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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
BIOMEDICINA
CATHARINA ALBIERO BUENO RAMOS
AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS SÉRICOS DE VITAMINA E, VITAMINA C E GAMA-GLUTAMILTRANSFERASE COMO MARCADORES DO PERFIL OXIDATIVO NA
GESTAÇÃO MOLAR: PROJETO PILOTO
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: ANÁLISES CLÍNICAS
Orientadora: Profa. Dra. Patrícia de Fátima Lopes de Andrade Co-orientadora: MSc Leda Maria Ferraz da Silva
Niterói, RJ 2016
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CATHARINA ALBIERO BUENO RAMOS
AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS SÉRICOS DE VITAMINA E, VITAMINA C E GAMA-GLUTAMILTRANSFERASE COMO MARCADORES DO PERFIL OXIDATIVO NA
GESTAÇÃO MOLAR: PROJETO PILOTO
Orientadora:
Profa. Dra. Patrícia de Fátima Lopes de Andrade Co-orientadora:
MSc Leda Maria Ferraz da Silva
Niterói, RJ 2016
Monografia apresentada à Universidade Federal Fluminense/sede Niterói como Trabalho de Conclusão de Curso para a obtenção do grau Bacharel em Biomedicina, na habilitação Análises Clínicas.
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CATHARINA ALBIERO BUENO RAMOS
AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS SÉRICOS DE VITAMINA E, VITAMINA C E GAMA-GLUTAMILTRANSFERASE COMO MARCADORES DO PERFIL OXIDATIVO NA
GESTAÇÃO MOLAR: PROJETO PILOTO
Aprovada em 01 de abril de 2016.
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Patrícia de Fátima Lopes de Andrade - UFF Presidente
Profa. Dra. Hye Chung Kang - UFF Titular
Prof. Dr. Enrico Mendes Saggioro - UFF Titular
MSc. Fernanda Freitas Oliveira Cardoso - UFF Suplente
Niterói, RJ 2016
Monografia apresentada à Universidade Federal Fluminense/sede Niterói como Trabalho de Conclusão de Curso para a obtenção do grau Bacharel em Biomedicina, na habilitação Análises Clínicas.
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente, gostaria de agradecer aos meus pais que tornaram possível toda a caminhada rumo a minha sonhada formação. Por todo o apoio, incentivo e dedicação investidos em mim. Em especial à minha mãe, que esteve sempre ao meu lado e dedicou horas e mais horas para ouvir meus anseios e compartilhar felicidades, além de ter dado 1000% de si para cuidar de mim e me ver feliz.
Aos meus irmãos, que apesar de distantes estão sempre dispostos a me ajudar e ter boas conversas.
Às minhas queridas amigas de infância Lara e Analice, que compartilharam muitas experiências comigo, das lágrimas aos sorrisos. Por todos os sonhos sonhados juntas e por terem sempre me impulsionado até aqui. Vocês são parte essencial da minha vida!
Ao meu namorado, que cuidou de mim, viveu meus desesperos comigo, me acolheu e se dedicou tanto a mim durante todo esse tempo. Quem esteve sempre me motivando a ser quem eu sou e me ajudando a seguir em frente. Sem você eu definitivamente não estaria aqui. Eu te amo, amor.
Às minhas preciosas amigas da faculdade. Manoela, amiga de todas as horas para o resto da vida, a primeira amiga e a pessoa mais incrível que eu conheci na UFF. E Juliana e Élida, parceiras de estudo, de BNBD, de piquenique, de discussões, de angústias e seja mais o que for, parceiras de tudo.
Aos meus amigos de terceiro ano, David, Sheen e Klaus, que sempre fizeram o que puderam para estar comigo, ouviram meus problemas e fizeram meus dias muito mais felizes.
Aos amigos de Macaé, Leo, Haru e Malagutti, que apesar de estarem longe, sempre são pessoas com quem eu posso contar.
Aos amigos e professores do BNBD, por compartilharem comigo esse lindo projeto que passou a fazer parte da minha vida!
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Agradeço imensamente à Georgina, Luna e Mariana e a todas as pessoas do laboratório de hematologia do HUAP que me acolheram, ajudaram e ensinaram. Por todas as conversas, aprendizados e disposição para ajudar a qualquer momento. Vocês fizeram da hemato a minha segunda casa.
Em especial, à Hye, que foi como uma segunda mãe pra mim. Que tanto me ensinou, aconselhou, ouviu e esteve tão presente na minha vida desde o segundo período da faculdade. Muito obrigada por todo carinho, dedicação e cuidado! Você foi, definitivamente, muito importante na minha formação e na minha vida.
À todos os professores que me ensinaram e participaram da minha caminhada na UFF. Sem vocês, nada disso seria possível.
Às minhas queridas orientadoras, Patrícia e Leda, que me deram tantas oportunidades, conselhos e acreditaram em mim. Por toda a dedicação e tempo oferecidos para a realização desse trabalho, pelas boas risadas e por todo o carinho. Vocês são incríveis!
Ao professor Enrico, por ter feito com que eu me apaixonasse pela toxicologia e por ter sido o melhor orientador de monitoria de todos os tempos! Obrigada por todo o aprendizado e atenção que dedicou a mim.
À incrível coordenação de biomedicina, que esteve sempre disponível para resolver nossos problemas e tirar dúvidas. Além daquelas boas horas de conversa. Vocês são maravilhosos!
À toda equipe da UFF e da ME envolvida com o trabalho, que nos ajudaram muito e possibilitaram a realização desse estudo.
E por fim, à todas as pessoas que apesar de eu não ter mencionado fizeram parte importante da minha vida, contribuíram para a realização desse trabalho e tornaram possível o sonho de me formar na UFF.
À todos, por tudo que fizeram, muito Obrigada!
