitaria tri-sináptica está inclusa, mas não é o único padrão de conectividade. Há uma via direta para CA3 vinda do EC, e uma via direta para CA1 também do EC. Da mesma forma, CA1 emite também para o subiculum e este para o EC. (B) Desenho esquemático mostrando as camadas celulares. Comparando com o painel A é possível notar diferentes origens de eferências do EC organizadas pelas camadas celulares: enquanto que a camada II emite pela via perfurante para DG e CA3, a camada III do EC emite pela via temporoamônica (considerada parte da via perfurante) diretamente para CA1. Retirado de Amaral et al. (2007).. O potencial de campo local A emergência de padrões oscilatórios da atividade elétrica em CA1, assim como em qualquer espaço neural, está associada à circuitaria, morfologia e neuroquímica das células daquele local. O potencial de campo local (local field potential – LFP; ver Figura 2 para um exemplo de oscilação) é a série temporal obtida pela medida da voltagem elétrica do meio extracelular dos tecidos neurais, mas influenciada diretamente pelas correntes iônicas que atravessam as membranas (da Silva, 2009). As correntes iônicas são ocasionadas pelas. 14.

(16) entradas sinápticas excitatórias, que aumentam o fluxo de íons positivos para dentro das células (por ex., Na+), e entradas sinápticas inibitórias, que aumentam o fluxo de íons positivos para fora da célula (por ex., K+) ou aumentam o fluxo de íons negativos para dentro da célula (por ex., Cl-). Como os íons possuem cargas negativas ou positivas, podemos enxergar esta movimentação da seguinte forma: entradas excitatórias aumentam a positividade interna da célula e diminuem a externa; do contrário, entradas inibitórias aumentam a positividade externa e diminuem a interna. A cada um destes efeitos há um potencial sináptico associado: potencial excitatório pós-sináptico (PEPS) e potencial inibitório pós-sináptico (PIPS), respectivamente. Devido à organização das entradas sinápticas se mostrar segregada pelas camadas em CA1, entradas de PIPS e de PEPS produzem dipolos elétricos no meio extracelular. Estes dipolos, portanto, criam um potencial elétrico independente da membrana, apenas no meio extracelular. Por exemplo, um sumidouro na região distal de CA1 ocasionado por um PEPS torna-se uma região com poucas cargas positivas e poucos íons de sódio. Ao mesmo tempo, na região perisomática, surge uma corrente de retorno, o que ocasiona uma fonte de cargas para o meio extracelular. Do contrário, um PIPS ocasiona uma fonte de potássio para o meio extracelular e sua corrente de retorno, um sumidouro. Portanto, a visão dominante afirma que em resposta à criação de um polo carregado, seja pelo PIPS ou PEPS, há sempre a criação de um outro polo com carga oposta: o efeito líquido, portanto, será um dipolo (Nunez and Srinivasan, 2006; Destexhe and Bedard, 2012; mas veja Riera et al., 2012 para discussão sobre monopolos). A criação deste dipolo repercute no tecido extracelular uma diferença de potencial ou voltagem, cujo tamanho está diretamente relacionado à quantidade de dipolos criados simultaneamente por neurônios sincronizados. Assim, entradas excitatórias ou inibitórias simultâneas criam ao longo de colunas de neurônios um mesmo dipolo elétrico, ocasionando deflexões grandes na voltagem detectada; de outro modo, entradas dessincronizadas, típicas em tarefas de alta demanda cognitiva e que dependem de integração sensorial, criam simultaneamente dipolos com orientações opostas, criando deflexões menores e mais rápidas. A detecção destes dipolos pode ser realizada por eletrodos superficiais, cujo sinal detectado denomina-se eletroencefalograma (EEG), ou profundos, denominados potencial de campo local (LFP). Ambos os sinais são, portanto, condicionados à organização celular, ao contexto comportamental e à técnica de registro, e surgem como resultado da atividade populacional.. 15.

(17) Mudanças no pH contribuem para o LFP Como parte de seu repertório normal, o encéfalo trabalha com a produção de íons H+ e OH- através de diferentes vias do seu metabolismo (Chesler, 2003). De forma notavelmente controlada, também é capaz de mudar o pH local em resposta a estímulos externos; e do contrário, é capaz de responder a estímulos externos com mudanças internas do pH. Por exemplo, os astrócitos aumentam o pH interno em resposta à estimulação cortical (Chesler and Kraig, 1987) e respondem a variações na concentração de potássio extracelular (Walz and Hertz, 1983). A diminuição do pH do meio extracelular, ou acidificação, influencia diretamente na condutância de canais iônicos sensíveis à acidez, que respondem à presença de H+ e são seletivos para Na+ (Waldmann and Lazdunski, 1998). Embora seja bem descrito nas regiões periféricas, atuando na sinalização de dor em resposta a substâncias ácidas e inflamação (Waldmann et al., 1997), variações no pH também estão presentes no encéfalo, onde têm relação com aprendizado e memória (Sun and Alkon, 2002; Krishtal, 2003; Mott et al., 2008), respondem a eventos traumáticos centrais, como isquemia (Astrup et al., 1977), a estimulação cerebral (Urbanics et al., 1978) e a infusão de neurotransmissores (Chen and Chesler, 1992a, 1992b). A atividade neural normalmente leva a mudanças no pH que podem se dar de forma sustentada e duradoura (de 7 segundos a minutos) (Urbanics et al., 1978) ou transientes e rápidas (milissegundos) (Chesler, 1990; Chesler and Kaila, 1992). Como os íons que influenciam no pH são carregados, é possível que possuam também contribuição direta na geração do potencial de campo local (Buzsáki et al., 2012). O potencial de campo é local ou global? Apesar do LFP levar no nome a característica local, estimativas do grau de dispersão deste sinal demonstraram um alcance de 400 µm no eixo lateral e mais de 1 mm no eixo vertical no córtex auditivo; todavia, através de condução de volume, o sinal pode ser detectado a mais de 6 mm de distância (Kajikawa and Schroeder, 2011). Já estimativas feitas na área visual encontraram que o sinal do LFP é resultado da integração de neurônios posicionados em um raio de 150 µm a 250 µm (Katzner et al., 2009; Xing et al., 2009). É possível que o LFP seja resultado tanto da circuitaria local, de entradas de longa distância, de ondas que propagaram e/ou de condução de volume (Pesaran, 2009). A detecção no tempo do potencial de voltagem revela que o mesmo se comporta de forma oscilatória, predominantemente não-estacionária e correlacionada a algum tipo de comportamento, como atividade exploratória, sono ou tomada de decisão. A faixa dos potenciais de campo local é. 16.

