I UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS DA MEMBRANA DOS ERITRÓCITOS DE PACIENTES RENAIS CRÔNICOS EM HEMODIÁLISE E POSSÍVEIS
ASSOCIAÇÕES COM INFLAMAÇÃO
JULIE ANN KEMP DUARTE
NITERÓI - RJ 2018
JULIE ANN KEMP DUARTE
PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS DA MEMBRANA DOS
ERITRÓCITOS DE PACIENTES RENAIS CRÔNICOS EM
HEMODIÁLISE E POSSÍVEIS ASSOCIAÇÕES COM
INFLAMAÇÃO
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Ciências Médicas.
ORIENTADOR(A): Profa Dra DENISE MAFRA
CO-ORIENTADOR(A): Dra MARTA G. B. M ESGALHADO
NITERÓI - RJ 2018
III Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
JULIE ANN KEMP DUARTE
PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS DA MEMBRANA DOS ERITRÓCITOS DE PACIENTES RENAIS CRÔNICOS EM HEMODIÁLISE E POSSÍVEIS
ASSOCIAÇÕES COM INFLAMAÇÃO
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Ciências Médicas Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Alair Augusto Sarmet Moreira Damas dos Santos Universidade Federal Fluminense
______________________________________________________________________ Profa. Dr.a Ludmila Ferreira Medeiros de França Cardozo
Universidade Federal Fluminense
______________________________________________________________________ Prof. Dra. Aline Silva de Aguiar
Universidade Federal de Juiz de Fora
NITERÓI – RJ 2018
V Aos meus queridos pais,
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, por todo o suporte e incentivo durante toda a minha trajetória acadêmica até o dia de hoje.
Ao meu noivo Pedro, por todo apoio, companheirismo e dedicação.
Aos meus irmãos e familiares, por toda paciência e pela participação em cada obstáculo e em cada conquista.
À minha excelentíssima orientadora Denise Mafra, exemplo de pesquisadora e professora, por todas as oportunidades concedidas.
A Marta Esgalhado, por toda ajuda desde o início do projeto até hoje e pelos conhecimentos transmitidos.
Às minhas parceiras de pesquisa Renata Azevedo e Bruna Regis, por toda a parceria e dedicação ao longo do projeto.
A professora Nágila Damasceno e todo seu grupo de pesquisa que me receberam muito bem na USP e tornaram possível minha pesquisa.
A todos os pacientes que concordaram em participar desse estudo, permitindo o aprimoramento do conhecimento científico em nefrologia.
VII “Existem muitas hipóteses em ciência que estão erradas. Isso é perfeitamente aceitável, eles são a abertura para achar as que estão certas”.
RESUMO
Introdução: Pacientes com doença renal crônica (DRC) em hemodiálise (HD) apresentam notório estado inflamatório. Dentre os vários fatores que levam à inflamação, o perfil de ácidos de graxos é um deles. A literatura científica aponta o papel de alguns ácidos graxos no aumento do processo inflamatório. No entanto, poucos pesquisadores analisaram e/ou quantificaram o perfil de ácidos graxos eritrocitário em pacientes com DRC em HD. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar o perfil de ácidos graxos de paciente DRC em HD e verificar possíveis associações com o estado inflamatório. Métodos: Trata-se de um estudo transversal onde foram recrutados 32 pacientes com DRC em HD na clínica Renalcor/RJ (50.0% homem, 54.9 ± 10.2 anos, 44.63 ± 28.4 meses em HD e 26.4 ± 4.9 Kg/m2) e 12 indivíduos saudáveis (33,3% homem, 48.3 ± 11.8 anos, e 25.0 ± 3.9 Kg/m2). Marcadores inflamatórios plasmáticos como proteína C-reativa ultra sensível (PCR-us) e interleucina-6 (IL-6) foram analisados por ensaio imunoenzimático (ELISA), enquanto o estresse oxidativo foi avaliador através das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Adicionalmente, as toxinas urêmicas plasmáticas como Indoxil Sulfato (IS) e P-cresyl Sulfato (p-CS) foram analizadas por HPLC. A análise dos ácidos graxos foi feita na membrana dos eritrócitos por cromatografia gasosa. Foi avaliado também o estado nutricional e a ingestão alimentar. Resultados: Valores de ácido palmitoléico foram maiores nos pacientes em HD do que nos indivíduos saudáveis (p <0,001). Além disso, os pacientes apresentaram menores valores de ácido oleico (p <0,01), ácido linoléico (p <0,03), ácido araquidônico (p <0,001), ácido eicosapentanóico (p <0,03) e ácido dihomo gama-linolênico (DGLA) (p <0,04). Como esperado os pacientes apresentaram níveis significativamente maiores de PCR-us e TBARS em comparação aos indivíduos saudáveis, bem como os níveis de toxinas urêmicas, quando comparados aos valores de referência. Foi encontrada correlação positiva entre o DGLA e IL-6 (r = 0.406, p = 0.021), bem como associação negativa entre GLA e p-CS (β = - 0.49, p = 0.007).
Conclusão: Os resultados sugerem que os pacientes em HD apresentam perfil de ácidos graxos alterado, baixos níveis de ácidos graxos poliinsaturados, o que pode corroborar para o aumento do risco de desenvolvimento da DCV. Além disso, as correlações encontradas sugerem que os ácidos graxos atuam na inflamação no paciente em HD.
Palavras chave: Lipídios; Inflamação; Doença renal crônica; Hemodiálise; Albumina sérica.
IX ABSTRACT
Introduction: Patients with chronic kidney disease (CKD) on hemodialysis (HD) treatment have a notorious inflammatory state. Among the several factors that lead to inflammation, the fatty acid profile is one of them. The scientific literature points out the role of some fatty acids in increasing the inflammatory process. However, few researchers have analyzed and / or quantified the erythrocyte fatty acid profile in patients with CKD in HD. Thus, the objective of this study was to analyze the fatty acid profile of DRC patients in HD and to verify possible associations with the inflammatory state.
Methods: In this cross-sectional study 32 patients with CKD in HD were enrolled in the Renalcor / RJ clinic (50.0% man, 54.9 ± 10.2 years, 44.63 ± 28.4 months in HD and 26.4 ± 4.9 kg / m2) and 12 healthy subjects (33.3%, 48.3 ± 11.8 years, and 25.0 ± 3.9 kg / m2). Plasma inflammatory markers such as ultra-sensitive C-reactive protein (hs-CRP) and interleukin-6 (IL-6) were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), while the oxidative stress was evaluated by thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). In addition, plasma uremic toxins levels such as Indoxyl Sulfate (IS) and P-cresyl Sulfate (p-CS) were analyzed by HPLC. Fatty acid analysis was performed on the erythrocyte membrane by gas chromatography. Nutritional status and the food intake were also evaluated. Results: Palmitoleic acid levels were higher in HD patients than in healthy subjects (p <0.00). In addition, patients presented lower values of oleic acid (p <0.01), linoleic acid (p <0.03), arachidonic acid (p <0.00), eicosapentaenoic acid (p <0.03) and acid gamma-linolenic dihomo (DGLA) (p <0.04). As expected patients presented significantly higher levels of hs-CRP and TBARS compared to healthy subjects, as well as elevated levels of uremic toxins. Positive correlation was found between DGLA and IL-6 (r= 0.406, p= 0.021), as well as a negative association between GLA and p-CS (β= - 0.49, p= 0.007).
Conclusion: In conclusion, the data suggest that HD patients have altered fatty acid profile, low levels of polyunsaturated fatty acids and high levels of saturated fatty acids, which may corroborate to increase the risk of developing CVD. In addition, the correlations found suggest that fatty acids act on inflammation in HD patients.