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RESUMO
A doença trofoblástica gestacional é um termo aplicado a um grupo raro de tumores relacionados com a gestação. A mola hidatiforme (MH) constitui sua forma clínica mais comum. Ela apresenta duas entidades clínicas distintas com base nas suas diferenças morfológicas, histopatológicas e genéticas: MH completa e parcial. Estudos mostram que o estresse oxidativo (EO) constitui um fator de risco importante para o desenvolvimento da doença. As vitaminas E e C são antioxidantes essenciais provenientes da dieta, exercendo um papel fundamental no combate ao EO. A gama-glutamiltransferase (GGT), por sua vez, está intimamente relacionada ao EO visto que está diretamente envolvida no metabolismo da glutationa, principal tiol intracelular e potente agente antioxidante. Dessa forma, essas substâncias podem ser utilizadas como marcadores do perfil oxidativo, que embora seja considerado importante na etiologia da MH, carece de informações acerca de seus marcadores na literatura. Então, o presente estudo teve como objetivo avaliar a correlação entre o perfil oxidativo com a ocorrência de MH através da dosagem sérica de vitamina E, C e GGT em gestantes com MH. Trata-se de um estudo observacional de corte transversal com grupo de comparação. A amostragem foi composta por quatro pacientes com MH em tratamento nos centros de referência. As dosagens das vitaminas foram realizadas de forma automatizada por serviço terceirizado e as dosagens de GGT foram feitas pelo serviço de Patologia Clínica do Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP) e no laboratório de análises clínicas da Maternidade Escola/UFRJ, também de forma automatizada. Todas as pacientes avaliadas apresentaram suficiência de vitamina E. Nas análises de concentração sérica de vitamina C, 50% delas apresentou deficiência dessa vitamina. Para as dosagens de GGT, apenas uma das pacientes apresentou valores acima do limite superior do intervalo de referência, no entanto, ela relatou consumo diário de álcool, além de se tratar de uma paciente obesa. Os resultados obtidos até o momento são insuficientes para determinar relação entre deficiência de vitaminas e ocorrência de MH, portanto se faz necessária a avaliação de maior número de pacientes, bem como comparação com o grupo controle. A continuidade do estudo dessas substâncias como marcadores do perfil oxidativo é importante por serem possíveis preditores de ocorrência e evolução da MH e sua utilização pode ser avaliada para uso na rotina laboratorial.
Palavras-chave: Mola hidatiforme, estresse oxidativo, gama-glutamiltransferase,
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ABSTRACT
Gestational trophoblastic disease is a term applied to a rare group of pregnancy-related tumors, and the hydatidiform mole (HM) is its most common clinical form. The disease has two distinct clinical entities based on their morphological, histopathological and genetic differences: complete and partial HM. Studies have shown that oxidative stress (OS) is an important risk factor for the disease development. Vitamins E and C are essential antioxidants from the diet, playing a fundamental role in combating OS. The gamma-glutamyl transferase (GGT), in turn, is closely related to OS since it is directly involved in the metabolism of glutathione, the main intracellular thiol and powerful antioxidant. Therefore, these substances may be used as biomarkers of oxidative profile, which is considered important in the etiology HM, even though there is a lack of information about its markers in the literature. Thus, the aim of the present study was to evaluate the correlation between oxidative profile with the occurrence of HM through the dosage of serum levels of vitamin E, vitamin C and GGT in pregnant women with HM. This is an observational cross-sectional study with comparison group. The sample was composed by four patients with MH under treatment in reference centers. The dosages of vitamins were performed by an outsourced service and levels of GGT were determinated by the Clinical Pathology Service from Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP) and clinical laboratory of Maternidade Escola/UFRJ as well. All patients evaluated had an adequate vitamin E status. The serum concentration of vitamin C revealed 50% of deficiency in the population studied. The GGT dosage showed that one of the patients having values above the upper limit of the reference range, however, this patient is obese had reported daily alcohol consumption. The obtained results are insufficient to determine the relationship between vitamin deficiency and occurrence of HM, therefore it is necessary to evaluate a greater number of patients, as well as to compare to a control group. Giving continuity to the study of these substances as markers of oxidative profile is important because their relevance as predictors of occurrence and development of HM and its use can be evaluated for use in the laboratory routine.
Keywords: Hydatidiform mole, oxidative stress, gamma-glutamyl transferase,
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
DHA – Desidroascorbato
DTG – Doença Trofoblástica Gestacional
EDTA – Ácido Etilenodiaminotetracético
ERO – Espécie Reativa de Oxigênio
ERN – Espécie Reativa de Nitrogênio
EO – Estresse Oxidativo
GGT – Gama-glutamiltransferase
GSH – Glutationa reduzida
hCG – Gonadotrofina Coriônica humana
HUAP – Hospital Universitário Antônio Pedro
LAMAP – Laboratório Multiusuário de Apoio à Pesquisa em Nefrologia e Ciências Médicas
ME – Maternidade Escola
MH – Mola Hidatiforme
MHC – Mola Hidatiforme Completa
MHP – Mola Hidatiforme Parcial
NO – Óxido Nítrico
NTG – Neoplasia Trofoblástica Gestacional
SDA – Semidesidroascorbato
TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
UFF – Universidade Federal Fluminense
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Reação do α-tocoferol com os radicais peroxila... 15
Figura 2 - Esquema representativo da “reciclagem” do ascorbato... 16
Figura 3 - Exemplo da atuação do ascorbato como pró-oxidante na presença de ferro...
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Figura 4 - Esquema de coleta, processamento e transporte para a realização das dosagens de vitamina C, vitamina E e GGT...
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Figura 5 - Esquema de coleta, processamento e transporte das amostras para a realização de todas as dosagens previstas no grande projeto em qual esse faz parte...
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LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Dosagens de GGT, vitaminas C e E das pacientes pós-esvaziamento molar (n=4) ...
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores de média e desvio padrão das dosagens de GGT, vitamina C e vitamina E das pacientes (n=4)...
