FITASE: ASPECTOS GERAIS E SUAS PRINCIPAIS APLICAÇÕES
Valéria França de Souza 1
Flávia de Floriani Pozza Rebello 2
José Luis Ramirez Ascheri 3
RESUMO
Enzimas são um grupo de substâncias orgânicas de natureza geralmente protéica (existem também enzimas constituídas de RNA, as ribozimas), com atividade intra ou extracelular que têm funções catalisadoras. O objetivo deste trabalho apresenta breve revisão bibliográfica sobre fitase, abordando a importância, o processo de obtenção e suas aplicações. As enzimas possuem um amplo campo de aplicações, como por exemplo, na indústria de alimentos, indústrias químicas, farmacêuticas, nas indústrias de couro, nas indústrias têxteis, no tratamento de efluentes e em rações animais. A fitase, ou mio-inositol-hexafosfato fosfohidrolase, é uma fosfatase fitato-específica que cataliza a hidrólise do ácido fítico, ou mio-inositol-hexafosfato, formando inositol e fosfatos. Conclui que o uso de fitase também proporciona menor impacto ambiental.
Termos para indexação: Fitase, fósforo, indústrias.
PHYTASE: GENERAL ASPECTS AND ITS APPLICATIONS
ABSTRACT
Enzymes are a group of organic substances usually protein in nature (there are enzymes made of RNA, ribozymes, with activity wich is intracellular or extracellular functions catalyst. This paper presents a brief literature review on phytase, addressing the importance of the process of obtaining and its applications. Enzymes have a wide range of applications, such as in the food industry, chemical, pharmaceutical, leather industries, textile industries, in wastewater treatment and animal feed. The phytase or myo-inositol-hexaphosphate fosfohidrolase is a pyhtate-specific phosphatase that catalyzes the hydrolysis of phytic acid or myo-inositol-hexaphosphate, inositol and phosphate form. Concluded that the use of phytase also provides less environmental impact.
Index terms: Phytase, phosphorus, industries.
1 Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, vssouzafrana@
gmail.com
2 Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, flavi.rebello@
gmail.com
INTRODUÇÃO
O fitato é um composto presente principalmente nas paredes celulares dos grãos de soja e milho. É um composto cíclico (inositol) contendo seis grupos fosfato, representando cerca de 1-1,5% da matéria seca do grão (DRACKLEY, 2000).
Assim, estes grãos e seus subprodutos constituem uma importante fonte de fósforo, sendo amplamente utilizado em rações animais (AO et al., 2007).
Porém, para que este fósforo seja absorvido, é necessária a presença de uma enzima específica, denominada fitase. Os animais monogástricos, como as aves e suínos, no entanto, não produzem esta enzima, ou não a produzem em quantidades suficientes para transformar este fitato em fósforo inorgânico (SILVA et al., 2005). O fósforo inorgânico é fundamental para o desempenho destes, participando de uma série de reações metabólicas, além de contribuir para uma maior absorção de cálcio, importante para a formação óssea (POWERS et al., 2006) e disponibilizar outros minerais importantes para o seu desenvolvimento, que se encontravam na forma de quelatos com o fitato, principalmente os minerais bivalentes como: ferro, cálcio, cobre e zinco (CUNEO et al., 2000).
Se o fósforo não for absorvido pelo organismo animal, ele será totalmente excretado nas fezes e urina, causando um enorme impacto ambiental, uma vez que o fósforo é extremamente tóxico pra peixes, além de causar eutrofização de lagos, rios e lagoas (AO et al., 2007; BEAULIEU, 2005; SELLE, 2007).
Os dejetos excretados pelos animais têm como principal destino a utilização como adubo orgânico, por serem constituídos de uma excelente fonte de minerais (fósforo, cálcio, magnésio e manganês) para nutrição de plantas, inclusive soja e milho (CHENG e HARDY, 2002).
Assim, o manejo adequado da adubação viabiliza a produção do próprio animal em seu novo ciclo, uma vez que a concentração nutricional dos dejetos determina a quantidade a ser aplicada no solo de forma sustentável, e neste caso, a concentração de fósforo no dejeto é de maior importância que o nitrogênio (LUDKE et al., 2000). Além disso, o fósforo é um dos suplementos minerais de maior custo na formulação das rações (CHENG e HARDY, 2002). A fitase (mio-inositol-hexaquifosfato fosfohidrolase (EC 3.1.3.8)) é uma enzima encontrada em grande concentração em sementes de plantas, cereais em grãos, alguns tipos de fungos (Aspergillus niger), bactérias do tipo Enterobactericiae, leveduras e microorganismos do rúmen (SILVA, 2003).