Keywords: Lipids; Inflammation; Chronic kidney disease; Hemodialysis; Human serum albumin.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1. Critérios para a DRC...19
Quadro 2. Estadiamento da doença renal crônica...20
Quadro 3. Estado Nutricional de Adultos Segundo IMC...36
Quadro 4. Cálculo da Densidade Corporal...37
Quadro 5. Valores de referência para percentuais de gordura corporal...37
Figura 1. Exemplos de tamanhos das estruturas químicas dos ácidos graxos...22
Figura 2. Estrutura química dos ácidos graxos com relação a sua saturação...23
Figura 3. Mecanismo de ação da SCD-1, balanceando a quantidade de AGMI...25
Figura 4. Metabolismo dos ácidos graxos das famílias n-6 e n-3...26
Figura 5. Potenciais mecanismos de ação do ácido graxo n-3 sobre fatores de transcrição...27
Figura 6 - Ácidos graxos saturados ativando mediadores pró-inflamatórios...29
Figura 7. Hipótese de como o ácido graxo poderia aumentar a remoção de toxinas urêmicas no plasma de pacientes em HD...31
Figura 8 - Correlação entre DGLA e níveis plasmáticos de IL-6 em pacientes em hemodiálise...46
Figura 9. Correlação entre ácido gama linolênico no eritrócito e níveis plasmáticos de p-CS em pacientes em hemodiálise...47
XI LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características gerais e antropométricas dos indivíduos participantes do estudo...42 Tabela 2. Ingestão diária de calorias e macronutrientes...43 Tabela 3. Parâmetros bioquímicos e marcadores inflamatórios...44 Tabela 4. Concentração de ácidos graxos da membrana do eritrócito em pacientes em HD e no grupo controle...45 Tabela 5. Regressão linear múltipla para possíveis preditores dos níveis de pCS...46
LISTA DE ABREVIATURA AA Ácido araquidônico
ACAT Acil-CoA:colesterol aciltransferase AG Ácidos graxos
AGCC Ácido graxo de cadeia curta AGCM Ácido graxo de cadeia média AGCL Ácido graxo de cadeia longa AGCML Ácido graxo de cadeia muito longa AGMI Ácido graxo monoinsaturado AGPI Ácido graxo poliinsaturado AGS Ácido graxo saturado AHA American Heart Association AMBc Área do braço muscular corrigida ALA Ácido alfa linoleico
CC Circunferência da cintura
CRTH2 Receptor de quimiocina expressa em células T helper tipo 2 CG Cromatografia gasosa
COX Cicloxigenase CT Colesterol total
DAGE Deficiência de ácidos graxos essenciais DC Densidade corporal
DCB Dobra cutânea bicipital DCSE Dobra cutânea subescapular DCSI Dobra cutânea supra ilíaca DCT Dobra cutânea tricipital DCV Doença cardiovascular
DGLA Ácido dihomo-gamma linolenico DHA Ácido docosahexaenóico
DM Diabetes Mellitus
XIII DP Desvio padrão
DP Diálise peritoneal DRC Doença renal crônica D6D Delta 6 desaturase D5D Delta 5 desaturase EPA Ácido eicosapentaenoico
ERNs Espécies reativas de niteroigênio EROs Espécies reativas de oxigênio FAV Fístula arteriovenosa
FFAR2 Receptor de ácido graxo livre 2 FFAR3 Receptor de ácido graxo livre 3 GC Gordura corporal
GLA Ácido gama linolênico
GLP-1 Peptídeo semelhante a glucagon 1 HD Hemodiálise
HDL Lipoproteína de alta densidade
HPLC Cromatografia líquida de alta performance ICAM Moléculas de adesão intercelular
IFN Interferon
IMC Índice de massa corporal IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6 IS Indoxil Sulfato
KDOQI Kidney Disease Quality Outcomes Quality Initiative KDIGO Clinical Practice Guideline
LA Ácido linolênico
LDL Lipoproteína de baixa densidade LPS Lipopolissacarídeo
LOX Lipoxigenase MDA Malondialdeído
MLG Massa livre de gordura
MPC-1 Proteína quimioatraente de monócitos 1 NF-ƙB Fator nuclear kappa B
NKF National Kidney Foundation n-3 Ômega 3
n-6 Ômega 6
OMS Organização mundial da saúde PCR Proteína C-reativa
PCR-us Proteína C-reativa ultrassensível p-CS P cresil sulfato
PGE1 Prostaglandina E 1 PGH1 Prostaglandina H 1 SCD-1 Estearoil-Coa dessaturase TFG Taxa de filtração glomerular TG Triglicerídeo
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa TRS Terapia substitutiva renal Tx Transplante
VCAM Molécula de adesão da célula vascular 15-HETE Ácido15- Hidroxieicosatetraenóico
XV SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA...17
2. REVISÃO DA LITERATURA...19
2.1 DOENÇA RENAL CRÔNICA...19
2.2 INFLAMAÇÃO NA DOENÇA RENAL CRÔNICA...20
2.3 ÁCIDOS GRAXOS...22
2.4 ÁCIDOS GRAXOS E SUA INFLUÊNCIA NA INFLAMAÇÃO...26
2.5 ÁCIDOS GRAXOS NA DRC...32 3. OBJETIVOS...34 3.1 GERAL...34 3.2 ESPECÍFICOS...34 4. MATERIAIS E MÉTODOS...35 4.1 CASUÍSTICA...35
4.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO...35
4.3 ASPECTOS ÉTICOS...35
4.4 INGESTÃO ALIMENTAR...35
4.5 AVALIAÇÃO NUTRICIONAL...36
4.6 COLETA E ANÁLISE DE MATERIAL BIOLÓGICO...38
4.6.1 Parâmetros bioquímicos de rotina...38
4.6.2 Determinação de marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo...38
4.6.3 Determinação dos níveis plasmáticos de toxinas urêmicas...39
4.6.4 Determinação do perfil de ácidos graxos na membrana dos eritrócitos...39 5.0 ANÁLISE ESTATÍSTICA...41 6. RESULTADOS...41 7. DISCUSSÃO...47 8. CONCLUSÃO...54 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...55 10. APÊNDICES...67
11.ANEXOS...69 11.1. COMITÊ DE ÉTICA...69
17 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
A doença renal crônica (DRC) consiste na perda progressiva e irreversível da função renal, associada à piora da qualidade de vida e ao aumento da mortalidade prematura, sendo atualmente um problema de saúde pública global (Junior et al., 2004; Pena et al., 2012; Perico & Remuzzi, 2012). As doenças cardiovasculares (DCV) são as principais causa de morte nessa população, sendo agravada nos pacientes em hemodiálise (HD), que apresentam risco 20 vezes maior que a população geral (K/DOQI, 2002; Gansevoort et al., 2013; Ardhanari et al., 2014; Liu et al., 2014; McCullough et al., 2016). Dentre os fatores de risco para desenvolver as DCV, destacam-se a inflamação, estresse oxidativo e recentemente a disbiose intestinal, condições estas que estão interligadas como gatilho (Stenvinkel, 2010; Vaziri ND et al., 2012; Barros AF et al., 2015). Assim, mecanismos que envolvem a diminuição do estado inflamatório têm sido destacados como abordagem promissora para reduzir a progressão da DRC e minimizar as complicações cardiovasculares. Neste contexto, a dieta pode ser estratégia nutricional eficaz para modular diretamente essas duas condições.
Os ácidos graxos (AG) são reconhecidos por influenciarem o estado inflamatório através de vários processos, como produção e liberação de eicosanóides, alteração de bactérias microbianas intestinais, modulação da fluidez de membranas e outras (Yang et al., 2011; Dennis et al., 2015; Rodríguez-Carrio et al., 2017). Entre os ácidos graxos poliinsaturados (AGPI) existem aqueles denominados essenciais, como a família dos ácidos graxos ômega-3 (n-3) e ômega-6 (n-6) (Das et al., 2006). No passado, os ácidos graxos n-6 eram apontados como atuantes diretos no sistema inflamatório, como moduladores de doenças inflamatórias através dos compostos ativos gerados, aumentando a inflamação, enquanto os ácidos graxos n-3 eram apontados como moduladores da inflamação com função antiinflamatória (Das et al., 2008).
Adicionalmente, sabe-se que em cada passo da dessaturação e elongação dos ácidos graxos, eicosanóides são liberados, sendos esses de diversas séries, com atuações e respostas diferentes, podendo ser pró ou antiinflamatória. Onde já foi comprovado e bastante elucidado na literatura que o ácido araquidônico (AA), que faz parte do família n-6, está associado ao efeito pró-inflamatório devido à liberação de leucotrienos e tromboxanos das séries 2 e 4, que são as séries pró-inflamatórias (Yui et al., 2015; Sergeant et al., 2016). Enquanto, a fámilia n-3 produz os ácido eicosapentaenóico (EPA) e ácido docosahexaenóico (DHA). EPA e DHA são substratos para ciclooxigenases 2
(COX-2) e lipoxigenases (LOX), sintetizando uma variedade de eicosanóides incluindo resolvinas, protectinas e maresinas, estando relacionadas com a diminuição do estresse oxidativo e inflamação, através da inibição da expressão de moléculas de adesão como a proteína-1 de adesão celular vascular (VCAM-1) e molécula de adesão intercelular-1 (ICAM) (Calder, 2010).