(18) considerada a região lenta dos potenciais neurais, menos de 300 Hz; um potencial de ação, por exemplo, ocorre em faixas de frequência instantânea próximas a 1000 Hz. Além disto, sinais muito lentos também são removidos pelos sistemas de detecção a fim de retirar o componente de corrente contínua, permanecendo apenas o de corrente alternada. Portanto, os sinais detectados estão na faixa de 1 – 300 Hz e a amplitude de cada faixa se comporta de acordo com uma distribuição teórica 1/f de potência. Via de regra, sinais com a frequência menor possuem maior amplitude, ao passo que sinais com maior frequência possuem a amplitude atenuada. Isto ocorre porque o tecido neural atua como um filtro passa-baixo (Bazhenov et al., 2011). Sinais de baixa frequência e com maior amplitude se propagam por grandes distancias, como a faixa lenta dos sinais do LFP (< 30 Hz); sinais de alta frequência, como os disparos neuronais, ficam limitados a uma pequena região em trono da célula ou dipolo de origem.. Figura 2. Sinal representativo de acoplamento entre o envelope de amplitude de HFOs e a fase do teta. Painel superior: sinal de LFP durante uma época de teta (sono REM). Painel. 17.

(19) médio: sinal filtrado para HFO (120 – 160 Hz). Painel inferior: envelope de amplitude normalizado do sinal filtrado do HFO. Retirado e adaptado de Scheffer-Teixeira et al. (2012).. Acoplamento efático: interações entre LFP e neurônios Evidências sugerem que os potenciais de campo local são capazes de modular a atividade neural de forma independente da atividade sináptica, evento conhecido como acoplamento efático (ephaptic coupling; Jefferys, 1995; Holt and Koch, 1999; Binczak et al., 2001; Bokil et al., 2001; Deans et al., 2007; Anastassiou et al., 2010, 2011; Fröhlich and McCormick, 2010). Os neurônios possuem atividade oscilatória própria, intrínseca, dependentes principalmente de canais de sódio e, em menor grau de potássio, mas independentes de transmissão sináptica (Amitai, 1994; Gutfreund and Segev, 1995; Zhu et al., 1999; Dickson et al., 2000; Agrawal et al., 2001; Sanhueza and Bacigalupo, 2005; Yoshida and Alonso, 2007); apesar desta relativa autonomia oscilatória, podem sofrer influência de oscilações extracelulares por ressonância, vista como uma das formas possíveis do acoplamento efático. Neurônios tálamo-corticais, envolvidos na geração do sono de ondas lentas (slow wave sleep; SWS) possuem oscilações de membrana na faixa de delta (0.5 – 4 Hz) (Dossi et al., 1992). Neurônios piramidais do hipocampo possuem oscilações de membrana cuja frequência está próxima da banda de teta, de 2 – 7 Hz (Leung and Yu, 1998; Hu et al., 2002; Bland et al., 2005), e seu máximo de atividade se dá no vale das oscilações teta extracelulares, ou seja, no pico das oscilações teta intracelulares, momento de maior excitabilidade celular (Kamondi et al., 1998). É interessante que estas oscilações se apresentam quando o neurônio está despolarizado ou hiperpolarizado, mas ausentes no potencial de repouso, sugerindo um papel tanto inibitório quanto excitatório das ondas teta sobre as células piramidais (Hu et al., 2002). Em interneurônios também ocorrem oscilações de membrana dependentes de canais de sódio. A sua faixa de frequência é mais variável, desde interneurônios com oscilações na faixa de teta (5 – 15 Hz), registradas no geniculado lateral (Zhu et al., 1999) e no stratum lacunosum-moleculare de CA1 (Chapman and Lacaille, 1999), a oscilações na faixa de gama (20 – 100 Hz) no estriado lateral (Bracci et al., 2003). O acoplamento entre o LFP e as oscilações de membrana de neurônios adjacentes leva a uma coordenação de atividade entre aqueles neurônios, mesmo quando as oscilações extracelulares são tão baixas quanto 0,2 mV ou menos. Demonstrou-se que seu principal efeito é sobre a coordenação temporal dos potenciais de ação, e não a um aumento ou. 18.