12 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 13 1.1. ESTRESSEOXIDATIVO ... 14 1.2. VITAMINASE E C ... 15 1.3. GAMA-GLUTAMILTRANSFERASE ... 17
1.4. MOLAHIDATIFORMEEESTRESSEOXIDATIVO ... 18
2. OBJETIVOS ... 18 2.1. OBJETIVOGERAL... 18 2.2. OBJETIVOESPECÍFICO ... 18 3. JUSTIFICATIVA ... 18 4. RELEVÂNCIA DO ESTUDO ... 19 5. METODOLOGIA ... 19
5.1. LOCAISDEREALIZAÇÃODOESTUDO ... 19
5.2. TIPODEPESQUISA ... 19
5.3. AMOSTRA ... 19
5.3.1. Critérios de Inclusão e Exclusão ... 20
5.4. LOGÍSTICADECOLETAEPROCESSAMENTODASAMOSTRAS ... 20
5.5. ANÁLISEESTATÍSTICA ... 21
6. RESULTADOS ... 21
6.1. LOGÍSTICADECOLETAEPROCESSAMENTODASAMOSTRAS ... 21
6.2. AMOSTRAGEM ... 23
6.3. ANÁLISEDASVITAMINASEGGT ... 24
7. DISCUSSÃO ... 26
8. CONCLUSÀO ... 28
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 29
ANEXO 1: APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ... 32
APÊNDICE 1: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ... 37
APÊNDICE 2: ORIENTAÇÕES GERAIS E DIETÉTICAS PARA A COLETA DE SANGUE ... 39
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1. INTRODUÇÃO
A mola hidatiforme (MH) trata-se de uma anomalia da gestação caracterizada por presença de placenta com aumento anormal das vilosidades coriônicas acompanhada de proliferação trofoblástica. Essa complicação é a mais frequente entre as doenças trofoblásticas gestacionais (DTG), que constituem um grupo de doenças caracterizadas por tumores originários do tecido trofoblástico placentário relacionados à gestação (SECKL et al., 2010; BRAGA et al., 2011).
As DTGs podem ser classificadas de acordo com sua forma clínica em dois grupos: MH, forma benigna da doença, e neoplasia trofoblástica gestacional (NTG), forma maligna que pode se apresentar como coriocarcinoma, mola invasora, tumor trofoblástico do sítio placentário ou tumor trofoblástico epitelioide. (BELFORT, BRAGA & FREIRE, 2006; LURAIN, 2011; GOLDSTEIN & BERKOWITZ, 2012). A característica comum às DTGs é o aumento da gonadotrofina coriônica humana (hCG), marcador biológico-hormonal da gravidez molar (BRAGA et al, 2014).
A MH, por sua vez, apresenta duas entidades clínicas distintas, podendo ser classificada como MH parcial (MHP) ou MH completa (MHC) com base em suas diferentes características morfológicas, histopatológicas e genéticas (KAJII & OHAMA, 1977; BELFORT et al., 2007). Em relação aos aspectos clínicos, os comportamentos da MHC e da MHP são diferentes. Os sinais e sintomas observados na MHC são mais intensos quando comparados a MHP. Além disso, a MHC parece ter maior incidência de casos enquanto a MHP geralmente apresenta-se como um aborto incompleto ou retido e os níveis de hCG tendem a apresenta-ser mais baixos, quando comparados aos valores da MHC (SZULMAN & SURTI, 1984).
O estudo da MH é importante pela capacidade de evolução da doença para NTG, em incidência que varia de 18 a 28% nos Estados Unidos da América (GARNER et al., 2007) e de 7 a 25% no Brasil (BELFORT & BRAGA, 2004). As evoluções malignas, bem como as complicações clínicas, são mais frequentes na MHC ocorrendo em aproximadamente 20% delas, enquanto na MHP somente 5% evoluem para NTG (DANTAS et al., 2012). Isso pode ser explicado pela natureza androgenética da MHC, visto que a superexpressão de genes paternos é associada
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com marcada hiperplasia trofoblástica (FISHER, 2009) que aumenta o risco para NTG e metástases (HOFFNER & SURTI, 2012).
Entre os fatores de risco etiológicos para o desenvolvimento da MH, destacam-se os extremos de idade materna e gravidez molar anterior. Além disso, o abortamento espontâneo em gestações anteriores está associado ao aumento do risco de gravidez molar de duas a três vezes. Outro fator importante associado à MH é a dieta, visto que a diminuição do consumo de alguns nutrientes foi relacionada com o aumento na incidência da doença (BERKOWITZ, CRAMER, BERNSTEIN et al., 1985).
1.1. ESTRESSE OXIDATIVO
O estresse oxidativo (EO) é causado por um desequilíbrio entre moléculas pró-oxidantes e antioxidantes, devido a uma excessiva produção de radicais livres somadas ou não a capacidade antioxidante diminuída (BARREIROS & DAVID, 2006). Esse desequilíbrio leva à oxidação de biomoléculas com perda de suas funções biológicas gerando dano oxidativo a diferentes células e tecidos e, quando crônica, pode implicar no aparecimento de diversas doenças (BARBOSA et al., 2010).
O estabelecimento e a gravidade do EO podem ser avaliados através de vários biomarcadores produzidos a partir da interação das espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERNs) com diferentes biomoléculas. Além disso, a expressão e as atividades das moléculas redox-sensíveis, tais como as enzimas antioxidantes, podem servir como biomarcadores de EO (NAFAR et al., 2011).
O sistema antioxidante natural consiste em numerosos componentes que visam inibir ou reduzir os danos causados pela ação deletéria dos radicais e espécies reativas não radicais. Esse sistema é geralmente dividido em enzimático e não-enzimático, sendo o último composto por múltiplas moléculas antioxidantes de origem endógena ou exógena (dietética) (YILMAZ et al., 2004). Quanto ao sistema enzimático, as principais enzimas do sistema antioxidante são a catalase, a glutationa peroxidase e a superóxido dismutase (BARBOSA et al., 2010).
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O sistema de defesa exógeno (não-enzimático) inclui, em especial, os compostos antioxidantes de origem dietética, destacando-se as vitaminas, os minerais e os compostos fenólicos. Entre as principais vitaminas com importante ação antioxidante, observa-se o ácido ascórbico (vitamina C) e o α-tocoferol (vitamina E) (BIANCHI & ANTUNES, 1999; VANNUCCHI et al, 1998).
