UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
DANIELE MASSELLI RODRIGUES DEMOLIN
“Identificação de Norovírus murino (MNV) nos biotérios
brasileiros”.
CAMPINAS 2017.
“Identificação de Norovírus murino (MNV) nos biotérios
brasileiros. ”
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências na Área de Concentração em Clínica Médica.
ORIENTADOR: PROF. DR. MARCUS ALEXANDRE FINZI CORAT CO-ORIENTADOR: PROF. DR. MARCELO LANCELLOTTI
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA
ALUNA DANIELE MASSELLI RODRIGUES DEMOLIN, E ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCUS ALEXANDRE FINZI CORAT.
CAMPINAS 2017.
DANIELE MASSELLI RODRIGUES DEMOLIN
ORIENTADOR: PROF. DR. MARCUS ALEXANDRE FINZI CORAT COORIENTADOR: PROF. DR. MARCELO LANCELLOTTI
MEMBROS:
1. PROF. DR. MARCUS ALEXANDRE FINZI CORAT
2. PROF. DR. MARCEL FRAJBLAT
3. PROF. DR. CLAUDIA MADALENA CABRERA MORI
4. PROF. DR. JOSE LUIZ PROENÇA MODENA
5. PROF. DR. ANDRÉ SCHWAMBACH VIEIRA
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Aos meus pais, Antonio Carlos Rodrigues e Iolanda Maria Masselli Rodrigues, pelos exemplos de respeito e responsabilidade, pelos constantes
ensinamentos, incentivo e por serem tão importantes e especiais em minha Vida. Á vocês, minha eterna gratidão.
Às minhas filhas Ana Luiza e Maria Fernanda, minhas eternas companheiras, por serem minha sustentação e razão do meu viver.
A Deus, por iluminar o meu caminho, dar forças e sabedoria todos os dias de minha Vida, e aos anjos da guarda, pela eterna proteção divina.
Aos meus pais Antonio Carlos e Iolanda, por ser meu porto seguro e pelo infindável apoio em todas as minhas decisões. Sempre me ensinaram a agir com ética, respeito, simplicidade, dignidade e honestidade, o que foi fundamental para minha formação pessoal e profissional.
Ás minhas irmãs, Juliane e Cristiane pelo carinho e companheirismo de sempre; por estarem sempre torcendo pelas minhas conquistas, mesmo de longe.
As minhas filhas, Ana Luiza e Maria Fernanda, razão do meu viver, que tiveram muita paciência em entender os momentos da ausência materna, mas que sem elas eu não teria forças para continuar.
Ao meu esposo Leandro Demolin, pelo apoio e compreensão nesta caminhada. Pelas palavras de força nos momentos difíceis. Peço desculpas por me ausentar com tanta frequência.
Ao meu orientador Marcus Alexandre Finzi Corat, pelo desafio em me aceitar como sua aluna, pela amizade, confiança e paciência. Você se ausentou por 2 anos, senti sua falta, mas mas com você aprendi a pensar e filosofar mais do que devo.
À minha querida Profa. Dra. Ana Maria Aparecida Guaraldo (in memorian), um ser humano especial e que teve grande influência na minha carreira e descoberta da área da ciência de animais de laboratório. Seu companheirismo, incentivo e dignidade foram de grande valor. Obrigada por tudo Ana!!!
Ao Prof. Dr. Rovilson Gilioli, meu chefe, pelos 23 anos de convivência, por todos os ensinamentos na área de monitoramento da saúde animal e pelo estímulo ao desenvolvimento deste trabalho.
trabalho e nas correções do artigo. Você sempre me deu segurança em suas correções.
Ao Prof. Dr. Werner Nicklas, pela sua atenção sempre muito especial e por acreditar e ser o incentivador para a realização deste trabalho. Você me deu a dica para os estudos com MNV.
Ao Prof. Marcelo Lancelotti, por aceitar a co-orientação, por abrir as portas de seu laboratório e pelos ensinamentos que muito contribuiu no meu aprendizado.
Á minha querida amiga e parceira Kelly Alves Bicalho, pela sua amizade, companheirismo e por sempre me receber tão bem. Nossas conversas sempre foram enriquecedoras. Obrigada por toda a ajuda e apoio!!
A todos os professores que participaram da banca de qualificação, em especial, ao Prof. Dr. José Luiz Modena, pela valiosa contribuição.
Á Profa. Selma Georgio, por ceder a linhagem celular utilizada em todas as etapas deste trabalho.
Á pesquisadora Ana Luiza Pamplona Mosimann do IOC/Ficoruz-Curitiba, por me ensinar a realizar todas as análises moleculares.
Á Jéssica Bertol, pela sua experiência, pela sua paciência e clareza de sempre. Agradeço pelo tempo que dispensou comigo te “amolando”.
Ao André Pires, pela amizade e paciência em me socorrer todas as vezes que precisei “gritar” por sua ajuda na formatação de figuras e tabelas, entre outras coisas. Obrigada por estar sempre presente!
Á Dulcinéia Martins de Albuquerque pode ser tão calma e sempre nos auxiliar quando precisamos. Obrigada por ceder o laboratório nos procedimentos de sequenciamento.
Aos colegas do CEMIB/UNICAMP: Prof. Dr. Luiz Augusto Correa Passos, Delma Pegolo Alves, Armando Ferreira Lima Filho, Sônia Cano Montebelo Rachel, Marcos Zanfolin, Marisa Mendes Mencarelli, Márcio Augusto de Paula e Sérgio Luiz Lucino, por me apoiarem e pela colaboração em atender meus inúmeros pedidos.
Aos meus sogros, Maria Auxiliadora Denízio Demolin e Reynaldo José Demolin pelo carinho, pelo apoio e por me acolherem.
Á toda a minha família (tios, tias e primas), em especial à Tia Gracinha, pelo carinho e pelo infindável apoio.
As amigas da Unicamp: Danielle, Alessandra, Raquel, Giovana Marcatti e Márcia Simone pela amizade e pela alegria contagiante... não vou esquecer do “Let it go”.
Às Instituições que se dispuseram em enviar amostras de fezes e animais, o que foi fundamental para o desenvolvimento deste trabalho.
Meus agradecimentos especiais a equipe do Laboratório de Controle Sanitário do CEMIB/UNICAMP:
Á Josélia Cristina de Oliveira Moreira, não sei nem o que dizer! Você foi fundamental, a peça mais importante para a realização e continuidade deste trabalho (e continua sendo até hoje!). Tenho uma gratidão enorme por ter você no laboratório, sempre soube que eu não estaria enganada na sua escolha. Obrigada pelo constante apoio, amizade, por ser meu ombro amigo, por ser tão positiva com a VIDA!!! Sua amizade é um presente que ganhei da vida e vou levá-la comigo para sempre.
Á Clarice Yukari Minagawa Issei, minha veterinária preferida, uma excelente profissional, dedicada e comprometida. Obrigada por fazer parte de minha vida, pela sua amizade, companheirismo e por me socorrer nos momentos de ausência no laboratório e me ensinar sempre um pouco mais!
compreensão em todos os momentos. Saiba que várias das nossas conversas contribuíram no meu dia-a dia!
Ao Sílvio Rogério Cardozo dos Santos, pela amizade, colaboração, pela troca de idéias e pelo constante incentivo. Agradeço por toda a ajuda dada!
Á Euma da Cunha Ramos, pela amizade, paciência e por atender todas as nossas expectativas quando foi “resgatada” por nós (equipe do LCQS). Agradeço pela sua dedicação e por auxiliar em várias etapas deste trabalho.
Á Jéssica Stoppa Viana, nossa estagiária, que virou amiga, companheira e que até hoje continua nos dando o apoio profissional e pessoal. Agradeço pela amizade e confiança.
Ao amigo Robson da Silva Pontes, por compartilhar diversos momentos conosco. Agradeço pela amizade e incentivo.
À Nina, um ser canino que chegou nos 45 minutos do último tempo, mas que não poderia faltar, que de uma forma ou de outra foi uma grande companheira nas noites no computador.
Aos animais que cederam suas vidas para a realização deste trabalho.