(20) diminuição das taxas de disparo (Anastassiou et al., 2010, 2011). Tal efeito pode mediar a criação de assembleias de neurônios e facilitar plasticidade sináptica. O acoplamento efático também pode ser observado em células não-neuronais. As células da glia, que normalmente se encontram próximas às sinapses, estão interconectadas por junções em fenda, cuja permeabilidade se mostra sensível às mudanças do pH externo e aos íons de cálcio e potássio extracelular (Perez-Velazquez et al., 1994; De Curtis et al., 1998; Huang et al., 2005). Além da possível influência das células gliais, as junções em fenda também parecem ter um papel fundamental na geração de oscilações rápidas no hipocampo (Draguhn et al., 1998), tanto pelas junções nas células piramidais (Traub and Bibbig, 2000) como nos interneurônios (Traub et al., 2001). A sua permeabilidade pode ser modulada também por neurotransmissores (Velazquez et al., 1997) e pelo potencial de campo local (Taylor and Dudek, 1982). Os potenciais de ação, por sua vez, possuem uma influência limitada no acoplamento efático. Registros extracelulares do tecido neural mostram dominância de oscilações lentas e uma relativa ausência de disparos (> 500 Hz). Normalmente com a movimentação de eletrodos é possível registrar disparos em um espaço limitado: pequenos deslocamentos levam à perda dos disparos, enquanto que oscilações lentas permanecem quase imutáveis. A estas observações e o fato das oscilações do LFP demonstrarem uma lei de potência 1/f (a amplitude de sinais de maior frequência são atenuados em relação a sinais lentos), diz-se que o tecido neural extracelular possui capacidade de filtragem de oscilações de alta frequência (Bédard et al., 2004; Pettersen and Einevoll, 2008), atuando portanto como um filtro passa – baixo. Esta capacidade é atribuída tanto a um meio extracelular não-homogêneo como a propriedades de filtragem das membranas de dendritos (Bédard et al., 2004; Lindén et al., 2010; Buzsáki et al., 2012). Portanto, disparos possuem um raio de ação muito limitado e só podem ser detectados por eletrodos muito próximos aos neurônios. Uma notável exceção é a evidência de acoplamento efático entre disparos de feixes de axônios mielinizados, tanto em feixes cujos nodos de Ranvier estão alinhados ou desalinhados (Binczak et al., 2001). Portanto, salvo no caso de uma proximidade extrema como a de feixes de axônios, o sinal dos disparos não se propaga pelo meio extracelular tal como o LFP. A filtragem digital incompleta de sinais rápidos, todavia, produz artefatos lentos que podem vazar para bandas inferiores e simular um sinal oscilatório (Zanos et al., 2011); além disto, é possível detectálos mesmo em eletrodos extracelulares sem disparos aparentes, cujas células foram definidas por um limiar (Okun et al., 2010). A menos que o tecido neural filtre as oscilações pelo método de Fourier, é improvável que estes artefatos existam na realidade. Não está bem. 19.

(21) estabelecido se o sinal de disparos que vazaram por causa da filtragem incompleta possui alguma relevância biológica no processamento neural ou se é puramente um artefato; como reflete a atividade de disparos de diversos neurônios, espera-se encontrar correlações funcionais paralelas aos mesmos.. LFP hipocampal Uma das oscilações mais notáveis observadas e intensamente estudadas no sistema hipocampal de roedores são as ondas teta. Este padrão de atividade surge, por exemplo, quando os animais estão ativamente explorando um ambiente, correndo em uma roda de corrida, navegando em um labirinto aquático, ou durante o sono REM (sono de movimento rápido dos olhos; rapid eye movement sleep). As oscilações do potencial de campo local na faixa de teta, todavia, não surgem sozinhas como uma onda única e sinusoidal. As ondas teta ocorrem juntamente com oscilações mais rápidas, chamadas coletivamente de ondas gama (30 - 120 Hz). Estas ondas rápidas estão associadas a processos cognitivos. Vejamos separadamente como surgem estes padrões oscilatórios:. Oscilações Teta O sistema hipocampal apresenta uma oscilação de amplitude relativamente alta na faixa de 4 a 12 Hz denominada teta. Na década de 60 diversas linhas de estudo indicavam uma correlação entre atividade motora e o surgimento de teta em roedores. Sugeriu-se que as ondas teta estavam associadas ao reflexo de orientação, aprendizado e atenção, além da atividade motora espontânea (Adey, 1962; Vanderwolf, 1969; Buzsáki, 2002). Um dos autores mais influentes da área, Vanderwolf correlacionou diversas manifestações comportamentais com o aparecimento e manutenção das oscilações teta. De acordo com Whishaw & Vanderwolf (1973) as oscilações teta aparecem no hipocampo dorsal durante algum comportamento motor voluntário, como nadar, pular, correr, caminhar, pressionar uma barra, mover a cabeça, manipular comida, e durante o sono REM, o que pode ser considerado uma incrível exceção não só pela ausência de locomoção, mas pela quase completa atonia muscular. Todavia, em comportamentos automáticos, como se limpar, mastigar, vocalizar, não há o aparecimento de teta. Posteriormente descobriu-se que os ritmos teta podem ser divididos em teta tipo I e tipo II com base na sua sensibilidade aos efeitos de um antagonista colinérgico, a atropina: enquanto que o teta tipo I é insensível à atropina e possui frequência mais rápida (7 – 8 Hz), o tipo II, mais lento (4 – 5 Hz), é abolido. Em contraste ao tipo II, tipicamente caracterizado pela sua sensibilidade a antagonistas colinérgicos, o tipo I é. 20.

(22) dependente da ativação serotoninérgica do locus coeruleus e GABAérgica do septo medial, mas não de vias noradrenérgicas e dopaminérgicas (Bland, 1986). Provavelmente os ritmos observados nos animais sejam uma combinação dos dois tipos, pois modulações colinérgicas do teta durante comportamentos voluntários são capazes de afetá-los, mas não aboli-los. Um possível mecanismo para o componente colinérgico é o de evitar competição de oscilações na faixa infra- e supra-teta, já que a ativação optogenética de neurônios colinérgicos do septo medial reduz a potência dessas oscilações vizinhas à teta e inibe o aparecimento de sharp-. wave ripples; todavia, tem um efeito mínimo sobre a amplitude, frequência e coerência de teta (Vandecasteele et al., 2014; Mamad et al., 2015). A ativação colinérgica, portanto, provavelmente atua na inibição de redes geradoras de sharp-waves, as células piramidais de CA3. Figura 3. Perfil de profundidade das oscilações teta hipocampais em ratos. Painel esquerdo. Eletrodos lineares com 16 contatos na região CA1 e Giro Denteado. Painel direito. Oscilações teta durante caminhada apresentam mudança gradual na fase assim como presença de ondas rápidas (gama) em porções mais profundas. Retirado de Bragin et al. (1995).. O modelo clássico para a geração do ritmo teta na região hipocampal envolve a criação de pelo menos dois dipolos na região CA1 e DG. Uma via essencial para a geração de teta é a via septohipocampal (Rawlins et al., 1979; Yoder and Pang, 2005). Esta via origina-. 21.

