Processo simultâneo de sacarificação e fermentação alcoólica de polpa de tamarindo (Tamarindus indica L.) para posterior acetificação / Simultaneous saccharification and alcoholic fermentation of tamarind (Tamarindus indica L.) pulp for further acetificat

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 8, p.57220-57233 aug. 2020. ISSN 2525-8761

Processo simultâneo de sacarificação e fermentação alcoólica de polpa de

tamarindo (Tamarindus indica L.) para posterior acetificação

Simultaneous saccharification and alcoholic fermentation of tamarind

(Tamarindus indica L.) pulp for further acetification

DOI:10.34117/bjdv6n8-216

Recebimento dos originais:08/07/2020 Aceitação para publicação:14/08/2020

Lyssa Setsuko Sakanaka

Doutora em Ciência de Alimentos pela Universidade Estadual de Londrina Instituição : Universidade Tecnológica Federal do Paraná - câmpus Londrina

Endereço : Av. dos Pioneiros, 3131 Jd Morumbi, Londrina, PR, Brasil E-mail : [email protected]

Daniel Dantas Campelo

Mestrando em Tecnologia de Alimentos pela Universidade Tecnológica Federal do Paraná Instituição : Instituto Federal do Maranhão- Câmpus Codó

Endereço : Povoado Poraquê, s/n, Zona Rural E-mail :[email protected]

Beatriz Pereira Sella

Técnica em Biotecnologia integrado ao ensino médio pelo Instituto Federal do Paraná Instituição : Instituto Federal do Paraná- Câmpus Londrina

Endereço : Rua Alagoas, 2001, Centro, Londrina, PR, Brasil E-mail: [email protected]

Gustavo Yuji Asada

Técnico em Biotecnologia integrado ao ensino médio pelo Instituto Federal do Paraná Instituição : Instituto Federal do Paraná- Câmpus Londrina

Endereço : Rua Alagoas, 2001, Centro, Londrina, PR, Brasil E-mail : [email protected]

Larissa de Grande Piccinin

Graduanda em Engenharia Química pela Universidade Tecnológica Federal do Paraná Instituição : Universidade Tecnológica Federal do Paraná, câmpus Londrina

Endereço : Av. dos Pioneiros, 3131 Jd Morumbi, Londrina, PR, Brasil E-mail : [email protected]

Jefferson Sussumu de Aguiar Hachiya

Mestre em Tecnologia de Alimentos pela Universidade Tecnológica Federal do Paraná Instituição : Instituto Federal do Paraná- Câmpus Londrina

Endereço : Rua Alagoas, 2001, Centro, Londrina, PR, Brasil E-mail : [email protected]

Claudio Takeo Ueno

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 8, p.57220-57233 aug. 2020. ISSN 2525-8761 Instituição : Universidade Tecnológica Federal do Paraná - câmpus Londrina

Endereço : Av. dos Pioneiros, 3131 Jd Morumbi, Londrina, PR, Brasil Email : [email protected]

Wilma Aparecida Spinosa

Doutora em Tecnologia de Alimentos pela Universidade Estadual de Campinas Instituição : Universidade Estadual de Londrina

Endereço : Rodovia Celso Garcia Cid, PR 445 km 380, Londrina, PR, Brasil E-mail : [email protected]

