UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS - FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE: INFECTOLOGIA E MEDICINA TROPICAL
MARLUCE APARECIDA ASSUNÇÃO OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DA COMBINAÇÃO DE DIFERENTES MÉTODOS
LABORATORIAIS UTILIZADOS PARA DIAGNOSTICAR E CARACTERIZAR LEPTOSPIRA SPP. A PARTIR DE AMOSTRAS DE SANGUE DE PACIENTES COM SUSPEITA DE LEPTOSPIROSE EM MINAS GERAIS,
BRASIL, 2008 a 2014.
BELO HORIZONTE - MG 2016
MARLUCE APARECIDA ASSUNÇÃO OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DA COMBINAÇÃO DE DIFERENTES MÉTODOS
LABORATORIAIS UTILIZADOS PARA DIAGNOSTICAR E CARACTERIZAR LEPTOSPIRA SPP. A PARTIR DE AMOSTRAS DE SANGUE DE PACIENTES COM SUSPEITA CLÍNICA DE LEPTOSPIROSE EM MINAS
GERAIS, BRASIL, 2008 a 2014.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical da Faculdade de Medicina da UFMG, para a obtenção do título de Doutora.
Orientador: Prof. Dr. José Carlos Serufo.
BELO HORIZONTE - MG 2016
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca J. Baeta Vianna – Campus Saúde UFMG Oliveira, Marluce Aparecida Assunção.
O48a Avaliação da combinação de diferentes métodos laboratoriais utilizados para diagnosticar e caracterizar Leptospira spp. a partir de amostras de sangue de pacientes com suspeita de leptospirose em Minas Gerais, Brasil, 2008 a 2014 [manuscrito]. / Marluce Aparecida Assunção Oliveira. - - Belo Horizonte: 2016.
129f.: il.
Orientador: José Carlos Serufo.
Área de concentração: Infectologia e Medicina Tropical.
Tese (doutorado): Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina.
1. Leptospirose/diagnóstico. 2. Leptospira/genética. 3. Técnicas de Laboratório Clínico. 4. Ensaio de Imunoadsorção Enzimática. 5. Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real. 6. Dissertações Acadêmicas. I. Serufo, José Carlos. II. Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina. III. Título.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Reitor
Prof. Dr. Jaime Arturo Ramírez. Vice-Reitora
Profa. Dra. Sandra Regina Goulart Almeida.
Pró-Reitora de Pós-graduação
Profa. Denise Maria Trombert de Oliveira
Pró-Reitora de Pesquisa Profª. Adelina Martha dos Reis.
FACULDADE DE MEDICINA
Diretor
Prof. Tarcizo Afonso Nunes. Vice-Diretor
Prof. Humberto José Alves.
Coordenador do Centro de Pós-Graduação Prof. Luiz Armando Cunha de Marco
Subcoordenador do Centro de Pós-Graduação Prof. Edson Samesima Tatsuo
Chefe do Departamento de Clínica Médica Profa. Valéria Maria Augusto
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Área de Concentração
Infectologia e Medicina Tropical. Coordenador
Prof. Eduardo Antônio Ferraz Coelho. Subcoordenador
Prof. Antônio Luiz Pinho Ribeiro.
MEMBROS DO COLEGIADO
Professor Antônio Luiz Pinho Ribeiro. Professora Denise Utsch Gonçalves. Professor Eduardo Antônio Ferraz Coelho. Professora Maria do Carmo Pereira Nunes. Professor Unaí Tupinambás.
Professor Vandack Alencar Nobre Jr.
DEDICATÓRIA
Aos que me trouxeram à existência
e aos que são a razão da minha vida.
AGRADECIMENTOS
A Deus, que na pessoa de Jesus Cristo é o autor e consumador da minha fé.
Ao professor Dr. José Carlos Serufo pela oportunidade, orientação e parceria ao longo da minha carreira profissional.
Meu marido (Belline) e filhos (Filipi e Guilherme) por me apoiarem e respeitarem as minhas escolhas.
À minha mãe amada e presente, ao meu pai amado que há tempos não está fisicamente comigo, somente nas minhas lembranças e saudades.
À minha irmã, meu irmão e minha cunhada.
Aos meus sobrinhos e os mais novos integrantes da família (Gabrielzinho e Estevão).
As minhas filhas de coração (Gabriela e Rúbia).
A toda a equipe do Serviço de Doenças Bacterianas e Fúngicas da Funed, incluindo Cris Mendes e Aline Tatiana pelo carinho, respeito, parceria e colaboração.
Ao ex-diretor do Instituto Octávio Magalhães, Dr. Júlio Cesar Martins Siqueira que acreditou e apoiou as minhas investidas.
À Jussara, secretária do PPG em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical pela disponibilidade, atenção e presteza.
À Fundação Ezequiel Dias, instituição que permitiu o meu crescimento e realização profissional.
Ao PPG em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical da Faculdade de Medicina da UFMG.
EPÍGRAFE
Deus surpreende a ciência
e envergonha a incredulidade.
RESUMO
Introdução: A leptospirose é uma doença icteroinfecciosa e febril causada por espiroquetas do gênero Leptospira spp. A diversidade das manifestações clínicas da leptospirose torna indispensável a abordagem epidemiológica e laboratorial para a sua confirmação. Os métodos de detecção de anticorpos e cultivo do agente etiológico não permitem o diagnóstico precoce da doença. A maioria dos casos em que os pacientes evoluem para óbito ou não há a oportunidade da coleta de segunda amostra não são confirmados pelos métodos imunológicos. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a combinação de diferentes métodos laboratoriais utilizados para o diagnóstico da leptospirose, verificar a ocorrência de sorovares de Leptospira spp. e caracterizar geneticamente Leptospira spp. a partir do DNA obtido de amostras de pacientes com suspeita de leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período de 2008 a 2014. Métodos: Amostras de 78 pacientes foram examinadas pelos métodos de ensaio imunoenzimático (ELISA-IgM), aglutinação microscópica (MAT), PCR específico convencional utilizando três diferentes iniciadores e
real-time PCR. O ELISA-IgM foi realizado com kits Panbio, seguindo as
recomendações do fabricante. O MAT e a cultura foram realizados segundo o protocolo do Laboratório de Referência Nacional (Fiocruz/RJ). Dois protocolos de PCR in house em condições específicas foram realizados, uma reação
monoplex (iniciadores G1/G2) e uma reação duplex (iniciadores LipL41F/R e flaβF/R). O real-time PCR foi otimizado usando os iniciadores
LipL32-45F/LipL32-286R e as sondas LipL32-189PFAM e RNAseP3FAM. O real-time PCR amplificou unicamente os sorovares patogênicos de Leptospira spp. A sensibilidade foi equivalente a quatro cópias do DNA genômico. Os produtos obtidos pelo real-time PCR que apresentaram Ct. 36 e/ou amostras com mais de 15 dias de curso da doença foram sequenciados pela plataforma ABI 3730. Os resultados foram traduzidos pelo programa Bioedit e as sequências de DNA/FASTA foram alinhadas pelo BLAST. Para verificar a soroprevalência de sorovares de Leptospira spp. foram analisados dados secundários de resultados de MAT de soros encaminhados ao Lacen/MG no período de 2008 a 2012. A caracterização molecular do DNA das cepas de referência de
Leptospira spp. foi realizada pela técnica de Low Stringency Single Specific Primer (LSSP-PCR). Os perfis gerados de 22 cepas de referência foram
agrupados por similaridade do DNA utilizando o software Bionumerics, versão 7.1. Resultados: A doença predominou em indivíduos jovens e adultos com maior ocorrência em homens. Os métodos utilizados isoladamente para o diagnóstico da leptospirose (MAT, ELISA-IgM, Cultura, PCR Monoplex, PCR
Duplex e PCR em Tempo Real) apresentaram positividade de 16,7%, 20,5%,
1,3%, 9%, 13% e 10,3% respectivamente; quando combinados, chegaram a 33,5% de positividade. Os métodos sorológicos apresentam maior positividade que os métodos moleculares, exceto quando considerado o curso de doença no intervalo de 0 – 4 dias, neste intervalo, o real-time PCR apresentou maior positividade. Análise dos dados secundários mostrou maior frequência para o sorovar Icterohaemorrhagiae pelo MAT. Com dois iniciadores (flaβF1 e LipL41F) foi possível a diferenciação de 13 sorovares e o agrupamento de duas cepas isoladas no Lacen/MG. Assim, esses resultados nos permitiu inferir que o LSSP-PCR pode ser uma ferramenta útil para identificação de possíveis sorovares infectantes em casos de surtos e epidemias. Conclusão: Os dados afirmam sobre a importância da realização dos métodos estudados no intervalo adequado do curso da doença, com aumento da positividade dos exames laboratoriais. Destaca-se o potencial do real-time PCR combinado aos outros métodos para o diagnóstico da leptospirose humana, em especial no início da doença, momento de extrema importância para o seu manuseio clínico.
