COMPARAÇÃO DIRETA ENTRE RESINAS CROMATOGRÁFICAS NA PURIFICAÇÃO DO ÁCIDO CLAVULÂNICO

VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica

27 a 30 de julho de 2009 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil

COMPARAÇÃO DIRETA ENTRE RESINAS CROMATOGRÁFICAS NA PURIFICAÇÃO

DO ÁCIDO CLAVULÂNICO

1

Patrícia Harumi Yonamine, 2 Clóvis Sacardo da Silva, 3 Marlei Barboza Pasotto 1

Bolsista de Iniciação Científica PIBIC/FAPESP/UFSCar, discente do curso de Engenharia Química

2

Aluno de Pós-Graduação da Universidade Federal de São Carlos, discente do curso de Engenharia Química

3

Professor do Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal de São Carlos

1, 2, 3

Departamento de Engenharia Química - UFSCar, Via Washington Luis, Km 235, CEP: 13565-905 - São Carlos - SP, Brasil

e-mail: marlei@ufscar.br

RESUMO - O uso do processo de adsorção cromatrográfica é uma importante etapa na

concentração e purificação do inibidor de enzimas beta-lactamase, o ácido clavulânico (AC). O desenvolvimento de novas técnicas em cromatragrafia, bem como inúmeras fases estacionárias com diferentes conformações estruturais, tem proporcionado excelentes resultados no que se refere à purificação de produtos biotecnológicos. Este trabalho demonstra os resultados obtidos na avaliação de um conjunto de resinas comerciais dentre as quais são necessárias na etapa de extração e purificação do AC, analisando quais apresentam melhor rendimento, fator de purificação e fator de concentração. Os resultados obtidos mostram que, dentro do conjunto de resinas de troca-iônicas, algumas resinas aniônicas apresentaram capacidade de concentrar o ácido clavulânico com fatores de concentração acima de 1,8, fatores de purificação entre 1,2 e 2,35 e rendimentos próximo a 95%.

Palavras-Chave: ácido clavulânico, purificação, resinas cromatográficas.

INTRODUÇÃO

O processo de adsorção é uma técnica bastante usada na purificação e concentração de biomoléculas. O uso da engenharia genética possibilitou o desenvolvimento de inúmeras

proteínas recombinantes, exigindo o

desenvolvimento de resinas principalmente de troca iônica e estratégias de separação e purificação. No entanto, poucos são os trabalhos apresentados na literatura para a separação e purificação de antibióticos envolvendo este desenvolvimento das resinas de troca iônicas, principalmente em relação aos antibióticos beta-8lactâmicos.

Os antibióticos β-lactâmicos representam aproximadamente 65% do mercado mundial para antibióticos (Elander, 2003). Sua importância farmacêutica se dá pelo fato de serem inibidores do crescimento de bactérias, combatendo assim muitas infecções em seres humanos e animais.

Porém, vários microrganismos patogênicos

apresentam resistência aos antibióticos beta-lactâmicos devido à ação de beta-lactamases produzidas por estes microrganismos. O ácido clavulânico (AC), apesar de possuir uma fraca atividade bacteriana é um potente inibidor da enzima beta-lactmase, o uso conjugado com penicilinas e cefalosporina dão-lhes a proteção contra beta-lactamases, enzimas produzidas pelas bactérias

resistentes a antibióticos beta-lactâmicos (Mayer et al., 1997).

O AC não apresenta nenhum grupo fortemente hidrofóbico e é quimicamente instável, principalmente em altas temperaturas e pHs maiores que 7,0 e menores que 5,0 (Bersanetti et al., 2005). Estas características fazem com que seu processo de produção e separação tenha baixos rendimentos. Este fator depreciativo é carregado durante todas as etapas de purificação. Com isso, torna-se essencial o estudo de processos que diminuam a hidrólise do AC e o número de etapas necessárias na purificação.

O processo de purificação do AC

proveniente da fermentação envolve uma série de etapas, dentre as quais se destaca, inicialmente, a filtração do fermentado para separação dos sólidos e células presentes, seguido do isolamento do produto, o qual pode ser por extração líquido-líquido ou por técnicas de separação cromatográfica, tal como a que utiliza os princípios de troca iônica (Mayer et al., 1996).