RESUMO

O tamarindo (Tamarindus indica L) é um fruto de sabor único muito comum do norte e nordeste brasileiro, rico em fibras. Devido às características sensoriais do produto, sabor ácido e azedo pronunciados, a produção de um fermentado acético deste fruto pode ser uma alternativa interessante. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar a influência dos parâmetros de processo: temperatura (25, 31,5 e 38 0C), concentração de leveduras (1,0, 1,5 e 2% g de levedura seca/g de polpa) e mix de enzimas (250, 500 e 750µL/L) sobre o processo fermentativo da polpa de tamarindo diluída. Para este estudo, aplicou-se um planejamento experimental 33_{, com três repetições do ponto} central. A sacarificação e fermentação simultâneas foi realizada em erlenmeyers incubadas em shaker a 137 rpm, com controle de temperatura, de acordo com o planejamento. As variáveis respostas: sólidos solúveis, teor alcoólico, acidez total e pH foram analisadas nos fermentados após 24 e 48h do início do processo. Para cada variável resposta foi gerado um modelo matemático e feita a análise de variância (ANOVA). Para o processo de otimização da fermentação, foram definidos alguns parâmetros: maior teor alcoólico, maior pH, menor acidez total e menor teor de sólidos solúveis. A condição ótima para a fermentação de polpa de tamarindo durante 24 horas foi: 25°C, 300µL/L de mix de enzimas e 2% de levedura. Também foi otimizado o processo de fermentação em 48 horas e, nesta situação, a condição ótima foi de: 25°C, mix de enzimas a 250 µL/L e 1,25% de concentração de levedura. Os valores dos parâmetros analisados foram satisfatórios para o resultado da fermentação alcoólica para posterior produção de um vinagre, isto é, dependendo das condições, é possível obter uma bebida alcoólica com 4% de etanol, necessária para a acetificação.

Palavras – chave: Pectinase, Glucanase, Teor de álcool, Acidez, Fermentado de fruta. ABSTRACT

Tamarind (Tamarindus indica L) is a fruit of unique flavor and very common in the northen and northeastern of Brazil, rich in fibers. Due to the product's sensory characteristics, pronounced acid and sour taste, the production of an acetic fermented fruit can be an interesting alternative. Thus, the objective of this work was to evaluate the influence of the process parameters: temperature (25, 31.5 and 38 0C), yeast concentration (1.0, 1.5 and 2% g of dry yeast / g of pulp) and mix of enzymes (250, 500 and 750µL /L) on the fermentation process of diluted tamarind pulp. For this study, an experimental design 33_{was applied, with three repetitions of the central point. Simultaneous} saccharification and fermentation was performed in erlenmeyers incubated in a shaker at 137 rpm, with temperature control, according to the experimental design. The response variables: soluble solids, alcohol content, total acidity and pH were analyzed in the fermented products after 24 and 48 hours of the process. For each response variable, a mathematical model was generated and the analysis of variance (ANOVA) was performed. For the fermentation optimization process, some parameters were defined: higher alcohol content, higher pH, lower total acidity and lower soluble solids content. The optimal condition for the fermentation of tamarind pulp for 24 hours was: 25 °

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C, 300µL/L of enzyme mix and 2% yeast. The fermentation process was also optimized in 48 hours and, in this situation, the optimum condition was: 25 ° C, enzyme mix at 250 µL/L and 1.25% yeast concentration. The values of the analyzed parameters were satisfactory for the result of the alcoholic fermentation for later production of a vinegar, that is, depending on the conditions, it is possible to obtain an alcoholic beverage with 4% ethanol, necessary for acetification.

Keywords: Pectinase, Glucanase, Alchohol, Acidity, Fruit fermented beverage. 1 INTRODUÇÃO

A produção de bebidas fermentadas a base de frutas no Brasil vem crescendo continuamente e, em muitas regiões, se tornou uma fonte de renda para a população, visto que há produção de frutas durante o ano todo no país. O fermentado de fruta é definida como a bebida alcoólica com graduação de 4 a 14% (v/v), a 20ºC, obtida da fermentação alcoólica do mosto de fruta sã, fresca e madura (BRASIL, 2008). O processo de obtenção de fermentados a partir de frutas é muito semelhante ao processo de produção de vinho, com algumas adequações, de acordo com as características de cada tipo de fruta a ser utilizada. É considerada uma bebida interessante, uma vez que os fermentados apresentam características das frutas que as originam, contribuindo para sua aceitação sensorial, além de seu valor nutricional em termos de carboidratos, vitaminas, proteínas e sais minerais.