1.2. VITAMINAS E e C
A vitamina E é a principal vitamina lipossolúvel presente no plasma, podendo ser encontrada em quatro principais isômeros: α-tocoferol, β-tocoferol, γ-tocoferol e δ-tocoferol, sendo o α-tocoferol o mais ativo e amplamente distribuído nos tecidos e no plasma (BIANCHI & ANTUNES, 1999). Os tocoferóis exercem um importante efeito antioxidante atuando como inibidores da peroxidação lipídica por interromper a reação radicalar em cadeia nas membranas. Isso se dá através da doação de um átomo de hidrogênio para radicais peroxila, que possibilita a conversão desses em espécies eletricamente mais estáveis e, consequentemente, menos reativas. Nesse processo o tocoferol é convertido a tocoferil, que deve ser regenerado para manutenção de sua atividade antioxidante (CATANIA et al, 2009). Entre as substâncias importantes na regeneração do tocoferol, destaca-se a vitamina C, que atua doando um átomo de hidrogênio ao radical tocoferil. Nesse processo, ela é convertida a semidesidroascorbato (SDA) (BARREIROS et al, 2006) (Figura1).
Figura 1: Reação do α-tocoferol com os radicais peroxila, que são
convertidos a hidroperóxidos lipídicos (LOOH), enquanto este é convertido a tocoferil. No sentido inverso, observa-se a reciclagem do α-tocoferol pela ação do ascorbato, que é então convertido a semidesidroascorbato (SDA).
Fonte: Adaptado de: Guaratini et al, 2007.
Ascorbato SDA
Radicais
peroxila LOOH
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A vitamina C (ácido ascórbico) é encontrada no organismo principalmente na sua forma de base conjugada, o ascorbato. Trata-se de um agente redutor, apresentando intensa atividade antioxidante contra radicais presentes em meio hidrofílico. Devido a essa propriedade, o ascorbato pode ser oxidado a SDA pela maioria das EROs e ERNs, exercendo seu efeito protetor (BARREIROS et al, 2006). O SDA pode então ser reconvertido a ascorbato por uma reação de dismutação, como observado na figura 2. No entanto, na presença de metais de transição, como o ferro, o ascorbato pode exercer atividade oxidante tornando-se capaz de produzir espécies radicais e não-radicais (BARBOSA et al., 2010) (Figura 3)
.
Figura 2: Esquema representativo da “reciclagem” do ascorbato.
SDA= semidesidroascorbato
Figura 3: Exemplo da atuação do ascorbato como pró-oxidante na presença de ferro. O ascorbato,
como potente redutor atua sobre o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-férrico que passa ao estado ferroso. Esse, por sua vez ao reagir com o peróxido de hidrogênio forma espécies reativas radicais e não-radicais, reação conhecida como reação de Fenton.
Alguns estudos mostraram a capacidade da vitamina C em reduzir os níveis de biomarcadores do EO. A suplementação com essa vitamina por dois meses reduziu em 22% o F2-isoprostano (biomarcador de peroxidação lipídica) em indivíduos que apresentaram elevada concentração desse marcador no plasma. Foi proposto que, nestes casos, a suplementação com vitamina C seria benéfica para reduzir o EO (BLOCK et al, 2008).
A favor do papel antioxidante sinérgico entre a vitamina C e E, estudos sugerem que o ascorbato potencialize o efeito do tocoferol através da redução dos radicais tocoferil. Além disso, em estudos com ratos e porcos da guiné observaram um aumento das concentrações plasmáticas do tocoferol relacionado ao consumo
Fe3+−EDTA + ascorbato→ Fe2+−EDTA + SDA Fe2+−EDTA + H2O2→Fe3+−EDTA + OH•+ OH
-Fonte:Adaptado de Halliwell e Gutteridge, 2007. DHA = desidroascorbato
SDA= semidesidroascorbato
Fonte:Adaptado de: Halliwell e Gutteridge, 2007. SDA= semidesidroascorbato
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elevado de ascorbato. No entanto, em estudo realizado em seres humanos para avaliar o efeito antioxidante sinérgico entre estas duas vitaminas na redução da peroxidação lipídica, a suplementação com ambas não mostrou benefícios em relação à suplementação com cada umas delas isoladamente (HUANG et al, 2002).
1.3. GAMA-GLUTAMILTRANSFERASE
A GGT é uma enzima responsável por catalisar a transferência do grupo gama-glutamil de peptídeos e de outros compostos para outros peptídeos, aminoácidos e água. Apesar de ser encontrada em maior quantidade no tecido renal e em menores proporções em outros tecidos, a enzima presente no soro é, principalmente, de origem hepática (ALCÂNTARA, 2007). Tradicionalmente, a GGT é considerada um marcador sensível de doenças hepatobiliares e também de consumo crônico de álcool. Entretanto, essa enzima parece estar intimamente relacionada ao EO (NAKAGAWA, 2012).
A GGT é também responsável pelo metabolismo extracelular da glutationa reduzida (GSH), o principal tiol intracelular e importante agente antioxidante. Devido à sua atividade redutora, a GSH possui um papel central na defesa celular contra o EO (HUBER & ALMEIDA, 2008). Esse tiol encontra-se em um constante estado de reciclagem sofrendo a ação da GGT, que transfere resíduos de glutamato para outros aminoácidos, como cisteína, metionina e glutamina (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007).
Devido ao fato da GGT desempenhar papel importante na homeostase da GSH, sua expressão aumenta como uma resposta adaptativa à exposição ao EO, uma vez que essa enzima aumenta o transporte de glutationa para o interior celular. No entanto, paradoxalmente, a GGT está também diretamente envolvida na geração de EROs sob condições fisiológicas, principalmente em presença de ferro ou outros metais de transição. Dessa forma, os níveis séricos de GGT podem refletir não apenas resposta ao EO, como também a geração e acúmulo desse estresse (NAKAGAWA, 2012).
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1.4. MOLA HIDATIFORME E ESTRESSE OXIDATIVO
Uma hipótese sobre a patogênese da MH relata o envolvimento de danos induzidos pelo EO, como estado inflamatório caracterizado pelos níveis elevados de citocinas. Acredita-se também que os defeitos da placenta na MH possam decorrer do EO, já tendo sido evidenciada a diminuição da resposta antioxidante nessas pacientes (AGARWALET al, 2005). Já os danos provocados ao DNA foram associados com a capacidade antioxidante total diminuída em pacientes com MHC (HARMA et al, 2003), podendo estar relacionada à sua maior propensão de evolução para NTG.