“Os sonhos não determinam o lugar onde vocês vão chegar, mas produzem a força necessária para tirá-los do lugar em que vocês estão. Sonhem com as estrelas para
que vocês possam pisar pelo menos na Lua. Sonhem com a Lua para que vocês possam pisar pelo menos nos altos montes. Sonhem com os altos montes para que
vocês possam ter dignidade quando atravessarem os vales das perdas e das frustrações”.
Os Norovírus, pertencentes à família Caliciviridae, são vírus não envelopados, com genoma constituído de RNA fita simples com polaridade positiva. São os principais agentes causadores de surtos de gastroenterite não bacteriana esporádica e epidêmica em seres humanos, com distribuição mundial. Afetam outras espécies animais como: bovinos, suínos, ovinos, cães e roedores. Norovírus murino (MNV) é descrito como um dos mais recentes agentes infecciosos a acometer animais de laboratório. Devido a sua prevalência e seu potencial em interferir em resultados experimentais, a apresentação de informações a respeito deste patógeno e seu monitoramento tornam-se de importante contribuição na pesquisa científica. Atualmente, não há dados demonstrando esta prevalência em nosso país. Neste estudo, avaliamos a ocorrência da infecção por MNV em colônias de camundongos nas cinco regiões do Brasil, abrangendo 26 biotérios nacionais localizados em universidades, institutos e centros de pesquisa, públicos ou privados, incluindo dois biotérios localizados também na América Latina. Um índice de positividade de 29,96% (175/584) foi obtido pela detecção de MNV nas amostras de fezes de camundongos, analisadas pela reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) para a região conservada e não conservada do gene do capsídeo viral (VP1) localizado na região ORF2. A análise da região conservada do gene do capsídeo viral demonstrou uma identidade de nucleotídeos entre 87% a 99%, enquanto a região variável apresentou uma identidade de 42% a 88%. Ainda na tentativa de realizar o isolamento deste vírus, células RAW 264.7 inoculadas com suspensão fecal de uma linhagem geneticamente modificada, apresentou efeito citopático, sugestivo de infecção por MNV e confirmado pelo RT-PCR. O isolamento viral nos permitiu estabelecer a técnica de imunofluorescência indireta para estimar a soroprevalência de MNV nos biotérios de produção e experimentação das diferentes instituições. Uma porcentagem de 26,54% (219/825) das amostras testadas apresentou anticorpos específicos anti-MNV. Nosso estudo foi o primeiro a relatar com abrangência a identificação de MNV em colônias de camundongos em biotérios brasileiros, evidenciando a relevância na implantação de um programa de monitoramento sanitário no nosso país e com isso, respaldar nossa pesquisa científica biomédica através de triagens deste patógeno no Brasil e comparativamente no mundo.
Palavras chave: Norovirus Murino, Biotérios brasileiros, Monitoramento sanitário, Saúde animal.
Norovirus which belongs to Caliciviridae family is a non-enveloped, positive-sense RNA virus. It is worldwide distributed and causes epidemic and sporadic nonbacterial gastroenteritis in humans. It affects animal species as cattle, dogs, sheep, pigs and rodents. Murine norovirus (MNV) is the most recent infectious agent in laboratory mice. Because your worldwide prevalence, and its potential to interfere in experimental studies, bring out information about norovirus and its surveillance turns an important assignment in scientific research. Actually, there is no data demonstrating the prevalence of MNV in our country. In this study, we evaluated the occurrence of MNV infection in mouse colonies in five regions of Brazil, 26 national facilities located in universities, institutes, and research centers, public or private, including two facilities located in Uruguai. A positivity index of 29.96% (175/584) was obtained in mouse fecal samples by reverse transcriptase polymerase chain reaction for a conserved and non-conserved region of the viral capsid gene located in the ORF2 region. Analysis of the conserved region of the viral capsid gene demonstrated a nucleotide identity between 87% to 99%, while the variable region had an identity of 42% to 88%. In an attempt to isolate MNV, RAW 264.7 cells inoculated with fecal suspension of a genetically modified strain had a suggestive cytopathic effect of MNV infection and confirmed by RT-PCR. Viral isolation allowed us to establish the indirect immunofluorescence technique to estimate MNV seroprevalence in production and experimental facilities in Latin America intitutions. A percentage of 26.54% (219/825) of samples tested showed anti-MNV specific antibodies. Our studies was the first to report comprehensively the identification of MNV in mouse colonies of Brazilian facilities, evidencing the relevance in implantation the health monitoring program in our country and with that, support our biomedical scientific research through screenings of this pathogen in Brazil and comparatively in the world.
sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo viral (VP1). ... 26
Figura 2: Estrutura do capsídeo viral dos Norovírus. ... 27
Figura 3: Organização do RNA genômico e subgenômico dos vírus pertencentes a família Caliciviridae. ... 29
Figura 4: Ciclo de replicação dos membros do gênero Norovírus ... 36
Figura 5: Organização genômica das regiões de leitura (ORF’s) do MNV e representação esquemática dos primers utilizados nas reações de amplificação. A seta representada em verde demonstra a sequência dos
primers sense e antisense para a região conservada do gene do
capsídeo e a seta em laranja representa a região variável do gene do capsídeo e suas respectivas posições no genoma. ... 54
Figura 6: Eletroforese em gel de agarose 2%. Produto amplificado com tamanho de 187 pb com primers direcionados a região conservada do capsídeo do MNV, provenientes de amostras de fezes de camundongos naturalmente infectados. PM: Padrão de peso molecular 100 pb; Colunas 1 - 6: amostras de fezes de camundongos de biotérios de produção de Centros de Pesquisas; Coluna 7: controle positivo e Coluna 8: controle negativo (H2O DEPC). ... 62
Figura 7: Células RAW 264.7 infectadas com suspensão fecal de camundongo naturalmente infectado com MNV. A: Monocamada de células RAW 264.7 não infectadas (250x); B e C: Efeito citopático do MNV () após 48 horas de infecção, evidenciado pelas células arredondadas e vesiculadas no 3° dia após inoculação (400x). ... 63
de uma linhagem de camundongo geneticamente modificado. PM: Padrão de peso molecular 100pb; Coluna 1: células RAW 264.7 não infectadas; Colunas 2 -11: 3ª, 4ª, 5ª, 6ª, 7ª, 8ª, 9ª, 10ª, 11ª e 12ª passagem celular; Coluna 12: controle negativo (H2O DEPC)... 64
Figura 9: Reação de Imunofluorescência Indireta. A e B: Células RAW 264.7 infectadas com MNV ( isolado LCQS 1). ... 65
Figura 10: Porcentagem de positividade para MNV pela técnica de Imunofluorescência indireta. ... 66
Figura 11: Porcentagem de Biotérios e animais positivos para MNV no período de 2011 a 2015, pela técnica de IFI. ... 68
Figura 12: Mapa da América do Sul demonstrando a localização regional e densidade geográfica dos biotérios nas diferentes regiões geográficas do Brasil e na América do Sul. O símbolo ▲ representa os biotérios avaliados ... 69
Figura 13: Identificação da porcentagem de biotérios positivos e negativos para MNV no Brasil e Uruguai. ... 72
Figura 14: Contribuição regional para o total de infeção pelo MNV obtido por RT-PCR nos biotérios de camundongos nas regiões geográficas do Brasil e Uruguai. ... 72
Figura 15: Positividade total para MNV nos biotérios de produção e experimentação do Brasil e Uruguai. ... 73
Figura 16: Comparação da distribuição da positividade de MNV entre os tipos de instituições analisadas na região Sudeste. ... 74
Figura 18: Alinhamento múltiplo da região conservada do capsídeo (VP1) de MNV comparadas com outras 31 sequências depositadas no GenBank.