Palavras-chave: Leptospirose, Leptospira sp. Teste de Aglutinação Microscópica, ELISA-IgM, real-time PCR, Diagnóstico laboratorial
ABSTRAT
Introduction: Leptospirosis is an infectious and acute disease caused by leptospira spp. The disease has variable clinical features and is difficult to diagnose. Therefore, laboratory and epidemiological approaches are required to improve the detection of leptospirosis. Culture and serological methods have been used for laboratory diagnosis of leptospirosis from the end of the first week of the disease. These methods do not allow for an early diagnosis. Most cases in which patients progressing to death or not there is the opportunity of the second sample collection are not confirmed by immunological methods. Thus, our objective was to evaluate different laboratory methods for the diagnosis of leptospirosis, verify the occurrence of Leptospira spp. and genetic characterization the Leptospira spp. from the detected DNA samples from patients with suspected leptospirosis in Minas Gerais, Brazil, from 2008 to 2014. Methods: Samples of 78 patients were examined by the Enzyme Linked Immunosorbent Assay method (ELISA-IgM), Microscopic Agglutination Test (MAT), specific Polymerase Chain Reaction (PCR) in house using three different pairs of primers, and the Real Time PCR. The ELISA-IgM was performed with Panbio kits, following the manufacturer’s recommendations. The MAT and the culture were made under the National Reference Laboratory (Fiocruz/RJ) protocol. Two specific PCR were performed, one monoplex reaction (G1/G2 primers) and another duplex reaction (LipL41 F/R and flaβF/R primers). The Real Time PCR was optimized using the primers LipL32-45F/LipL32-286R and the probes LipL32-189PFAM and RNAseP3FAM. These primers’ specificity resulted in the amplification only from pathogenic serovars of Leptospira spp. The sensibility was equivalent to four genomic DNA copies. Products obtained by real-time PCR that showed Ct. greater than 36 and/or samples with more than 15-day disease course were sequenced by ABI platform 3730. The results were translated by BioEdit program and DNA/FASTA sequences were aligned using the BLAST database. Secondary data from MAT results were used to verify the Leptospira spp. seroprevalence from serum samples sent to Lacen-MG from 2008 to 2012. DNA molecular characterization from reference strains
the technique Low Stringency Single Specific Primer (LSSP-PCR). The profiles generated from 22 reference strains maintained in Lacen-MG were grouped by similarity of DNA using the BioNumerics software, version 7.1. Results: Our results support that the disease predominates in young people and adults with higher incidence in men. The methods separately used to leptospirosis diagnostics (MAT, ELISA-IgM, Culture, Monoplex PCR, Duplex PCR and Real Time PCR) presented a positivity of 16,7%; 20,5%; 1,3%; 9%; 13% and 10,3% respectively, when combined, they showed 33,5% positivity. The serologic methods presented a bigger positivity than the molecular methods, except when considered the disease evolution at the 0 – 4 days interval. The real-time PCR presented the best positivity results in this interval. The analysis of secondary data from MAT results showed higher frequency for the serovar Icterohaemorrhagiae. With two primers (flaβF1 and LipL41F) was possible differentiate 13 serovars and grouping by DNA similarity of strain isolated from patients which allowed us to consider the LSSP-PCR method a useful tool for identification of infectious serovars in cases of outbreaks and epidemics. Conclusion: Our results showed the importance of the studied methods’ execution in the appropriate disease evolution interval, what elevates the positivity of laboratory exams. We highlight the potential of real-time PCR when combined with other methods in order to diagnosis the human leptospirosis, in special, at the disease initial phase, the important moment in the disease clinical handling.
Keywords: Leptospirosis, Leptospira sp. Microscopic Agglutination Test, ELISA-IgM, real-time PCR, Laboratory diagnosis.
LISTA DE FIGURAS F
FIIGGUURRAA 1 - Porcentagem de exposição à situação de risco dos 78 1 pacientes com suspeita clínica de leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período de 12/2011 a 03/2014... 35 F
FIIGGUURRAA 2 - Porcentagem de sinais e sintomas clínicos apresentados 2 pelos 78 pacientes com suspeita clínica de leptospirose em Minas
Gerais, Brasil, no período de 12/2011 a
03/2014... 36 F
FIIGGUURRAA 3 - Gel de agarose 1%, corado por brometo de etídio, 3 iniciadores G1/G2 (fragmento 285 pb)... 43 F
FIIGGUURRAA 4 - Gel de agarose 2%, corado por brometo de etídio, 4 iniciadores LipL41F/R-flaBF/R (fragmentos 520 pb e 793 pb)... 44 F
FIIGGUURRAA 5 - Gel de agarose 1%, corado por brometo de etídio, 5 iniciadores L41 F/R e flaβ F/R (LMD)... 45 F
FIIGGUURRAA 6 - Curva padrão da sensibilidade analítica do real-time PCR, 6 Limite Mínimo de Detecção (LMD)... 47 F
FIIGGUURRAA 7 - Demonstração da avaliação da especificidade dos 7 iniciadores LipL32-45F e LipL32-286R realizada com 24 sorovares de
Leptospira spp. e 11 cepas de diferentes espécies bacterianas... 48 F
FIIGGUURRAA88 - Alinhamento de sequências, 528/13-3 e gene lipL 32... 49 F
FIIGGUURRAA99-- Alinhamento de sequências, 813/13 e gene lipL 32... 50 F
FIIGGUURRAA1100-- Alinhamento de sequências, 173/14 e gene lipL 32... . 50 F
FIIGGUURRAA 1111 -- Alinhamento de sequências, sorovar Copenhageni, cepa M20 e gene lipL 32... 51 F
FIIGGUURRAA 1122 -- Fluxograma do diagnóstico sorológico de pacientes com suspeita clínica de leptospirose... 52 F
FIIGGUURRAA 113 - Distribuição espacial dos casos de leptospirose 3 confirmados por diagnóstico laboratorial em Minas Gerais no período de 2008 a 2012... 53 F
FIIGGUURRAA 114 - LSSP-PCR: Gel de agarose 2%, corado por brometo de 4 etídio com iniciador fla F1... 54 F
etídio com iniciador LipL41F... 55 F
FIIGGUURRAA 116 - LSSP-PCR: dendograma mostrando a reprodutibilidade 6 dos perfis gerados pelo iniciador flaβF1 dos sorovares Icterohaemorrhagiae, Panama, Shermani, e Tarassovi... 56 F
FIIGGUURRAA 117 - LSSP-PCR: dendograma mostrando a reprodutibilidade 7 dos perfis gerados pelo iniciador LipL41F dos sorovares Icterohaemorrhagiae, Panama, Shermani, e Tarassovi... 56 F
FIIGGUURRAA 118 - Dendograma mostrando a similariadade genética do 8 fragmento gerado pelo iniciador flaβF1 pelo método de LSSP-PCR de 22 sorovares de Leptospira sp... 57 F
FIIGGUURRAA 119 - Dendograma mostrando a similariadade genética do 9 fragmento gerado pelo iniciador LipL41F pelo método de LSSP-PCR de 22 sorovares de Leptospira sp... 58 F
FIIGGUURRAA 2200 - LSSP-PCR: Gel de agarose 2%, corado por brometo de -etídio, iniciadores flaBF1 e LipL41F, cepas 528/13 e 949/14... F
FIIGGUURRAA 221 - Dendograma mostrando a similaridade genética do 1 fragmento gerado pelo iniciador flaBF1 pelo método de LSSP-PCR entre as cepas de referência e as cepas isoladas de pacientes...