Além disso, muitos estudos vêm demonstrando que os marcadores de EO estão aumentados e os níveis de antioxidantes endógenos tendem a estar reduzidos em grávidas com comorbidades, interferindo nos mecanismos anômalos relacionados a desfechos adversos da gestação (HUBEL, 1999). Embora o perfil oxidativo seja considerado importante na etiologia da MH, poucas informações acerca dos marcadores do EO estão disponíveis na literatura relacionados com a doença.
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar a correlação entre o perfil oxidativo com a ocorrência de MH.
2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO
Determinar as concentrações séricas das vitaminas C e E e da GGT em gestantes com MH, comparando com gestantes sem comorbidades.
3. JUSTIFICATIVA
A MH é uma doença rara e negligenciada e os ambulatórios de DTG do Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP) da Universidade Federal Fluminense (UFF) e da Maternidade Escola da Universidade Federal do Rio de Janeiro (ME/UFRJ) detêm a terceira maior casuística do mundo no atendimento de
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pacientes acometidas por essa doença da gravidez. Além disso, o perfil oxidativo parece ter relação direta com a ocorrência da MH, no entanto, poucas informações sobre essa relação estão disponíveis na literatura. Dessa forma, o presente estudo se faz necessário para gerar novos conhecimentos acerca da relação entre o EO e a MH e, possivelmente, sugerir novos marcadores para o acompanhamento da doença.
4. RELEVÂNCIA DO ESTUDO
O presente estudo é relevante para a área de Análises Clínicas, uma vez que avalia a utilização dos níveis séricos de vitamina E, vitamina C e GGT como marcadores de evolução da gestação molar. Além disso, o uso da GGT na rotina laboratorial pode ser importante devido ao baixo custo de sua dosagem e facilidade de execução.
5. METODOLOGIA
5.1. LOCAIS DE REALIZAÇÃO DO ESTUDO
Este estudo foi realizado no Ambulatório de Doenças Trofoblásticas do HUAP/UFF e Ambulatório de Doenças Trofoblásticas da ME/UFRJ. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da UFF (CAAE: 37660714.7.0000.5243, Anexo 1) e as atividades foram realizadas após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecidas (TCLE, Apêndice 1).
5.2. TIPO DE PESQUISA
Trata-se de um estudo observacional de corte transversal com grupo de comparação.
5.3. AMOSTRA
A amostra foi composta por pacientes grávidas com MH em tratamento nos centros de referência. O grupo de comparação será composto por gestantes sem comorbidades dos mesmos serviços.
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5.3.1. Critérios de Inclusão e Exclusão
Critérios de Inclusão
O critério de inclusão do estudo foi: pacientes com diagnóstico confirmado de gestação molar.
Critérios de Exclusão
No presente estudo serão excluídas: pacientes com história de morbidade obstétrica.
5.4. LOGÍSTICA DE COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
Este estudo é parte de um grande projeto intitulado “Estresse oxidativo e influência da ingestão alimentar na ocorrência de mola hidatiforme e evolução para neoplásia trofoblástica gestacional”. Esse é composto por múltiplas análises das pacientes com MH para o estudo mais aprofundado da doença, de sua evolução para NTG e sua relação com o estresse oxidativo e ingestão alimentar. Sendo assim, o estudo inclui avaliação nutricional e antropométrica, além dos diversos testes bioquímicos.
As pacientes foram recrutadas à medida que chegaram para primeira consulta de atendimento médico para o tratamento da gestação molar, quando foram convidadas a participar do estudo e assinaram o TCLE. Previamente, logo após o esvaziamento, essas receberam as orientações gerais e dietéticas para a realização da coleta de sangue (Apêndice 2).
As amostras de sangue venoso foram obtidas dentro de uma semana pós-esvaziamento molar e coletadas entre 8 e 10 h da manhã após jejum noturno de 12-14 h para a realização dos exames bioquímicos. O sangue foi colhido em tubo heparinizado livre de metais para as dosagens de vitamina C, e em tubo âmbar com gel separador sem anticoagulante para as dosagens de vitamina E e não âmbar para a GGT. As amostras foram então processadas e transferidas para tubos de transporte e armazenadas de maneira adequada até o envio dessas para os laboratórios responsáveis pelas dosagens.
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As dosagens de vitaminas C e E foram realizadas de forma automatizada por serviço terceirizado (Laboratório Morales Ltda). Já as dosagens de GGT foram realizadas de forma automatizada pelo Setor de Patologia Clínica do HUAP e pelo Laboratório de análises clínicas da ME.
5.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, Chicago: EUA) versão 18.0. As
frequências foram calculadas através do teste de Fisher.
6. RESULTADOS
6.1. LOGÍSTICA DE COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
A maior dificuldade encontrada em um projeto com diferentes análises como o apresentado é a viabilização das coletas, processamento e transporte das amostras. Isso ocorre visto que é necessário o seguimento de protocolo e padronização adequada para que quando obtidos, os resultados sejam fidedignos. Além disso, tratando-se de um projeto com seres humanos em que se deve seguir uma orientação de jejum e alimentação adequados, muitas dificuldades decorrem da orientação da paciente pela equipe e do seguimento das orientações pela paciente participante, respeitando a padronização estabelecida.
Assim que coleta, processamento, armazenamento e transporte das amostras foram estabelecidos, o procedimento foi padronizado como ilustrado na figura 4. No entanto, as vitaminas C e E e a GGT correspondem a apenas uma parcela das amostras obtidas e processadas simultaneamente no projeto. Como pode ser observado na figura 5, foram obtidos 13 tubos de sangue de cada paciente, sendo 3 tubos de heparina livres de metais (tampa azul escuro), 2 tubos sem anticoagulante com gel separador (tampa amarela), 1 tubo de fluoreto (tampa cinza), 5 tubos âmbar com gel separador para obtenção de soro (tubo alaranjado de tampa vermelha) e 2 tubos com gel separador para obtenção de soro (tampa vermelha).
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Figura 4: Esquema de coleta, processamento e transporte para a realização das dosagens
de vitamina C, vitamina E e GGT
Nota: GGT= Gama-glutamiltransferase, RPM= Rotações por minuto.