LCQS1 corresponde ao isolado obtido de células infectadas e LCQS2 a LCQS11 correspondem a amostras obtidas de animais naturalmente
infectados de quatro biotérios da região Sudeste. Estas sequências, derivadas de produtos de PCR, foram comparadas com outras 31. Os pontos representam similaridade entre as cepas avaliadas. ... 77
Figura 19: Matriz de identidade da região conservada do gene do capsídeo (VP1). Porcentagens de similaridade dos nucleotídeos dos diferentes genótipos de MNV depositados no GenBank. Percentuais determinados pelo
BLAST - BioEdit 7.2.5. ... 79
Figura 20: Análise filogenética baseada na sequência de nucleotídeo da VP1 de isolados de MNV e cepas protótipos do genogrupo V. As sequências M87661.2 e X86560.1 foram utilizadas como grupos externos. MNV obtido de células infectadas está identificado como LCQS1 e LCQS2; 3;
4; 5; 6, 7; 10 e 11 referem-se à MNV obtido de amostras fecais de animais
naturalmente infectados. A árvore filogenética foi construída pelo programa MEGA6, pelo método Neighbor-Joining. Valores de bootstraps foram definidos em 1000 réplicas. A escala de barra representa unidades por substituição de nucleotídeos. ... 81
Figura 21: Demonstração das análises realizadas pela curva de melting de clones obtidos com primers direcionados a região variável do capsídeo de MNV. Eletroforese em gel de agarose 2% representando os amplificados de 219pb de amostras dos diferentes biotérios analisados. ... 85
Figura 22: Alinhamento múltiplo da região variável do capsídeo (VP1) de MNV.
LCQS1 corresponde ao isolado obtido de células infectadas e, as outras
no GenBank. ... 87 Figura 23: Análise filogenética baseada na sequência variável de nucleotídeos do
gene do capsídeo (VP1) de isolados de MNV e protótipos do genogrupo V. As sequências M87661.2 e X86560.1, correspondem a grupos externos. As sequências estão indicadas pelo simbolo ●. A árvore filogenética foi construída pelo programa MEGA6, método
Neighbor-Joining e valores de bootstraps definidos em 1000 réplicas. A escala de
Tabela 1: Caracterização genética e imunológica das linhagens de camundongos avaliadas pelo RT-PCR, no período de 2011 a 2016...48
Tabela 2: Sequência de primers empregados nas reações de RT-PCR e sintetizados para a região do gene do capsídeo (VP1) da ORF2 para a detecção dos diferentes genotipos de MNV...54
Tabela 3: Condições de ciclagem das reações de RT-PCR realizadas com dois conjuntos de primers...55
Tabela 4: Identificação das sequências de MNV depositadas no GenBank e utilizadas para as análises filogenéticas...60
Tabela 5: Porcentagem de positividade para MNV na Imunofluorescência Indireta, nos biotérios de produção experimentação...67
Tabela 6: Identificação de norovírus murino (MNV) em amostras de fezes de camundongos em diferentes Estados do Brasil e no Uruguai...70
Tabela 7: Positividade de MNV por região...71
Tabela 8: Porcentagem de infecção por MNV pela análise do RT-PCR com primers para a região variável do capsídeo, entre os biotérios de produção e experimentação...82
Tabela 9: Porcentagem de positividade no RT-PCR para infecção por MNV, com a utilização de primers para a região variável...83
AALAS – American Association for Laboratory Animal Science AANE – Aminoácido não essencial
AKT – Proteína quinase sreina/treonina, do inglês Serine - Threonine Kinase 1 A-MuLV - Abelson Murine Leukemia Virus
APC – Células apresentadoras de antígeno
ATG – Gene realcionado a autofagia, do inglês Autophagy –related gene BLAST – Basic Local Alignment Search Tool
cDNA - DNA complementar
CEMIB - Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na área da Ciência de Animais de Laboratório.
CEUA – Comitê de Ética no uso de animais CO2 - Gás carbônico
CXR – Corante referência, do inglês Carboxy-X-rhodamine DEPC - Dietilpirocarbonato
DMEM - Meio mínimo essencial modificado por Dulbecco’s DNA - Ácido desoxiribonucléico
dNTP - Dinucleotídeo trifosfato ECP - Efeito citopático
EDTA - Ácido etileno diamino tetracético
eIF – Fator de iniciação eucariótica, do inglês Eukaryotic Initiation Factor ELISA - Enzyme-linked immunosorbent assay
EUA – Estados Unidos da América FCV – Feline Calicivirus
FDA – Food and Drug Administration
FELASA – Federation of European of Laboratory Animal Science Association FITC - Isotiocianato de fluoresceína
FUT – Fucosyl transferase
HBGA – Antígenos do grupo de histocompatibilidade sanguínea, do inglês Human
blood genotype antigen
HuNoV – Norovírus humano, do inglês Human Norovirus ICLAS – International Council for Laboratory Animal Science
IFI - Imunofluorescência indireta IFN – Interferon
Ig – Imunoglobulina IL – Interleucina
IME – Imuno microscopia eletrônica IPTG – Isopropil β-D-1-thiogalactosidade Kb - Kilobases
KCl - Cloreto de Potássio kDa - Kilodalton
LB – Luria Bertani
MAVS - proteína de sinalização antiviral mitocondrial MDA-5 – Melanoma differentiation associated gene
MDR-1 – Gene de resitência múltipla a drogas, do inglês Multi-drug resistance gene ME- Microscopia eletrônica
MFIA – Median Fluorescence Intensity Assay MgCl2 - Cloreto de Magnésio
MHV-3 – Mouse Hepatitis Virus
MNV – Norovirus murino, do inglês Murine Norovirus MVM – Mouse Minute Virus
NGS - Next generating sequencing NLR’s – NOD-like receptors
NS - Não estrutural
ORF - Região aberta de leitura, do inglês Open reading frame pb - Pares de base
PBS - Tampão salina-fosfato, do inglês Phosphate Buffer Saline
PCR - Reação em cadeia da polimerase, do inglês Polymerase chain reaction PKR – Protein kinase receptor
Poli-A – poli-adenilada ppm – Partículas por milhão
PPR’s – Pathogen recognition receptors PTB – Polypyrimidine tract binding protein RAG – Recombination activating gene
RNA - Ácido ribonucléico
dsRNA – Ácido ribonucléico dupla fita mRNA - RNA mensageiro
sgRNA – RNA subgenômico
ssRNA - Ácido ribonucleico simples fita RPM - Rotação por minuto
RT - Trancriptase reversa, do inglês Reverse Transcriptase
RT-PCR - Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa
RT-qPCR - Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa em tempo real
SDS - Dodecilsulfato de sódio SFB – Soro Fetal Bovino
SPF – Livre de patógenos especificados, do inglês Specified Pathogen Free SRSV – Small Round Structure Virus
STAT – Signal Transducers and activators of Transcription TAE - Tampão Tris – Acetato - EDTA
TCD4 – Linfócitos T CD4 TCD8 - Linfócitos T CD8 TLR – Toll – like receptor
Tm – Temperatura de anelamento, do inglês Melting Temperature TMEV-GDVII – Theiler Murine Encephalomyelitis Virus (GD VII) TNF – Fator de necrose tumoral, do inglês Tumoral necrose factor TRIS – Tris-hidroximetil aminometano
TTR – Termination – re-initiation
VF-1 – Fator de Virulência, do inglês Virulence factor VLP – Virus like particles
VP – Proteína viral, do inglês Viral Protein VPg - Proteína viral ligada ao genoma WHO – World Health Organization
X-Gal – 5-bromo-4-cloro-3-indol β-D-galactosidase μM – Micromolar
1. INTRODUÇÃO ... 23 1.1 Contexto histórico ... 23 1.2 Norovírus ... 25 1.2.1 Classificação ... 25 1.2.2 Características gerais ... 26 1.2.3 Organização genômica ... 28 1.2.4 Proteínas virais... 29
1.2.5 Replicação do genoma viral ... 34
1.2.6 Patogênese ... 37 1.2.7 Métodos de Diagnóstico ... 38 1.2.8 Norovírus murino (MNV) ... 41 2. JUSTIFICATIVA ... 44 3. Objetivos ... 46 3.1 Objetivo Geral ... 46 3.2 Objetivos específicos ... 46 4. Material e Métodos ... 47
4.1 Perfil das instituições analisadas ... 47
4.2 Animais ... 47
4.2.1 Amostras de fezes... 48
4.2.2 Amostras de plasma ... 48
4.3 Linhagem celular ... 49
4.4 Isolamento do norovírus murino (MNV) ... 49
4.5 Reação de Imunofluorescência Indireta (IFI) ... 50
4.6 Produção de anticorpos específicos para MNV ... 51
4.7 Extração do RNA viral ... 52
4.7.1 Extração do RNA viral de amostras de fezes ... 52
4.7.2 Extração de RNA viral de células RAW 264.7 ... 53
4.8 Primers ... 53
4.9 Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR)... 55
4.10 Clonagem ... 56
4.11 Extração do DNA plasmidial ... 57
4.12 Curva de Melting ... 57
4.13 Purificação da amostra pré-sequenciamento ... 58
4.14 Sequenciamento dos produtos de MNV. ... 58
5.3 Imunofluorescência indireta (IFI) ... 64 5.4 Ocorrência da infecção por norovírus murino no Brasil e no Uruguai ... 68 5.5 Detecção de MNV nas amostras de fezes de camundongos por RT-PCR com primers para a região conservada. ... 70 5.6 Caracterização molecular e análise filogenética – Região conservada do
capsídeo ... 75 5.7 Caracterização molecular e análise filogenética – Região variável do capsídeo viral – domínio P2 / ORF2... 81 6. DISCUSSÃO ... 89 7. CONCLUSÕES ... 100 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 101 9.ANEXOS...116
1. INTRODUÇÃO
1.1 Contexto históricoAgentes infecciosos como bactérias e parasitas, estão associados com grande parte dos quadros de diarréia aguda, comumente conhecido como gastroenterites. Estes quadros são caracterizados por um processo inflamatório da mucosa intestinal e tem se tornado uma das maiores causas de mortalidade e de grande importância na saúde pública (1). Os sintomas clínicos são caracterizados por
náuseas, vômitos, dor abdominal, letargia e diarréia, com período de incubação de 24 a 48 horas. Nos casos de gastroenterite crônica, pode ocorrer uma desidratação com perda de eletrólitos e muitas vezes levando à morte.