Além disso, foi observado outro meio de atuação dos ácidos graxos que de forma indireta pode ajudar na redução da inflamação. Sabe-se que os paciente em HD apresentam retenção das toxinas urêmicas devido estarem ligadas à albumina sérica, ocasionando aumento do estado inflamatório. Desta forma, foi observado em um estudo in vitro que o ácido graxo docosahexaenoico (DHA) atuou como competidor com as toxinas urêmicas pela ligação à albumina. Os ácidos graxos apresentam afinidade de ligação maior com a albumina em comparação com as toxinas urêmicas, o que pode ser observado no estudo devido o aumento da fração livre das toxinas urêmicas no plasma e consequentemente sua remoção pelo tratamento dialítico (Tao et al., 2015). Poucos estudos mostraram alterações substanciais no perfil de ácidos graxos no eritrócito e no plasma de pacientes em HD, entretanto, apenas um estudo até o momento realizou associação entre o perfil de ácidos graxos e marcadores de inflamação nos pacientes em HD (Huang et al., 2012; Turolo et al., 2018). Foi observado que pacientes em HD apresentam menores valores de AGPI tanto no plasma quanto no eritrócito, além da associação negativa entre o ácido linolênico (LA) e a interleucina-6. O objetivo deste estudo foi analisar o perfil de ácidos graxos de paciente DRC em hemodiálise e verificar possíveis associações com marcadores inflamatórios.
19 2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 DOENÇA RENAL CRÔNICA
A definição de doença renal crônica (DRC) consiste em lesão renal com perda progressiva e irreversível da função dos rins. Segundo o National Kidney Foundation (NFK) em seus guias NKF-KDOQI (2000) e NFK-KDIGO (2013), a DRC é definida como anomalias na estrutura e função renal, por três ou mais meses, afetando a saúde do indivíduo, de acordo com os critérios descritos no Quadro 1.
Quadro 1. Critérios para a DRC (uma das seguintes opções presentes por mais de 3 meses).
Critérios para doença renal crônica (pelo menos um dos abaixo por mais de 3 meses)
Marcador de lesão renal
Albuminúria
Anormalidades no sedimento urinário
Distúrbios eletrolíticos e outras desordens devido a doença dos túbulos renais
Anormalidades detectadas por biópsia renal Anormalidades detectadas por exames de imagem Antecedente de transplante renal
Redução da TFG < que 60 mL/min
TFG: taxa de filtração glomerular. Fonte: Adaptado de NKF-KDIGO, 2013.
A DRC é uma doença progressiva, apresentando cinco estágios de classificação. A classificação é baseada na taxa de filtração glomerular (TFG) e albuminúria, podendo variar entre os estágios 1 a 5, cuja os quatro primeiros estágios apresentam como intervenção o tratamento conservador, denominada como fase pré-dialítica. O estágio 5 apresenta exacerbação dos sinais e sintomas da doença, geralmente sendo o paciente direcionado à terapia renal substitutiva, que consiste no tratamento por diálise peritoneal (DP), hemodiálise (HD) ou transplante renal (Tx). (Tabela 2) (Baiardi, 2002; NKF-KDIGO, 2013).
Quadro 2. Estadiamento da doença renal crônica.
DRC, doença renal crônica; TFG, taxa de filtração glomerular; Verde, baixo risco (se não há outros marcadores de doença renal, sem DRC); Amarelo, risco moderadamente aumentado; Laranja, risco alto; Vermelho, risco muito alto. Fonte: Adaptado de NKF-KDIGO, 2013.
O paciente DRC em tratamento conservador frequentemente já apresenta diversas alterações metabólicas, como inflamação e o estresse oxidativo, sendo agravados após o início da terapia renal substitutiva, como o tratamento dialítico. (Prichards 2003; Barreto et al., 2010).
2.2 INFLAMAÇÃO NA DOENÇA RENAL CRÔNICA
A progressão da DRC e consequentemente das DCV levam ao aumento do estado inflamatório e do estresse oxidativo. O paciente com DRC em decorrência das comorbidades pré-existentes junto ao estilo vida sedentário e hábitos alimentares ruins, leva à piora do estado inflamatório, devido alguns fatores citados abaixo:
- Obesidade: Cada vez mais presente entre os pacientes com DRC, a obesidade agrava estado pró-inflamatório, visto que o tecido adiposo é um órgão endócrino, que libera substâncias como adipocinas, citocinas inflamatórias TNF-α (Fator de necrose tumoral - alfa), IL-6 (interleucina - 6), MCP-1 (Proteina quimioatratora de monocitos -1), Prognóstico de DRC por Categorias de TFG e
Albuminúria
Categorias de Albuminúria Persistente
A1 A2 A3 Normal a levemente aumentada Moderadamente aumentada Severamente aumentada ˂ 30 mg/dia 30-300 mg/dia ˃ 300 mg/dia
T FG (m l/ m in /1,73m 2 ) G1 Normal ou alta ˃ 90 ml/min G2 Levemente reduzida 60-89 ml/min G3a Leve a moderadamente reduzida 45-59 ml/min G3b Moderada a severamente reduzida 30-44 ml/min G4 Severamente reduzida 15-29 ml/min G5 Falência Renal ˂ 15 ml/min
21 IL-1 (interleucina - 1) e proteína C-reativa (PCR), cooperando para exarcerbação do estado inflamatório, acarretando no desenvolvimento da aterosclerose nesses paciente (Cordeiro et al., 2010; Witasp etal., 2014).
- Redução da depuração de citocinas inflamatórias: O paciente DRC apresenta normalmente níveis aumentados de citocinas inflamatórias, aumentando em decorrência do declínio da função renal, podendo ser explicada pelo fato do rim ser o principal local de depuração das citocinas (Carrero et al., 2008).
-Estresse oxidativo: O estresse oxidativo é decorrente do desequilíbrio entre a geração de compostos oxidantes (espécies reativas de oxigênio (EROs), espécies reativas de nitrogênio (ERNs) e a atuação dos sistemas de defesa antioxidante.(Small et al., 2012). O acúmulo de EROs e ERNs ultrapassa os mecanismos de defesa do hospedeiro, ocasionando lesão celular e/ou disfunção orgânica, como a oxidação de moléculas como DNA, proteínas e lipídeos. (Himmelfarb et al., 2009; Powers et al., 2011; Lightfoot et al., 2012). Além de danos a macromoléculas, o estresse oxidativo é capaz de causar danos em estruturas renais, levando à progressão da DRC. (Small et al., 2012; Ruiz et al., 2013). É também fortemente associado à inflamação, pois existe íntima relação entre este e a resposta inflamatória sistêmica, onde as EROs podem ativar diretamente fatores de transcrição que promovem a síntese de citocinas, ampliando a cascata inflamatória (Aminzadeh et al., 2013).
-Desequilíbrio da microbiota intestinal: A disbiose causada pelo predomínio de bactérias gram negativas, em sua maioria do filo firmicutes, são grandes causadoras da inflamação sistêmica, além disso, toxinas urêmicas provenientes da microbiota também possuem ação inflamatória. As principais toxinas urêmicas originadas são Indoxyl sulfato (IS) e o p-cresyl sulfato (p-CS), de modo que possuem ação direta sobre a inflamação sistêmica, como visto em várias pesquisas (Stockler-Pinto et al., 2016; Briskey et al., 2016).
-Composição dos ácidos graxos: Os ácidos graxos possuem ação na função e estrutura das membranas das células, regulação de vias sinalizações intracelulares, atividade de fator de transcrição, que atuam sobre a liberação de citocinas (Calder, 2015). Pacientes DRC apresentam desequilíbrio no perfil de ácidos graxos, sendo agravado pelo tempo em tratamento dialítico (Sikorska-Wiśniewska et al., 2017).
2.3 ÁCIDOS GRAXOS
Os ácidos graxos estão bastante difundidos na alimentação, sendo encontrados em diversos alimentos de origem animal e vegetal (Calder, 2015). Esses alimentos são constituídos por triglicerídeos (TG), do qual o principal componente é o ácido graxo. Os ácidos graxos podem ser classificados de acordo com o comprimento da cadeia carbônica (ácido graxo de cadeia curta, média e longa) e sua saturação (saturado e insaturado) (Bell et al, 1997) (Figuras 1 e 2).
Figura 1. Exemplos de tamanhos das estruturas químicas dos ácidos graxos. (Farias, E.S. et al., 2012.)
23 Figura 2. Estrutura química dos ácidos graxos com relação a sua saturação.
Fonte: https://www.infoescola.com/bioquimica/lipidios/ - Acesso em 28/08/2018
Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) apresentam estrutura com até seis átomos de carbono e sem duplas ligações, sendo desta forma classificado como saturado. Sua produção ocorre majoritariamente no intestino grosso, pela fermentação dos carboidratos complexos pelas bactérias colônicas, dando origem principalmente ao acetato, propionato e butirato. Os AGCC são absorvidos pelas células epiteliais do intestino grosso (enterócitos) e metabolizados em três sítios ativos: enterócitos, fígado e células musculares (Layden et al., 2013; Ríos-Covian et al., 2016). Estudos tem mostrado que os AGCC possuem benefícios, tais como: nutrição dos enterócitos, modulação inflamatória, secreção de peptídeo semelhante a glucagon 1 (GLP-1), estimulação da produção de leptina e regulação do perfil lipídico, devido sua atuação nos receptores 2 e 3 de ácidos graxos livres “free fatty acid receptor 2” FFAR2 e FFAR3, que estão presentes em órgãos importantes como tecido adiposo, cólon, intestino delgado, fígado, neutrófilos, monócitos, músculo esquelético e sistema imunológico (Layden et al. 2013, Puddu et al. 2014, Huazano-García et al., 2013).