O processo de adsorção cromatográfica em coluna de leito fixo é o mais conhecido e empregado na indústria nos processos de

separação e purificação de compostos

biotecnológicos. Neste tipo de sistema, consegue-se um nível de consegue-separação e remoção equivalente a muitos estágios do processo em tanque agitado. Geralmente, os processos de separação por adsorção cromatográfica ocorrem através de um sistema cíclico, no qual o adsorvente é

alternadamente posto em contato com a corrente de carga (etapa de adsorção), durante a qual os

componentes desejados são seletivamente

adsorvidos. Posteriormente, segue-se a etapa de regeneração do adsorvente, durante a qual os

componentes anteriormente retidos são

dessorvidos (etapa de dessorção) (Ward, 1991). Portanto, o DEQ-UFSCar vem trabalhando em pesquisas na área de Bioquímica com a meta de desenvolver técnicas eficientes na produção e separação do AC. Assim, contribuindo para o desenvolvimento do projeto global de pesquisa “Purificação de antibióticos beta-lactâmicos de caldos de bioprocessos”, este trabalho objetivou o estudo da purificação do AC via troca iônica em coluna de leito fixo, realizando experimentos em diversas resinas cromatográficas com o intuito de se determinar estratégias que promovam melhor rendimento para o processo.

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais

Ácido clavulânico: Todos os ensaios foram

realizados com caldos produzidos por

fermentação com Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, cujos meios de cultura são essencialmente constituídos de glicerol, isolado protéico de soja, SUPRO 783, suplementação de ornitina, solução de sais, (NH4)2SO4 e KH2PO4 (Teodoro, et al., 2005).

Resinas cromatográficas: Amberlite IRA-400, Amberlite IRA-402, Amberlite IRA-410, ANX FF, DEAE FF, Q FF, Q XL, Streamline DEAE (todas aniônicas), CM FF, SP FF, SP XL (catiônicas), Amberlite XAD-2, Amberlite XAD-4, Amberlite XAD-1180 e Diaion HP-20 (não iônicas).

Métodos Analíticos

Determinação da concentração do AC: A

concentração de ácido clavulânico foi

determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) segundo o método descrito por Foulstone & Reading (1982) com reação com imidazol, em um cromatógrafo com detector de fotodiodo (Waters 996 com PDA) utilizando uma coluna de fase reversa (C-18, µ-Bondapak, de 3,9x300 mm).

Análise da concentração de contaminantes: A concentração de contaminantes foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) a 280nm em um cromatógrafo com detector de fotodiodo (Waters 996 com PDA) utilizando uma coluna de fase reversa (C-18, µ-Bondapak. De 3,9x300 mm), descontando-se a influência da

concentração de ácido clavulânico nesse

comprimento de onda.

Pré-tratamento do caldo fermentado: O caldo cultivado contendo micélios foi filtrado por de membranas de microfiltração de 0,2µm (modelo CFP-2-E-8A). Na seqüência o filtrado proveniente da microfiltração foi ultrafiltrado por uma membrana de ultrafiltração de 3kDa (modelo UFP-3-E-3MA), ambas as membranas fornecidas pela Amersham Biosciences. O filtrado resultante foi armazenado a pH 6,2 em ultra-freezer a -70ºC. Ressalta-se que as condições de micro e

ultrafiltração foi aquelas previamente

estabelecidas em estudos realizados por Silva et al., (2007).

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

A extração do AC foi realizada em pequenas colunas de leito fixo contendo 1 mL de volume de resina. As condições de trabalho para cada resina foram de acordo com o recomendado pelo fabricante. Em relação às alíquotas coletadas, após passarem pela coluna, foram determinadas as concentrações de AC. O aparato experimental está representado no esquema simplificado da Figura 1.

Figura 1 – Esquema do aparato experimental

Após a saturação da coluna, esta foi lavada com água e a eluição foi realizada com um gradiente recomendado pelo fabricante. Foram coletadas alíquotas do efluente da coluna, sendo as concentrações de ácido clavulânico e os contaminantes determinados conforme descrito anteriormente.

ANÁLISE DOS RESULTADOS

Em cada experimento com a respectiva resina cromatográfica, foram calculados os fatores de concentração (

F

F

C

C

F

=

(1)

onde Cfração é concentração do componente na fração, Camostra é concentração do componente na amostra inicial.

Cofração ACamostra Co ACfração P

C

C

C

C

F =

(2)

onde CC0 é concentração de contaminantes na amostra inicial e CC0fração é concentração de contaminantes na fração coletada.

O rendimento será determinado de acordo com a Equação 3.

100

×

=

∑

V

C

V

C

R

(3)

onde

V

V

AC.

A degradação do AC (

D

determinada pela Equação 4.