59
60 F
FIIGGUURRAA 222 - Dendograma mostrando a similaridade genética do 2 fragmento gerado pelo iniciador LipL41F pelo método de LSSP-PCR entre as cepas de referência e as cepas isoladas de pacientes... 61
LISTA DE QUADROS Q
QUUAADDRROO 1 - Concentração final de DNA, número estimado de cópias 1 genômicas e a média dos Ct. obtidos para cada diluição indicada... 46
LISTA DE TABELAS T
TAABBEELLAA 1 - Sorovares utilizados como antígenos na reação de 1 MAT... 24 T
TAABBEELLAA 2 – Distribuição por sexo e idade de pacientes com suspeita 2 clínica de leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período de 12/2011 a 03/2014... 34 T
TAABBEELLAA 3 - Número total de amostras examinadas de pacientes com 3 suspeita clínica de leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período de 12/2011 a 03/2014 distribuídos pelo tempo de evolução da doença... 37 T
TAABBEELLAA 4 - Total de resultados positivo, reagente/indeterminado e não 4 reagente/negativo obtidos pelos diferentes métodos utilizados para o diagnóstico da leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período de 12/2011 a 03/2014... 38 T
TAABBEELLAA 5 - Número de exames positivos de pacientes com suspeita 5 clínica de leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período de 12/2011 a 03/2014, obtidos por diferentes métodos laboratoriais, considerando o tempo de evolução da doença... 39 T
TAABBEELLAA 66 - Combinação da positividade de MAT e ELISA-IgM das amostras sorológicas de pacientes com suspeita clínica de leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período de 12/2011 a 03/2014... 40 T
TAABBEELLAA 7 - Combinação da positividade de MAT e PCR das amostras 7 sorológicas de pacientes com suspeita clínica de leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período de 12/2011 a 03/2014... 41 T
TAABBEELLAA 88 - Combinação da positividade do ELISA-IgM e PCR das amostras sorológicas de pacientes com suspeita clínica de leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período de 12/2011 a 03/2014... 42 T
TAABBEELLAA 9 - Homologia do alinhamento entre as sequências obtidas de 9 amostras de pacientes e do gene da lipoproteína de membrana externa
LISTA DE ABREVIATURAS/SIMBOLOS ag – Acograma.
cols – Colaboradores.
Ct – Threshold cycle.
ELISA – Ensaio imunoenzimático.
EMJH – Ellinghausen e MacCullogh, modificado por Johnson e Harris (meio de cultura).
DNA – Ácido desoxirribonucleotídico.
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético
fg – Fentograma.
Fiocruz – Fundação Oswaldo Cruz.
Funed – Fundação Ezequiel Dias
GAL – Gerente de ambiente laboratorial (cadastro de amostras biológicas) °C – Grau centigrado
IgG - Imunoglobulina G.
IgM – Imunoglobulina M.
Lacen-MG – Laboratório Central de Saúde Pública do Estado de Minas Gerais.
LMD – Limite Mínimo de Detecção
LSSP – Low Stringency Single Specific Primer.
– Maior ou igual a.
MAT – Teste de Aglutinação Microscópica.
MG – Mina Gerais
MLST – Multilocus Sequece Typing. µL – microlitro.
µM – Micromolar. mM – Milimolar.
MPM – Marcador de peso molecular.
MS – Ministério da Saúde. N°/n. – Número.
ng – Nanograma.
Nm – Nanomoles.
OMS – Organização Mundial da Saúde.
OPAS – Organização Panamericana de Saúde.
p. – Página.
PBH – Prefeitura de Belo Horizonte.
pb. – Pares de bases nucleotídicas.
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase.
PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis.
pg – Picograma. pH – Potencial hidrogeniônico. pmoles – Picomoles. % – Porcentagem. Pos. – Positividade. Prof°/Profª – Professor/(a).
qPCR – Reação em cadeia da polimerase quantitativa.
RJ – Rio de Janeiro.
RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism.
SDBF – Serviço de Doenças Bacterianas e Fúngicas.
SPSS - Statistical Package for the Social Sciences.
sp – Uma única espécie.
spp – Várias espécies.
Taq – Termus aquaticus (enzima DNA polimerase).
U – Unidade.
UPA – Unidade de pronto atendimento.
v. – Volume.
VNTR – Variable Number Tandem Repeats.
VPN – Valor preditivo negativo.
VPP – Valor preditivo positivo.
SUMÁRIO
1. Considerações iniciais 1
2. Introdução 2
3. Revisão de Literatura 4
3.1. Breve Histórico 4
3.2. Agente Etiológico – taxonomia, morfologia e cultivo 5
3.3. Epidemiologia da Leptospirose 7
3.4. Transmissão 9
3.5. Infecção e evolução clinica 9
3.6. Diagnóstico 11
3.7. Tratamento 15
3.8. Prevenção e controle 16
3.9. Identificação e caracterização genética de Leptospira spp. 17
4. Objetivo geral 19
4.1. Objetivos específicos 19
5. Metodologia 20
5.1. Cálculo amostral, critério de inclusão e coleta de dados laboratoriais,
clínicos e epidemiológicos 20
5.1.1. Avaliação do impacto nos resultados laboratoriais quando utilizados diferentes métodos para o diagnóstico da leptospirose em Minas Gerais,
Brasil, no período de 12/2011 a 03/2014. 20
5.1.2. Análise de informações clínicas e epidemiológicas de 78 pacientes com suspeita clínica de leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período
de 12/2011 a 03/2014 obtidos da ficha SINAN-MS 21
5.1.3. Verificação da soroprevalência de sorovares de Leptospira spp. detectados pelo MAT em amostras de soro encaminhadas ao Lacen/MG
no período de 2008 a 2012 21
5.2. Fluxo de amostras encaminhamento ao Lacen-MG 22
5.3. Caracterização das amostras 22
5.4. Coleta das amostras 23
5.5. Cultivos de Leptospira sp. a partir de amostra de sangue 23
5.7. Reação de Soroaglutinação Microscópica 25
5.8. Ensaio Imunoenzimático - ELISA- IgM 25
5.9. Extração de DNA 26
5.10. Reação em Cadeia da Polimerase em condições específica (PCR in
house) 26
5.11. Determinação da sensibilidade e especificidade das PCR in house 27 5.12. Verificação de inibidores da Reação em Cadeira da Polimerase
presentes em soro humano 27
5.13. Análise dos produtos amplificados 28
5.14. Real-time PCR 28
5.14.1. Determinação do limite mínimo de detecção do real-time PCR 28
5.15. Análise estatística 29
5.16. Sequenciamento de DNA real-time PCR positivo 29 5.17. Caracterização molecular do DNA de cepas de referência de
Leptospira spp. e cepas isoladas de amostras de pacientes 30
5.18. Análise dos produtos amplificados 31
5.19. Análise de dados - software BioNumerics 31
6. Resultados 33
6.1. Informações clínicas e epidemiológicas de 78 pacientes com suspeita clínica de leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período de 12/2011 a
03/2014 obtidos da ficha do SINAN-MS 33
6.2. Resultados obtidos por diferentes métodos laboratoriais de 78 pacientes com suspeita clínica de leptospirose em Minas Gerais, Brasil,
no período de 12/2011 a 03/2014 36
6.3. Concordância obtida entre os diferentes métodos laboratoriais
analisada segundo o tempo de evolução da doença de 78 pacientes com suspeita clínica de leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período de
12/2011 a 03/2014 39
6.4. Padronização dos métodos moleculares usados para o diagnóstico
de leptospirose 42
6.5. Soroprevalência de sorovares de Leptospira spp. obtida da análise de dados secundários (MAT) de amostras encaminhados ao Lacen-MG no
período de 2008 a 2012 51 6.6. Caracterização molecular do DNA de cepas de referência de
Leptospira spp. por LSSP-PCR 56
7. Discussão 62
8. Conclusões 70
9. Limitações 71
10. Referências bibliográficas 72 11. Apêndice 1. Real-time PCR improves early diagnosis of human
leptospirosis in Minas Gerais, Brazil 87
12. Apêndice 2. Human leptospirosis: occurrence of serovars of
Leptospira spp. in the state of Minas Gerais, Brazil, from 2008 to 2012 101 13. Apêndice 3. Diagnosis of human leptospirosis through molecular methods at the immunogenic stage of the disease. 107
14. Anexo 1. Parecer consubstanciado do CEP 114
1. CONSIDERAÇÕES INICIAIS
A motivação para a realização deste estudo decorre da necessidade de obter maior acurácia para o diagnóstico laboratorial da leptospirose e para identificação de sorovares de Leptospira.