Os ácidos graxos de cadeia média (AGCM), apresentam cadeia carbônica de até 12 átomos de carbono, não apresentando dupla ligação, ou seja, são também ácidos graxos saturados. Sua absorção se dá pelas células da mucosa do intestino, e é de forma facilitada com transporte direto para a circulação portal. Estudos demonstraram que os AGCM, possuem a beta-oxidação mais rápida (não necessita da carnitina para entrar na
mitocôndria), de forma que a lipólise é maior do que a lipogênese. Estudos têm mostrado que esses AGCM podem melhorar o perfil lipídico de pacientes com dislipidemia, obesidade e síndrome metabólica (Sengupta et al., 2011; Rongrong et al., 2015; Liu et al., 2017).
Os ácidos graxos de cadeia longa (AGCL), possuem em sua cadeia carbônica 14 ou mais átomos de carbono, podendo chegar até mais de 20 átomos de carbono, sendo então denominado de ácido graxo de cadeia muito longa (AGCML). No entanto, a saturação deste grupo pode variar entre ácido graxo saturado (AGS), ácido graxo monoinsaturado (AGM) com apenas uma dupla ligação ou ácido graxo poliinsaturado (AGPI) com duas ou mais ligações duplas. Os ácidos graxos saturados (AGS) de cadeia longa encontram-se no estado sólido à temperatura ambiente. O principal representante do AGM, é a família ômega 9 (composto pelo ácido oléico), presente no azeite de oliva, azeitonas, abacate e, o principal representante dos AGPI, é a família dos n-6 e n-3 (composto pelos ácidos linoléico e ácido linolênico), presente nos peixes, soja, óleos vegetais (Connor et al, 2000).
Após a absorção, os ácidos graxos (AG) são transportados pelos quilomícrons no sistema linfático e em seguida na corrente sanguínea. Os triglicerídeos dos quilomícrons são hidrolisados pela lipoproteína lípase (LPL), liberando os ácidos graxos para os tecidos, onde são re-esterificados, formando novamente triglicerídeos, ocorrendo desta forma o armazenamento da gordura no organismo (Ferreira et al., 2003). De maneira geral, a gordura saturada (C12:0, C14:0 e C16:0) eleva a concentração plasmática de colesterol. Diversos mecanismos são propostos para essa alteração, entre eles: redução dos receptores de LDL hepáticos, maior atividade da ACAT (acilcolesteril-aciltransferase), aumentando a esterificação do colesterol das lipoproteínas contendo apo B e aumento na quantidade de colesterol esterificado transportado nas LDL (Vaziri et al., 2009).
A espécie humana não é capaz de sintetizar os ácidos graxos integrantes das famílias n-6 e n-3, por não dispor de enzimas dessaturases específicas, de forma que estas duas famílias são conhecidas como ácidos graxos essenciais (AGE), necessitando ser obtidos pela alimentação (Das et al., 2006). Os ácidos linoléico (LA) e alfa linolênico (ALA), quando ingeridos podem ser dessaturados e alongados nos tecidos do organismo, formando ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (AGPI-CL) (Benatti et al., 2004), dando origem ao ácido araquidônico (AA), ácido eicosapentaenóico (EPA) e ácido docosahexanóico (DHA) (Hornstra et al.,2000).
25 O mecanismo de atuação das dessaturases é através da oxidação de dois carbonos da cadeia, formando duplas ligações, enquanto o processo das elongases é adicionando dois atomos de carbono à cadeia. Existindo três dessaturases ∆5, ∆6 e ∆9, onde as enzimas ∆5 e ∆6 atuam na dessaturação dos AGPI. As dessaturases e elongases apresentam maior afinidade pelos AG n-3, de forma que exista competição entre os AG por essas enzimas (Perini et al., 2010). Já a dessaturase ∆9, conhecida também por estearoil-CoA dessaturase-1 (SCD-1), atua introduzindo uma dupla ligação na cadeia de carbono do AGS, transformando-o em um AGMI (Figura 3).
Figura 3. Mecanismo de ação da SCD-1, balanceando a quantidade de AGMI. (Adaptado de Huang et al. 2012)
Com relação aos AGE, é de suma importância a avaliação da razão n-6:n-3. Sabe-se que a dieta ocidental consiste em elevada ingestão de alimentos fonte de n-6 e reduzida ingestão de alimentos fonte de n-3. Sendo baseada em alimentos industrializados e fonte de gordura saturada. Assim, a população ocidental mundial chega a apresentar razão 20:1 de n-6 para n-3, ao invés da razão recomendada de 2:1 ou 3:1. De acordo com estudo de
Simopoulos et al., (2016), valores elevados desta razão n-6/n-3 estão relacionados com aumento do estado inflamatório, obesidade, risco para ateroesclerose e diabetes.
2.4 ÁCIDOS GRAXOS E SUA INFLUÊNCIA NA INFLAMAÇÃO
O AA, EPA e o DHA, são substratos para a formação de derivados lipídicos, como os eicosanoides e docosanóides, que dão origem as prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, lipoxinas e outras, que são responsáveis por causar estímulos celulares na inflamação, infecção, etc (Schmitz et al., 2008; Russo et al., 2009; Levin et al., 2009).
Os ecosanóides bioativos gerados pelo AA, tais como tromboxano A2, prostaglandinas E2 e leucotrienos B4, apresentam ação direta como pró-inflamatória (Benatti et al., 2004; Calder et al., 2009), enquanto os ecosanóides bioativos gerados pelo EPA, tais como tromboxano A3, prostaglandina I3 e E3 e leucotrienos B5, apresentam ação inversa, atuando como anti-inflamatório e antagonistas dos ecosanóides do AA (Layé et al., 2004) (Figura 4).
Figura 4. Metabolismo dos ácidos graxos das famílias n-6 e n-3. (Martin et al, 2006). Há inúmeros estudos científicos que comprovam a relação benéfica dos ácidos graxos de cadeia curta, ácidos graxos mono e poliinsaturados sobre a inflamação. Os ácidos graxos poliinsaturados n-3 diminuem a liberação na circulação sanguínea de IL-1
27 e IL-6, a proliferação de linfócitos T, a atividade das células natural killer, de neutrófilos, e prostaglandinas E2 (Vedin et al, 2008). Os mecanismos pelos quais os ácidos graxos n-3 apresentam característica anti-inflamatória são devidos atuação sobre a via de sinalização do Fator Nuclear kB (NF-B) e pela ligação aos receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (PPAR). Os ácidos graxos n-3 inibem a via de sinalização do NF-B através da diminuição da fosforilação do inibidor I-kB, da estimulação do GPR120 (inibidor da membrana de NF-kB) e pela ligação PPAR (Thies et al, 2001; Han et al., 2012; Daak et al., 2015) (Figura 5). A outra via de atuação dos ácidos graxos é através da ativação do PPAR, que normalmente está presente nos monócitos/macrófagos, células endoteliais e células musculares lisas vasculares, inibindo a liberação na circulação de IL-6, IL-1β, TNF-α, reduzindo a inflamação (Zhao et al., 2005) (Figura 5). Os AGPI conseguem se ligar aos três tipos existentes de PPAR alfa (α), gama (γ) e beta/delta (β/δ), enquanto que os AGS se ligam apenas aos tipos α e β/δ (Varga et a., 2011).
Figura 5. Potenciais mecanismos de ação do ácido graxo n-3 sobre fatores de transcrição. (Adaptado de Schmitz & Ecker et al., 2008).
Já os ácidos graxos poliinsaturados n-6 apresentam atividade ainda incerta sobre a inflamação (Calder et al., 2011). O DGLA é utilizado como substrato para COX e LOX, originando eicosanoides como as prostaglandinas série 1 (PGs1) e 15- (S)
anti-inflamatória, vasodilatadora, redução da pressão sanguínea, inibição da atividade anti neoplásica e outras. Entretanto, esse mesmo ácido graxo, o DGLA, também é associado ao aumento da citocina IL-6 em outras doenças, elevando o estado inflamatório. Já o AA, é considerado como fator pró-inflamatório. O AA é substrato para COX e LOX, gerando prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos de série par, como 2 e 4 (Sergeanta et al., 2016). Os eicosanóides oriundos do AA estão comprovadamente associados à inflamação, além de regularem expressões de genes, consequentemente regulando atividades celurares e receptores nucleares como NF-B e PPAR (Schmitz & Ecker et al., 2008; Caputo et al., 2011).