Epidemias de gastroenterite virais em seres humanos foram primeiramente descritas em 1929 por Zahorsky (2). Inicialmente denominada como winter vomiting
disease, esta doença, até então desconhecida, caracterizava-se por episódios súbitos
de vômitos e diarréia que ocorriam nos períodos mais frios.
Durante as décadas de 1940 e 1950, estudos de transmissão experimental em voluntários humanos foram realizados pela administração de filtrado fecal derivado de pacientes com sintomas clínicos. Embora houvesse a suspeita da presença de um agente viral, naquela época, não foi possível o isolamento e a identificação do vírus por métodos tradicionais de cultura celular (2).
Desde 1940, os vírus estão relacionados a importantes causas de epidemias de gastroenterites, comumente encontradas em seres humanos e com distribuição mundial. A Organização Mundial de Saúde (World Health Organization-
WHO) (3), estima que ocorra aproximadamente quatro a seis bilhões de casos/ano de
diarréia aguda em crianças e adultos nos países em desenvolvimento (4). Em países
subdesenvolvidos, a incidência das gastroenterites é elevada, sendo a segunda causa principal de morte em crianças menores de cinco anos de idade (5). É notável que a
presença destes agentes esteja relacionada ás condições de saneamento básico que de certa forma apresenta um grande impacto econômico e social (6).
Dentre os agentes etiológicos, os vírus associados a gastroenterites têm aumentado progressivamente e pertencem a quatro famílias distintas: Reoviridae (Rotavírus), Caliciviridae (Norovírus e Sapovírus), Astroviridae (Astrovírus) e
Adenoviridae (Adenovírus). Outros agentes virais como os Picobirnavírus,
Picornavírus e Bocavírus, podem induzir a um semelhante quadro de infecção (7).
Em 1968, um surto epidêmico de gastroenterite ocorreu em um grupo de estudantes de uma escola na cidade de Norwalk, Ohio, EUA (8). A partir daí novos
pacientes voluntários, foram desafiados com filtrado fecal obtidos deste grupo de estudantes afetados.
Em 1972, Kapikian e colaboradores (9) visualizaram por imunomicroscopia
eletrônica, uma partícula viral de 27 a 32 nm nas amostras de fezes. A partir destas descobertas, o vírus tornou-se a cepa protótipo para um grupo de vírus até então não cultivável, denominado de Norwalk-like vírus ou Small Round Structured Virus (SRSV), conhecidos atualmente como norovírus (10, 11).
Estudos demonstram que a maioria das epidemias são causadas principalmente por vírus pertencentes ao gênero Norwalk, hoje denominado norovírus
(12). Estes vírus são altamente infecciosos e causadores de surtos relacionados a
infecções transmitidas por água e alimentos contaminados, fômites ou transmissão via contato direto (4, 12, 13). São comumente encontrados em hospitais, escolas e
creches, viagens em navios transatlânticos e casas de repouso para idosos. Apesar de afetarem indivíduos de todas as idades, altas taxas de mortalidade e morbidade podem ser observadas em crianças, idosos e pacientes imunocomprometidos (1, 14, 15).
A clonagem e a caracterização inicial do RNA genômico só ocorreu por volta de 1990, a partir de amostras de fezes humanas (16). Esta etapa foi de grande
importância, pois permitiu a classificação genética destes vírus e o desenvolvimento de métodos moleculares para seu diagnóstico.
1.2 Norovírus
1.2.1 Classificação
Norovírus pertencem à família Caliciviridae e segundo a classificação proposta pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV), a família Caliciviridae apresenta cinco gêneros: Vesivirus (Vesicular exanthema of swine virus), Lagovirus (Rabbit hemorrhagic disease virus), Sapovirus (Sapporo virus), Nebovirus
(Newbury-1 virus) e Norovirus (Norwalk virus) (17).
Os membros do gênero Norovírus acometem uma grande variedade de espécies hospedeiras que incluem: bovinos, ovinos, suínos, felinos, cães e roedores
(18).
Atualmente, o gênero Norovirus é classificado em sete genogrupos (GI – GVII), baseado na sequência de aminoácidos das proteínas do capsídeo viral (VP1)
(10, 13, 19). No entanto, estes genogrupos são subdivididos em genótipos ou clusters,
baseados na similaridade genética entre eles.
Os genogrupos I, II e IV compreendem vírus encontrados em seres humanos. As infecções pelo GI e GII são responsáveis pela maioria das doenças em humanos, enquanto que as infecções associadas pelo genótipo GII.4 ocorrem com maior frequência e apresentam-se como uma das maiores causas das gastroenterites epidêmicas ou esporádicas (6, 10, 15, 19, 20, 21, 22). Atualmente, uma nova variante, GII.17,
tem sido reportada nas províncias da China (23), embora os motivos desta restrição
geográfica ainda não estão bem esclarecidos.
O genogrupo GIII inclui vírus identificados em bovinos (24, 25), enquanto que
aqueles identificados em suínos estão classificados no genogrupo GII (26, 27). O GIV
consiste de dois genótipos GIV.1 que infectam humanos e GIV.2 que infectam felinos e caninos (28). O genogrupo GV inclui vírus detectados em roedores (19, 29, 30).
Atualmente, vírus que infectam cães também estão inseridos no genogrupo VI (19, 31; 32, 33, 34). Vinjé (19) propõe um novo genogrupo para esta espécie, denominado GVII.
Devido à diversidade genética e a capacidade de recombinação dos norovírus, juntamente com a contínua pressão seletiva exercida pelo sistema imune, uma nomenclatura unificada de genotipagem tem sido proposta, sugerindo a inclusão de sequências da ORF1 (open reading frame) para melhor identificação de cepas relacionadas (13, 19, 21, 35).
Figura 1: Classificação do norovírus em sete genogrupos (GI a GVII) baseado na sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo viral (VP1).
Fonte: Vinjé, 2015(19).
1.2.2 Características gerais
Os membros do gênero Norovírus, são vírus pequenos, não envelopados, com diâmetro entre 27 e 40 nm, e o capsídeo apresenta uma simetria icosaédrica (17)
Figura 2: Estrutura do capsídeo viral do Norovírus.