(23) se de neurônios colinérgicos e GABAérgicos na área septal medial e na banda diagonal de Broca (MS-DBB) e, através da fimbria e do fórnix dorsal, envia suas eferências para o sistema hipocampal, respectivamente, para as regiões ventrais e dorsais (Rawlins et al., 1979). Os neurônios GABAérgicos inervam quase todas as classes de interneurônios hipocampais e seu efeito sobre estes neurônios é exclusivamente inibitório (Freund and Antal, 1988). Portanto, a porção GABAérgica da via septohipocampal atua na desinibição e sincronização das células piramidais do hipocampo (Toth et al., 1997; Hangya et al., 2009). Ademais, uma classe de interneurônios hipocampais modulada por esta via inibitória retorna inervações também inibitórias para o septo medial (Figura Suplementar 12), produzindo assim um mecanismo de retroalimentação negativo (Toth et al., 1993; Takács et al., 2008). Já a inervação colinérgica se dá tanto sobre interneurônios como em células piramidais, mas os efeitos são heterogêneos e dependentes dos receptores colinérgicos expressos (m1 e m3 nas piramidais; m2 e m4 nos interneurônios; Levey et al., 1995). Quando as invervações colinérgicas são ativadas, células em cesta, por exemplo, podem responder com uma hiperpolarização, despolarização sustentada ou resposta bifásica (hiperpolarização inicial com despolarização tardia lenta); as células OLM, por sua vez, respondem com despolarização sustentada (Widmer et al., 2006). O efeito resultante é variável; mesmo assim, evidências apontam para uma ativação colinérgica das células teta piramidais (theta-on cells) do hipocampo e inibição dos interneurônios não-teta (theta-off cells; Smythe et al., 1992). O conhecimento da importância do septo e integridade da via septohipocampal para a geração do teta vem de estudos em que lesões nessas áreas foram capazes de abolir o teta tanto do DG quanto do CA1 (Sainsbury and Bland, 1981; Bland and Bland, 1986). Por outro lado, lesões específicas dos neurônios colinérgicos, deixando os neurônios GABAérgicos intactos, levaram a uma diminuição na amplitude do teta, mas não o aboliram completamente (Lee et al., 1994). Ao mesmo tempo, lesões do septo medial (atingindo tanto células GABAérgicas como colinérgicas) ou infusão de muscimol (agonista GABA-A) aboliram o teta hipocampal; infusão de carbacol (agonista colinérgico similar à acetilcolina) e bicuculina (antagonista GABA-A) reinduziu o teta mesmo sem o septo medial (Smythe et al., 1992). Os autores hipotetizaram que as oscilações teta dependem da atuação sinérgica da excitabilidade colinérgica e inibição de interneurônios GABAérgicos, produzindo assim excitabilidade hipocampal. Em contraste com a ideia de que o septo medial e a banda diagonal de Broca são os únicos geradores de teta hipocampal, os dipolos de teta em CA1 parecem ser numerosos; há muitas flutuações na amplitude, coerência e nas fases do teta que são dependentes das. 22.

(24) camadas (Montgomery et al., 2009). Dentre outros possíveis geradores de dipolos de teta, podemos citar a ativação e inibição perisomática das piramidais de CA1 pelas colaterais de Schaffer (de CA3), recorrentes de CA1 ipsi- e contralateral, via dupla de entrada do córtex entorrinal, ou seja, a perfurante direta para CA1 e a perfurante para DG (Brankačk et al., 1993; Bragin et al., 1995; Kamondi et al., 1998; Kocsis et al., 1999; Buzsáki, 2002; Montgomery et al., 2009). Além do teta hipocampal, o córtex entorrinal medial possui um gerador interno de teta nas suas camadas. Enquanto que a camada II possui um teta cuja fase e amplitude são parecidas com o teta observado no DG, a camada III apresenta um teta parecido com o da região de CA1 (Mitchell and Ranck, 1980). Lesões na camada III do córtex entorrinal medial, que projeta a via perfurante direta sobre o stratum lacunosum-moleculare de CA1, elimina um dos dipolos que incide em CA1 (Kamondi et al., 1998), embora não elimine completamente o teta (Montoya and Sainsbury, 1985; Bragin et al., 1995). E, assim como o septo medial tem participação na geração dos dois tipos de teta, evidências apontam participação do entorrinal também na geração pelas duas vias (Montoya and Sainsbury, 1985). Resultados mais recentes demonstram que a região CA1 consegue gerar ritmos teta independente de quaisquer conexões extrínsecas (do hipocampo contralateral e CA3, DG, entorrinal e septo medial ispilaterais). Além disto, este teta em CA1 isolado demonstrou reversão de fase e aumento da amplitude em direção à fissura, resistência à atropina e frequência compatível com registros in vivo (Goutagny et al., 2009; Figura 3 e 4). Os autores também demonstraram que o teta de CA1 isolado depende apenas de receptores AMPA/cainato e receptores GABA-A. Portanto, as oscilações teta são geradas localmente, utilizam a circuitaria interna de CA1 (essencialmente dos ciclos de retroalimentação negativa dos interneurônios) e são moduladas pela circuitaria extrínseca.. 23.

(25) Figura 4. Perfil laminar das oscilações teta. Em A o perfil laminar foi realizado por Bragin et al. (1995) e demonstra aumento da potência de teta em direção à fissura hipocampal (hf; Aa), alta coerência em todo o eixo de profundidade (Ab) e reversão de fase a partir da camada piramidal (Ac). Em B os resultados foram reproduzidos por Lubenov & Siapas (2009). Em Ba estão mostradas as oscilações de teta como uma superfície (cores vermelhas são o pico; cores azuis, vale) ao longo do tempo (eixo x) e simultaneamente em todas as camadas de CA1 (eixo y; linha horizontal marca a camada piramidal de CA1). Em Bb está a fase (vermlho) e potência (azul) de teta. Note novamente reversão abaixo da camada piramidal e aumento de potência em direção à fissura hipocampal. E em Bc está a coerência de teta ao longo do perfil de profundidade. Retirado e adaptado de Bragin et al. (1995) e Lubenov & Siapas (2009).. Propagação de ondas Ao longo do eixo septo-hipocampal há diversos geradores internos de teta que atuam em conjunto para gerar e propagar as oscilações teta (Goutagny et al., 2009; Lubenov and Siapas, 2009). O septo medial e a banda diagonal de Broca inervam de forma diferenciada CA1 e CA3 ao longo do eixo septotemporal: o septo medial envia fibras para porções. 24.