O tamarindeiro (Tamarindus indica L.) é oriundo da África, possui uma vagem marrom não muito resistente, e é comum em regiões tropicais como o Nordeste brasileiro (TAMARINDO, 2019). Em seu interior, o tamarindo contém um material fibroso e avermelhado, sendo composto por 30 a 55% de polpa, 11 a 30% de casca e fibras e de 33 a 40% por sementes; a polpa de tamarindo é considerada rica em ácidos orgânicos, que contribuem em parte nas suas características sensoriais como ácido succínico, tartárico, málico, acético, cítrico e fórmico, sendo o ácido tartárico o majoritário com valores entre 12,2 e 23,8 % (EL-SIDDIG et al., 1999)

Pelo seu agradável aroma e sabor ácido-doce, o fruto é muito utilizado na fabricação de refrescos, sorvetes, doces, licores e geleias. A polpa é usada especialmente como laxante suave no tratamento da prisão de ventre, possuindo a propriedade de evitar a formação de cristais de oxalato de cálcio na urina (CLARCK, 2019).

O maior cultivo do tamarindo se concentra no norte e nordeste brasileiro, no entanto, grande parte dessa produção é perdida, por não ser utilizada no curto período de vida útil do fruto após a colheita. Comercialmente, é destinada à venda em feiras livre locais e produção de alguns gêneros alimentícios, sendo que os produtos derivados de tamarindo apresentam excelente aceitação, com alta intenção de compra (SANTOS et al., 2010). Algumas pesquisas envolvendo fermentação de polpa de tamarindo já foram realizadas, sendo que para a obtenção destes produtos, foram realizadas

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operações como correção das condições da polpa, mistura com outras frutas e incorporação de aditivos à bebida (CAPELA et. al, 2006; SANTOS et al., 2018). Esta prática é comum na obtenção de bebidas alcoólicas derivadas de polpas de frutas de caráter ácido, uma vez que o principal fator de inibição da fermentação pelas leveduras está relacionado ao tipo de ácido e sua concentração no meio. Neste aspecto, ações como adição de carbonato de cálcio ou aumento da concentração da fonte de carbono (sacarose ou caramelo) pelo processo conhecido como chaptalização (AQUARONE, 2013), são realizados, como reportados nos fermentados de goiaba (SANTOS et al., 2020) e de manga (FONSECA et al., 2020). No entanto, a riqueza de propriedades nutricionais da polpa de tamarindo pode proporcionar uma fermentação sem necessidade de adição de outras substâncias, originando um produto saudável, original e natural.

As informações das condições mais adequadas para a produção do fermentado do tamarindo, assim como a caracterização da bebida produzida, é de grande importância para o melhor aproveitamento das produções locais da cultura e geração de renda para as regiões produtoras, estimulando cada vez mais o cultivo dessa variedade, em especial pelo fato do tamarindo ser um cultivo pertencente à agricultura familiar, valorizando os produtores locais.

Neste sentido e com base nas propriedades que o Tamarindus indica L. apresenta, o objetivo deste projeto foi realizar uma fermentação e sacarificação simultânea da polpa de tamarindo, de modo a se obter uma bebida alcoólica que poderá ser utilizada para a produção de um vinagre, sem necessidade de uso de aditivos ou chaptalização.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 MATERIAL

Os tamarindos foram adquiridos em feiras e mercados do município de São Luís - MA nos meses de setembro e outubro de 2015/2016 e transportados para o Laboratório de Processamento de Produtos de Origem Vegetal do Instituto Federal do Maranhão – Câmpus Maracanã, onde foram estocadas em temperatura ambiente nas respectivas embalagens, até o dia do processamento para a produção de polpa, que ocorreu em 48h da data da compra. As enzimas utilizadas neste projeto foram a Viscozyme L® e Pectinex Ultra Tropical® (Novozyme®, Dinamarca) cedidas pela LNF – Latinoamericana. A enzima Viscozyme L® segundo o fabricante, possui atividade de 100 FGB/g sendo considerada uma mistura de β-glucanase, xilanase e celulase. A Pectinex Ultra Tropical possui atividade 5.000 PECTU/g sendo uma mistura de pectina liase e poligalacturonase. Ambas as enzimas possuem atividade ótima entre as temperaturas de 35 e 55 ºC e pH entre 4 e 5,5. Para a fermentação, foi utilizado o fermento biológico seco comercial da marca Fleischmann®, composto

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por leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae. Os reagentes, grau analítico, foram adquiridos no comércio de Londrina, PR.