Durante o período de incubação dos grãos, o fitato de sódio (substrato sintético), é hidrolizado à ésteres fosfatos de mio-inositol menores por meio de uma série de reações de fosforilação, liberando o fósforo inorgânico, sendo o fósforo um mineral essencial para o desenvolvimento adequado dos animais e para a formação óssea destes, além de participar do metabolismo e síntese protéica (NAVES, 2009).
A síntese de fitase realizada na membrana celular de fungos é comercialmente a forma mais comum
A atividade da fitase é expressa como sendo a quantidade de enzima capaz de hidrolisar 1 micromol de fosfato inorgânico (PO-4 ) por minuto proveniente de 1,5mM em pH 5,5 e a temperatura de 37ºC, expresso em unidades de fitase, PU ou FTU (YI et al., 1996).
Alguns fatores que podem afetar a capacidade da fitase em hidrolisar o fitato no trato digestivo dos monogástricos, como: a variação de pH, temperatura e o tempo de passagem do alimento pelo trato gastrointestinal (SILVA, 2003).
O tipo do alimento (quantidade e origem do fitato) a dose de fitase empregada e a idade do animal também influenciam a atuação da fitase (JONGBLOED et al., 1992).
A presença e a atividade da fitase variam dentro de uma mesma ordem botânica e espécie, podendo esta perder atividade em pH ácido (a fitase atua melhor em pH entre 6,0 e 8,0 (CHOI et al., 2001; KEROVUO et al., 1998; KIM et al., 1998; POWAR e JAGANNATHAN, 1982; SHIMIZU, 1992; YOON et al., 1996) ou pelo processamento (BORGES, 1997).
Atualmente, a fermentação no estado sólido (FES) tem despertado maior interesse, em função dos bons rendimentos (LIMA, 2009).
DEFINIÇÃO
Enzimas são proteínas de configuração globular, constituída de estrutura terciária ou quaternária, cuja função principal é atuar como catalisador biológico, acelerando a velocidade de diversas reações químicas no organismo, sem contudo serem modificadas durante o processo (CHAMPE e HARVEY, 1989). Possuem alta especificidade e estão associadas à todos os eventos metabólicos.
As enzimas digestivas apresentam um sítio ativo que permite-lhes atuarem na quebra de uma determinada ligação química (PENZ JÚNIOR, 1998), sob condições ótimas de pH, umidade e temperatura.
Segundo Kies (1996) a fitase é definida como uma fosfatase que hidrolisa um ou mais grupos fosfato.
Os grãos que fazem parte das dietas de suínos e aves contém fósforo sob a forma de fitato.
A indisponibilidade deve-se a quantidade de fósforo e cátions bivalentes como o cálcio, ferro, magnésio, manganês, zinco, cobre, etc que apresentam-se quelatados à molécula de ácido fítico ou ácido mio-inositol hexafosfórico, ou simplesmente fitato. Por estarem indisponíveis há uma redução na absorção de aminoácidos, além de haver maior inibição da atividade das enzimas tripsina, pepsina e amilases (ZANELLA,1999)
A interação entre fitatos e proteínas é dependente das condições de pH e ocorre por ligação iônica, de forma que em valores baixos de pH, ocorre formação de ligações eletrostáticas do fitato com resíduos de aminoácidos básicos como: a arginina, lisina e histidina formando um complexo insolúvel. Ao se aproximar do ponto isoelétrico em que a carga da proteína é neutra não haverá ligação com fitato (COUSINS,1999).
A ação da fitase começa na hidrólise do fosfato na posição 3. Em seguida, hidrolisa-o na posição 4, 5, 6 e por último na posição 1. O sexto grupo fosfato (na posição 2) não é hidrolisado pela fitase (KIES, 1996).
A absorção do fósforo ocorre principalmente no duodeno, através de difusão ativa e passiva, sob forma de fosfato inorgânico ou ortofosfato (PO4 -3), podendo também ser absorvido por alguns fosfolipídios.
IMPORTÂNCIA
A biotecnologia vem empenhando-se em buscar novas alternativas no sentido de melhorar o valor nutricional dos alimentos. São produzidas enzimas exógenas as quais atuam da mesma forma que as endógenas, apresentando sítios ativos que atuam em substratos específicos, hidrolizando-os. Essa ação catalítica é determinada pela estrutura primária, secundária, terciária e quaternária das enzimas. Assim, o pH é fator fundamental, uma vez que alterações no pH afetam a dissociação do ácido fítico (MROZ e JONGBLOED,1998). Qualquer alteração na estabilidade das enzimas ocasiona uma alteração na estrutura das mesmas podendo levar à perda de sua capacidade catalítica (PENZ Jr, 1998).