(26) ventrais e a banda diagonal de Broca para as regiões dorsais (Nyakas et al., 1987). Tomada como um todo, a circuitaria septohipocampal pode estar relacionada à capacidade de propagação das oscilações teta ao longo do eixo septotemporal (Lubenov and Siapas, 2009; Patel et al., 2012) através da criação de áreas sucessivas de inibição e ativação no MS-DBB: uma vez que estas áreas vão percorrendo o MS-DBB, sucessivas porções do eixo septotemporal do hipocampo vão sendo ativadas pelos neurônios GABAérgicos marca-passo do MS-DBB, que sabidamente estão presentes na região (Sotty et al., 2003). A onda de disparos neuronais associados que ocorre no hipocampo fornece também sucessivas ondas de inibição sobre o MS-DBB, pois ativam em sincronia interneurônios hipocampais que enviam eferências para os neurônios colinérgicos e GABAérgicos do MS-DBB (Toth et al., 1993). Como os neurônios GABAérgicos do MS-DBB inibem através de colaterais outros neurônios GABAérgicos locais (Figura Suplementar 12), e embora o retorno inibitório do hipocampo possa desinibir células adjacentes, os próprios neurônios GABAérgicos do MS-DBB sincronizam outros neurônios locais pelo envio de colaterais recorrentes (Borhegyi et al., 2004). Por fim, este mecanismo de propagação sustenta também um mecanismo de associação de informações espaciais e emocionais pelos dois polos do hipocampo, fazendo com que informações heterogêneas saiam do hipocampo em salvas coerentes. Evidências mostram que esta via não é essencial para a geração e manutenção do teta hipocampal (Rawlins et al., 1979); todavia ainda se desconhece seu efeito sobre a propagação.. Navegação e memória O hipocampo tem um papel central no aprendizado, consolidação, evocação, reconsolidação e extinção de memórias (Squire, 1992; McGaugh, 2000; Debiec et al., 2002; Bannerman et al., 2004; Suzuki et al., 2004). As células de CA1 apresentam enorme capacidade de plasticidade sináptica, evidenciada pela potenciação de longa duração (long term potentiation – LTP) e apontada como um modelo sináptico para a aquisição e consolidação de memórias (Bliss and Collingridge, 1993; Izquierdo and Medina, 1995). Demonstrou-se também que a indução de LTP em CA1 ocorre de forma ótima quando realizado na frequência de estimulação de teta (Larson et al., 1986). Quando realizada in vivo com o animal anestesiado, observou-se que indução de LTP por estimulação de alta frequência depende da fase do teta: quando a estimulação é feita no pico, induz-se LTP; quando é feita no vale ou na fase zero, não há efeito. Todavia, após a indução de uma LTP, também foi observado que pulsos na fase negativa do teta reverteram a indução da LTP, provocando uma depotenciação (Hölscher et al., 1997). Também se observou que o. 25.

(27) hipocampo atua em conjunto com o córtex prefrontal pelo acoplamento das fases do teta, aumento de coerência e aumento de amplitude após um estímulo condicionado (Paz et al., 2008). As ondas teta estão relacionadas a uma série de resultados convergentes: aprendizado (Berry and Thompson, 1979; Seager et al., 2002; Griffin et al., 2004), atenção (Bennett et al., 1973), associação de itens em contextos diferentes (Tort et al., 2009), novidades ambientais (Jeewajee et al., 2008), memória espacial (Winson, 1978), tomada de decisão (Jones and Wilson, 2005; Tort et al., 2008; Benchenane et al., 2010; Belchior et al., 2014). Ademais, demonstrou-se uma perda de desempenho no aprendizado e memória em animais cujo teta foi inibido por lesão ou infusão de drogas no septo medial (Berry and Thompson, 1979; Mitchell et al., 1982; Givens and Olton, 1990), infusão de antagonistas colinérgicos (Solomon et al., 1983) e agonistas GABAérgicos (Givens, 1995) no hipocampo. A maior parte dos estudos é realizada em roedores e coelhos, mas as evidências do papel cognitivo do teta convergem para primatas humanos e não humanos (Kahana et al., 2001). Vertes (2005) propõe que o ritmo teta seja uma etiqueta para a memória (tag): eventos que ocorrem com o teta seriam classificados como importantes e, assim, consolidados; eventos que ocorrem sem o teta, por outro lado, são eventos menos importantes ou insignificantes, e assim não seriam codificados. Seu mecanismo seria co-ativar regiões responsáveis pelas etiquetas, como o hipocampo, a amígdala e o córtex pré-frontal, além de modular no nível sináptico a LTP (seja pela própria potenciação ou depotenciação; neste caso chamado de synaptic tag).. Oscilações Gama Oscilações gama são ondas do potencial de campo na faixa de 30 a 100 Hz (Buzsáki and Wang, 2012). Evidências apontam que estas oscilações surgem pela somação espacial e temporal de potenciais pós-sinápticos, tanto de PIPS como PEPS (Buzsáki and Vanderwolf, 1983; Soltesz and Deschenes, 1993; Steriade et al., 1996; Traub et al., 1996a, 2003; Penttonen et al., 1998), ocasionados pelas redes de interneurônios (Traub et al., 1996a, 2001; Bartos et al., 2002) e pela interação de interneurônios e neurônios piramidais (Fries et al., 2007). Modelos computacionais revelam um forte componente no tempo de decaimento dos potenciais inibitórios para a geração de gama (Kopell et al., 2010). Estas oscilações de membrana ocasionam o aparecimento de fontes e sumidouros de íons (source and sink) no meio extracelular pela sua capacidade de sincronizar suas oscilações de membrana (Penttonen et al., 1998). Embora seja fonte de discussão se estas cargas no meio extracelular são capazes ou não de influenciar membranas adjacentes ou até mesmo se propagar para locais mais distantes, nota-se um crescente consenso na visão operante dos acoplamentos. 26.