2.2 OBTENÇÃO DA POLPA DE TAMARINDO

As vagens foram selecionadas pelo critério de integridade da casca e sanidade da polpa. Em seguida, foram lavadas com água corrente e descascadas. A obtenção da polpa foi realizada pelo método tradicional de maceração em que as vagens selecionadas foram imersas em água na relação 1:1 (m/v) em baldes de polipropileno para hidratação da polpa por 15 min. Após este procedimento, a polpa foi pasteurizada a 70 ºC, por 30 min em panelas de 10 L sob agitação constante, embaladas em sacos plásticos estéreis, congelada e transportada em caixas térmicas até o laboratório de Bebidas da UTFPR – Câmpus Londrina (Paraná); por fim, armazenada em freezer a -4ªC até a elaboração dos fermentados.

2.3 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DA POLPA DE TAMARINDO

A determinação do pH foi realizada pela leitura direta de uma solução 10g/L de polpa de tamarindo em 50 mL de água destilada, em potenciômetro de bancada (Tecnopon® ) (IAL, 2008; OLIVEIRA, 2010a).

O teor de sólidos solúveis totais foi determinado utilizando-se a polpa de tamarindo diluída em água destilada na proporção de 1:2 (m/v), sendo centrifugada a 5.000 rpm por 10 min, uma alíquota do sobrenadante foi retirada e a leitura efetuada em refratômetro digital de bancada (Mettler Toledo ®_{), sendo o resultado expresso em ºBrix.}

A acidez foi determinada pesando-se 5 g de polpa de tamarindo diluída em 100mL de água e titulada com solução de NaOH – 0,1 M até o ponto de viragem, tendo como indicador o azul de bromotimol. Os resultados foram expressos em mEq/L de ácido tartárico (IAL, 2008). Todas as análises foram realizadas em triplicata.

2.4 SACARIFICAÇÃO E FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEA (SFS) DA POLPA DE TAMARINDO

Os ensaios fermentativos seguiram um planejamento experimental do tipo 3k, com três variáveis independentes, sendo elas a temperatura de fermentação, variando de 25 a 38°C, a concentração de enzimas, de 250 a 750 µL/L e a concentração de levedura, de 1 a 2% (Tabela 1). Para definição do planejamento experimental, foi empregado o software Statistica 10.0 (Statsoft,

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Tulsa, EUA). O delineamento resultou em 27 ensaios, sendo que foram realizadas três repetições no ponto central, totalizando 30 experimentos.

A quantidade necessária de levedura foi adicionada em um erlenmeyer estéril de 500mL, após foi adicionada a polpa de tamarindo a 37°C e por fim foram inoculadas as enzimas, nas concentrações definidas pelo planejamento experimental, de modo a promover a sacarificação e a fermentação alcoólica concomitantes. Os erlenmeyers foram transferidos para um Shaker orbital, sendo previamente ajustados a temperatura de acordo com planejamento experimental, e rotação a 137rpm. Alíquotas foram retiradas após 24 h e 48 h de fermentação, para análises de sólidos solúveis, pH, acidez titulável e etanol, que consistiram nas variáveis respostas do planejamento experimental. Previamente às análises, as amostras foram centrifugadas nas seguintes condições: 12.000 rpm, a 25°C por 10 minutos e o seu sobrenadante analisado.

Tabela 1 – Valores codificados e reais das variáveis independentes do planejamento experimental.

nível Temperatura (°C) Concentração de enzimas (μL/L)* Concentração de levedura (%) -1 25 250 1 0 31,5 500 1,5 +1 38 750 2

*: mix de enzimas Viscozyme L®_{e Pectinex Ultra Tropical}®_{na concentração (1:1)}

2.5 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO FERMENTADO DE POLPA DE TAMARINDO

Os sólidos solúveis do fermentado foram determinados por leitura direta utilizando um refratômetro digital de bancada ( Nova Instruments). O aparelho é calibrado com água destilada e em seguida coloca-se, aproximadamente, 1mL de amostra e o visor indica a porcentagem de sólidos solúveis. Leitura realizada em duplicata.