AC

AC

R

D

= 1

−

(4)

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Resultados das resinas de troca aniônica

Os resultados das resinas de troca aniônica da série Amberlite IRA-400, IRA-402 e IRA-410 de base forte podem ser observados nas figuras 2 a 4. O comportamento da concentração do AC e dos contaminantes nas frações coletadas foram próximos para as resinas IRA-400 e 402. Quando a coluna está sendo alimentada e as frações coletadas apresentam concentração relativa do produto acima de 0,05, este ponto é designado de ponto de ruptura. Em um processo industrial, quando a concentração atinge o ponto de ruptura a alimentação é interrompida. Considerando o ponto de ruptura para as resinas 400 e IRA-402, estes ocorreram próximos a 6 min e 7 min, respectivamente (Figura 2 e 3). Nota-se que, para resina IRA-410, não foi observado o ponto de ruptura do leito, este fato deve ao volume de amostra ser insuficiente para que se ocorra o ponto de ruptura (Figura 4). Em relação aos contaminantes, a série Amberlite apresentou comportamento semelhante em relação ao fator de concentração nas frações coletadas durante a fase de eluição.

Nas figuras 5 e 6 estão representados os

resultados das resinas de base fraca

Dietilaminoetil (DEAE). Observa-se que para ambas as resinas StreamLine DEAE e DEAE-FF, o volume de amostra aplicado não foi suficiente para que houvesse o ponto de ruptura do leito. Os

contaminantes apresentaram comportamento

semelhante durante a etapa de adsorção e dessorção para ambas as resinas.

Os resultados das resinas de base fortes Q-XL e Q-FF pode ser observado nas Figuras 7 e 8, respectivamente. Nota-se que a resina Q-FF apresentou dessorção do AC na etapa de lavagem (água) para a retirada do excesso da amostra nos interstícios do leito (Figura 8).

Na Figura 9, pode se observar o comportamento da resina mista (troca iônica e interação hidrofóbica) ANX–FF. Neste caso, a lavagem com água deionizada foi suficiente para que houvesse a dessorção do AC da resina

.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Eluição Água Caldo AC C_co tempo (min) C /C 0

Figura 2 – Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes na resina IRA-400 0 5 10 15 20 25 30 35 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 AC C_co C /C 0 Eluição Água Caldo tempo (min)

Figura 3 – Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes na resina IRA-402

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Eluição Água Caldo tempo (min) C /C 0 AC C_co

Figura 4 – Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes na resina IRA-410

5 10 15 20 25 30 35 40 0 1 2 3 4 5 6 AC C_co C /C 0 Eluição Água Caldo Streamline Deae tempo (min)

Figura 5 - Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes na resina Streamline DEAE 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

Caldo Água Eluição

C /C 0 tempo (min) AC Cco

Figura 6 – Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes na resina DEAE-FF

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 Eluição Água Caldo tempo (min) C /C 0 AC Cco

Figura 7 – Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes na resina Q-XL 0 2 4 6 8 10 12 14 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 tempo (min) C /C 0

Caldo Água Eluição

AC

C_co

Figura 8 – Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes na resina Q-FF 0 2 4 6 8 10 12 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

Caldo Água Eluição

tempo (min) C /C 0 AC Cco

Figura 9 – Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes na resina ANX-FF

Resultados das resinas de troca catiônica

Os resultados das resinas de troca catiônicas podem ser observados nas figuras 10 a 12. Sendo as resinas do tipo trocadoras de cátions e o AC em solução um ânion (AC-), observa que o AC não foi adsorvido pelas resinas catiônicas (Figura 10 a 12). O fato de que as frações coletadas durante a eluição apresentar concentração relativa próxima a 0,2 podem estar relacionadas à baixa velocidade de difusão do AC nos poros das resinas, fato este observado em

resinas porosas. Os contaminantes não

apresentaram concentração relativa na etapa de eluição, como se observa nas figuras 10 a 12, indicando que os principais contaminantes no caldo de AC pré-tratado por membrana de ultrafiltração de 3 kDa apresentam características aniônicas. 0 2 4 6 8 10 12 14 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 C /C 0 tempo (min)

Caldo Água Eluição

AC

C_co

Figura 10 – Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes CM-FF 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 tempo (min) Eluição Água Caldo C /C 0 AC Cco

Figura 11 – Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes SP-FF 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Eluição Água Caldo tempo (min) C /C 0 AC Cco

Figura 12 – Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes na resina SP-XL

Resultados das resinas não-iônicas

Geralmente, as propriedades de separação das resinas não-iônicas (resinas hidrofóbicas) provem da sua estrutura macro reticular (contendo uma fase contínua de polímero e uma fase contínua porosa), da sua grande área superficial e de sua natureza aromática. Esse tipo de resina absorve e libera espécies iônicas através de interações polares e hidrofóbicas.