As dificuldades encontradas para a confirmação dos casos de leptospirose pelos critérios clínicos e epidemiológicos requerem apoio laboratorial para que a abordagem terapêutica da leptospirose não seja retardada, além de possibilitar a sua prevenção e controle, e o conhecimento sobre a ocorrência e distribuição dos sorovares de Leptospira em Minas Gerais A parte experimental deste projeto foi desenvolvida na Fundação Ezequiel Dias, com o apoio e o interesse institucional em aplicar os protocolos padronizados, visando oferecer novos serviços à população atendida pelo Sistema Único de Saúde (SUS) quanto ao diagnóstico laboratorial da leptospirose.
2. INTRODUÇÃO
A leptospirose é uma doença icteroinfecciosa e febril causada por espiroquetas do gênero Leptospira spp. e está entre as doenças negligenciadas listadas pela Organização Mundial de Saúde/OMS (Guia de Vigilância Epidemiológica, 2009, Guia de Vigilância em Saúde, 2014). No Brasil, as áreas mais afetadas são os centros urbanos (FIGUEIREDO e cols., 2001, BARCELOS & SABROZA, 2001, SARKAR e cols., 2002). Dados clínicos e epidemiológicos indicam que a doença é endêmica em todo o país, tornando-se epidêmica em períodos chuvosos (GONÇALVES e cols., 1992, KO e cols., 1999, VIJAYACHARI e cols., 2008).
A transmissão da doença para humanos ocorre pelo contato direto com sangue, tecidos, órgãos e urina de animais infectados, ou pelo contato indireto com água ou solo contaminados (MICHNA, 1970, FAINE, 1982).
As manifestações clínicas da leptospirose variam de brandas até graves, o que dificulta o diagnóstico clínico, sendo indispensável a abordagem epidemiológica e laboratorial para a conclusão dos casos suspeitos (DOUDIER e cols., 2006, SEHGAL, 2010, Guia de Vigilância em Saúde, 2014).
Os métodos disponíveis para o diagnóstico desta doença no Brasil se resumem na detecção de anticorpos a partir da primeira semana do início das manifestações clínicas e no cultivo do agente etiológico, e não permitem o seu diagnóstico precoce. A confirmação laboratorial pelos métodos imunológicos ou por isolamento bacteriano não é observada na maioria dos casos suspeitos em que os pacientes evoluem ou não para óbito. A indisponibilidade de amostras pareadas é limitação adicional ao diagnóstico imunológico. A cultura, além de baixa sensibilidade, demanda cerca de três a seis meses para ser finalizada, expressando valor quase que unicamente epidemiológico (WUTHIEKANUN e cols., 2007).
Em Minas Gerais, assim como em outros estados do Brasil, as doenças febris agudas como dengue, influenza, riquetsiose, hantavirose, meningite, febre tifoide, sepse, entre outras incluindo a leptospirose, são de difícil
diferenciação pela similaridade do quadro clínico e pela sobreposição da sazonalidade (BRUCE e cols., 2005, SOUZA e cols., 2007).
A leptospirose é subnotificada e não se sabe o número real de óbitos ocorrido em todo o país. Entre os anos de 1991 a 2000, foram confirmados no Brasil 34.142 casos de leptospirose, dos quais, 3.271 evoluíram para óbito (Guia de Vigilância Epidemiológica, 2009). No período de 2000 a novembro de 2015, foram confirmados 60.012 casos com 5.777 óbitos (http://portalsaude.saude.gov.br/index.php/situacao-epidemiologica-dados acesso 15/01/2016).
A relevância detse estudo está pautada nas dificuldades encontradas para o correto e pronto diagnóstico de casos de leptospirose, especialmente naqueles em que os pacientes evoluem precocemente a óbito ou que não há a oportunidade da coleta de segunda amostra. Espera-se que o uso combinado de metodologias microbiológicas, imunológicas e moleculares contribua para a conclusão laboratorial dos casos suspeitos, diagnóstico precoce, tratamento adequado, identificação dos sorovares infectantes e a associação com os principais reservatórios.
3. REVISÃO DA LITERATURA 3.1. Breve Histórico
A leptospirose foi descrita pela primeira vez em 1880, no Cairo, por Larrey (MANUAL DE LEPTOSPIROSE,1997) e, posteriormente, por Landouzy, em 1883, mas permaneceu a descrição feita por Adolf Weil em 1886, que separou a leptospirose do grupo de infecções com manifestação ictérica (AREAN, 1962). Mathieu e Weil, em 1886, descreveram a leptospirose como uma síndrome icteroinfecciosa e febril, mas a causa não foi determinada (MATHIEU, 1886, WEIL, 1886).
O agente etiológico foi visualizado pela primeira vez em corte de tecido renal de paciente que morreu supostamente por febre amarela (STINSON,1907, AREAN, 1962). A busca para evidenciar o agente etiológico da leptospirose intensificou-se em 1913 e 1914, mas somente em fevereiro de 1915 foi anunciada a descoberta do “Spirochaeta da doença de Weil”. O agente foi cultivado, caracterizado por Inada e Ido e denomindo Spirochaeta
icterohaemorrhagiae (INADA e cols., 1916). Após o sucesso do isolamento do
agente, foi desenvolvido um método sorológico para o diagnóstico da doença com base na propriedade aglutinante do soro de pacientes acometidos pela leptospirose (MARTIN & PETIT, 1917). As limitações dos métodos sorológicos e a dificuldade da interpretação dos resultados são reportadas há décadas, destacando a importância da qualidade e quantidade da amostra biológica obtida no tempo adequado do curso da infecção para a realização do exame (TURNER, 1969).
A leptospirose é uma das zoonoses de maior ocorrência em todo o mundo. A doença acomete homens, animais domésticos e selvagens, sendo caracterizada por uma ampla vasculite. O primeiro relato da leptospirose bovina foi publicado em 1935, isolada a partir de vitelos com infecção aguda (AMATREDJO CAMPBELL, 1975). O primeiro isolamento de L. hardjo em gado foi feito por Roth e Galton em 1960, nos Estados Unidos, mais tarde no Canadá por Robertson e cols., em 1964. Na Austrália, o primeiro isolamento de L.
hardjo foi feito por Sullivan e Stallman em 1969.
primeiros trabalhos no Brasil foram realizados nas cidades do Rio de Janeiro e São Paulo, por Aragão e Carini, que demonstraram a presença do micro-organismo em ratos (ENRIETTI, 2001, LEMOS e cols., 2010).
O primeiro caso de leptospirose em seres humanos ocorreu no Paraná e foi oficialmente notificado em 1917. Em 1930, foi registrado oficialmente o primeiro caso de leptospirose humana ocorrido em São Paulo, confirmado pelo inóculo de sangue de paciente infectado em cobaias, reproduzindo experimentalmente a doença. Em 1940, a presença de Leptospira spp. em cães com manifestações clínicas compatíveis com leptospirose foi descrita no Rio de Janeiro (BROD e cols., 2005). Relatos de surtos epidêmicos no Rio Grande do Sul e Paraná ocorreram em 1942 (ENRIETTI, 2001). Investigações realizadas no Instituto Biológico de São Paulo avaliaram a importância de diferentes espécies na manutenção e transmissão da doença humana (SOTO e cols., 2007).