A determinação de acidez foi realizada com 1mL de amostra, 50mL de água destilada e três gotas do indicador fenoltaleina, e titulada com hidróxido de sódio 0,1M em um erlenmeyer até ponto de viragem. Para o cálculo foi utilizada a Equação 1 e o resultado é dado em porcentagem de ácido tartárico. Análise realizada em triplicata.

𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 𝑉. 𝑓. 𝑀. 0,6.100 (Eq.1)

Sendo: V: volume (mL) gasto de NaOH até o ponto de viragem; f: fator de correção da solução de NaOH e M: concentração da solução de NaOH.

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O pH foi determinado por leitura direta do sobrenadante na temperatura ambiente, segundo o Instituto Adolfo Lutz (2008), em potenciômetro (Hanna Instruments, modelo HI 2221), calibrado com soluções tampão como indicado pelo fabricante, e realizado em triplicata.

O método utilizado para determinação do teor alcoólico foi o de Ebuliometria descrito por Curvelo Garcia (1998), com um ebuliômetro (Tech Vision). O princípio da análise é baseado na diminuição do ponto de ebulição do fermentado devido à presença do álcool com base no teor alcoólico na escala GayLussac (°GL). Análise realizada em triplicata.

2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS

Os modelos polinomiais para cada resposta foram ajustados utilizando o programa Statistica (Statsoft, Tulsa, EUA), versão 10.0. Para as análises, foi utilizada a análise de variância, ANOVA, e o Teste F com nível de significância de 5%, para avaliar o nível de significância, o coeficiente de determinação (R2) e a falta de ajuste dos modelos matemáticos de cada resposta. Também foi aplicada a função desejabilidade (otimização multi-resposta) para otimização das condições de fermentação.

3 RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DA POLPA DE TAMARINDO

As medidas de sólidos solúveis, pH e acidez estão associados diretamente ao estágio de maturação do fruto no ato da colheita, como também das condições climáticas e edáficas que a planta de origem está submetida (GURJÃO, 2006).

O pH da polpa de tamarindo ficou em 2,49 (± 0,13), próximo ao reportado por outros autores; Gurjão (2006) observou uma variação no pH entre 1,5 a 1,8 na polpa de tamarindo in natura, em um intervalo de 30 dias correspondente ao início e término da maturação do fruto. Hamacke et al. (2013) obteve valores de pH 2,96, enquanto Suliemann et al. (2015) encontraram valores de pH entre 2,95 e 3,40.

Valores baixos de pH apresentado pela polpa de tamarindo é considerado positivo na manutenção das características físico-químicas durante a estocagem, por inibir atividades enzimáticas, mecanismos de oxidação que envolvam metais, além de promover controle microbiológico de agentes deteriorantes (EL-SIDDIG et al., 1999; SULIEMANN et al., 2015).

O teor de acidez da polpa de tamarindo foi de 20,6 ± 0,2 %, em ácido tartárico. Valores em torno de 28,80 a 38,80 % foram encontrados por Suliemann et al. (2015) no Sudão, e de 18,58% por Hamacke et al. (2013) em polpas da região de Minas Gerais. A acidez da polpa de tamarindo

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tende a evoluir ao longo do processo de maturação do fruto e a se estabilizar quando maduro, pelo aumento da concentração de ácidos orgânicos, dentre eles o ácido tartárico, pelo processo de desidratação (LONBARDI et al., 2000).

A variação ou não da acidez e pH em polpas de frutas, é atribuída ao efeito tampão que ocorre nos frutos, resultante da interação entre os sais de sódio e potássio com os ácidos orgânicos (OLIVEIRA, 2010b).

A polpa de tamarindo apresentou 16,56% de sólidos solúveis. A relação entre o teor de sólidos totais (ºBrix) e os ácidos orgânicos na polpa de tamarindo foi de 0,80, no entanto, devido à pungência do ácido tartárico presente, a doçura do fruto é mascarada. Essa mesma relação é utilizada para classificar o fruto em azedo (sour) ou doce (sweet), sendo um dos principais critérios para seleção de genótipos de tamarindeiro para fins de domesticação (RAO e MATHEW, 2012; SULIEMANN et al., 2015).