Adicionalmente, outros estudos mostraram o papel pró-inflamatório dos ácidos graxos saturados, ativando cascatas que secretam citocinas inflamatórias, tais como IL-6, receptores tipo Toll e NF-B, gerando resposta inflamatória (Bechoua et al., 2003; Thies et al., 2001; Calder, 2015) (Figura 6). Onde os AGS são reconhecidos pelo complexo CD14-TLR-4-MD2, acarretando na sinalização das vias inflamatórias. Além disso, os AGS modificam a microbiota intestinal, aumentando a produção de lipopolissacadrídeos (LPS), responsável pelo processo de endotoxemia e consequentemente maior liberação de espécies reativas de oxigênio (EROs). O aumento da circulação de EROs pode gerar modificações nas lipoproteínas, como as LDLox que são mais aterogênicas e inflamatórias, devido ligação a via inflamatória do Toll Like Receptor 4 (TLR4), implicando na expressão de fatores pró-inflamatórios transcritos como o NF-kB, que desempenha papel crucial na indução de mediadores inflamatórios (citocinas, quimiocinas ou moléculas co-estimulatórias) (Rocha et al., 2016).
29 Figura 6 - Ácidos graxos saturados ativando mediadores pró-inflamatórios.
(Adaptado Rocha et al., 2016)
Segundo Kaska et al. (2014), os ácidos graxos saturados apresentam função pró inflamatória dependendo do tamanho da sua cadeia carbônica, onde observou-se que os AGS com menores cadeias, tais como os ácido láurico (12:00) e o ácido mirístico (14:00), apresentaram relação positiva com o aumento da concentração de proteína c reativa ultrassensível (PCR-us) e interleucina-6 (IL-6), enquanto os ácidos graxos saturados com maiores cadeias carbônicas não apresentaram a mesma resposta. No mesmo estudo foram analisados os ácidos graxo monoinsaturados, sendo observado a mesma correlação entre o tamanho da cadeia carbônica e a ação pró inflamatória, entretanto, a posição da dupla ligação também influenciava na ação inflamatória, de maneira que os ácidos miristoleico (14:1) e palmitoleico (16:1) aumentaram os níveis de proteína c reativa (hsCRP) e interleucina 6 (IL-6). Neste contexto, os ácidos graxos de forma geral possuem atuação sobre os biomarcadores inflamatórios.
Uma nova hipótese sobre como os ácidos graxos poderiam interferir na inflamação nos pacientes com DRC em HD, é através da competição com as toxinas urêmicas pela ligação na albumina, acarretando maior eliminação das toxinas urêmicas através do tratamento dialítico. As toxinas urêmicas são formadas através da fermentação dos aminoácidos, oriundos dos alimentos proteicos da alimentação, por bactérias intestinais que expressam uréase, uricase e bactérias que possuem enzimas formadoras de indols e p-cresol. Ocasionando a geração de toxinas urêmicas tais como indoxil sulfato (IS), p-cresilsulfato (p-CS), ácido indol-3 acético (3-IAA) e N-óxido de trimetilamina (TMAO) (Meijers et al., 2009; Meijers et al., 2010a; Vanholder et al., 2011; Koppe et al., 2012). Apenas a TMAO é removida de maneira eficiente através da HD. IS, AIA e p-CS circulam, em sua maior proporção, ligadas à albumina o que impossibilita sua eliminação pelo procedimento dialítico (Deltombe et al., 2015; Meijers et al., 2010b).
A albumina é a proteína plasmática mais abundante na corrente sanguínea e é reconhecida como principal veículo de transporte para compostos endógenos e exógenos, incluindo ácidos graxos, bilirrubina, hormônios, metabólitos, aminoácidos, minerais como Zn e Cu ou fármacos (Goncharov et al., 2017). Sudlow et al. (1975) propuseram dois sítios específicos de ligação: sítio I e sítio II, atribuídos aos subdomínios IIA e IIIA, respectivamente. A maioria das toxinas urêmicas circulantes parece interagir com ambos os ligantes locais Sudlow I e II, localizados nos subdomínios IIA e IIIA, via forças eletrostáticas e / ou van der Waals (afinidade de ligação) (Devine et al., 2014). Entretanto, os ácidos graxos parecem ser o principal ligante endógeno na albumina (em torno de 0,1 a 2,0 moles de ácido graxo por mole de proteína), apresentando múltiplos sítios de ligação para o ácido graxo monoinsaturado (MUFA) e poliinsaturado (AGPI) (Petitpas et al., 2001; Fujiwara et al., 2008). Os locais de ligação dos ácidos graxos são os mesmos das toxinas urêmicas, dificultando a ligação para outros compostos (Varshney et al., 2008; Varshney et al., 2011; Yamasaki et al., 2017).
O acúmulo das toxinas urêmicas tem sido associada à inflamação e incidência de doenças cardiovasculares, principal causa de morte entre esses pacientes em HD (Schepers et al., 2007; Meijers et al., 2010b). Desta forma, o perfil de ácidos graxos dos pacientes em HD poderia interferir na competição pela ligação à albumina com as toxinas
31 urêmicas, diminuindo o estado inflamatório. A Figura 7 resume a competição hipotética entre ácidos graxos e toxinas urêmicas em pacientes com DRC.
Figura 7. Hipótese de como o ácido graxo poderia aumentar a remoção de toxinas urêmicas no plasma de pacientes em HD. O ácido graxo poliinsaturado nos eritrócitos pode competir com as toxinas urêmicas pela ligação do Sudlow II à albumina sérica humana. Os ácidos graxos têm maior afinidade pelo Sudlow II, o que pode inibir a ligação da toxina urêmica. As toxinas urêmicas livres apresentam pequeno tamanho, passando pela membrana de diálise, aumentando a remoção por tratamento dialítico e diminuindo o estado inflamatório. Fonte: Kemp et al., 2018 (submetido).
2.5 ÁCIDOS GRAXOS NA DRC
Os pacientes com DRC em HD apresentam modificações no perfil de ácidos graxos, com redução nos níveis dos AGPI da família n-3 (EPA e DHA) e n-6 (AA) e maiores razões n-6:n-3, quando comparado a indivíduos saudáveis (Dasgupta et al., 1990; Koorts et al., 2002; Madsen et al., 2011), possivelmente refletindo em um quadro de deficiência de ácidos graxos essenciais (DAGE) e maior risco para DCV. De fato, alguns sintomas de DAGE os pacientes em HD apresentam, tais como: fragilidade eritrocitária, disfunção plaquetária, pele escamosa e seca, aumento do risco para DCV e outras (Peck, 1997)
A alteração no perfil de ácidos graxos nestes pacientes pode estar relacionada ao tratamento dialítico e/ou a atual padrão alimentar da população brasileira. O tempo de tratamento dialítico parece causar alteração no perfil de ácidos graxos, especificamente dos n-3, entretanto, mais estudos são necessários para esclarecer o mecanismo (Sikorska-Wiśniewska et al., 2017). Outros estudos também observaram modificação no perfil de ácidos graxos dependendo do tratamento (HD, DP ou TX), onde foi observado que o paciente em HD menores valores dos AGMI e dos ácidos graxos da família n-3 (EPA e DHA), e maiores valores dos ácidos graxos da família n-6 (AA). A modificação no perfil de ácidos graxos foi associada apenas a modificação no padrão alimentar, que difere entre os grupos (An et al., 2009; Oh et al., 2012).
A alimentação do paciente DRC em HD é rica alimentos processados (rico em gordura saturada), carboidratos simples e carne vermelha e, pobre em alimentos naturais, como legumes, verduras e frutas. No que diz respeito ao conteúdo de lipídeos da dieta, estudos mostraram que a qualidade e a quantidade ingerida de ácidos graxos da alimentação possuí efeito de proteção na DRC (Pavinatto, 2017). A alteração no padrão alimentar pode acarretar desordens no perfil de ácidos graxos de maneira a aumentar a liberação de eicosanoides pró-inflamatórios, agravando a inflamação presente. Segundo Huang et al. (2012), pacientes HD com habito alimentar ocidental (“western diet”) poderiam se beneficiar com o aumento da ingestão de fontes alimentares de LA, devido observarem associação negativa entre LA e a IL-6.
Recentemente, foi demostrado que os pacientes em HD apresentam valores plasmáticos menores das razões EPA/AA, DHA/AA e (EPA+DHA)/AA, porém não se sabe ao certo ainda o mecanismo responsável, porém os pesquisadores acreditam que a alimentação seja uma das interferências nestes valores e/ou a desregulação no metabolismo dos ácidos graxos causado pelo acúmulo de toxinas urêmicas (Shoji et al.,
33 2015). Adicionalmente às razões citadas, foi observada que a razão entre ácido palmitoleico/ácido palmítico, que mensura a atividade da enzima Estearoil-CoA dessaturase-1 (SCD-1). Níveis altos de atividade de SCD-1 podem informar elevado consumo de gordura saturada, sendo desta forma um fator de risco para a inflamação. (Petersson et al., 2008; Petersson et al., 2009). Além disso, pacientes em HD apresentam elevados valores de SCD-1 (Huang et al., 2012).