Fonte: Karst & Wobus, 2016 (36).
Os membros da família Caliciviridae apresentam uma densidade de 1,33 a 1,41g/mL determinada por ultracentrifugação em cloreto de césio (10, 32).
As partículas virais são altamente resistentes, mantêm a infectividade em pH 2,7 por até 3 horas em temperatura ambiente. A viabilidade também é mantida após tratamento com éter 20% a 4°C por 18 horas ou ainda à incubação a 60°C por 30 minutos (37). As concentrações de hipoclorito de sódio de 5.000ppm por 1 minuto
ou 3.000ppm por 10 minutos foram consideradas eficientes na inativação de Norovírus, juntamente com a utilização de glutaraldeído e iodo (38). São resistentes á
desinfecção por amônia quaternária, solventes orgânicos, etanol 75% e hipoclorito de sódio a 300ppm (39). Irradiação ionizante (ultravioleta) e não-ionizante (gama) mostrou
inativar alguns Calicivírus, embora não há relatos específicos da eficiência deste método para o norovírus murino (MNV) (38).
1.2.3 Organização genômica
O genoma viral, com 7,5 kb de tamanho, é constituído de uma molécula linear de RNA fita simples, com polaridade positiva (RNAss+).
No geral, o genoma dos vírus pertencentes ao gênero norovirus possuem três ORFs (do inglês, open reading frame), com exceção do norovírus murino (MNV) que apresenta uma ORF alternativa (Figura 3). A ORF1 é traduzida em uma poliproteína de 194 kDa, que é clivada por uma protease viral (NS6) e produz seis proteínas não estruturais (NS), incluindo a própria NS6 (40). As outras proteínas não
estruturais incluem a RNA polimerase- dependente de RNA (NS7), a NS5/VPg, a NS3/NTPase/RNA helicase, a NS1/2 e NS4, que estão envolvidas no processo de formação do complexo de replicação (41, 42). As ORF2 e ORF3 são traduzidas a partir
de um RNA subgenômico e codificam as proteínas do capsídeo viral, VP1 e VP2, respectivamente. A VP1 é uma proteína estrutural de 60 kDa e, com papel importante na replicação do vírus. A VP2, uma proteína estrutural de menor tamanho, com 23 kDa, interage com o RNA genômico durante a formação do vírion (10).
Apenas os MNVs apresentam uma região de leitura alternativa, ORF4, que se sobrepõe á ORF2. É responsável por codificar uma proteína conhecida como VF1 (virulence factor 1), relacionada a funções regulatórias do sistema imune do hospedeiro e virulência (43, 44).
Assim como outros RNA vírus, a extremidade 5’ do genoma é covalentemente ligada a uma proteína conhecida como VPg (genome-linked viral
protein), de 13 a 15 kDa e com aproximadamente 22 aminoácidos. Por outro lado, a
extremidade 3’, apresenta uma cauda poliadenilada (poli-A), com 46 a 78 nucleotídeos, com uma estrutura stem-loop responsável por interagir com aproximadamente 10 proteínas celulares, entre elas a nucleolina (45). Há evidências
que demonstram que estas estruturas secundárias conservadas, presentes nas regiões 5’ e 3’ são importantes no processo de replicação, formação do RNA subgenômico, tradução e patogênese viral (45,46, 47, 48).
O RNA subgenômico, produzido durante a replicação, apresenta uma sequência de 2,4 kb similar na porção final do RNA genômico e também covalentemente ligado a uma VPg na região 5’ e a uma cauda poliadenilada na região 3’ (12, 49).
Figura 3: Organização do RNA genômico e subgenômico dos vírus pertencentes à família Caliciviridae.
Fonte: Royall & Locker, 2016 (50).
1.2.4 Proteínas virais
1.2.4.1 Proteínas não estruturais
p48 (NS1/2)
É uma proteína não estrutural, codificada na extremidade N-terminal da ORF1 e que apresenta uma variabilidade em tamanho e seqüências de aminoácidos entre os vírus do genogrupo I (48kDa) e genogrupo II (37kDa) (52). Estudos anteriores
sugerem que esta proteína esteja relacionada com a interação dos norovírus com o complexo de Golgi, apresentando importante papel no trânsito intracelular de proteínas virais assim como no rearranjo das membranas vesiculares, associada com
a replicação do RNA viral (52, 53). Hoje, sabe-se que a NS1/2 é processada durante os
estágios tardios da infecção viral por caspases celulares ativadas por apoptose (40).
NS3/p41 (p40) NTPase
Apresenta peso molecular de 41 kDa e 40 KDa nos vírus pertencentes ao genogrupo I e II, respectivamente. Esta proteína é classificada na superfamília das RNA helicases e apresenta a capacidade de hidrolisar ATP, sugerindo que esta tem uma atividade NTPase, porém não apresenta uma atividade de helicase (52).
NS4/p22 (p20)/3A-like
Esta proteína não estrutural, similar a proteína 3A dos Picornavírus, é responsável por codificar estruturas conservadas que mimetizam os sinais envolvidos com o trânsito entre o retículo endoplasmático e a fragmentação do complexo de Golgi.(18). Atua como antagonista nas vias de secreção celular, sugerindo um novo
aspecto na interação vírus e hospedeiro (54, 55).
NS5/VPg
A maioria dos membros pertencentes à família Caliciviridae apresentam na região 5’, estruturas secundárias conservadas, importantes no processo de replicação viral (45). A VPg (genome-linked viral protein) é uma proteína de aproximadamente
15kDa, com aproximadamente 22 aminoácidos e que se encontra covalentemente ligada ao RNA genômico e subgenômico. Estruturalmente, esta proteína apresenta um núcleo helicoidal que é flanqueado por regiões flexíveis N- e C-terminais (56).
Estudos realizados nos gêneros Norovírus murino (cepa MNV-1 CW1), NV (NC1959) e Feline calicivirus (FCV) demonstraram a interação da VPg com proteínas celulares do hospedeiro no ciclo de vida viral, sugerindo portanto um novo mecanismo de iniciação do processo de tradução (57). A VPg também é importante na regulação
vírus Norwalk têm demonstrado a sua importante função no recrutamento de fatores de iniciação da tradução. Em norovírus humano (HuNoV) e MNV, as VPgs interagem com componentes do complexo eIF4F, em particular eIF4E e eIF4A, um componente da família das RNA helicases (44, 58), assim como eIF3, uma proteína envolvida no
recrutamento do complexo de pré-iniciação (59).
NS6/3CLpro
Os norovírus codificam uma protease, denominada 3C-like (3CLpro), devido
a sua similaridade com a proteína 3C dos picornavírus (51). Sua função está associada
a clivagem da poliproteína codificada pela ORF1, dando origem as proteínas não-estruturais do norovírus (18).
Kuyumcu-Martinez et al. (60) reportou a inibição da síntese de proteínas
celulares em norovirus recombinantes, e estes dados demonstraram ser importantes na modulação da expressão gênica celular e viral (51).
RdRp (NS7)
A RNA polimerase dependente de RNA (RpRd) dos Calicivírus está relacionada com as enzimas presentes nos vírus da família Picornaviridae, como exemplo a 3D polimerase (3Dpol), a qual tem sido utilizada como modelo comparativo. As RpRd se estendem do aminoácido 1281 até a extremidade carboxi-terminal da ORF1.
Apresenta elementos estruturais e características catalíticas assim como em outros vírus RNA de polaridade positiva (51). As estratégias de processamento
proteolítico da poliproteína codificada pela ORF1 são capazes de gerar tanto proteínas precursoras como produtos finais de clivagem enzimática, aumentando a capacidade dos vírus em produzir enzimas com funções replicativas. Estudos enzimáticos com proteínas recombinantes confirmaram que o precursor 3CLpro-RdRp apresentou
atividade como protease e polimerase (61).
Estudos de eletrocriomicrografia e resolução atômica, realizados no passado, possibilitaram definir a estrutura icosaédrica, tridimensional (T=3) do capsídeo viral. As partículas virais são compostas por 90 dímeros da proteína do capsídeo, a VP1 (51, 62).