A fitase hidrolisa a ligação fósforo-proteína, removendo os efeitos proteolíticos negativos do ácido fítico e aumentando assim a digestão e absorção de proteína e aminoácidos (RAVINDRAN e BRYDEN, 1997).
PROCESSO DE OBTENÇÃO
Atualmente há duas formas de obtenção da fitase: pelo método de fermentação em estado sólido (SSF) e pelo método de fermentação submersa (SmF). De acordo com Vats et al (2004) alguns fatores devem ser considerados na escolha do método mais adequado à sua obtenção, tais como: concentração, disponibilidade dos nutrientes, condições da cultura, natureza do substrato.
A produção de amilases, celulases e fitases é amplamente obtida pelo método de fermentação em estado sólido (BOGAR et al., 2003).
A produção de fitase pelo Aspergillus ficumm (AF) NRRL 3135 vem sendo realizada pelos diferentes métodos: fermentações em estado sólido (EBUNE et al.,1995), semi-sólido (HAN et al.,1987) e submersão (HOWSON et al.,1983; ULLAH et al.,1987).
Ebune et al (1995) realizou um experimento utilizando a fitase oriunda de Aspergillus ficumm, utilizando óleo de canola. Estes autores observaram que o tempo de inoculação influencia significativamente a síntese enzimática.
Segundo Bogar et al. (2003) existem fitases produzidas pelos fungos Aspergillus niger e Aspergillus
ficumm pelo método de fermentação submersa. Porém, este
método é inviável economicamente.
Pandey et al (1999) relata que o método mais indicado para a produção de fitase é o da fermentação em estado sólido. A mesma conclusão foi obtida por BOGAR et al., 2003 que sugeriram que a fitase seria melhor produzida
por fungos filamentosos pelo método de fermentação em estado sólido utilizando substratos adequados. O produto cru obtido por essa fermentação pode ser utilizado em rações de aves funcionando como suplemento enriquecedor da dieta, uma vez que o produto obtido não contém apenas fitase sendo constituído também por outras enzimas. A proteína e os ácidos orgânicos produzidos podem também melhorar a digestibilidade por atuarem sobre as células vegetais que contém o fitato (PAPAGIANI et al., 1999; MANDVIWALA et al., 2000; PANDEY et al., 2001).
A produção de fitase utilizando a bactéria
Escherichia coli com glicose como substrato e um nível
médio de oxigênio geralmente utilizado nesses testes foi testada por Kleist et al., 2003. Esses autores observaram que o rápido consumo da glicose reduziu a concentração de oxigênio entre 5 e 10%, ocasionando um aumento da atividade enzimática (120 Uml) em um menor tempo (KLEIST et al., 2003)
Segundo Bogar et al (2003), a produção de fitase obtida pelo Mucor racemosus utilizando o método de fermentação em estado sólido, apresentaram melhores resultados em uma umidade de 71%, pH de 5,5 e uma temperatura de incubação de 25ºC. A produção praticamente foi o dobro com a suplementação de fontes de nitrogênio e carbono (de 14,5 IU/g MS para 26 IU/g MS). Isso mostra que a qualidade dessas fontes são pontos críticos e extremamente importantes sob o ponto de vista econômico. Os autores observaram que a fermentação em estado sólido foi mais eficaz que a fermentação submersa e com menor custo sendo a mais aplicável à suplementação de fitase nas dietas de aves.
PRINCIPAIS APLICAÇÕES INDUSTRIAIS
A indústria de alimentos tem interesse em utilizar as fitases para aumentar a biodisponibilidade de minerais, reduzindo o conteúdo de fitato de um determinado alimento, principalmente os alimentos derivados da soja e do milho. Além disso, as fitases podem ser utilizadas para a produção de alimentos funcionais, facilitando a absorção de fósforo. O uso de fosfatos provenientes de mio-inositol têm sido sugeridos por apresentar efeitos terapêuticos à humanos e animais, diminuindo o risco de doenças cardiovasculares (JARIWALA et al., 1990 e POTTER, 1995), reduzindo a formação de cálculos renais (MODLIN, 1980 e OHKAWA et al., 1984) e vários tipos de cânceres (BATEN et al., 1989; GRAF e EATON, 1993; SHAMSUDDIN, 2002; SHAMSUDDIN et al., 1997; ULLAH e SHAMSUDDIN, 1990; VUCENIK et al. 1993; VUCENIK e SHAMSUDDIN, 2003; YANG e SHAMSUDDIN, 1995) além de diminuir problemas digestivos.