3.2. Agente Etiológico – taxonomia, morfologia e cultivo
A leptospirose é causada por bactérias pertencentes à ordem
Spirochaetales, família Leptospiraceae, gênero Leptospira. Segundo o Manual
de Sistemática bacteriológica (BERGEY e cols., 1984) a família Leptospiraceae compreende dois gêneros: Leptospira e Leptonema. O gênero Leptospira é dividido em duas espécies: L. interrogans, agrupando os sorovares patogênicos, e L. biflexa, agrupando os não patogênicos (saprófitas). As duas espécies são diferenciadas pela capacidade de crescimento a 13oC na
presença de 8-azaquanina e pela incapacidade da L. biflexa de formar células esféricas na presença de NaCl 1M (LEVETT, 2001; JOHNSON & HARRIS, 1967). A classificação de leptospiras é feita empregando a reação de soroaglutinação microscópica com base na variação antigênica e absorção de aglutininas. Cepas com similaridades antigênicas são agrupadas em sorogrupos e diferenciadas em sorovares. Existem 25 sorogrupos, que agrupam mais de 260 sorovares patogênicos descritos (LEVETT e cols., 2001, CERQUEIRA & PICARDEAU, 2009). Cepas que apresentam pequenas diferenças antigênicas são classificadas como pertencentes a um mesmo
sorovar (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003). Com o avanço dos estudos moleculares, uma nova proposta de classificação destes micro-organismos tem tomado o lugar da classificação fenotípica. As espécies de leptospiras, nesta abordagem, são denominadas espécies genômicas. Vários estudos têm estabelecido diferentes espécies além de L. interrogans e L.
biflexa, com base na homologia do DNA e o conteúdo de G+C. (YASUDA e
cols., 1987, RAMADASS e cols., 1992). As espécies genômicas foram definidas como um grupo de sorovares de Leptospira spp. cujo DNA é hibridizado 70% ou mais à temperatura de 55°C; hibridizados 60% ou mais à temperatura de 70°C; além dos DNA não poderem ultrapassar a taxa de 5% de desemparelhamento de bases nucleotídicas. Atualmente, os métodos moleculares já permitiram a identificação de 14 genomoespécies patogênicas e patogênicas intermediárias e sete espécies não patogênicas de Leptospira (KAUFMANN e cols., 2006 acesso 10/03/2014, ROMERO-VIVAS e cols., 2013, LEVETT, 2015). A classificação baseada na homologia do DNA tem sido usada em conjunto com a antigênica, mesmo não tendo relação direta. Sorovares patogênicos e não patogênicos podem ser descritos na mesma genomoespécie (LEVETT, 2001, CERQUEIRA & PICARDEAU, 2009).
As leptospiras são bactérias helicoidais, flexíveis e móveis, medindo de 6 a 20 m de comprimento e cerca de 0,1 m de diâmetro. Apresentam corpo citoplasmático com dois filamentos axiais enrolados em espiral (flagelos periplasmáticos) com inserções polares, ambos envolvidos por uma membrana externa denominada envelope. As leptospiras têm extremidades em forma de gancho (FAINE, 1982, BERGEY e cols., 1984, WOLGEMUTH e cols., 2006). A morfologia bacteriana e o movimento de saca-rolhas (BINDER e cols., 1998) dos dois flagelos favorecem sua penetração ativa nos tecidos dos hospedeiros. São aeróbias obrigatórias, quimiorganotróficas e utilizam ácidos graxos de cadeia longa saturada e insaturada como fonte de energia e carbono (BERGEY e cols., 1984, FAINE e cols., 1999, LEVETT, 2001). Crescem em meios complexos de Fletcher (FLETCHER, 1928) e Stuart (STUART, 1946) acrescidos com 8-10% de soro de coelho ou Ellinghausen-MacCullogh-Johnson-Harris (EMJH), acrescidos de albumina bovina e ácidos graxos
(ELLINGHAUSEN e cols., 1965). Apresentam crescimento ótimo entre 28 e 30°C em pH 6,8-7,8 e o tempo de geração varia de 5-20 horas (BERGEY e cols., 1984, MYERS, 1985).
3.3. Epidemiologia da Leptospirose
Na última década, a leptospirose emergiu como doença infecciosa de importância global, ocorrendo em áreas urbanas de países industrializados e em desenvolvimento, bem como em regiões rurais em todo o mundo (BHART e cols., 2003).
A manutenção da leptospirose em regiões urbanas e rurais do Brasil é favorecida pelo clima tropical úmido e vasta população de roedores (BARCELOS e cols., 2003, JESUS e cols., 2012, LIMA e cols., 2012). Dados clínicos e epidemiológicos indicam que a doença é endêmica em todo o país. (GONÇALVES e cols., 1992, DIAS e cols., 2007). A revisão sistemática dos fatores associados à leptospirose no Brasil no período de 2000-2009, relatou que 78,8% dos casos acometeu o sexo masculino; e 61,2% a faixa etária compreendida de 20 a 49 anos. No Brasil, de 2001 a 2003, do total de 3.747 casos confirmados laboratorialmente 72,0% ocorreram em área urbana (PELISSARI e cols., 2011).
No Rio Grande do Sul, a diversidade das situações de exposição, reservatórios, agentes etiológicos e manifestações clínicas mostraram a diversidade socioambiental do seu acometimento. (BARCELOS e cols., 2003). Observou-se que em São Paulo a doença ocorre em todo o seu território com maior frequência (68,5%) na Grande São Paulo, devido à alta densidade populacional, à falta de saneamento básico, baixos níveis socioeconômicos e o aumento da precipitação pluviométrica (ROMERO e cols., 2003).
Em Salvador, Bahia, observou-se que a soroprevalência foi inversamente associada ao aumento da escolaridade e ao aumento de renda. A soroprevalência observada tem níveis mais elevados entre as populações que vivem em áreas consideradas de alto risco, onde a leptospirose é hiperendêmica ou onde há alto grau de exposição devido à ampla circulação do agente (DIAS e cols., 2007). Em Belo Horizonte, Minas Gerais, grande parte de
casos confirmados mostram estreita correlação com a falta de serviços de esgoto e a ocorrência de favelas (FIGUEIREDO e cols., 2001). O controle da população de roedores e da incidência da leptospirose exige desde manejo ambiental, urbanização de favelas, drenagem e canalização de córregos e rios, a ações simples como a limpeza de bueiros e a destinação adequada do lixo urbano (FIGUEIREDO e cols., 2001). No entanto, em Minas Gerais, os dados existentes são insuficientes para associar a importância dos diferentes hospedeiros com a ocorrência da leptospirose humana.
O ambiente familiar parece constituir determinante importante na transmissão da doença nas favelas urbanas, sendo provavelmente consequência das precárias condições ambientais existentes no domicílio e peridomicílio, que, aliadas à altas infestações de roedores, favorecem o risco de exposição humana, o que acontece nas principais cidades do Brasil (SOARES e cols., 2010, PELISSARI e cols., 2011).
A leptospirose é considerada doença emergente em todo o mundo, entretanto apenas 50% dos países das Américas mantêm política de notificação do agravo. Ocorrem cerca de 320.000 casos anualmente no mundo, sendo que as Américas contribuem com 10% deste valor e o Brasil com mais de 28.000 casos. A maioria dos países das Américas não faz notificação regular, entretanto a doença tem impacto importante na saúde de suas populações. A falta de notificação regular por parte de muitos países fragiliza as ações de vigilância em saúde e impede o conhecimento do verdadeiro impacto da doença nessas regiões (COSTA e cols., 2012). No mundo, a doença é endêmica principalmente no Caribe, América Central e do Sul, bem como no Sudeste Asiático e Oceania (PAPPAS e cols., 2008).
Embora, grandes avanços tenham sido alcançados na pesquisa básica sobre a leptospirose, o desafio atual é traduzir esses avanços em medidas de prevenção e controle da doença, principalmente em países em desenvolvimento. Neste cenário, as respostas mais eficazes podem ser intervenções diretas nos determinantes de pobreza, muitas vezes, responsáveis pela transmissão e manutenção da doença.
3.4. Transmissão
No homem, a doença resulta principalmente da exposição direta com espécime biológico de animal infectado ou indiretamente, através do contado com água e solo contaminados com urina de animais portadores ou doentes. As principais vias de contaminação estão relacionadas com a atividade laboral (BELMACHER e cols., 2004, NÁJERA e cols., 2005, LUPI e cols., 2013), recreativa (GROBUSH e cols., 2003, BOLAND e cols., 2004) e acidental (KO e cols., 1999, FIGUEIREDO e cols., 2001).
Vários animais estão relacionados como fontes de infecção. As
Leptospira patogênicas são amplamente distribuídas na natureza, se mantendo
nos rins de diversos hospedeiros reservatórios silvestres e domésticos. A importância de cada espécie de Leptospira na infecção humana varia de acordo com as atividades laborais, condições e hábitos de vida da população. Pequenos mamíferos são os reservatórios mais importantes; os grandes herbívoros também aparecem como fontes significativas de infecção. (MICHNA, 1970, LEVET e cols., 2015).
3.5. Infecção e evolução clínica
A entrada de leptospiras no organismo do hospedeiro é facilitada pelo seu movimento ativo. A bactéria penetra na pele lesada (microabrasões e cortes), na pele íntegra após imersão prolongada em água contaminada ou em mucosas sadias (LEVETT, 2001, ROSARIO FERNANDEZ e cols., 2012). Após a penetração, as leptospiras atingem a corrente sanguínea e, passadas as primeiras 48 horas, podem atingir todos os tecidos. Por quimiotaxia, alcançam diferentes órgãos e tecidos com localização especial no fígado, rim, coração, músculo esquelético, meninges e olhos (YURI e cols., 1993, MAROTTO e cols., 2010).