3.2 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO FERMENTADO DA POLPA DE TAMARINDO

Os resultados obtidos após 24h de fermentação estão apresentados na Tabelas 2.

Para cada variável resposta foi gerado um modelo, levando-se em consideração as interações entre as variáveis independentes, e seus coeficientes de regressão, linear ou quadrático para cada uma das variáveis resposta, estão indicadas na Tabela 2, assim como os resultados da ANOVA, os valores de R2_{, R}2_{ajustado, lack of fit (p-valor).}

Tabela 2. Coeficientes de regressão do modelo gerado pelo planejamento experimental 33_{para as respostas pH, sólidos} solúveis (o_{Brix), acidez (% em ácido tartárico), etanol (%) e ANOVA, para 24h de fermentação.}

Equação

pH = 2,532 - 0,043T + 0,063T2 _{+ 0,036E + 0,083E}2 _{- 0,031L - 0,064L}2 _{+ 0,069T}2_E2 _{- 0,145T}2_{L -} 0,097T2_L2 _{+ 0,066EL}2 _{- 0,171E}2_{L – 0,075E}2_L2

R2_{= 0,632 (R}2_{ajustado= 0,372)} Falta de ajuste p = 0,419

SS (o_{Brix) = 8,689 + 0,797T + 0,066T}2_{+ 0,271E - 0,087E}2 _{- 0,012L + 0,158TE - 0,158TL +} 0,134T2_{L - 0,140EL – 0,145E}2_L

Acidez (%, em ácido tartárico) = 27,495 + 1,956T + 0,521T2_{+ 0,552E + 0,049L + 0,459TE}2_- 0,436T2_{E + 0,367T}2_{L - 0,715EL - 0,567EL}2 R2_{= 0,802 (R}2_{ajustado= 0,712)} Falta de ajuste p = 0,132 Etanol (%) = 3,818 - 0,446T + 0,299T2 _{+ 0,093E + 0,916L - 0,105T}2_E2_{+ 0,120TL - 0,119TL}2 _- 0,093T2_{L + 0,098EL}2 R2_{= 0,796 (R}2_{ajustado= 0,703)} Falta de ajuste p = 0,237

R2_{= coeficiente de determinação. Termos lineares (X) e quadráticos (X}2_{), sendo X, T= temperatura, E= mix de enzimas} ou L=levedura.

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Pela análise de variância, os modelos são considerados válidos estatisticamente e não possuem falta de ajuste (lack of fit; p>0,05), ou seja, podem prever o comportamento das variáveis respostas na fermentação. Para a resposta pH, o valor do R2 _{e R}2_{ajustado, variável esta que considera} o número de efeitos ou interações ignoradas para melhorar o modelo, não têm um valor satisfatório. No entanto, pode-se observar, avaliando-se os dados experimentais (dados não mostrados), que o pH não variou muito durante a fermentação (entre 2,2 a 2,8), o que justifica o baixo coeficiente de determinação. Em processos fermentativos, é interessante que o mosto apresente um pH menos ácido no decorrer do processo, uma vez que a polpa de tamarindo tem característica ácida, condição que dificulta o metabolismo das leveduras.

Ao analisar a polpa fermentada após 24 horas de fermentação, o pH, para concentração de levedura a 1%, foi superior quando próximo ao ponto central para concentração de mix de enzimas (500 μL/L) e temperatura (31,5°C), como mostrado na Figura 1a. Quando a concentração de leveduras tende a níveis maiores (Figura 1b), o comportamento da resposta do pH do mosto é o oposto, atingindo valores menores, nas mesmas condições.

Figura 1a. Superfície de resposta para o pH em função da temperatura e concentração de enzimas a 1% (m/v) de levedura.

Figura 1b. Superfície de resposta para o pH em função da temperatura e concentração de enzimas a 2% (m/v) de levedura.

Fonte: autoria própria (2020).