Dados obtidos com estudos em Calicivírus animal mostram que as proteínas estruturais VP1 e VP2 são codificadas por um RNA subgenômico.
VP1
A proteína VP1, codificada pela ORF2, possui peso molecular entre 58 e 60 kDa, apresenta de 530 a 555 resíduos de aminoácidos (51).
Apresenta dois principais domínios, o domínio S (shell) e o domínio P (protruding) (62). O domínio S, com uma sequência conservada de 225 aminoácidos,
contém oito cadeias antiparalelas do tipo β, comumente encontradas em proteínas do capsídeo viral e formam assim a estrutura icosaédrica (9). O domínio P, com uma
sequência hipervariável de 127 aminoácidos, interage formando dímeros, que estabilizam o capsídeo e formam as protusões características do virion (12, 51). É
organizado em dois subdomínios: P1 e P2, sendo que do ponto de vista conformacional, o subdomínio P2 localiza-se externamente a superfície do capsídeo, contém sítios de ligação que são reconhecidos por anticorpos neutralizantes e representam importantes determinantes da virulência e antigenicidade viral, assim como já demonstrado nas interações entre os antígenos do grupo ABO e o norovírus nas infecções em humanos (63).
Estudos prévios demonstram altas taxas de mutação neste subdomínio (64)
e a substituição de um único aminoácido neste domínio no MNV, tem sido associada à atenuação da infecção in vivo (65).
A proteína VP1 quando expressa em células de inseto a partir de baculovírus recombinante, é capaz de realizar a montagem de VLPs, do inglês:
virus-like particles, e que estruturalmente e antigenicamente mimetizam o vírus, exceto que
estas partículas não possuem o genoma viral (51). Esta oligomerização, ou
automontagem da partícula, também pode ocorrer sem a presença do domínio P (61).
entre proteínas, mais do que entre RNA e proteína, sejam responsáveis pela correta montagem do capsídeo do norovírus. (66).
VF1
A proteína VF1 é encontrada apenas em norovírus murino e alguns sapovírus humanos. É codificada por uma região de leitura alternativa, denominada ORF4, que se sobrepõe á ORF2, sendo expressa por um RNA subgenômico. Durante a infecção viral, a VF1 pode ser encontrada nas mitocôndrias que apresentam um importante papel na sinalização da resposta imune inata, através de proteínas de membrana, denominadas proteína de sinalização antiviral mitocondrial (MAVS) (43).
Estas proteínas apresentam um domínio N-terminal CARD-like e um domínio de transmembrana C-terminal e estão envolvidas na ativação de NF-kB e IRF3 na resposta a infecção viral. Estes dados demonstram o envolvimento das mitocôndrias na imunidade inata (67). .Análises funcionais têm demonstrado que a VF1 apresenta
um papel antagônico na resposta imune inata á infecção por impedir a regulação de genes celulares ativados pela via inata, como o interferon β. Em estudos in vitro, utilizando células RAW 264.7, as funções relacionadas ao controle da apoptose foram observadas durante a infecção viral na ausência da expressão da ORF4. Por outro lado, em experimentos in vivo, com camundongos STAT1-/- infectados com vírus
mutante para a expressão da ORF4, observou-se uma expressão tardia para os sintomas clínicos, demonstrando, portanto, seu papel na virulência viral (43).
VP2
A VP2 é uma proteína codificada pela ORF3, apresenta de 208 a 268 resíduos de aminoácidos, peso molecular que varia de 22 a 29kDa e, exibe uma grande variabilidade tanto no tamanho quanto na composição da seqüência de nucleotídeos entre os vírus da mesma família (51, 68). Evidências do papel da VP2
sugerem sua contribuição no aumento da expressão da VP1, na estabilização das VLPs e no empacotamento do genoma viral (69).
Os mecanismos envolvidos no processo de tradução desta proteína ainda não estão bem esclarecidos. Há indícios que este processo ocorra via um mecanismo denominado “terminação-reiniciação” (TTR), ou seja, que o evento de tradução da VP1 via RNA subgenômico ocorre através das interações na região 3’ que favorecem o recrutamento de fatores de iniciação de transcrição para a região 5’ – VP2 (70). Estes
dados suportam a idéia de que a síntese da VP2 é regulada pela VP1.
Alguns estudos também revelam que a VP2 está envolvida na indução da resposta imune protetora, por regular a maturação de células apresentadoras de antígenos (71).
1.2.5 Replicação do genoma viral
O conhecimento do ciclo de vida e os mecanismos envolvidos na replicação viral do norovírus humano (HuNoV) têm sido estudados baseado em outros membros da família Caliciviridae, como o calicivírus felino (FCV) e o MNV (10, 72, 73).
As estratégias de replicação do Norovírus são bem semelhantes aos vírus RNAss de polaridade positiva e ocorre pela síntese de uma fita intermediária de polaridade negativa que serve como molde para a produção do RNA genômico a partir da RNA polimerase - RNA dependente (RpRd), uma enzima altamente conservada entre os vírus RNA (10).
Cada uma das etapas da replicação viral do norovírus encontram-se resumidas na figura 4. Na primeira etapa da replicação, ocorre a adsorção do vírion aos receptores de superfície celular que envolve diferentes estruturas de carboidratos. O norovírus humano (HuNoV) liga-se a antígenos do grupo de histocompatibilidade sanguínea (HBGA, do inglês: histo-blood group antigens) que são carboidratos complexos que se ligam neste caso, com o subdomínio P2 do capsídeo viral, altamente variável, formando uma interface com a cadeia de oligossacarídeos dos antígenos (74).
Por outro lado, o norovírus murino liga-se ás radicais de ácido siálico, glicolipídeos e glicoproteínas e, a entrada do vírus na célula hospedeira ocorre pelo processo endocítico, mediado por proteínas como dinamina e colesterol (75). Recentes
mediado a ligação dos MNV a superfície celular, juntamente a cofatores moleculares presentes nos fluídos biológicos (76).
Depois da internalização na célula e desnudamento do genoma viral, inicia-se a tradução. A ORF1 codifica uma poliproteína que é sintetizada pela clivagem proteolítica de uma protease viral, NS6 e, resulta na liberação de proteínas não estruturais para formar o complexo de replicação no citoplasma da célula hospedeira
(77).
A formação deste complexo ocorre pela indução de proteínas não-estruturais p48 (NS1-2) e p22 (NS4), e envolve membranas da célula hospedeira e proteínas que são redistribuídas e modificadas durante a infecção viral (41, 74). Estas
membranas são derivadas do retículo endoplasmático, complexo de Golgi e endossomos (40, 42). Entretanto, a interação entre estas organelas e o complexo de
replicação durante a infecção viral pode induzir a ativação de sensores da imunidade inata, embora este processo precise ser melhor investigado (78).
Recentemente, foi demonstrado que este complexo de replicação envolve uma rede citoesquelética, através da organização dos microtúbulos em conjunto com a RNA polimerase viral (NS7) (41). Apenas quando este complexo é formado, a RdRp
(NS7) começa a síntese do RNA polaridade negativa a partir do RNA genômico, cujo mecanismo é dependente da interação entre a VPg e a RdRp, que se ligam através de pontes fosfodiéster junto ao nucleotídeo inicial, guanidina, presente nos membros da família Caliciviridae, sendo o processo conhecido como “guanilação” (79).
Já a síntese do RNA subgenômico que é traduzido em proteínas estruturais, VP1, VP2 e VF1 no caso de MNV, pode ocorrer por dois mecanismos distintos: um deles pode estar associado á interação de uma estrutura stem-loop da VP1, juntamente com a RpRd viral (79) ou por um processo denominado de terminação
“prematura” da replicação do RNA polaridade negativa, através de um sinal de terminação (44). As proteínas estruturais são montadas e empacotam o RNA genômico
formando as partículas virais maduras. A liberação dos vírions ocorre após a lise celular (74).
Embora todos estes processos tenham sido detalhados por análises computacionais e mutacional, o entendimento das funções das proteínas celulares na tradução do genoma viral e na replicação, ainda estão sob novos estudos, de forma a avaliar o impacto da infecção viral em processos celulares como: transporte
núcleo-citoplasma, morte celular, assim como no desenvolvimento de vacinas e drogas terapêuticas (13).