Os tubos de heparina livre de metais foram imediatamente centrifugados após a coleta e foram feitas com o plasma 5 alíquotas para dosagem de óxido nítrico (NO) em criotubo (tampa azul clara) e uma alíquota de vitamina C em tubo âmbar de transporte (tubo alaranjado de tampa amarela). Um dos tubos foi separado após centrifugado sem ser manipulado para futura dosagem de metais. Posteriormente, com as células restantes de um dos tubos manipulados, foi feito o hemolisado de eritrócitos, para o qual foram feitas 5 alíquotas. Todas as alíquotas obtidas foram congeladas, bem como o tubo utilizado para dosagem de metais e aquelas que não foram para análise permaneceram em freezer -80ºC.
Os tubos de fluoreto e de gel sem anticoagulante (amarelo) foram centrifugados e levados para os laboratórios de análise específicos para cada centro de referência. As 5 amostras obtidas em tubo âmbar com gel separador foram centrifugadas. Uma delas foi separada para dosagem de vitamina D. As outras foram utilizadas para fazer alíquotas para dosagem de vitaminas K, A, E, as quais foram congeladas a -80ºC, e de homocisteína em tubos âmbar de transporte. Os tubos de homocisteína e vitamina D foram transportados em gelo.
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Finalmente, após colhido o sangue os dois tubos com gel separador de tampa vermelha foram centrifugados, um foi separado para as dosagens de insulina, ácido fólico e vitamina B12 e transportados em gelo, e o outro foi utilizado para obtenção de 5 alíquotas para dosagem de radicais livres mantidas em -80ºC.
Figura 5: Esquema de coleta, processamento e transporte das amostras para a realização de todas
as dosagens previstas no grande projeto o qual esse faz parte
Nota: NO= óxido nítrico; ME= Maternidade escola; HUAP= Hospital Universitário Antônio Pedro; RPM= rotações por minuto.
6.2. AMOSTRAGEM
Apesar do início das coletas terem sido planejadas para começo de janeiro de 2016, só foi possível iniciá-las no dia 2 de março devido às dificuldades técnicas encontradas. As cirurgias de esvaziamento molar foram suspensas temporariamente no HUAP e houve falta dos kits utilizados para as dosagens do beta-hCG, impossibilitando o recrutamento de pacientes nesse centro de referência. Além disso, para a viabilização das coletas na ME/UFRJ, foram encontrados diversos
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problemas de fluxo e foi necessária uma preparação adequada de toda a equipe da ME para que as orientações fossem passadas para as pacientes corretamente e o recrutamento fosse então viável.
Até o presente momento foram recrutadas cinco pacientes, no entanto, apenas para quatro já estão disponíveis os resultados dos exames, sendo estas incluídas no estudo. As pacientes sem comorbidades que farão parte do grupo controle ainda não foram recrutadas, pois há necessidade de pareamento por idade e idade gestacional.
A média de idade encontrada para as pacientes já incluídas no estudo foi de 24 ± 10,5 anos, sendo a idade máxima de 38 anos e a mínima de 14.
6.3. ANÁLISE DAS VITAMINAS E GGT
Os resultados médios e desvios padrão para as dosagens realizadas estão expressos na tabela 1. Para as dosagens de GGT obteve-se valor médio de 27,15 ± 13,31 U/L, sendo o valor máximo e mínimo encontrados de 44,4 U/L e 12 U/L, respectivamente. Já para a vitamina C, o valor médio encontrado foi de 0,67 ± 0,35 mg/dL, com valor máximo de 1,11 mg/dL e mínimo de 0,36 mg/dL. Finalmente, para as dosagens de vitamina E, a média das concentrações encontradas foi de 8,92 ± 1,21 mg/L, sendo o valor máximo de 9,86 mg/L e mínimo de 7,55 mg/L. O resultado de vitamina E de uma das pacientes ainda não está disponível então não foi utilizado no cálculo de média e desvio padrão dos valores dessa vitamina.
Tabela 1: Valores de média e desvio padrão das dosagens de GGT, vitamina C
e vitamina E das pacientes (n=4)
Nota: GGT= Gama-glutamiltransferase; VIT C= Vitamina C; VIT E= Vitamina E; VR= valor de referência; dp= desvio padrão.
Os resultados individuais das dosagens das vitaminas e GGT podem ser observados no gráfico 1. Sobre as dosagens de GGT, uma das pacientes apresentou valor de 44,4 U/L, acima do limite superior do intervalo de referência. As
média 27,15 0,67 8,92 dp 13,31 0,35 1,21 GGT , U/L (VR 8-34 U/L) VIT C, mg/dL (VR 0,5-1,5 mg/dL) VIT E, mg/L (VR 5-20 mg/L)
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demais pacientes apresentaram valores de GGT de 12 U/L, 25 U/L e 27,2 U/L, que estão dentro do intervalo de referência. Para a vitamina C, duas pacientes apresentaram resultados abaixo do limite inferior do intervalo de referência, caracterizando uma deficiência dessa vitamina, com valores séricos de 0,36 mg/dL e 0,42 mg/dL. As outras duas pacientes apresentaram suficiência de vitamina C, com 0,78 mg/dL e 1,11 mg/dL na dosagem dessa vitamina. Já para a vitamina E, todas as pacientes apresentaram concentrações séricas dentro dos intervalos de referência para essa substância, com 9,86 mg/L, 9,72 mg/L e 7,55 mg/L de vitamina E sérica.
Gráfico 1: Dosagens de GGT, vitaminas C e E das pacientes
pós-esvaziamento molar (n=4)
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7. DISCUSSÃO
Os fatores etiológicos e a incidência relacionados à ocorrência de MH são de difícil caracterização. Isso ocorre devido a diversos fatores como a raridade da doença, dificuldade no estabelecimento adequado da população de risco, falta de centralização nos bancos de dados disponíveis e deficiência de estudos com grupos controles bem escolhidos, que viabilizariam a comparação de possíveis fatores de risco (LURAIN, 2010).