Valores maiores de pH são mais vantajosos no processo fermentativo, como descreve Lin et al. (2012), que afirmam que o pH do mosto entre 4,0 e 5,0 é o ideal para maior produção de etanol, em processo fermentativo com S. cerevisae. Desta maneira, se comparadas as respostas obtidas nas Figuras 1a e 1b, observa-se que no tratamento com menor concentração de leveduras (1%), atinge-se maiores valores de pH (3,4).

Em relação ao parâmetro acidez, observa-se que com a concentração de enzimas em seu maior nível (750 μL/L), e de leveduras (1%) e temperatura (25°C), nos menores níveis, há maior

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consumo dos ácidos orgânicos da polpa e, assim, diminuição da acidez total do fermentado (Figura 2).

Por outro lado, em temperaturas superiores à 30°C, há queda nas funções metabólicas das leveduras, também relatado por Lin et al. (2012). Este comportamento pode ser observado na Figura 2, visto que, em temperaturas menores, há menor concentração de ácidos, ao passo que, quando a temperatura é aumentada, maior é a acidez do fermentado.

Quando analisado o teor de álcool formado no processo, observou-se que a maior produção de etanol ocorreu quando menores temperaturas de fermentação foram empregadas, em especial, com concentrações menores de levedura (Figura 3).

Assim como a resposta metabólica da acidez, mostrada na Figura 2, o teor alcoólico tem grande influência da temperatura. Quando esta foi ajustada nos menores níveis, houve maior produção de etanol.

Figura 2. Superfície de resposta para a acidez em função da temperatura e concentração de leveduras com 750 μL/L de enzimas.

Figura 3. Superfície de resposta para o etanol em função da temperatura e concentração de leveduras com a concentração de enzimas de 250 μL/L.

O procedimento de análise realizado para 24h de fermentação foi o mesmo para a definição dos modelos matemáticos das respostas para tempo de 48h de fermentação, e estão apresentados na Tabela 3.

Tabela 3. Coeficientes de regressão do modelo gerado pelo planejamento experimental 33_{para as respostas pH, sólidos} solúveis (o_{Brix), acidez (% em ácido tartárico), etanol (%) e ANOVA, para 48h de fermentação.}

Equação

pH = 2,520 - 0,086T + 0,030T2 _{+ 0,204E - 0,097E}2 _{+ 0,044L + 0,079L}2 _{+ 0,263T}2_E_{– 0,151T}2_E2 ₊ 0,134T2_L2_{+ 0,185EL}2 _{- 0,057E}2_{L – 0,110E}2_L2

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SS (o_{Brix) = 8,836 + 1,231T - 0,118T}2_{+ 0,462E - 0,060E}2 _{+ 0,012L - 0,015L}2_{+0,093TE -}

0,323TE2_{– 0,284T}2_{E – 0,033T}2_E2_{– 0,468TL- 0,119TL}2_{+ 0,241T}2_{L + 0,028T}2_L2_{-0,332EL +}

0,174EL2 + 0,245E2L + 0,059E2L2

Acidez (%) = 27,376 + 4,931T + 1,512T2 +1,247E + 0,451E2_{+ 1,181L + 0,587L}2

-0,457TE- 0,279TE2_{- 0,733T}2 E – 0,702T2E2 – 1,096TL - 1,189TL2 + 0,633T2_{L + 0,658EL}2 _{- 0,253E}2_{L +} 0,347E2_L2 R2_{= 0,953 (R}2_{ajustado= 0,895)} Falta de ajuste p = 0,126

Etanol (%) = 3,989 - 0,963T + 0,439T2 _{- 0,123E – 0,035E}2_{- 0,054L – 0,056L}2_{–0,385TE +}

0,254TE2_{+ 0,130ET}2_{- 0,034T}2_E2 _{+ 0,158TL - 0,094TL}2_{- 0,110T}2_{L – 0,150T}2_L2_{– 0,085EL -} 0,141E2_{L + 0,06E}2_L2

R2_{= coeficiente de determinação. Termos lineares (X) e quadráticos (X}2_{), sendo X, T= temperatura, E= mix de enzimas} ou L=levedura. Valores em negrito : dados estatisticamente significativos (p<0,05).