Os resultados da adsorção do AC nas resinas hidrofóbicas podem se observados nas Figuras 13 a 16. Todas as resinas apresentaram baixa adsorção do AC. No entanto, a resina XAD-4, foi capaz de separar o AC de uma parte dos contaminantes como mostra a Figura 14. Deve se ressaltar que estas resinas são utilizadas em vários processos de purificação de antibióticos beta lactâmicos como pré-tratamento do caldo para eliminação de coloração e contaminantes.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 Eluição AC C_co C /C 0 Água Caldo tempo (min)

Figura 13 – Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes na resina XAD-2

0 5 10 15 20 25 30 35 40 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 C /C 0 AC Cco Eluição Água Caldo tempo (min)

Figura 14 - Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes na resina XAD-4

0 5 10 15 20 25 30 35 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 AC Cco C /C 0 Eluição Água Caldo tempo (min)

Figura 15 – Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes na resina XAD-1180

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 C /C 0 Eluição Água Caldo AC C_co tempo (min)

Figura 16 – Curva da evolução da adsorção de AC e contaminantes HP-20

Análise do fator concentração e purificação das resinas

O conjunto de resultados apresentado nas figuras 2 a 16 pode ser melhor analisado comparando-se os fatores de concentração (FCAC) e de purificação (FP) para cada ensaio. O fator de concentração e purificação foi calculado referente à fração coletada de maior concentração de AC. Esses parâmetros podem ser observados na Tabela 1.

As resinas não-iônicas e catiônicas apresentaram fatores de purificação menores que 1, sendo que a resina XAD-1180 e HP-20 apresentaram degradação superior a 20%.

Por outro lado, os resultados demonstram que o conjunto de resinas aniônicas apresenta capacidade de concentrar o AC e fatores de purificação entre 1,1 e 2,3, com rendimentos acima de 90%. No entanto, as resinas aniônicas da série Amberlite apresentaram as maiores taxas de degradação pelos sítios ativos da resina, fato este observado por Barboza et al. (2002).

Tabela 1 – Fatores de concentração e purificação do conjunto avaliado de resina para purificação do AC RESINA FP (-) FCAC (-) R_AC (%) Aniônica IRA-400 1,07 0,56 77 IRA-402 1,19 1,18 56 IRA-410 1,71 0,58 72 S. DEAE 1,53 2,60 82 DEAE FF 1,12 0,55 78 Q-XL 2,35 2,01 98 Q-FF 2,20 1,82 95 ANX FF 2,30 1,06 89 Catiônica SP XL 0,88 0,54 90 SP FF 0,98 0,63 91 CM FF 0,95 0,95 92 Não-iônica XAD-2 0,93 1,37 92 XAD-4 0,80 1,00 84 XAD-1180 0,86 0,69 76 HP-20 0.89 1,23 77

CONCLUSÃO

Pelos resultados obtidos, o processo de recuperação do AC utilizando coluna de leito fixo é um processo viável quando utilizado resinas aniônicas, ocorrendo separação do antibiótico de muitos contaminantes, como mostrado pelos fatores de purificação obtidos.

As resinas catiônicas e hidrofóbicas não

conseguem concentrar e purificar o AC.

as aniônicas, como que em um pré-tratamento para retirada prévia de contaminantes.

No geral, as resinas que obtiveram os melhores resultados foram as aniônicas QX-L, Streamline DEAE e Q-FF, apresentando valores altos de purificação próximos a 2,3 e de concentração entre 1,8 e 2,6.

NOMENCLATURA

C

C

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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clavulanic acid degradation. Biochemical En-gineering Journal, v.23, p.31-36.

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TEODORO et al., (2005). Influence of feeding conditions on clavulanic acid production in fed-batch cultivation with medium containg glycerol, Applied Microbiology Biotechnology. v.72, p.450-455.

WARD, O. P., (1991). Biochemical Separations. Bioprocessing. Van Nostrand Reinhold, New York, cap.4, p.55-72.

AGRADECIMENTOS

Agradecimentos a FAPESP pela bolsa de Iniciação Científica e pelo auxílio financeiro e a CNPq pela bolsa de doutorado.