Apesar dos efeitos benéficos serem bem conhecidos, são necessários estudos mais conclusivos antes da utilização de fitase na alimentação humana como aditivo (KEROVUO, 2000).
A síntese química de mio-inositol apresenta várias complicações e dificuldades, incluindo a utilização
de pressões e temperaturas extremas, pois a fitase hidrolisa em sequência hexafosfatos de mio-inositol. A produção de seus derivados ou de mio-inositol livre utilizando fitases é uma alternativa de síntese química importante. A hidrólise enzimática apresenta algumas vantagens como: especificidade estérica e condições de reações mais brandas. Os derivados de fosfatos de mio-inositol podem ser utilizados como substratos enzimáticos em reações metabólicas (KEROVUO, 2000).
A remoção de ácido fítico de plantas pode ser importante também na indústria processadora de papel. Uma fitase estável termicamente pode ser potencialmente um novo agente biológico que degrade o ácido fítico em alguns processos. Além, de evitar a produção de produtos carcinogênicos e subprodutos tóxicos, minimizando o impacto ambiental e aumentando a segurança nessas indústrias. (KEROVUO, J., 2000).
BIOLÓGICAS
A utilização de diversas enzimas em diferentes aplicações industriais contribui para a melhoria do meio ambiente através da redução do uso de energia e de matérias-primas, diferentemente dos processos clássicos (ABENZYMES, 2011).
Segundo Ahmad et al. (2000), houve efeito efetivo da fitase microbiana obtida do fungo Aspergillus
niger na biodisponibilidade do fósforo e cálcio em frangos
de corte entre 0-28 dias de idade. Estes autores observaram que a concentração de cinzas no osso da tíbia e dedos dos frangos de corte que receberam dieta controle (4,7 g/Kg de fósforo não-fítico) foi semelhante àquelas que receberam dieta de 20% a menos de fósforo não-fítico, porém suplementadas com fitase, indicando que a suplementação de fitase aumentou a utilização de fósforo fítico.
Tejedor et al. (2001), avaliaram o efeito da fitase sobre o desempenho de aves e a energia metabolizável aparente corrigida pelo nitrogênio de dietas à base de milho e farelo de soja com diferentes níveis de cálcio e fósforo disponível.
Estes autores relataram um incremento no ganho de peso (500 FTU, melhora de 3,4%; 750 FTU, melhora de 2,8%), e ambas concentrações de fitase melhoraram em 3% a conversão alimentar. A inclusão da fitase também melhorou a digestibilidade do cálcio e fósforo, bem como a digestibilidade da energia bruta e proteína bruta e os valores de energia digestível ileal aparente.
De acordo com Tejedor et al. (2001), a adição de fitase em dieta inicial à base de milho e farelo de soja, para pintos de corte, melhorou o ganho de peso e a conversão alimentar. Os melhores resultados foram encontrados quando as concentrações de fitase foram de 500 FTU (ganho de 3,4%) e 750 FTU (ganho de 2,8%). Ambas as concentrações melhoraram a conversão alimentar em 3%.
Em um outro experimento, Pizzolante et al. (2002) verificou que o desempenho de frangos de corte não foi afetado pelos níveis de fitase e de cálcio utilizados, sendo os machos superiores às fêmeas em ganho de peso, consumo e conversão alimentar.
de 600 FTU de fitase na dieta de frangos de corte, foi possível reduzir em 0,075% o nível biológico ótimo de fósforo disponível (Pd) a fim de se obter um ganho de peso máximo.
Brenes et al. (2003) avaliaram o efeito da fitase microbiana na utilização de minerais em frango de corte em dietas com dois níveis de fósforo disponível (3,5 g/Kg e 2,5 g/Kg) e 6 níveis de fitase (0, 200, 400 e 600 FTU/kg de dieta). Estes autores concluíram que a adição de fitase com 200 FTU/kg em dieta à base de milho e farelo de soja com baixo nível de fósforo disponível, favoreceu um melhor desempenho e incremento na utilização de cálcio, fósforo e zinco.
Schoulten et al. (2003) avaliaram níveis de cálcio em rações à base de milho e farelo de soja, suplementadas com fitase em frangos de corte de 1 a 21 dias e constataram que um aumento nesses níveis na ração reduziram o ganho de peso, a digestibilidade da matéria seca e a retenção de nitrogênio. Isto indica que os níveis de cálcio devem ser reduzidos proporcionalmente à redução dos níveis de fósforo total. Os mesmos autores verificaram que o melhor ganho de peso foi obtido com 0,46% de cálcio na ração suplementada com fitase e que o nível de 0,59% de cálcio proporcionou melhor mineralização óssea.