A fase aguda da leptospirose é considerada até o décimo quarto dia após o início dos primeiros sinais e sintomas. A doença é bifásica: a primeira fase dura de quatro a sete dias, período que o microrganismo pode ser isolado do sangue e do líquido cefalorraquidiano de indivíduos infectados. A segunda fase pode durar de quatro a trinta dias e é caracterizada por leptospirúria e
presença de anticorpos no soro (AREAN, 1962, FAINE, 1982, DAHER e cols., 2010).
A sua sintomatologia clássica, seja na forma ictérica ou anictérica é ampla e caracterizada por: febre, calafrios, mialgia generalizada, cefaléia, dor retro - orbital, podendo ser acompanhados de complicações renais, hemorrágicas, cardíacas, respiratórias, oculares, entre outras.
Cerca de 10 a 15% dos casos evoluem para a forma mais grave da doença, que pode apresentar-se como a tríade bem conhecida de: icterícia, insuficiência renal e hemorragia (doença de Weil). O comprometimento renal é complicação frequente nos pacientes com a forma grave da leptospirose. A mortalidade nos casos de leptospirose grave, causada por insuficiência renal e cardíaca é de 5 a 15%, enquanto que a forma pulmonar grave e insuficiência respiratória provocam mais de 50% das mortes. (HELMERHORST e cols., 2012, COSTA e cols., 2012). A forma pulmonar grave é menos conhecida e é caracterizada por hemorragia intralveolar e pode levar à insuficiência respiratória aguda e morte. O prognóstico está relacionado com a gravidade e sobrevivência do paciente e inclui indicadores de insuficiência renal, acometimento pulmonar e desequilíbrio eletrolítico (SPICHLER e cols., 2008, HELMERHORST e cols., 2012). Pacientes com leptospirose e insuficiência respiratória aguda (IRA) apresentam diátese hemorrágica, insuficiência hepática, insuficiência respiratória, insuficiência circulatória, pancreatite e rabdomiólise (DAHER e cols., 2010). Existe associação frequente entre insuficiência renal e lesão pulmonar. O comprometimento cardíaco na leptospirose parece contribuir pouco no processo de edema pulmonar da doença, mas, são frequentes os casos de coexistência de lesões pulmonares e cardíacas (FONTES e cols., 2010).
Hemoptise maciça e síndrome de angústia respiratória aguda (SARA) têm sido descritas como as principais causas de óbito na leptospirose (GONCALVES e cols., 1990 e 1992). O estado hemodinâmico e as alterações na maioria dos pacientes com leptospirose grave são semelhantes ao que se observa na sepse (DAHER e cols., 2010). A leptospirose pode ser considerada doença sistêmica em que a resposta imune está implicada no seu agravamento
pela formação de complexos imunes, liberação de citocinas e promoção da vasculite. Tais danos são responsáveis pelo edema e diátese hemorrágica, que afetam principalmente os capilares dos rins, pulmões e fígado (CINCO e cols., 2006, MEDEIROS e cols., 2010, ROSARIO FERNANDEZ e cols., 2012).
A cura da leptospirose acontece geralmente a partir da segunda semana após o início da infecção com o aparecimento de anticorpos circulantes e o desaparecimento da bacteriemia. Há poucos relatos que sugerem que a leptospirose pode induzir a sintomas crônicos. Nenhum estudo até o momento confirmou a persistência de Leptospira spp. nos tecidos de pacientes que tenham morrido por outras causas (LEVETT e cols., 2001).
3.6. Diagnóstico
A leptospirose apresenta manifestações clínicas que variam desde benignas a graves. Essas variações dificultam o diagnóstico clínico sendo indispensável abordagens epidemiológica e laboratorial para a sua determinação. (SPICHLER e cols. 2008, DAHER e cols. 2010). O diagnóstico muitas vezes não é feito devido às manifestações clínicas mínimas ou inaparentes. Cerca de 90% dos casos são diagnosticados como doença febril de origem indeterminada (BUDIHAL & PERWEZ, 2014). A leptospirose deve sempre ser incluída no diagnóstico diferencial de outras doenças febris agudas. O diagnóstico clínico da leptospirose e a compreensão do curso da doença são importantes na seleção das amostras biológicas para o diagnóstico laboratorial (FAINE, 1982).
Existem vários métodos sorológicos para o diagnóstico laboratorial da leptospirose, sendo os principais, o teste de aglutinação microscópica (MAT), a aglutinação macroscópica (SAT) (BRANDÃO e cols., 1998), a aglutinação em látex (OBREGON e cols., 2007), hemaglutinação indireta (IHA) (LEVETT & WHITTINGTON, 1998), a aglutinação em microcápsula, a imunofluorescência (RIA), a contraimunoeletroforese (HAMAD e cols., 2005) e o ensaio imunoenzimático (ELISA) (MACBRIDE e cols., 2007, DESAKORN e cols., 2012). De forma geral, os testes citados apresentam níveis de aproximadamente 72% de especificidade para a doença na fase aguda
(DOUNGCHAWEE e cols., 2008). O MAT e o ELISA-IgM são os métodos sorológicos mais usados no Brasil e em todo o mundo.
No período entre 2007 a 2012, do total de 22.351 casos de leptospirose confirmados no Brasil, 19.540 foram concluídos por critérios clínico-laboratoriais
(http://dtr2004.saude.gov.br/sinanweb/tabnet/dh?sinannet/lepto/bases/leptobrne t.de; acesso 06/04/2014).
Mesmo com o desenvolvimento de métodos laboratoriais de maior complexidade, o Teste de Aglutinação Microscópica (MAT) continua sendo o método padrão ouro recomendado pelo Ministério da Saúde e reconhecido mundialmente para confirmação laboratorial dos casos de leptospirose (WHO, 2003, Guia de Vigilância Epidemiológica, 2009, DAHER e cols. 2010). O MAT apresenta alta sensibilidade e especificidade para detectar anticorpos, tanto IgM como IgG, sorogrupos específicos e por isso não diferencia infecções recentes de infecções passadas. A interpretação deste teste não é fácil, há reações cruzadas que ocorrem entre diferentes sorogrupos, especialmente na fase aguda da doença. (ARMED e cols., 2009). Observa-se desvantagem significativa do método quando usado em regiões onde a leptospirose é endêmica e grande proporção da população apresenta títulos elevados. Pode ser difícil a interpretação dos resultados em pacientes que foram previamente vacinados, infectados ou são originários de áreas endêmicas (LUCCHESI e cols., 2004; BAJANI e cols., 2003). Outra desvantagem é que a realização do MAT está restrita aos laboratórios de referência capazes de manter os cultivos de cepas a serem utilizados como antígenos vivos na reação (ARMED e cols., 2009). O resultado do MAT muitas vezes depende da observação da soroconversão, o que requer a análise de pelo menos duas amostras pareadas, coletadas com intervalo mínimo de uma semana da primeira coleta. Assim, o MAT não permite o diagnóstico precoce da infecção (BAJANI e cols., 2003, KEE e cols., 1994).
O ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção de anticorpos (IgM) vem sendo empregado para o diagnóstico rápido da leptospirose em vários países (CAMARGO e cols., 1992). O ELISA apresenta como vantagem a
agilidade e facilidade do procedimento. A sensibilidade e especificidade variam de acordo com o kit utilizado e a população alvo, mas, geralmente apresenta maior sensibilidade e especificidade menos satisfatória (BAJANI e cols., 2003, BLACKSELL e cols., 2006). O ELISA-IgM tem valor na triagem de casos suspeitos de leptospirose em que as amostras coletadas dentro do prazo recomendado pelo fabricante podem ser descartados pelo critério laboratorial, quando os exames apresentam resultados não reagentes (McBRIDE e cols., 2007). Anticorpos anti-leptospiras da classe IgM podem ser detectados no soro dos pacientes durante anos após a infecção (McBRIDE e cols., 2007, ABDULKADER e cols., 2002). Os estudos que avaliam o ELISA-IgM para o diagnóstico da leptospirose compartilham da necessidade de se obter um teste de triagem que apresente sensibilidade e especificidade em níveis aceitáveis para o diagnóstico na fase inicial da doença, o que seria um grande benefício para o paciente. Por outro lado, testes de triagem de baixa qualidade ou mal conduzidos podem afetar negativamente a abordagem clínica quando um resultado falso-negativo pode impedir o inicio do tratamento específico. Assim, são necessários testes que possam diagnosticar a leptospirose precocemente, antes mesmo do tempo de detecção apresentado pelos métodos sorológicos disponíveis atualmente (EFFLER e cols., 2002). A alternativa seria a detecção de antígenos pelo método de isolamento ou a detecção de ácidos nucleicos por métodos moleculares.