Porém, ainda há carência de estudos e conhecimento sobre o papel do perfil de AG na DRC, onde a maioria dos estudos apenas observou a comparação do perfil de ácidos graxos ou realizou intervenção com suplementação, sem antes saber ao certo o impacto do AG basal no metabolismo do paciente com DRC. Mesmo que alguns pesquisadores tenham avaliado o perfil de ácidos graxos de pacientes DRC em HD, poucos avaliaram a associação dos ácidos graxos com a inflamação. Assim, o presente estudo pretendeu avaliar o impacto do perfil de ácidos graxos eritrocitário sobre os marcadores inflamatórios em pacientes com doença renal crônica em hemodiálise.
3. OBJETIVOS 3.1 GERAL
Avaliar o perfil de ácidos graxos da membrana do eritrócito e possíveis relações com os marcadores inflamatórios em pacientes com doença renal crônica em hemodiálise.
3.2 ESPECÍFICOS
Avaliar se há diferença entre o perfil de ácidos graxos de paciente DRC em HD e indivíduos sem doença renal crônica e inflamatória;
Avaliar os níveis plasmáticos de IS, p-CS e, verificar a relação com o perfil de ácidos graxos em pacientes com DRC em HD;
Avaliar associação entre o perfil de ácidos graxos e as medidas antropométricas (IMC, CC, GC, MM) em pacientes com DRC em HD e indivíduos sem DRC e inflamatória.
35 4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CASUÍSTICA
Trata-se de um estudo transversal, sendo recrutados 32 pacientes com DRC em hemodiálise atendidos na clínica RenalCor/Rio de Janeiro, entre o período dos anos de 2016 e 2017. Todos os pacientes foram informados previamente sobre a coleta e uso de material biológico. Os dados demográficos, clínicos e bioquímicos foram obtidos através da análise de prontuários e entrevistas com os pacientes, como parte da consulta nutricional ou no momento da coleta do material biológico (sangue). O perfil dos ácidos graxos dos pacientes foi comparado com o perfil de ácidos graxos de 12 indivíduos que não possuíam nenhuma doença crônica e/ou inflamatória.
4.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO
Foram incluídos no estudo pacientes do sexo masculino e feminino com DRC em HD, com idade entre 18 e 60 anos e com fístula arteriovenosa (FAV) como acesso vascular. Não foram incluídos pacientes com doenças autoimunes, hepáticas, AIDS e câncer. Enquanto, no grupo controle foram incluídos indivíduos com idade entre 18 e 60 anos, ambos os sexos, sem doenças crônicas e ou inflamatórias. Não foram incluídos em ambos os grupos fumantes, grávidas, pacientes em uso de suplementos (ômega-3, óleo de peixe, probióticos, prebióticos, simbióticos ou antioxidantes).
4.3 ASPECTOS ÉTICOS
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade Federal Fluminense - Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP/UFF) recebendo número do parecer 1.602.965 (Anexo 11.1). Os pacientes foram informados sobre a pesquisa e assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice 10.1).
4.4 INGESTÃO ALIMENTAR
A análise da ingestão alimentar foi realizada através do recordatório alimentar de 24h de três dias (1 dia de diálise, 1 dia sem diálise e 1 dia de final de semana). Sendo avaliado e quantificado o valor energético total através do recordatório alimentar, onde foram separados os macronutrientes como carboidrato, proteína e lipídeo. Os lipídeos foram
avaliados separadamente pelas suas classes: saturado, monoinsaturado e poliinsaturado, através da tabela Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (TACO, 2011).
4.5 ESTADO NUTRICIONAL
A avaliação do estado nutricional foi realizada por dados antropométricos, através da avaliação do peso corporal, estatura, circunferência do braço, circunferência da cintura e dobras cutâneas (tricipital, biciptal, subescapular e supra-ilíaca). A avaliação antropométrica foi realizada após a sessão de diálise, utilizando o adipômetro do tipo Lange Skinfold Caliper (Cambridge Scientific Industries Inc.).
O estado nutricional foi avaliado segundo o índice de massa corporal (IMC), obtido pela razão entre o peso e a estatura ao quadrado, e sua classificação seguiu o proposto pela Organização Mundial de Saúde (OMS, 1995; OMS, 1997).
Quadro 3. Estado Nutricional de Adultos Segundo IMC
Classificação IMC (kg/m2)
Magreza ≤ 18,4
Eutrofia 18,5-24,9
Pré-obesidade 25-29,9
Obesidade ≥ 30
Fonte: OMS, 1995; OMS, 1997.
Para avaliar a reserva adiposa, foi calculado o Percentual de Gordura Corporal. Nesta técnica, a composição corporal é estimada utilizando-se a somatória de quatro pregas cutâneas: biciptal, triciptal, subescapular e supra-ilíaca. Após a aferição das pregas, seu somatório segue o proposto na equação de Durnin e Womersely para o cálculo da Densidade Corporal (DC):
37 Quadro 4. Cálculo da Densidade Corporal
Idade (anos) Homens Mulheres
17 – 19 DC = 1,1620 - 0,0630 x (log Σ) DC = 1,1549 – 0,0678 x (log Σ) 20 – 29 DC = 1,1631 - 0,0632 x (log Σ) DC = 1,1599 – 0,0717 x (log Σ) 30-39 DC = 1,1422 - 0,0544 x (log Σ) DC = 1,1423 – 0,0632 x (log Σ) 40 – 49 DC = 1,1620 - 0,0700 x (log Σ) DC = 1,1333 – 0,0612 x (log Σ) ≥ 50 DC = 1,1715 - 0,0779 x (log Σ) DC = 1,1339 – 0,0645 x (log Σ) Fonte: Durnin & Womersley, 1974.
A partir dos valores de DC, a porcentagem de gordura corporal total é determinada utilizando a fórmula de Siri (1961):
Gordura Corporal (%) = 4,95/DC – 4,5 x 100
O valor de referência para o percentual de gordura corporal em homens foi de até 25% e em mulheres de até 30% do peso corporal e os percentuais de gordura corporal no quadro 5.
Quadro 5. Valores de referência para percentuais de gordura corporal
Parâmetros Homens Mulheres
Risco de distúrbios associados à desnutrição ≤ 5 ≤ 8
Abaixo da média 6 a 14 9 a 22
Média 15 23
Acima da Média 16 a 24 24 a 31
Risco de doenças associadas à obesidade ≥ 25 ≥ 32
Fonte: Lohman et al., 1991
A massa livre de gordura (MLG) foi calculada subtraindo-se a massa correspondente ao percentual de gordura da MC total. Para analisar o perfil de
distribuição de gordura corporal foi aferida a CC. Para isto o paciente manteve-se de pé e, com auxílio de uma fita métrica não extensível, o indivíduo era circundado na linha natural da cintura, na região mais estreita entre o tórax e o quadril, no ponto médio entre a última costela e a cristailíaca. A leitura era feita no momento da expiração. Os valores obtidos foram comparados com os valores limítrofes associados ao risco de desenvolvimento de complicações relacionadas à obesidade. Para homens este risco encontra-se aumentado quando os valores de CC são maiores que 102 cm e, para mulheres, quando maiores que 88 cm (NCEP, 2001).
4.6 COLETA E ANÁLISE DE MATERIAL BIOLÓGICO
A coleta de sangue foi realizada após 12 horas de jejum em tubos Vacutainer®, uma parte em tubos contendo EDTA como anticoagulante e a outra parte dos tubos contendo gel separador para obtenção de soro. Os tubos foram centrifugados (3000rpm por 15 minutos a 4oC) para obtenção de plasma e soro, que foram armazenados (-80 oC) para análises posteriores. Após separação do plasma (3000 rpm, 15 min, 4C), foi coletado 500 µL de concentrado de hemácia para a etapa de lise dos eritrócitos, iniciando com a lavagem junto do PBS gelado (1:10; v/v, 15 min, 3000 rpm), descartando o sobrenadante até que o pellet ficasse livre de hemoglobina.
4.6.1 Parâmetros bioquímicos de rotina
Os níveis plasmáticos dos parâmetros bioquímicos como ureia, creatinina, albumina, glicose, colesterol total, lipoproteína de alta densidade (HDL), triglicerídeos e PCR-us foram determinados através de kits comerciais da BioClin® no laboratório nutrição experimental da faculdade de nutrição da UFF (LABNE). Os valores da lipoproteína de baixa densidade (LDL) foram calculados através da fórmula de Friedewald (1972).