Um grande número de potenciais fatores de risco para a ocorrência da MH tem sido avaliado, no entanto, apenas dois estão bem estabelecidos: a gestação molar prévia e os extremos de idade materna. A idade materna avançada e a gestação em mulheres muito jovens foram consistentemente correlacionadas com maiores taxas de acometimento por MH. Em comparação com mulheres entre 24 e 35 anos, o risco para o desenvolvimento da doença é de cerca de 2 vezes maior para mulheres abaixo dos 21 anos ou acima dos 35, e cerca de 7 a 10 vezes maior para mulheres com idade superior aos 40 anos (SEBIRE & SECKL, 2008; ALMEIDA, 2011). As idades maternas encontradas para as gestantes já recrutadas neste estudo são consistentes com o descrito na literatura, mostrando a incidência aumentada nos extremos de idades, sendo duas pacientes menores de 21 anos (14 e 18 anos) e uma paciente acima de 35 (38 anos de idade).
O perfil oxidativo é considerado importante na etiologia da MH. Em estudos que avaliaram a relação entre as concentrações de NO- plasmático (marcador de EO) e o desenvolvimento da MH em pacientes com MHC, observou-se concentrações desse marcador significativamente maiores no grupo cursando com gestação molar quando comparado com o grupo controle (HARMA et al., 2005). Além disso, já foi evidenciada a diminuição da resposta antioxidante em pacientes com MH (AGARWAL et al, 2005).
Apesar da dieta ser considerada por muitos autores como fator de risco para a ocorrência de MH, não existe em literatura estudos de avaliação nutricional dessas pacientes. Além disso, quanto à dosagem de vitaminas antioxidantes, apenas Kolusari et al (2009) fizeram análises séricas em pacientes com MH. Eles observaram que essas pacientes apresentaram níveis séricos de vitamina E
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significativamente reduzidos quando comparadas com gestantes sem comorbidades e mulheres não grávidas.
Em estudo com porcos da guiné, Paidi et al (2014) observaram que as defesas antioxidantes durante o desenvolvimento fetal estavam reduzidas em animais com deficiência em vitamina C, aumentando a susceptibilidade ao EO. Além disso, Ikpen et al (2012) observaram que os níveis de vitamina C e E estavam significativamente diminuídos em pacientes com pré-eclampsia quando comparados com gestantes sem comorbidades.
Metade das pacientes incluídas no presente estudo apresentaram deficiência em vitamina C, o que pode acarretar na redução em suas defesas antioxidantes e consequentemente no aumento do risco para o desenvolvimento de comorbidades. Em comparação com gestantes sem comorbidades, para as quais Vrzhesinskaya et al (2015) encontraram deficiência de vitamina C em 20,4% da população estudada, há maior frequência dessa deficiência nas pacientes com MH avaliadas.
Como observado por Hans & Edward (2010), a suplementação da vitamina C em gestantes foi relacionada significativamente com a diminuição da hospitalização do grupo estudado, apresentando efeito protetor para comorbidades. Sendo assim, sua suplementação pode ser então futuramente avaliada na prevenção da MH se observarmos correlação da deficiência e ocorrência da doença, visto já ter sido notada deficiência dessa vitamina em 50% dos indivíduos no grupo estudado.
Não foram visualizadas quaisquer alterações nos níveis séricos de vitamina E, indicando a suficiência dessa vitamina em todas as voluntárias. No entanto, o status adequado dessa vitamina ainda não está bem definido para gestantes. Em estudos que gestantes estavam com os níveis de vitamina E documentadamente baixos, a suplementação com essa vitamina foi benéfica na prevenção de complicações na gestação. No entanto, na literatura, a prevalência de deficiência de vitamina E em gestantes foi descrita como sendo de 5,9% no Golfo Pérsico, levando os autores a acreditarem que a maioria das gestantes apresentam suficiência dessa vitamina. Adicionalmente, outras pesquisas mostram que a suplementação com vitamina E, não apresentou benefício significativo contra o desenvolvimento de problemas na gestação. Entretanto, sabe-se que o status de vitamina E deve ser adequado em
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para garantir gestações saudáveis, sugerindo que a suplementação dessa vitamina em quantidades superiores ao consumo diário recomendado não traz benefícios para as gestantes (TRABER, 2014).
Quanto às dosagens de GGT, apenas uma das pacientes apresentou resultados acima do limite superior de referência para essa substância. No entanto, essa relatou o consumo de álcool diariamente, além de se tratar de uma paciente obesa, tornando difícil associar esse resultado com a ocorrência da MH. Um estudo realizado com população mista verificou que, dos parâmetros que podem alterar o nível sérico de GGT em até 20%, o uso de álcool e a circunferência da cintura foram os que influenciaram significativamente nas dosagens desse marcador (LIU et al, 2012).
8. CONCLUSÃO
Como descrito em literatura, observou-se a maior ocorrência da MH nos extremos de idades, representados por 75% das pacientes avaliadas, sendo duas com idade inferior a 21 anos e uma com idade superior aos 35 anos. As concentrações séricas de vitamina E encontradas apresentaram-se dentro dos limites de referência. No entanto, isso pode ter ocorrido devido ao baixo n recrutado até o momento, sendo necessária a análise de maior número de pacientes para a avaliação de uma possível correlação entre os níveis dessa vitamina com a ocorrência da MH. Já para os valores de GGT, apenas uma paciente apresentou níveis elevados dessa enzima, porém trata-se de uma paciente obesa que faz uso diário de álcool. .
Os resultados obtidos para as dosagens séricas de vitamina C mostraram que apenas 50% das pacientes avaliadas apresentaram suficiência dessa vitamina. Entretanto, é necessária a avaliação de um maior n e de comparação dos resultados das gestações molares com o grupo controle para verificarmos a possível relação de deficiência de ingestão de vitamina C e ocorrência de mola.
O estudo dessas substâncias como marcadores do perfil oxidativo é importante por serem possíveis preditores de ocorrência e evolução da MH e sua utilização pode ser avaliada para uso na rotina laboratorial.
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APÊNDICE 1
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Dados de identificação
Título do Projeto: “Estresse oxidativo e influência da ingestão alimentar na
ocorrência de mola hidatiforme e evolução para neoplasia trofoblástica gestacional”.
Pesquisadores Responsáveis: Pós-graduandos Leda Maria Ferraz da Silva e
Marcelo Burlá
Instituição a que pertence os Pesquisadores Responsáveis: Universidade Federal
Fluminense
Telefones Para Contato: (021) 26299031 / (021) 36747282.