(28) efáticos. Nesta visão, as oscilações não são meros epifenômenos da computação interna de uma célula, sem qualquer efeito, mas sim que são capazes de influenciar outras células sem utilizar disparos para tal (Young and Eggermont, 2009; Anastassiou et al., 2010, 2011). A visão analógica-digital de transmissão de informação (respectivamente, LFP e disparos) sustenta que as oscilações gama sejam capazes de refinar e aproximar uma rede de neurônios de forma a deixar seus disparos mais sincronizados, permitindo plasticidade sináptica, seja de estruturas próximas ou distantes (Traub et al., 1996b; Fell and Axmacher, 2011). Além de recrutar e formar (por plasticidade sináptica) assembleias de neurônios, as oscilações gama estão correlacionadas com roteamento de informações (Colgin et al., 2009), atenção seletiva (Ray et al., 2008c), memória de trabalho (Howard et al., 2003; Kamiński et al., 2011), e codificação e evocação de memórias (Sederberg et al., 2003; Osipova et al., 2006; Montgomery and Buzsáki, 2007). Montgomery & Buzsáki (2007) demonstram que as regiões CA1 e CA3 do hipocampo de ratos acoplam-se na faixa de gama quando o animal realiza uma tarefa de memória. O maior acoplamento entre as duas estruturas se dá justamente no momento de grande demanda cognitiva, em que o animal deve tomar uma decisão. Igarashi et al. (2014) encontraram que o córtex entorrinal lateral se acopla a CA1 utilizando a faixa lenta do gama (20 – 40 Hz) na resolução de uma tarefa espacial associativa. Além da origem de gama estar nos potenciais de membrana das células, muitas células disparam preferencialmente em certas fases das oscilações gama (Senior et al., 2008; Sirota et al., 2008). Tanto as células piramidais como alguns interneurônios estão acoplados à fase de gama no hipocampo (Csicsvari et al., 2003; Klausberger and Somogyi, 2008) e no córtex entorrinal (camadas II e III; Chrobak and Buzsáki, 1998). As células biestratificadas apresentam o acoplamento mais forte. Estas mesmas células possuem o pico de atividade no vale do teta e respondem fortemente às oscilações ripples, de forma muito semelhante às células piramidais de CA1 (Klausberger et al., 2004). Também acopladas, embora mais fracas do que as biestratificadas, em ordem de força de acoplamento estão as células em cesta positivas para parvalbumina (que também se acoplam aos ripples), células axo-axônicas e as células OLM, cujo acoplamento ao gama é considerado baixo ou ausente (Tukker et al., 2007). As células biestratificadas e em cesta, portanto, compartilham diversas semelhanças: ambas influenciam as regiões somáticas e perisomáticas das células piramidais, estão acopladas à teta, à gama e às oscilações ripples. Estas células sofrem estreita influência das vias aferentes de CA3 e influenciam as piramidais em momentos críticos da somação espacial para tomada de decisão de disparo. As células axo-axônicas e em cesta, apesar de contribuírem significativamente para as oscilações de gama (e apresentarem coincidência de. 27.

(29) pico de atividade, ambas no pico do teta), têm picos que atividade que não coincidem com o pico de atividade das piramidais. Como estas células recebem aferências do córtex entorrinal, é possível que sua ativação no pico crie condições de inibição global sobre as piramidais, já que ocorre durante a maior amplitude de gama no hipocampo, e permita apenas a ativação das células cujas entradas foram mais fortes (durante a precessão de fase conforme o animal avança em um campo de lugar, células fortalecidas passam a ‘subir’ na fase do teta). Já as células biestratificadas podem atuar na criação e manutenção de sequências de assembleias durante uma tarefa (como nos replays) e durante o sono SWS, nos episódios de ripples (Klausberger et al., 2003). As células OLM, por fim, apesar de não participarem ativamente da geração de gama, podem atuar como porteiros para a entrada de gama, seja pela via do entorrinal ou pela via do CA3 (Leão et al., 2012), envolvidas indiretamente na modulação de gama. Modelos de precessão de fase das células piramidais de CA1 sugerem um desacoplamento (desinibição) das redes de interneurônios, permitindo que as células se ativem mais cedo (Fries et al., 2007). Evidências apontam que interneurônios, tais como as células biestratificadas e em cesta, acompanham as piramidais na precessão de fase; todavia, não se ativam antes, mas sim depois das piramidais, sugerindo que estas recrutam os interneurônios para criar um efeito a jusante sobre outras células (Maurer et al., 2006; EgoStengel and Wilson, 2007). Por este mecanismo, células piramidais que conseguiram se ativar atuam na inibição de outras células (como outras células de lugar; place cells, veja Introdução Suplementar) de forma a diminuir ativação inespecífica (evitando que uma célula de lugar se ative fora do seu campo de lugar, por exemplo).. Acoplamento entre frequências As oscilações elétricas do encéfalo não são completamente independentes (Fell and Axmacher, 2011). Diversos modelos de interação e evidências empíricas demonstram a existência de acoplamento entre oscilações de baixa e alta frequência de uma forma muito similar às telecomunicações (Agarwal et al., 2014; Lever et al., 2014; Figura 5). Potencialmente, as oscilações de alta frequência, como a gama, podem se acoplar a oscilações de frequência menor, como a teta, de diversas formas: fase – amplitude (Colgin et al., 2009; Belluscio et al., 2012; Scheffer-Teixeira et al., 2012), fase – fase (Belluscio et al., 2012), amplitude – amplitude (Bruns and Eckhorn, 2004; Witte et al., 2008), frequência – frequência (Witte et al., 2008), ou quaisquer outras combinações de características oscilatórias (Jensen and Colgin, 2007a; Tort et al., 2008, 2010; Colgin et al., 2009; Belluscio et al., 2012; Buzsáki. 28.