A cultura de Leptospira spp. pode ser realizada a partir de sangue e liquido cefalorraquidiano na primeira semana de doença e urina, a partir da segunda semana. Mesmo apresentando alta especificidade, o método é pouco usado para fins diagnósticos devido ao crescimento lento da bactéria e da baixa sensibilidade do teste. Para ser concluído, o resultado de cultura leva de três a seis meses (HAMAD e cols., 2005). A cultura tem seu valor quase unicamente epidemiológico e é muito importante na identificação dos sorovares envolvidos em surtos ou epidemias, ou mesmo circulante em determinada região (WHO, 2003).
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) pode ser realizada em diferentes espécimes biológicas como sangue total, soro, líquor (MERIEN e
cols., 1992, GRAVEKAMP e cols., 1993, ROMERO e cols., 1998), urina (LUCCHESI e cols., 2004, VAN EYS e cols., 1989) e sêmen (HEINEMAN e cols., 2000) para elucidação de casos suspeitos de leptospirose. Diferentes protocolos com diferentes sequências alvos têm sido estudados nas últimas décadas (GRAVEKAMP e cols., 1991, BAL e cols., 1994, CABALLERO e cols., 1994, GERRITSEN e cols., 1995, SMYTHE e cols., 2002, NASSI e cols., 2003, BEDIR e cols. 2010, AGAMPODI e cols., 2012). A primeira descrição de amplificação de DNA por PCR em amostras de soro humano foi em 1991 e teve a sensibilidade aumentada devido ao uso de sondas específicas hibridizadas ao DNA amplificado (GRAVEKAMP e cols., 1991). A PCR é baseada na amplificação de genes universais ou genes restritos à patogenicidade de Leptospira spp. Ainda hoje, o uso desta técnica é dificultado pelo custo, falta de recursos humanos qualificados e infraestrutura adequada de laboratórios, sejam, públicos ou privados. A PCR convencional não tem sido bem avaliada, colocando em dúvida o valor real do método para tal diagnóstico. Com o incremento do real-time PCR, que combina a amplificação e detecção da sequência alvo na mesma reação, tem-se demonstrado excelentes resultados de sensibilidade e especificidade, com baixo risco de contaminação durante todo o procedimento (MUSSO e cols., 2013). Os métodos sorológicos e moleculares podem apresentar resultados discordantes, porém complementares, por detectarem a doença em intervalos de tempo distintos (FONSECA e cols., 2006a, OOTEMAN e cols., 2006, MUSSO e cols., 2013). Quando avaliado o tempo de execução, a sensibilidade, a especificidade e o custo-benefício, o método de PCR mostra-se promissor para o diagnóstico precoce da leptospirose (FONSECA e cols., 2006ab, OOTEMAN e cols., 2006).
O estudo da combinação de métodos microbiológicos, imunológicos e moleculares para o diagnóstico da leptospirose pode contribuir significativamente para a conclusão laboratorial dos casos suspeitos.
3.7. Tratamento
O benefício da terapia com antibióticos no tratamento da leptospirose ainda é discutível, principalmente para os casos que apresentam maior
gravidade. Quando administrado ao paciente penicilina, doxiciclina ou cefalosporina, estes antibióticos não parecem diminuir as taxas de mortalidade, a duração da febre, o número de pacientes com oligúria ou que necessitam de diálise (CHARAN e cols., 2013). Alguns autores citam que o uso de antibióticos para tratar a leptospirose pode influenciar na duração da doença, com diminuição de dois a quatro dias no seu curso (BRETT-MAJOR & COLDREN, 2012).
Há décadas, vem sendo observado que a administração de antibióticos pode ser eficaz quando iniciada até o quarto dia após o início de sintomas. Após este tempo, a administação de antibióticos parece não alterar o curso da doença, uma vez que, lesões no endotélio vascular e em vários outros órgãos já estariam presentes (ALEXANDER & RULE, 1986 e MERIEN, 1992).
Em ensaio clínico randomizado realizado em Salvador/Bahia, Brasil, em 253 pacientes com mais de quatro dias de início de sintomas, observou-se maior mortalidade no grupo tratado com penicilina (12%) quando comparado com o grupo tratado com placebo (6%); esta diferença não foi estatisticamente significativa. Neste estudo, o uso de penicilina não beneficiou os pacientes com leptospirose, quando iniciado pelo menos após o quarto dia do inicio dos sintomas (COSTA e cols., 2003). Outro estudo mostrou que pacientes tratados com penicilina apresentaram períodos reduzidos de febre, disfunção renal e hospitalização (WAT, 1988).
Pacientes ambulatoriais com doença leve foram tratados por 5 a 7 dias com doxiciclina para reduzir a duração da doença e evitar a eliminação de leptospira na urina. O uso de penicilina G intravenosa e cuidados suportivos são os tratamentos de escolha para pacientes hospitalizados que apresentam a doença grave. Ensaios randomizados utilizando ceftriaxona intravenoso, cefotaxima, e doxiciclina demonstraram resultados semelhantes à penicilina G (VASHI e cols., 2009).
Diante dos relatos da literatura, a pesquisa clínica ainda se faz necessária para avaliar esquemas terapêuticos mais amplos a serem testados contra placebos. Revisão sistemática e metanálise de ensaios clínicos feita recentemente enfatiza a necessidade urgente de ensaios clínicos
adequadamente projetados e conduzidos para explorar o uso de vários antibióticos no tratamento da leptospirose, com o objetivo de orientar a formulação de políticas específicas para o tratamento da doença (CHARAN e cols., 2013).
3.8. Prevenção e controle
O controle da leptospirose é complexo e está relacionado às condições de vida da população em determinado local, considerando os aspectos ambientais, as diferentes fontes de infecção, as vias de transmissão e a ampla variedade de sorovares de Leptospira spp. As medidas de prevenção e controle devem ser conduzidas por três focos principais: a fonte de infecção, a rota de transmissão entre hospedeiro adaptado ou não ao hospedeiro humano e o tratamento da doença dos diferentes hospedeiros acidentais, incluindo o homem. Certamente o risco de infecção é minimizado ao se evitar o contato com a urina de animais, solo e águas contaminados (WHO, 2003).
Nos países desenvolvidos, suínos, bovinos e cães domésticos são amplamente imunizados, ao contrário do que ocorre na maioria dos países em desenvolvimento (LEVETT, 2001). As vacinas protegem contra a doença renal ou formas graves, mesmo assim, tem sido relatada a transmissão da doença aos seres humanos pelos cães imunizados. (FAINE, 1982, BROUGHTON & SCARNEL, 1985 e LEVETT, 2001). A imunização em humanos com vacinas polivalentes tem sido realizada em países do Extremo Oriente, onde ocorre grande número de casos em trabalhadores de plantação de arroz, como na China e Japão. Na França, uma vacina contendo apenas o sorovar Icterohaemorrhagiae é licenciada para uso humano. Foi desenvolvido em Cuba uma vacina com os sorovares Canicola, Icterohaemorrhagiae e Pomona para imunização humana (MARTINEZ SANCHEZ e cols.,1998, LEVETT, 2001). No Brasil, não existem vacinas disponíveis para o uso humano. Animais domésticos (cães, bovinos e suínos) são vacinados, o que impede o adoecimento, mas não a condição de portadores e transmissores da doença ao homem (Guia de Vigilância Epidemiológica, 2009).
3.9. Identificação e caracterização genética de Leptospira spp.
O avanço das metodologias moleculares para identificação de micro-organismos tem conduzido à classificação das leptospiras a um sistema de identificação de espécies genômicas. Observou-se a conservação do genoma intraespécie, embora a heterogeneidade entre sorovares indique a necessidade de estudos que busquem estratégias para a sua diferenciação (YASSUDA e cols.,1987, RAMADASS e cols., 1992, BRENNER e cols., 1999).