Nome do voluntário: _____________________________________________ Idade: _________ anos
R.G.: ________________________
Telefone para contato: ________________________/ _________________
A Sra. está sendo convidada a participar do projeto de pesquisa “Estresse
oxidativo e influência da ingestão alimentar na ocorrência de mola hidatiforme e evolução para neoplasia trofoblástica gestacional”, sob responsabilidade dos
pesquisadores pós-graduandos Leda Maria Ferraz da Silvae Marcelo Burlá, vinculados ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, da Universidade Federal Fluminense.As informações abaixo estão sendo fornecidas para esclarecê-la sobre sua possível participação voluntária neste estudo, que tem como objetivo avaliar as possíveis causas que levam ao desenvolvimento da mola hidatiforme, em mulheres que, como você foram atendidas na Maternidade Escola, Laranjeiras, Rio de Janeiro (Universidade Federal do Rio de Janeiro), ou no Hospital Universitário Antonio Pedro em Niterói (Universidade Federal Fluminense). O principal objetivo deste estudo é avaliar se o que você come tem alguma relação com o aparecimento da mola hidatiforme e como foi seu tratamento depois de retirada da mola. Vamos fazer algumas medidas como peso, altura, pressão, alguns exames de laboratório e ultrassonografia. A nutricionista fará perguntas sobre sua alimentação e sobre seus hábitos como fumar, beber etc. Todos os procedimentos levarão cerca de 1 hora e serão feitos durante o tempo que você se encontra no ambulatório. O sangue para
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os exames será retirado junto com o do exame de beta-hCG e todos os outros (pressão, peso, altura) não causam dor.
A sua participação consiste em autorizar o uso destas informações e daquelas que já estão no seu prontuário para fazermos o trabalho. A Sra. tem toda a liberdade de retirar o seu consentimento e deixar de participar do estudo a qualquer momento sem penalização alguma. Neste caso a Sra. poderá continuar seu tratamento na Instituição sem problemas. Todas as informações obtidas a seu respeito neste estudo, serão analisadas em conjunto com as de outros voluntários, não sendo divulgada a sua identificação ou de outros pacientes em nenhum momento. A Sra. tem a garantia de que todos os dados obtidos a seu respeito, só serão utilizados neste estudo. Caso seja necessário, a Sra. terá assistência permanente durante o estudo, ou mesmo após o término ou interrupção do estudo.
A Sra. não receberá nenhuma compensação financeira relacionada à sua participação neste estudo. Da mesma forma, a Sra. não terá nenhuma despesa pessoal em qualquer fase do estudo, incluindo exames e consultas. Durante o período de sua participação, se houver qualquer despesa adicional de sua parte em relação a condução ou alimentação, a Sra. será reembolsada.
A qualquer momento, se for de seu interesse, a Sra. poderá ter acesso a todas as informações obtidas a seu respeito neste estudo, ou a respeito dos resultados gerais do estudo.
Em qualquer etapa do estudo, a Sra. terá acesso aos profissionais responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas. Os principais investigadores são o Prof. Dr. Antônio Rodrigues Braga Neto (021-992040007 vivo) e Profa. Dra. Patrícia de Fátima Lopes de Andrade (980308672 tim; 021-973057223 claro).
O participante receberá uma cópia assinada do Termo de Consentimento Livre e Esclarecimento.
Niterói, _____ de _______________________ de 2016.
_______________________________________________________________ Data/ Assinatura Voluntário
_______________________________________________________________ Data/ Assinatura Pesquisador
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APÊNDICE 2
ORIENTAÇÕES GERAIS E DIETÉTICAS PARA A COLETA DE SANGUE Nome: _____________________________________________________________ Dia do Exame:___/___/___ Horário: ____________
Local: ______________________________________________________________ 1) ORIENTAÇÕES GERAIS PARA A REALIZAÇÃO DOS EXAMES DA MOLA
Jejum de 12 horas antes da coleta de sangue; Não tomar bebidas alcoólicas 48 horas antes;
Um dia antes evitar refeições pesadas ricas em gorduras e açúcar, consumidas em excesso; Não realizar atividade física intensa 24 horas antes;
Não tomar vitamina C ou qualquer outro suplemento vitamínico. 2) ORIENTAÇÕES DIETÉTICAS
Não comer, nas 24 horas anteriores à coleta, os seguintes alimentos devido ao alto teor de nitrito/nitrato:
Legumes, verduras e preparações
Não comer, nas 24 horas anteriores à coleta nenhum legume, verdura ou
alimentos feitos à base disso
Frutas Só pode comer maçã e pêra
Bebidas em geral e sucos
PROIBIDO: mate, coca-cola, chá comum e preto, sucos de frutas naturais e
artificiais (com vitamina C), bebidas alcoólicas Carnes e
derivados
PROIBIDO: Bacon, presunto, embutidos (linguiça, salsicha, salame),
carnes vermelhas, enlatados, ovo, queijos processados, peixe em conserva (sardinha em lata)
Condimentos PROIBIDO: Ervas (salsinha, cebolinha, manjericão, ervas finas, coentro, alecrim, etc.), ketchup, mostarda, maionese
Demais alimentos
PROIBIDO: Pizza congelada, queijos amarelos, chocolate, cogumelo, aspargo,
ervilha, feijão verde
Sugestão de cardápio a ser seguido no dia anterior ao exame:
Café da manhã
Leite/Iogurte/Coalhada Pão/Torrada
Requeijão/Queijo minas
Lanche Maçã ou pêra
Almoço
Arroz/Macarrão (sem molho de tomate) Feijão
Frango/Peixe
Sobremesa: gelatina ou doce Lanche
Leite/Iogurte/Coalhada Pão/Torrada
Requeijão/Queijo minas Jantar
Arroz/Macarrão (sem molho de tomate) Feijão
Frango/Peixe
Sobremesa: gelatina ou doce
Ceia Maçã ou pêra
Qualquer dúvida, entrar em contato com os pesquisadores:
Leda Maria Ferraz da Silva - (21) 983786243 (tim) Antônio Rodrigues Braga Neto - (21) 992040007 (vivo)