Figura 4: Organização genômica e ciclo de replicação dos membros do gênero norovírus. A figura A demonstra o RNA genômico representado por três ORFs, que codificam uma poliproteína, que compreende seis proteínas não estruturais e proteínas estruturais (VP1 e VP2). A figura B demonstra a interação entre a VP1 e a célula hospedeira que ocorre por antígenos do grupo sanguíneo (HBGA) em humanos e em camundongos via radicais de ácido siálico. Subsequentemente, o vírus é internalizado e o RNA é liberado. O RNA (+) é então transcrito e traduzido no citoplasma celular, pela presença de fatores de transcrição que são recrutados pela VPg, que se ligam covalentemente a região 5’ do genoma. Durante o processo de replicação, o RNA (+) é transcrito em RNA (-), que são utilizados como molde para a síntese de novos RNAs genômicos e subgenômicos. Em seguida, os vírions são montados e liberados da célula hospedeira.
Fonte: De Graaf et al., 2016 (23)
A
1.2.6 Patogênese
Até recentemente, o conhecimento sobre a patogênese da infecção pelo Norovírus humano tem sido dificultado pela incapacidade da propagação do vírus in
vitro (39).
O uso de diferentes modelos animais tem contribuído na elucidação dos mecanismos de patogenecidade da infecção pelo norovírus. Dentre estes modelos experimentais, apenas o norovírus murino se replica em cultura de células (80, 81, 82). Porcos e bezerros gnotobióticos, também foram utilizados e as lesões histopatológicas foram mais acentuadas nos experimentos com bezerros (82) do que
em porcos gnotobióticos (83). O tropismo celular do norovírus humano in vivo ainda não
está bem esclarecido, embora haja evidências de que os enterócitos da porção proximal do intestino delgado representam o sítio de replicação, devido à presença do antígeno viral nestas células (36).
Dados recentes reportam que os norovírus são capazes de infectar, especificamente, células imunes da lâmina própria e folículos linfóides, incluindo placas de Peyer (36), como demonstrado em bovinos e camundongos, e que também
se replicam em células apresentadoras de antígenos, como células dendríticas, macrófagos e células B (73).
Karst & Wobus (36) propuseram um modelo da infecção intestinal por
norovírus, demonstrando que as células M, um tipo celular presente em Placas de Peyer, apresentam um receptor para imunoglobulinas A (IgA), que possuem a capacidade de ligar-se á patógenos formando um complexo. Este complexo é então capaz de atravessar a barreira epitelial por um mecanismo de transporte vesicular transepitelial, conhecido por endocitose.
Embora acredita-se que a infecção por norovírus seja restrita ao intestino, estudos detectaram o RNA viral no soro de 15% de indivíduos infectados (12). O mecanismo da disseminação do vírus para os tecidos periféricos é pouco conhecida, mas estudos com o MNV mostrou que o tropismo por células dendríticas é capaz de facilitar a sua disseminação extra intestinal para os linfonodos mesentéricos (12).
1.2.7 Métodos de Diagnóstico
O norovírus foi primeiramente identificado pela utilização da microscopia eletrônica (ME) e imunomicroscopia eletrônica (IME) (9). Esta metodologia apresenta
limitações devido à sua baixa sensibilidade, pois requer altas concentrações de partícula viral, em torno de 105– 106 partículas/mL (84). Por outro lado, a
imunomicroscopia eletrônica permite a avaliação da resposta sorológica ao antígeno viral com sensibilidade dez vezes maior que a microscopia eletrônica direta.(10). Essas
técnicas utilizam equipamentos de alto custo e exige treinamento especializado para a execução e leitura microscópica. Desta forma, tanto a ME quanto a IME são utilizadas apenas nas atividades de pesquisa e não nas rotinas de diagnóstico.
Outros métodos de diagnóstico como: radioimunoensaio, ensaios imunoenzimáticos e Western blotting foram utilizados para a detecção do antígeno viral ou anticorpos anti-norovírus, através do uso de VLP’s (84) Somente após a
clonagem e sequenciamento do genoma do Norwalk virus (16) métodos moleculares
como RT-PCR puderam ser desenvolvidos para a detecção do vírus nas amostras de fezes nos surtos de gastroenterite. Entretanto, como novas cepas virais foram descobertas, e com o aumento no número de sequências acessíveis, o desenvolvimento de novos protocolos tem sido utilizado em conjunto com ensaios de segunda geração com o objetivo de identificar novas cepas circulantes.
1.2.7.1 RT-PCR
Atualmente, o RT-PCR é a técnica mais utilizada para a detecção do NoV e, considerado padrão ouro para o diagnóstico dos surtos de gastroenterite. Apresenta a vantagem de identificar diferentes genogrupos numa mesma amostra (84). Têm-se
utilizado diferentes iniciadores sequenciais (primers) em distintas regiões do genoma viral, como regiões conservadas que codificam para a RNA polimerase RNA dependente, a região da proteína do capsídeo (VP1), além das junções ORF1 e ORF2. Embora a maioria dos primers empregados para o diagnóstico das noroviroses amplifique regiões da polimerase, recomenda-se que a classificação genética de novas estirpes seja somente realizada com base na análise da sequência completa da VP1 (20, 85).
Os ensaios de PCR em tempo real (RT-qPCR) têm sido utilizados como testes rápidos e sensíveis no diagnóstico das diferentes cepas virais (35, 86, 87, 88). A
maioria dos protocolos utilizam iniciadores marcados com fluoróforos e a análise e confirmação dos resultados ocorre pela utilização de softwares que avaliam a intensidade de sinais emitidos, tornando-o um método altamente sensível e específico e que não requer o uso de gel de agarose (19).
Atualmente, os ensaios One-step RT-qPCR em que a transcrição reversa e a amplificação do cDNA são realizados em uma única reação, também são amplamente utilizados em laboratórios clínicos, pois além de serem rápidos, possuem a vantagem de diminuir o risco de contaminação cruzada (19). Além da elevada
sensibilidade, os testes RT-qPCR podem ser utilizados para determinar a quantidade de ácido nucleico presente numa amostra assim como determinar a carga viral.
Nos últimos anos, novos kits de diagnóstico qualitativos têm sido lançados no mercado com o intuito de determinar a prevalência global de norovírus nos surtos de gastroenterite. Estes testes permitem a rápida identificação e diferenciação entre as cepas pertencentes ao genogrupo I e II em humanos, com importante significado na saúde pública, pois permitem estabelecer protocolos de profilaxia e tratamento anti-viral. (4).
Novos formatos de ensaios moleculares, como o multiplex RT-PCR tem sido adotado como uma ferramenta tecnológica na rápida detecção de patógenos. Possuem a vantagem de detectar diferentes patógenos em um único teste, utilizam poucos volumes de amostras e são capazes de identificar a possibilidade de co-infecção e permitem realizar a genotipagem (89, 90).
Atualmente, metodologias moleculares, como o NGS (Next generating
sequencing) tem se tornado importante, pois permite identificar uma diversidade viral
em diferentes amostras e compará-la com o viroma e microbioma que podem influenciar na transmissão e expressão da infecção causada pelo NoV (91).
1.2.7.2 Ensaios imunoenzimáticos
Ensaios imunoenzimáticos como ELISA (Enzyme linked immunosorbent
tem sido importantes ferramentas para a triagem de um grande número de amostras de soro, assim como contribuem para estimar a prevalência da infecção por norovírus e detectar cepas antigenicamente distintas (38, 80, 86, 92, 93; 94; 95, 96).
No caso do norovírus humano, vários testes enzimáticos de terceira geração, de alta especificidade e sensibilidade recomendados pelo FDA (Food and
Drug Administration) estão disponíveis no mercado como: IDEIA Norovirus (Oxoid
Ltd., Hampshire,United Kingdom), Ridascreen Norovirus (R-Biopharm, Darmstadt, Germany), Ridaquick Norovirus (R-Biopharm, Darmstadt, Germany) e SD Bioline Norovirus (Standard Diagnostics, Inc., Kyonggi-do, South Korea) (35).