Neste caso, observa-se que, apenas para o teor de sólidos solúveis houve falta de ajuste do modelo (p<0,005), para os outros parâmetros, o modelo polinomial descreve satisfatoriamente o comportamento durante a fermentação. Para o processo fermentativo após 48horas, observa-se que a produção de etanol na fermentação foi favorecida quando utilizada menores concentrações de leveduras (1%), indicada pelas áreas de cor vermelha da Figura 4. Nota-se que as concentrações de enzimas empregadas não causaram alterações significativas na produção de etanol.

De acordo com Guan e Yao (2008) as temperaturas testadas não correspondem à faixa ótima de atividade das enzimas, que corresponde à temperatura próxima de 44°C. O pH do mosto também difere das condições consideradas como ótimas, que seria próximo do pH 4,6. Por outro lado, este processo se refere a uma sacarificação simultânea à fermentação, e para tanto, é preciso considerar a temperatura adequada para a atividade das leveduras também.

Comportamento semelhante pode ser observado ao empregar concentrações maiores de leveduras. Em temperaturas menores, entre o ponto central e o nível mais baixo, há maior produção de etanol, variando pouco conforme as diferentes concentrações de enzimas. Analisando-se a Figura 5, quando a temperatura de fermentação ocorre sob 31,5°C, a concentração de enzimas não tem interferência nos níveis de acidez. Por outro lado, quanto menores as concentrações de leveduras, menores os níveis de acidez, o que beneficia o processo fermentativo.

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Figura 4. Superfície de resposta para o etanol em função da temperatura e concentração de mix de enzimas na concentração de levedura 1% (m/v).

Figura 5. Superfície de resposta para a acidez em função da concentração de leveduras e de mix de enzimas na temperatura de 31,5o_C.

Avaliando-se o desenvolvimento das leveduras e as características desejáveis no fermentado alcoólico, os parâmetros de interesse para a fermentação foram definidos, sendo estes menor acidez, maior pH, maior teor alcoólico e menor sólidos solúveis.

A partir dos critérios estabelecidos e considerando as interações entre os fatores de temperatura, concentração de levedura e concentração de enzimas, a otimização do processo foi feito aplicando-se a função desejabilidade, que estabelece as faixas mais propícias de atividade de cada uma das respostas e prediz, por meio de modelos matemáticos, as condições em que a fermentação será otimizada, tanto no tempo de 24h quanto para de 48h.

Assim, as condições mais favoráveis para a fermentação de 24 horas foram: temperatura no nível 1 (25°C), concentração de levedura no nível 1 (2%) e concentração de enzimas no nível -0,8 (300 µL/L).

No tratamento de 48 horas, assim como no de 24 horas, as condições fermentativas mais adequadas foram de temperatura de 25°C (nível -1) e concentração de enzimas de 250 µL/L (nível -1), no entanto, a concentração de leveduras diferenciou-se, sendo 1,25% (nível -0,5) o tratamento adequado.

4 CONCLUSÃO

O processo de sacarificação e fermentação simultânea permitiu a obtenção de fermentados com graduação alcoólica a 4%, o que viabiliza a posterior acetificação do mosto para a obtenção de um vinagre de tamarindo.

A escolha das condições de processo a ser utilizado varia de acordo com diferentes objetivos, uma vez que, se escolhido o processo no tempo de 24 horas, é necessário maior

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investimento na concentração de leveduras. Em contrapartida, no processo de 48 horas, é possível a obtenção da mesma graduação alcoólica quando utilizando-se menor concentração de leveduras.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à CAPES, FAPEMA e UTFPR, pelo apoio financeiro, ao CNPq e à Fundação Araucária pelas bolsas de iniciação científica, e à LNF – Latinoamericana pela doação das enzimas. Ao Laboratório Multiusuários da UTFFR de Londrina (LabMultLD) e ao IFPR câmpus Londrina, pelas análises realizadas. Ao prof. Dr. Fábio Yamashita da UEL pelo auxílio na análise estatística, ao Mateus Paiva, George Guides e Pedro Borges pelo auxílio nos experimentos.

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