(30) and Wang, 2012b; Scheffer-Teixeira et al., 2012; Jirsa and Müller, 2013; Hyafil, 2015; Hyafil et al., 2015). Em todos os casos um acoplamento bem-sucedido entre duas frequências significa que uma determinada característica (fase, amplitude ou frequência) de uma oscilação está correlacionada (positiva ou negativamente) com uma característica de outra banda de frequência. Outra forma de encarar o acoplamento é considerar a capacidade de prever em que estado uma das características se encontra dado o registro de uma outra. Por exemplo, em um acoplamento fase – amplitude, dado que uma determinada fase foi registrada, a probabilidade da amplitude ser maior (ou menor) difere do acaso (e vice-versa). Embora geralmente se assuma que a frequência moduladora seja sempre a menor (Hyafil et al., 2015), faltam provas definitivas e análises de causalidade direcional (mas veja Jiang et al., 2015), além de não se poder descartar a presença de um terceiro oscilador atuando como “marca-passo” de dois osciladores independentes, mas que se apresentam acoplados.. Figura 5. Diferentes tipos de acoplamento entre frequências. Diversas características de uma oscilação lenta (oscilação representativa no topo), tais como fase, amplitude e frequência, podem ser correlacionadas com características de oscilações mais rápidas (as demais oscilações representativas). (A) Amplitude x amplitude; (B) Fase x fase, também conhecido como acoplamento n:m. (C) Fase x frequência. (D) Fase x amplitude. Retirado de Jensen and Colgin (2007).. Quantificação dos acoplamentos Phase – Amplitude Coupling (PAC). O acoplamento fase – amplitude entre duas bandas de frequências visa estabelecer se existe alguma fase preferencial de uma oscilação. 29.

(31) em que a amplitude de uma segunda oscilação é significativamente maior (Figura 6). O PAC é quantificado pelo grau de homogeneidade da distribuição das amplitudes de acordo com os bins das fases. Nesta análise filtramos duas bandas de frequência de interesse (por exemplo, teta: 4 -12 Hz; e gama alto: 60 – 100 Hz). Do sinal filtrado obtemos a série de fases de uma oscilação e o envelope de amplitude do outro, tipicamente realizado pelo método de Hilbert. Com estas duas séries temporais em mãos, particionamos as fases em intervalos iguais, os chamados bins (ou janelas) de fase (normalmente utilizamos bins de 20°). Por fim, coletamos os índices das fases que satisfazem cada intervalo de bin e buscamos a média das amplitudes instantâneas da outra oscilação. Portanto, para cada par de frequência, obtemos uma distribuição de amplitudes pelos bins de fase. Se esta distribuição for uniforme, concluímos que não há acoplamento entre a fase e a amplitude das duas oscilações. Se a distribuição não for uniforme, ou seja, se possuir determinadas fases em que a amplitude média é maior (ao passo que em outras fases será menor), dizemos que há acoplamento entre fase e amplitude. Para quantificar, portanto, o quanto esta distribuição se desvia de uma uniforme, diferentes métodos foram propostos (Penny et al., 2008; Tort et al., 2008, 2010; Young and Eggermont, 2009; Jirsa and Müller, 2013; Hyafil et al., 2015; van Driel et al., 2015). É possível utilizar métodos tão simples quanto a diferença entre a amplitude máxima e mínima normalizada pela amplitude máxima (Tort et al., 2010). No nosso trabalho a métrica utilizada é uma medida de entropia normalizada, a que denominamos de índice de modulação (modulation index, MI). Esta métrica foi desenvolvida incialmente para medir acoplamento fase – fase (Tass et al., 1998; Hurtado et al., 2004). Posteriormente, Tort et al. (2008) adaptou-a para utilizá-la como uma métrica de fase – amplitude. Esta adaptação, portanto, será utilizada ao longo deste trabalho. A métrica usada pela entropia tem o benefício de detectar qualquer desvio da distribuição uniforme, e não necessariamente uma distribuição unimodal. A entropia normalizada é uma outra forma de se expressar a divergência de Kullback-Leibler para a distribuição uniforme e a observada (ou verdadeira). Este método estatístico foi desenvolvido para comprar a equivalência entre duas distribuições e representa o ganho de informação ao se abandonar uma distribuição (no nosso caso a uniforme) e adotar uma distribuição alternativa (a observada). Outros métodos para avaliar o PAC foram desenvolvidos. Cohen (2008), por exemplo, realizou análise de potência espectral do envelope de amplitude da oscilação de interesse. O autor concluiu que um pico no espectro de potência significa a existência de uma modulação entre a fase daquela frequência que surgiu no pico do espectro e a amplitude da oscilação inicial de interesse. Outra forma é utilizar a mesma métrica do acoplamento fase – fase (Cohen, 2008; Penny et al., 2008). Neste caso, ao invés de obtermos. 30.