LDL = (CT - HDL) - (TG/5)
4.6.2 Determinação do marcador inflamatório e de estresse oxidativo
Os níveis plasmáticos de IL-6 foram analisados através do teste imunoenzimático Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) com kit comercial da marca Boster Immunoleader® (Pleasanton, CA, EUA). Para a peroxidação lipídica foi estimada pela determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), dentre elas o
39 malondialdeído (MDA), utilizando-se o método de Ohkawa modificado (Ohkawa et al., 1979).
4.6.3 Determinação dos níveis plasmáticos de toxinas urêmicas
A avaliação dos níveis plasmáticos das toxinas urêmicas, indoxil sulfato (IS) e p-Cresil sulfato (p-CS), foi realizada por Cromatografia Liquida de Fase Reversa (Reverse-phase- High performance liquid chromatography - RP-HPLC), utilizando dispositivo Waters Alliance 2695 (Waters, Zellik, Bélgica) conectado a um detector de fluorescência Waters 2475. A separação foi realizada à temperatura ambiente em uma coluna de fase reversa Ultrasphere ODS (150 3 4,6 mm, tamanho de partícula 5-lm; Beckman Instruments, Fullerton, CA) e com uma coluna de guarda Ultrasphere ODS (45 3 4,6 mm, 5-lm de partícula; mentos Beckman Instruments). A separação cromatográfica consistiu de um gradiente linear de metanol e tampão de formiato de amónio (50 mM, pH 3, 0) de 35 a 70% de metanol em 15 min a uma taxa de fluxo de 1 mL/min. O detector de fluorescência foi fixado em kex 265 nm/290 nm kem. Análise dos dados foi feito utilizando software Empoder 2 (Waters). Para determinar as concentrações totais plasmáticas das toxinas urêmicas, as amostras foram diluídas com água e aquecidas a 95°C durante 30 min. Depois foram resfriadas (10 min em gelo) e filtradas (Centrifree filter - Millipore, Billerica, MA). O ultrafiltrado (60uL) foi injetado na coluna. Espectros de emissão de fluorescência e excitação foram registrados a partir de soluções-padrão e de amostras urêmicas e não urêmicas, permitindo selecionar os comprimentos de onda ideais e excluir interferências. A curva de calibração foi construída com soluções-padrão das toxinas. As áreas de pico foram representadas graficamente em função das concentrações todas as concentrações foram expressos como miligramas por litro.
4.6.4 Determinação do perfil de ácidos graxos na membrana dos eritrócitos O método modificado utilizado para determinação dos ácidos graxos na membrana dos eritrócitos constitui de etapa de preparo da amostra e extração dos ácidos graxos, no qual foi adicionado 1 ml de Metanol/Clorofórmio HPLC (2:1), seguido de centrifugação por 20 min, a 20000 rpm. Essa etapa foi repetida 3x, sendo os sobrenadantes obtidos em cada lavagem reunidos e secos em centrivap (30min, ver quanto de temperuatura). A etapa de esterificação foi iniciada com adição de 0,5 ml de Hexano HPLC, e 125 uL de Metóxido de sódio (0,5 M), seguida de sonicação por 20 min. Em
seguida, foi adicionado 2,5 ml de solução de NaCl saturada, sendo a amostra mantida em repouso por 10 mim. Após essa etapa, foi adicionado 1 mL de Hexano HPLC seguido por agitação em vortex, durante 30 seg. O sobrenadante (fase hexânica) foi transferida para tubos de vidro. Essa etapa foi repetida 4 x, sendo todos os sobrenadantes reunidos e secos em fluxo de N2. Após completa evaporação, os ácidos graxos esterificados foram ressuspensos em 0,25 ml de Hexano HPLC, sonicando durante 5 min, filtrado (Milipore; 0,22 m) diretamente no vial e injetado no Cromatógrafo à Gás com detector de ionização de chama. O perfil de ácidos graxos foi determinado em cromatógrafo a gás Shimadzu, CG-2010, equipado com uma coluna capilar DB-FFAP (15 m x 0,100 mm x 0,10 um - J e W Scientific, Agilent Technologies). O hidrogênio foi utilizado como gás de arraste com fluxo de 0,27 mL/min, com vazão de 35 cm/s e pressão de 187,8 kPa. As taxas de fluxo de ar sintético, N2 e H2 foram, respectivamente, 300, 30, 30 mL/min. As temperaturas do injetor e do detector foram de 250 oC e 260 oC, respectivamente. A programação de temperaturas da coluna foi de 100 oC inicial, com retenção de 0,5 min, rampa de 25 oC/min a 195 oC, 3 oC/min a 205 oC, 8 oC/min a 230 oC, com retenção de 4 min, 50 oC/min a 245 oC, retendo por 0,5 min. A razão Split utilizada no injetor foi de 1:150 e o tempo de corrida total foi de 15,56 min. Como padrão externo utilizou-se uma mistura formada por 37 ésteres metil de ácidos graxos (FAME 37, código 47885, Sigma Chemical Co). O volume de injeção foi de 2 uL, em injetor automático AOC 20i. Os ácidos graxos foram identificados por meio da comparação dos tempos de retenção do padrão externo com as amostras. Foi utilizado também padrão interno methyl tricosanoate (C23:0, T9900, Sigma Chemical Co).
Os resultados foram expressos como percentual total de ácidos graxos presentes na amostra. Foram também calculadas algumas razões, que apresentam na literatura associação com o estado inflamatório ou correlação com risco de DCV. Para o cálculo do Índice ômega-3 foi somado os valores totais de EPA + DHA. Já para o cálculo do Estearoil-CoA dessaturase-1 (SCD-1, também conhecida como delta-9 dessaturase), foi realizada através da razão (ácido palmitoleico/ácido palmítico), por não sofrer muita interferência pela ingestão alimentar. Adicionalmente, foi calculado a atividade da enzima Delta-5 dessaturase (ácido araquidônico/ ácido dihomo-gamma linolénico) e Delta-6 dessaturase (ácido gama linoléico: ácido linoléico), devido serem etapas limitantes no processo de formação de novos ácidos graxos poliinsaturados.
41 5.0 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A distribuição de cada variável foi analisada pelos testes Kolmogorov-Smirnov ou Shapiro-Wilk conforme apropriado. As variáveis que apresentaram distribuição normal (paramétricas) foram descritas com valores de média e desvio padrão e, para as variáveis não paramétricas utilizou-se valores de mediana e variação interquartil (percentil 25 - 75). Foram utilizados testes não paramétricos para analisar as diferenças entre as as medianas (Mann-Whitney U, Wilcoxon W) e paramétricos para as diferenças entre as médias (teste t para amostras independentes). As correlações entre as variáveis foram analisadas com coeficientes Spearman para não paramétricos e Pearson para paramétricos. Análise de regressão múltipla linear foi realizada para determinar associações entre ácidos graxos e inflamação, ajustada para idade, sexo, IMC e tempo de HD. As análises foram realizadas no SPSS versão 23.0. Considerou-se um nível de significância de 5%.
6.0 RESULTADOS
Participaram do estudo 32 pacientes com DRC em HD (16 homens e 16 mulheres) e 12 participantes sem doença renal crônica e inflamatória (3 homens e 9 mulheres). Os principais fatores etiológicos da DRC nos pacientes deste estudo foi a nefroesclerose hipertensiva (58%). Os pacientes utilizavam como principal fármaco, os anti-hipertensivos da classe inibidora da enzima conversora de angiotensina (ECA). Na Tabela 1 consta as características gerais e antropométricas dos dois grupos, onde nenhuma das variáveis apresentou diferença significativa.
Tabela 1. Características gerais e antropométricas dos indivíduos participantes do estudo.
Variáveis HD (n=32) Controle (n=12) P-valor Idade 54.2 ± 9.6 48.3 ± 11.8 .14 Tempo em HD (meses) 44.6 ±28.4 - - IMC (Kg/m2) 26.3 ± 5.0 25.0 ± 3.9 .39 CC (cm) 93.4 ± 14.1 79.3 ± 14.2 .23 GC (%) 31.6 ± 8.9 29.8 ± 8.6 .60 MLG (kg) 48.8 ± 10.1 46.5 ± 8.2 .49
HD, hemodiálise; IMC, índice de massa corporal; CC circunferência da cintura; GC, gordura corporal; MLG, massa livre de gordura.
Embora não tenha havido diferença significativa entre os grupos, o grupo HD apresentou valor de IMC classificado pela OMS como pré-obesidade, onde 46,8% apresentou IMC de eutrofia, 31,2% de sobrepeso e 22% obesidade. Além disso, a circunferência da cintura quando separada por sexo revela que apenas as mulheres apresentam CC acima do recomendado (95,5 ± 12,9), já em relação ao percentual de gordura corporal ambos os sexos possuíram valores acima do recomendado (homens: 25,8 ± 7,9; mulheres: 38,5 ± 4,4). Avaliação antropométrica com indicativo de risco para doenças associadas à obesidade no grupo HD.