Ensaios fluorescentes multiplexados, que utilizam a tecnologia Luminex têm sido utilizados no diagnóstico de infecções pelo norovírus murino (MNV), por ser um teste automatizado e mais sensível do que as reações de ELISA (92). Este ensaio
permite a detecção simultânea de vários patógenos em uma única amostra e apresenta-se atualmente como uma ferramenta na detecção dos agentes infecciosos mais prevalentes encontrados em animais de laboratório. Permite analisar o perfil de resposta de diferentes citocinas, detecção de anticorpos a diferentes epítopos e antígenos virais e bacterianos (97).
O ensaio multiplexado baseia-se na utilização de microesferas de poliestireno, com 5 a 6 mm de diâmetro incorporado com fluoróforos vermelhos e laranja que permitem análises qualitativas e quantitativas em diversas amostras. As microesferas reconhecem diferentes alvos e são incubadas junto às amostras teste. Os analitos capturados por fluorescência são detectados pela utilização de anticorpos biotinilados conjugados com um fluoróforo reporter (ficoeritrina) (92).
1.2.8 Norovírus murino (MNV)
A descoberta do norovírus murino (MNV) abriu novos caminhos nos estudos de replicação viral, mecanismos de patogenecidade, interação vírus-hospedeiro e no desenvolvimento de metodologias para diagnóstico.
Até recentemente, o conhecimento sobre a patogênese da infecção pelo norovírus humano tem sido dificultado pela incapacidade da propagação do vírus in
vitro (39). O uso de diferentes modelos animais tem contribuído na elucidação dos mecanismos de patogenecidade dos norovírus. Desses modelos experimentais, em potencial, apenas o norovírus murino se replica em cultura de células. (73, 81).
MNV foi descrito pela primeira vez em 2003 por Karst e colaboradores (29),
em camundongos knockout para os genes RAG2 (recombination activating gene) e STAT-1 (signal transducer and activator of transcription 1). Estes camundongos, reconhecidos como RAG 2/STAT-1-/-, desenvolviam uma doença sistêmica causada
por um patógeno desconhecido, mas que poderia ser transmitida por inoculações intracerebrais sucessivas.
A análise do cérebro destes animais apresentou resultados negativos para patógenos humanos e murinos sabidamente conhecidos. Outras linhagens knockout para receptores de interferon αβγ (IFNαβγR-/-) quando infectadas também sucumbiam
á infecção após 30 dias, demonstrando, portanto, o papel dos interferons na resistência á infecção. Sinais clínicos de encefalite, vasculite, pneumonia e hepatite foram descritos.
A análise da seqüência de nucleotídeos demonstrou homologia á regiões do genoma dos Calicivírus que posteriormente foi nomeado norovírus murino 1 (MNV-1) (29).
Após a descoberta do MNV-1, três novas cepas de MNV foram descritas: MNV-2; MNV-3 e MNV-4, que são capazes de induzir infecção persistente, enquanto que MNV-1 induz a uma infecção transiente (99). As cepas de MNV descritas até então
apresentam uma identidade de nucleotídeos em torno de 87% a 94,1%, demonstrando que são altamente conservadas e demonstram características biológicas com elevado grau de homologia com a sequência MNV-1, mas divergem quando comparadas com norovírus humano e bovino (85).
Thackray e colaboradores (85) analisaram 26 sequências genômicas de
MNV e observaram alta homologia nos primeiros 32 nucleotídeos da região 5’, os 64 nucleotídeos da junção ORF1 e ORF2, assim como nos 47 nucleotídeos da ORF2, quando comparados entre as cepas descritas. Embora fosse possível verificar 13% de divergência, todas as sequências foram incluídas em um único genogrupo, genótipo e sorotipo.
A identificação da presença do MNV em camundongos RAG/STAT1
-/-contribuíu para o estudo dos mecanismos envolvidos na resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro, demonstrando que STAT1-/- é um fator preponderante no controle da infecção, desde que camundongos deficientes para STAT1-/- apresentam
altos títulos virais (36).
Vários estudos foram realizados para verificar a habilidade deste vírus em induzir doença clínica. Camundongos com expressão normal do gene STAT1 e deficientes para o gene RAG1 e RAG2 foram inoculados pelas vias: oral, nasal e intracranial, mas 90 dias após a inoculação não sucumbiram á infecção.
O gene ativador de recombinação (RAG) é essencial na produção de linfócitos T e B maduros, que por sua vez são componentes do sistema imune adaptativo. Estes genes codificam proteínas conhecidas como RAG1 e RAG2 que permitem a recombinação dos genes VDJ, envolvidos na maturação de células T e B. Por outro lado, as proteínas ativadoras da transcrição e sinal de transdução (STAT), pertencem à família de proteínas citoplasmáticas envolvidas no desenvolvimento e função do sistema imune e são ativadas na presença de polipeptídeos extracelulares. Apresentam a função de inibir a replicação viral e apoptose, resultando em uma baixa disseminação viral (99).
Camundongos RAG-/-, são capazes de fazer a infecção persistente com
excreção de partículas virais infecciosas por períodos prolongados, indicando que a imunidade adaptativa não é necessária á proteção contra o desenvolvimento da doença (100). Wobus e colaboradores (73) demonstraram a importância do sistema
immune inato na infecção por MNV-1, devido ao clearance viral observado em linhagens de camundongos imunocompetentes.
A infecção por MNV-1 em camundongos imunocompetentes demonstra que o vírus é capaz de replicar e disseminar por vários órgãos como: baço, pulmão, fígado e linfonodos mesentéricos. Análises histológicas permitiram observar a
presença de uma enterite leve, hipertrofia da polpa vermelha e polpa branca do baço após 72 horas de infecção e infiltrado inflamatório em hepatócitos (29, 99).
O sistema imune inato também tem papel importante na resistência á infecção por MNV. Camundongos deficientes para IFN tipo I (IFNαβ) e IFN tipo II (IFNγ) quando infectados pelo MNV são capazes de resistir á infecção, mas quando apresentam deficiência para ambos os tipos de interferon, a infecção é letal, sugerindo um possível mecanismo de compensação entre a resposta IFN I e II na resistência á infecção que de certa forma são capazes de controlar a disseminação viral para os tecidos periféricos (29). Diante destes fatos acredita-se que indivíduos com deficiência
na resposta imune inata podem desenvolver a doença com sintomas mais graves. Além disso, a variação genética dos receptores aos norovírus é um fator importante quanto à susceptibilidade à infecção (80).
O conhecimento in vitro e in vivo da replicação viral e as patologias das diferentes sequências genômicas de MNV, mesmo pertencentes ao mesmo genogrupo contribuíram no entendimento das diferenças genéticas entre elas.
Assim como em norovírus humano, há evidências de recombinação entre as distintas cepas de MNV, sugerindo a possibilidade do aparecimento de cepas geneticamente distintas (101, 102). Da mesma forma, sugere-se a possibilidade de
co-infecção com as diferentes cepas de MNV (38, 103).
Estudos imunohistoquímicos revelaram que MNV apresenta um tropismo por células de origem mononuclear; macrófagos e células dendríticas (73, 99). Baseado
nestes relatos foi possível identificar uma linhagem celular permissiva, denominada RAW 264.7, originária de células imortalizadas de macrófagos de camundongos, transformadas pelo vírus da leucemia de Abelson e que permitiu a propagação in vitro do MNV. Estes achados contribuíram significantemente para os estudos relacionados á biologia e patogênese do norovírus, utilizando o MNV como principal modelo.
Assim como em seres humanos, estudos epidemiológicos têm demonstrado que o norovírus animal apresenta distribuição mundial (18). Países da
América do Norte, Europa e Ásia tem descrito a alta prevalência da infecção por MNV em colônias de camundongos (38, 92, 93, 94, 100, 101, 104, 105, 106). Estes dados apontam para
um grande impacto do potencial deste vírus em interferir em resultados experimentais que utilizam modelos animais, como já demonstrados por alguns autores (107, 108, 109, 110, 111).