É importante a identificação de Leptospira spp. presente nos reservatórios animais, hospedeiros adaptados ou acidentais para evitar a propagação da leptospirose e permitir a prevenção de possíveis infecções em seres humanos, bem como em animais domésticos (BONFIM & KOURY, 2006, THAIPADUNGPANIT e cols., 2007).
A epidemiologia da leptospirose em diferentes países é pouco estudada, uma vez que este conhecimento resulta em grande parte do isolamento e caracterização fenotípica de Leptospira spp. O crescimento de Leptospira spp. é lento e o sucesso do isolamento a partir de amostras biológicas é pequeno (GEBRIEL e cols., 2006).
Há mais de uma década, pesquisadores vem desenvolvendo diferentes protocolos moleculares objetivando a detecção, identificação, tipificação e classificação das diferentes espécies, sorogrupos e sorovares de Leptospira spp. Diferentes abordagens moleculares vêm sendo estudadas como o uso de RFLP, ribotipagem, PFGE, VNTR, hibridização de DNA, assim como as abordagens baseadas no PCR utilizando iniciadores arbitrários, único iniciador específico em baixo rigor de estringência e análise de amplicon após o uso de endonucleases de restrição. Nos últimos tempos, tem sido usado o real-time PCR, sybergreen, taqman e qPCR. Sabidamente, os protocolos de RFLP, ribotipagem, PFGE são laboriosos, demorados e requerem considerável quantidade de DNA genômico (REITSTETTER, 2006). Estes protocolos demandam estruturas laboratoriais e equipamentos de maior complexidade, muitas vezes inviabilizando a execução desses métodos pelos laboratórios de países em desenvolvimento.
Os protocolos baseados no PCR podem ser considerados uma alternativa para a caracterização das leptospiras isoladas de casos clínicos humanos, animais e de fontes ambientais (COSATE e cols., 2012). Protocolos mais simples, rápidos e de menor custo podem permitir a identificação de espécies genômicas, sorogrupos e sorovares.
A técnica MLST é método relativamente fácil, mas envolve etapa de sequenciamento nem sempre disponível. O método tem sido usado na diferenciação de isolados de leptospiras a partir de genes espécie específico, estáveis e de evolução lenta (HAMED et cols., 2006).
O método de LSSP-PCR tem sido empregado em abordagens distintas para estudos de variação de sequência de DNA (PENA e cols., 1994, VILLA e cols., 1995, ENAN, 2012, OLIVEIRA e cols., 2003). A identificação e caracterização na maioria das vezes tem sido baseada no estudo da variabilidade dos fragmentos gerados pelos iniciadores G1/G2 (OLIVEIRA e cols., 2003, GEBRIEL e cols., 2006, BONFIM & KOURY, 2006, COSATE e cols., 2012). As vantagens apresentadas pelo método LSSP-PCR consistem na caracterização de espécies genômicas e sorovares a partir da amplificação específica de um fragmento; não é necessário o isolamento da leptospira infectante; não exige grandes quantidades de DNA genômico e é método rápido e de baixo custo comparado aos protocolos citados anteriormente (OLIVEIRA e cols., 2003, GEBRIEL e cols., 2006, BONFIM & KOURY, 2006).
4. OBJETIVO GERAL
Avaliar diferentes métodos laboratoriais (microbiológicos, imunológicos e moleculares) utilizados para o diagnóstico da leptospirose, verificar a ocorrência de sorovares de Leptospira spp. detectados pelo MAT e caracterizar geneticamente as Leptospira spp. a partir do DNA detectado de amostras de pacientes com suspeita de leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período de 12/2008 a 03/2014.
4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Descrever os aspectos clínicos e epidemiológicos dos pacientes incluídos neste estudo com suspeita de leptospirose em Minas Gerais no período de 12/2011 a 03/2014.
- Avaliar os resultados laboratoriais obtidos para cada paciente quando realizados diferentes métodos microbiológico (cultura), imunológicos (MAT e ELISA-IgM) e moleculares (PCR convencional e real-time PCR) para o diagnóstico de leptospirose.
- Verificar a soroprevalência de sorovares de Leptospira spp. detectados pelo MAT a partir de amostras de pacientes encaminhadas ao Lacen-MG no período de 2008 a 2012.
- Analisar a variabilidade dos fragmentos gerados por diferentes iniciadores utilizados na detecção de DNA de Leptospira spp. por Low Stringency Single
Specific Primer (LSSP-PCR) de amostras detectáveis de pacientes com
5. METODOLOGIA
Estudo descritivo de avaliação metodológica realizado no Laboratório Central de Saúde Pública de Minas Gerais, Fundação Ezequiel Dias, Instituto Octávio Magalhães, Divisão de Epidemiologia e Controle de Doenças, Serviço de Doenças Bacterianas e Fúngicas (SDBF), Laboratório de Referência Estadual e Regional para o diagnóstico da leptospirose.
Não houve financiamento por órgãos de fomento para a execução desse projeto. Este estudo analisou dados secundários dos registros internos do SDBF, não expondo em nenhum momento a identidade dos pacientes.
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais (CAAE:05120113.0.00005149).
5.1. Cálculo amostral, critério de inclusão e coleta de dados laboratoriais, clínicos e epidemiológicos.
5.1.1. Avaliação do impacto nos resultados laboratoriais quando utilizados diferentes métodos para o diagnóstico da leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período de 12/2011 a 03/2014.
Para avaliar o aumento dos resultados laboratoriais positivos para leptospirose quando utilizados os métodos de cultura, MAT, ELISA-IgM, PCR convencional e real-time PCR, foram realizados dois cálculos: o primeiro para saber o tamanho da amostra necessária para conhecer a prevalência de leptospirose na região metropolitana de Belo Horizonte. Neste cálculo utilizou-se os dados do Lacen/MG ano bautilizou-se 2010; no utilizou-segundo cálculo levou-utilizou-se em conta a comparação dos métodos de diagnósticos para leptospirose. Foi usada como referência a prevalência (0,098/100.000 habitantes) de leptospirose obtida pelos dados do Lacen/MG em 2010, nível de confiança de 95%, erro de amostragem de 0,05 e ambas, a sensibilidade e a especificidade do método de Microaglutinação (MAT) igual a 99%. O MAT é considerado o método padrão ouro pelo Ministério da Saúde e Organização Mundial da Saúde para o diagnóstico da leptospirose. Os cálculos resultaram em 17 amostras para análise de especificidade e 155 para sensibilidade.
O critério de inclusão de amostras para esta etapa do estudo foi definido como: amostras de sangue (soro, plasma em EDTA e sangue total coletado em heparina) de pacientes com suspeita clínica de leptospirose com até 21 dias de curso da doença, procedentes de unidades sentinelas localizadas em Belo Horizonte. Assim, no período de 12/2011 a 03/2014 foram obtidas apenas 78 amostras de pacientes com suspeita de leptospirose.
5.1.2. Análise de informações clínicas e epidemiológicas de 78 pacientes com suspeita clínica de leptospirose em Minas Gerais, Brasil, no período de 12/2011 a 03/2014 obtidos da ficha SINAN-MS.
Os dados obtidos a partir das fichas SINAN-MS (ANEXO 1) foram transcritos para uma planilha Excel. A partir desses dados foram gerados gráficos, tabelas e um mapa (TabWin, versão 3.6b acesso em 02/07/2010, http://www2.datasus.gov.br/DATASUS/index.php?area=060805). As variáveis analisadas foram: endereço do paciente, sexo, idade, situação de risco e os principais sinais e sintomas apresentados.
5.1.3. Verificação da soroprevalência de sorovares de Leptospira spp. detectados pelo MAT em amostras de soro encaminhadas ao Lacen/MG no período de 2008 a 2012.
Como recomendado pelo Ministério da Saúde, todas as amostras deste período foram triadas pelo método de ELISA-IgM. As amostras que apresentaram resultados indeterminado ou reativo foram confirmadas ou descartadas pelo MAT.
Para verificar a soroprevalência de sorovares de Leptospira spp. detectados pelo MAT, foram analisados dados secundários de resultados laboratoriais de MAT de amostras de soro encaminhadas ao Lacen/MG no período de 2008 a 2012. As amostras foram enviadas ao Lacen/MG acompanhadas da ficha epidemiológica do Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN).
Os critérios de inclusão de amostras para esta etapa do estudo foram: (1) amostras pareadas que apresentaram soroconversão: primeira amostra não