Na Tabela 2, está descrita a ingestão de macronutrientes, sendo observado que o grupo controle apresentou valores maiores de ingestão de energia, proteína e lipídeos, porém, apenas os lipídeos apresentaram diferença significativa em relação ao grupo HD. Entretanto, ao separar por classe os lipídeos, observa-se que o grupo HD teve maior
43 ingestão de gordura saturada e monoinsaturada, enquanto que o grupo controle apresentou ingestão significativamente maior de gordura poliinsaturada.
Tabela 2. Ingestão diária de calorias e macronutrientes dos pacientes com DRC em HD e no grupo controle. Variáveis HD (n=32) Controle (n=12) P-valor Calorias (Kcal/day) 1525.5 ± 338.9 2614.9 ± 1117.6 .14 Calorias (Kcal/kg) 22.1 ± 9.0 44.4 ± 21.8 .13 Proteínas (g/Kg) 1.0 ± 0.3 1.9 ± 0.9 .13 Carboidratos (%) 60.3 ± 17.1 52.3 ± 26.3 .28 Lipídeos (%) 22.0 ± 6.6 30.1 ± 9.8 .03 Monoinsaturado (%) 7.7 ± 5.0 5.7 ± 1.5 .28 Poliinsaturado (%) 2.3 (1.4 ̶ 11.2) 6.1 (4.6 ̶ 7.2) .01 Saturado (%) 8.3 ± 4.1 4.4 ± 1.1 .59
Os parâmetros bioquímicos e marcadores inflamatórios estão dispostos na Tabela 3. No grupo HD a glicemia apresentou valor médio acima do valor da referência, porém dentro deste grupo incluímos pacientes diabéticos (n=10). O perfil lipídico do grupo controle apresentou valores significativamente maiores das variáveis: CT, HDL e LDL em relação ao grupo HD, porém dentro dos valores recomendados pela American Heart Association (AHA). O grupo HD apresentou valor maior e significativo de TG, entretanto dentro do valor desejável (<150mg/dL) (Faludi et al., 2017). O valor de LDL do grupo HD foi acima do recomendado para pacientes que possuem alto risco para DCV (<70mg/dL) (Jellinger et al., 2017).
Como já era esperado, os valores do marcador inflamatório (PCR-us) e estresse oxidativo (MDA), estavam elevados nos pacientes, quando comparados com o grupo controle. Enquanto a IL-6 foi apenas avaliada no grupo HD. Foram mensurados também os níveis plasmáticos de duas toxinas urêmicas (IS e p-CS) no grupo HD. Sendo observado valores elevados de p-CS quando comparado com a referência do EuTOX (IS: 37,07 ± 26,50 mg/dL e p-CS: 23,0 ± 16,90 mg/dL).
Tabela 3. Parâmetros bioquímicos e marcadores inflamatórios nos pacientes com DRC em HD e no grupo controle. Variáveis HD (n=32) Controle (n=12) P-valor Ureia (mg/dL) 116.9 ± 29.3 29.5 ± 10.3 .00 Creatinina (mg/dL) 7.6 ±2.1 0.8 ± 0.1 .00 Albumina (g/dL) 3.8 ± 0.3 3.7 ±0.1 .17 Glicose (mg/dL) 121.2 ± 80.1 93.7 ± 17.6 .07 CT (mg/dL) 148.9 ± 39.2 189.4 ± 34.1 .00 HDL (mg/dL) 43.4 ± 15.4 68.7 ± 10.8 .00 LDL (mg/dL) 79.0 ± 30.4 101.1 ± 6.5 .02 TG (mg/dL) 132.0 (103.0 ̶ 167.5) 77.0 (64.0 ̶ 132.5) .00 PCR-us (mg/L) 2.9 (1.5 ̶ 5.2) 0.6 (0.2 ̶ 1.5) .00 MDA (µmol/L) 1.9 (0.4 ̶ 6.8) 0.2 (0.7 ̶ 0.3) .00 IL-6 (pg/mL) 18.3 (14.3 ̶ 23.4) - - IS (mg/dL) 19.4 ± 11.9 - - p-CS (mg/dL) 101.5 ± 57.2 - -
CT, colesterol total; HDL, lipoproteína de alta densidade; LDL, lipoproteína de baixa densidade; TG, triglicerídeos; PCR-us, proteína C reativa ultrassensível; MDA, malondialdeído; IL-6, interleucina 6; IS, indoxil sulfato; p-CS, p cresilsulfato.
Adicionalmente, na Tabela 4 podem ser observados os valores de ácidos graxos identificados e suas concentrações (%) em relação à área do pico total dos ácidos graxos. Com relação aos ácidos graxos monoinsaturados, houve diferença entre os grupos, sendo maior o valor do ácido graxo palmitoléico e menor do oleico. Os ácidos graxos poliinsaturados no grupo HD em sua grande maioria apresentaram valores menores do que no grupo controle. Onde o ácido linoleico, dihomo gama-linoleico, araquidônico, e eicosapentaenoico foram menores e com diferença significativa em relação ao grupo controle. O índice ômega-3 (EPA+DHA) foi igual para os grupos, porém bem abaixo do recomendado (>8%) (Harris & Von Schacky, 2004). Com relação aos valores de SCD-1, os pacientes em HD apresentaram valores mais elevados do que o grupo de indivíduos saudáveis, sendo significativa a diferença entre os grupos. O grupo HD apresentou valor significativo menor da variável D5D em comparação ao grupo saudável, enquanto não houve diferença entre os grupos em relação ao valor da D6D.
45 Tabela 4. Concentração de ácidos graxos da membrana do eritrócito em pacientes em HD e no grupo controle. Variáveis HD (n=32) Controle (n=12) P-valor AG. Saturado (%) Ácido Mirístico 0.17 ± 0.11 0.16 ± 0.03 .66 Ácido Palmítico 25.2 ± 3.8 24.4 ± 1.9 .35 Ácido Esteárico 30.6 ± 4.0 29.1 ± 0.9 .06 AG. Monoinsaturado (%) Ácido Palmitoleico 1.0 ± 0.7 0.3 ± 0.09 .00 Ácido Oleico 19.1 ±3.7 22.2 ± 3.2 .01 AG. Poliinsaturado (%)
Ácido linoleico (LA) 13.8 ± 2.4 15.5 ± 2.1 .03
Ácido gama-linolênico (GLA) 0.2 (0.1 ̶ 0.4) 0.2 (0.1 ̶ 0.7) .99 Ácido alfa-linolênico (ALA) 0.7 (0.3 ̶ 1.0) 0.6 (0.1 ̶ 1.1) .57 Ácido dihomo gama linoleico
(DGLA)
2.2 ± 0.6 2.6 ± 0.3 .04
Ácido araquidônico (AA) 0.08 (0.05 ̶ 0.14) 0.1 (0.1 ̶ 0.2) .00
Ácido eicosapentaenóico (EPA) 0.5 ± 0.1 0.6 ± 0.2 .03
Ácido docosahexaenóico (DHA) 1.3 ± 0.7 1.1 ± 0.5 .44
Índice (%)
EPA+DHA 1.8 ± 0.7 1.8 ± 0.5 .92
SCD-1 0.02 (0.01 ̶ 0.05) 0.01 (0.00 ̶ 0.01) .00
D5D 0.03 (0.02 ̶ 0.07) 0.06 (0.05 ̶ 0.09) .02
D6D 0.16 ± 0.03 0.17 ± 0.03 .66
SCD-1, Estearoil-Coa desaturase; D5D, delta 5 dessaturase; D6D, delta 6 dessaturase.
Além disso, correlações foram encontradas entre IL-6, p-CS e ácidos graxos. Onde IL-6 obteve associação positiva com DGLA (r= 0.406, p= 0.021) (Fig.6). Análise de regressão linear mostrou que o GLA foi preditor independente para os níveis de p-CS após ajuste para idade, gênero, IMC, tempo de diálise (Tabela 5) (Figura 8).
Figura 7. Correlação entre DGLA e níveis plasmáticos de IL-6 em pacientes em hemodiálise.
Tabela 5. Regressão linear múltipla para possíveis preditores dos níveis de pCS. Variáveis β-coeficiente p-valor
Idade 0,15 0,38
IMC -0,13 0,42
Gênero 0,15 0,38
Tempo em HD 0,14 0,56
GLA -0,49 0,007
IMC, índice de massa corporal; HD, hemodiálise; GLA, ácido gama-linolênico
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Figura 8. Correlação entre ácido gama linolênico no eritrócito e níveis plasmáticos de p-CS em pacientes em hemodiálise.