(32) a fase da banda rápida de frequência, as fases são obtidas do envelope de amplitude desta mesma banda rápida. As fases do envelope da banda rápida, então, são comparadas com as fases da banda lenta (neste caso, do sinal filtrado nativo, e não do seu envelope). Portanto, se o envelope da banda rápida e o sinal filtrado da banta lenta covariarem, a diferença entre as fases deverá ser constante, indicando acoplamento fase – amplitude. Notamos também que a bicoerência e acoplamento bifase (biphase-locking), originalmente idealizadas para medir acoplamento fase – fase, recentemente foram apontadas como métricas de fase – amplitude (Hyafil, 2015). Por fim, notamos que processos naturais provocam flutuações que podem resultar em distribuições ligeiramente acopladas, mas que deixam dúvidas sobre a sua significância biológica. Existem diversas formas de estabelecer quão desviada a distribuição observada deve estar em relação a uma distribuição uniforme para o efeito ser considerado significativo. Levando em conta que processos artificiais podem também levar a acoplamentos significativos, como oscilações harmônicas vindas de deflexões rápidas do sinal, ou apenas da não-sinusoidalidade dos sinais neurais, nós utilizamos alguns procedimentos para averiguar a existência e significância dos acoplamentos: (1) comparamos o acoplamento original com algumas distribuições surrogadas (discutidas no Artigo IV), principalmente com formas conservadoras (por exemplo, uma das séries temporais do par é quebrada aleatoriamente e invertida antes do cálculo da distribuição – utilizada na avaliação de PAC do Artigo III); (2) efetuamos inspeção visual do sinal cru sobreposto com os sinais filtrados; (3) realizamos a análise de média do sinal de LFP em volta do pico de amplitude do sinal rápido de interesse: neste caso esperamos encontrar um padrão oscilatório (avaliado no Artigo I). Phase – Phase Coupling (PPC). O acoplamento fase – fase ocorre quando a série temporal das fases de duas bandas de frequência covariam no tempo (Figura 7). O acoplamento pode ser entre duas bandas idênticas, como analisado na coerência, ou entre bandas de frequência diferentes, conhecido como acoplamento n:m. Tal denominação é utilizada pois para cada n ciclo de uma banda mais lenta ocorrem m ciclos de uma banda mais rápida. Para quantificar este acoplamento, há técnicas muito parecidas com a métrica do PAC, como já mencionado. No nosso trabalho o PPC será avaliado da seguinte forma (explicado em detalhes no Artigo IV): (1) obtemos a série temporal das fases das bandas de frequências lenta e rápida; (2) aceleramos a banda lenta de 1 até 40 vezes (equivalentes às suas harmônicas 7 Hz, 14 Hz, ... , 40*7 Hz); (3) para cada aceleração, obtemos a diferença entre as frequências da banda de frequência rápida original e a acelerada; (4) da distribuição da diferença de frequências obtemos uma métrica: o vetor resultante médio (obedecendo à. 31.

(33) forma utilizada em Belluscio et al. (2012)); (5) repetimos o procedimento para cada combinação n:m para obter um gráfico do vetor resultante de cada combinação; (6) por fim, observamos qual foi o multiplicador m que produziu o maior valor e qual o tamanho do efeito observado. Em conjunto com esta análise também realizamos um histograma de duas dimensões (fase da banda lenta vs fase da banda rápida). Neste gráfico, dividimos em intervalos as fases das bandas lenta e rápida e contamos as co-ocorrências entre as combinações de intervalos. Caso exista um acoplamento, esperamos ver um padrão de bandas diagonais cuja quantidade deve refletir o multiplicador m. Note, portanto, que esta métrica depende da ocorrência de ciclos entre frequências harmônicas e é independente da amplitude do sinal. Os mecanismos para que ocorra com sucesso este acoplamento são: (1) estabilização da frequência de duas oscilações harmônicas; (2) co-existência de acoplamento frequência – frequência entre frequências harmônicas (por ex., se a frequência de uma oscilação de 6 Hz está acoplada com uma de 30 Hz, caracterizando um acoplamento n:m de 1:5, então um incremento na frequência lenta para 7 Hz deve resultar em m incrementos na frequência superior, ou 35 Hz); (3) acoplamento fase – amplitude em conjunto com fase – fase: neste caso o aumento de amplitude atua como um proxy para a existência da oscilação rápida (e não um mero ruído). Dado que a oscilação rápida ocorreu, seus ciclos podem se apresentar constantes em relação à oscilação lenta apenas nesta condição de alta amplitude. Este mecanismo é testado no artigo IV.. 32.

(34) Figura 6. Índice de modulação e comodulograma. O sinal cru (a) é filtrado em duas bandas de interesse, uma banda lenta (b) e outra rápida (c). Da banda lenta estimam-se as fases pelo método de Hilbert (d); para a banda rápida, calcula-se o envelope de amplitude (e). Com a obtenção das duas séries temporais (f), as fases são divididas em intervalos e um histograma das amplitudes médias em cada intervalo é criada (g). Por fim, desta distribuição calcula-se o índice de modulação (MI) utilizando a fórmula da entropia normalizada (h). Para construir o comodulograma (f) realiza-se esta análise par-a-par varrendo todas as frequências de fase e amplitude. Retirado de Tort et al. (2008).. 33.

(35) Figura 7. Acoplamento n:m fase – fase entre teta e gama. (A) Histograma em duas dimensões da fase do teta pela fase do gama. Esquerda: histograma dos dados originais. Direita: histograma de dados surrogados. Note as bandas diagonais representando as múltiplas repetições do ciclo gama sobre um único ciclo de teta. (B) Painel superior: Vetor médio resultante para diferentes distribuições n:m. Note picos nos multiplicadores de teta equivalentes ao LG e HG. Painel inferior: histograma circular demonstrando o vetor resultante médio, utilizado como métrica para o acoplamento fase – fase neste trabalho. Retirado e adaptado de Belluscio et al. (2012).. Amplitude (Frequency) – Frequency (Amplitude) Coupling (AAC, FFC, FAC ou AFC). O acoplamento entre frequência ou amplitude de uma banda de frequência lenta e a frequência ou amplitude de uma banda rápida pode ser avaliado também de diferentes formas (Young and Eggermont, 2009; Jirsa and Müller, 2013; Hyafil et al., 2015). Nós reduzimos todas as combinações a um método relativamente simples. O acoplamento entre frequência e amplitude é calculado da seguinte forma: (1) detectamos todos os ciclos lentos do sinal; (2) fazemos uma varredura neste sinal para detectar épocas de amplitude alta, independente se a análise será amplitude ou frequência, pois isto é uma garantia adicional que de fato aquela. 34.