Em um outro experimento com frangos, esses mesmos autores estudaram os efeitos dos níveis de cálcio na ração suplementada com fitase para frangos de corte de 22 a 42 dias de idade, sobre a taxa de absorção verdadeira de minerais. Os autores conduziram um experimento com 600 frangos de 21 dias da linhagem Hubbard-MPK.Verificaram que, teores elevados de cálcio na ração suplementada com fitase reduziram somente a taxa de absorção de cálcio, não influenciando contudo, as taxas de absorção de fósforo, zinco, manganês e magnésio.
Tejedor et al. (2001), realizaram um estudo com pintos de corte durante um período de 8 a 18 dias de idade, com o objetivo de verificar o efeito de enzimas microbianas sobre os coeficientes de digestibilidade (CD), da matéria seca (MS), da proteína bruta (PB), da energia bruta (EB), do fósforo (P) e do cálcio de dietas à base de milho e farelo de soja com diferentes níveis de cálcio e fósforo disponível (Pd). Esses autores concluíram que a adição de fitase melhorou a digestibilidade da MS (5,2%), PB (2,4%) e EB (3,8%).
RAÇÕES
Além de disponibilizar fósforo, a adição de fitase em ração de suínos interfere no fluxo biológico deste ingrediente do trato gastrintestinal dos monogástricos para o tecido ósseo, interferindo na absorção de outros minerais como o zinco, cobre, ferro e cálcio (AO et al., 2007).
A intensidade de ação desta enzima, entretanto, depende também de outros fatores, dentre os quais a relação entre cálcio e fósforo da ração, quanto maior a relação (maior a quantidade de fósforo), menor a quantidade de fósforo liberada (BEAULIEU, 2005; ADEOLA, et al., 2006).
em que forneciam rações à base de milho e farelo de soja com níveis baixos (0,4) e normal (0,8%) de cálcio e suplementadas com fitase (750 e 1200 FTU/kg) derivada do Aspergillus ficuum para leitões. Os autores observaram um decréscimo no desempenho dos animais que consumiram rações com níveis normais de cálcio suplementadas com fitase, comparadas às com baixo nível de cálcio. Segundo Ludke (1999), efeitos semelhantes foram encontrados em um experimento com suínos, em que foi adicionado 1000 FTU/kg de fitase, oriunda de Aspergillus niger, em rações de suínos em crescimento. Este autor observou uma redução na absorção aparente de fósforo quando os níveis de cálcio aumentaram de 5 para 8g/Kg.
Miles et al. (2003), ao estudarem os efeitos da fitase em frangos de corte, verificaram um aumento na quantidade de fósforo solúvel na excreta destes, quando alimentados com fitase em relação às aves controle, onde não se administrou a fitase na ração.
Por outro lado, Applegate et al. (2003) observaram a redução deste teor em um experimento semelhante. A principal diferença entre ambos experimentos é que no experimento de Applegate a concentração de fósforo era menor, o que pode ter influenciado no resultado final. Já segundo Beaulieu (2005), em suínos em fase inicial, a excreção de fósforo solúvel dependeu não somente do teor de fósforo, como também da relação cálcio-fósforo total e solúvel em rações iniciais à base de milho e soja. Porém foi observado que houve uma redução na excreção de fósforo solúvel quando a relação entre cálcio e fósforo é superior a 1,7.
Silva (2003), trabalhando com fitase em ração para suínos em crescimento, observou maior absorção de macromoléculas em dietas com níveis maiores de fitase. Estes resultados podem ser observados nas figuras 1, 2, e 3, as quais relacionam níveis de fitase de 800 a 880 FTU/kg às macromoléculas excretadas nas fezes, como por exemplo: nitrogênio, cálcio e fósforo, respectivamente.
CONCLUSÕES
As enzimas possuem um amplo campo de aplicações, seja na indústria de alimentos, bebidas, rações para animais, entre outros setores. As fitases estão sendo amplamente utilizadas em rações para aves e suínos, a fim de promover um melhor aproveitamento do fósforo naturalmente presente nos grãos presentes nestas rações, levando à uma maior economia, já que devido à falta de enzima de forma endógena nestes animais, os produtores são obrigados à adicionar fósforo inorgânico às rações, uma vez que este mineral é de extrema importância para a formação de dentes e ossos, além de participar de uma série de reações metabólicas. O uso de fitase também proporciona menor impacto ambiental, uma vez que o fósforo não aproveitado pelos animais era excretado nas fezes, causando o processo de eutrofização de rios e lagos.
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