TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM CAPRINOS
Profa Dra ANNELIESE DE SOUZA TRALDI Departamento de Reprodução Animal – FMVZ / USP Cp 23 – 13630 000 Pirassununga, SP - Brasil
1. INTRODUÇÃO
Nos últimos 18 anos, diferentes protocolos de superovulação e criopreservação de embriões de caprinos foram propostos, além de diferentes métodos de colheita e transferência de embriões.
Com a evolução das técnicas de fertilização in vitro, a espécie caprina passou a ser utilizada no estudo da bisseção embrionária, da incorporação gênica na produção de animais transgênicos e clonagem, visando a obtenção de fármacos biológicos, participando assim a espécie caprina do futuro da medicina humana.
2. PARTICULARIDADES DA ESPÉCIE CAPRINA
Uma série de parâmetros reprodutivos diferenciam os caprinos dos demais animais domésticos, como o ciclo sexual estacional, a forma de indução e sincronização do estro de doadoras e receptoras e o tipo de resposta aos hormônios como o PMSG e o FSH-p que, após repetidas aplicações, causam a formação de anticorpos nessa espécie, o que diminui gradativamente a resposta superovulatória nas doadoras.
Associado a esses fatores, os caprinos apresentam respostas adversas aos tratamentos superovulatórios, de causas ainda desconhecidas mas supostamente hormonais, que levam à regressão de parte ou da totalidade dos corpos lúteos formados após a superovulação, o que inviabiliza a recuperação dos embriões.
A resposta a superovulação em caprinos varia sob a influência de diversos fatores, como a origem, o grau de contaminação de LH, a partida e a dosagem da gonadotrofina utilizada, além de fatores inerentes ao animal, como raça, peso corporal, nível nutricional e a interligação desses fatores com a estação do ano. Tais fatores irão se refletir no número e na qualidade dos corpos lúteos formados, no número das estruturas colhidas e daquelas viáveis e/ou passíveis de congelação.
3. AÇÃO DE DIFERENTES HORMÔNIOS EXÓGENOS NA RESPOSTA SUPEROVULATÓRIA DE CAPRINOS
A sincronização do estro em doadoras que serão superovuladas e de receptoras, pode ser realizada com o uso de pessários vaginais impregnados com 45 mg de acetato de
Fluorogestona-FGA (26, 8, 10, 38, 20, 14) ou 50 a 60 mg de medroxiprogesterona-MAP
(3, 45, 41, 26, 34, 13, 40, 43, 35, 37), dispositivos intravaginais - CIDR (31), implantes
subcutâneos (42, 38, 1, 27) ou, exclusivamente, prostaglandina F2α (4, 50, 22).
A variação na produção de embriões é dependente da razão FSH/LH do preparado, ou seja, aqueles ricos em FSH produzem melhores porcentagens de ovulações e traduzem-se em melhores colheitas e/ou maior viabilidade embrionária (5, 6, 21, 24, 8, 31, 38, 32, 12). Nas últimas duas décadas, a maior parte das pesquisas em produção in vivo de embriões de caprinos concentrou-se na ação da PMSG (2, 3, 45, 26, 44, 13, 15, 42, 29, 36, 14), do FSH-p (4, 17, 8, 25, 28, 38, 22, 35, 37), do FSH-o (31) e do hMG (16, 35, 47).
3.1 PMSG
Uma dosagem de 1000 a 1200 UI de PMSG é usualmente utilizada (2, 3). Embora o cio apareça cerca de 30 a 60 horas após a retirada da esponja impregnada com progestágeno (33, 15, 42, 20, 14), as ovulações continuam a ocorrer por um prazo de 77 horas, resultando na colheita de embriões em diferentes estágio de desenvolvimento (15).
3.2 FSH-p .
O FSH-p é utilizado em caprinos em concentrações que variam de 16 a 18 mg (padrão ARMOUR), ocorrendo o estro entre 24 e 54 horas após a retirada das esponjas (4, 34, 8, 25, 10, 42, 20, 1).
Porém, tanto o PMSG (11) quanto o FSH-p (9, 39), levam à formação de anticorpos em período tão curto quanto 14 dias após a primeira administração, ocasionando uma diminuição na taxa de ovulações, após tratamentos sucessivos, e um retardo na manifestação dos sintomas de estro, o que incompatibiliza a inseminação das doadoras em intervalo fixo.
3.3 hMG
O custo elevado do tratamento com o hMG o torna menos utilizado em caprinos que as demais gonadotrofinas, apesar de apresentar resposta superovulatória semelhante ou superior (30, 40, 35, 12, 47). Uma dose de 1200 UI é recomendada (600 UI de FSH e 600 UI de LH) e o início dos sintomas de estro ocorre em média 23 ± 1.1h após a retirada das esponjas (47), semelhantemente ao FSH-p.
3.4. MANIFESTAÇÃO DO ESTRO
A manifestação dos sintomas de estro em resposta ao agente superovulante, não é obrigatoriamente acompanhada por ovulações (22, 25).
Essa refratariedade ao hormônio exógeno, demonstrada pela ausência de manifestação de estro e concentrações de P4 inferiores a 1 ng/ml nos dias subsequentes ao final do tratamento hormonal, pode ocorrer em cerca de10% das superovulações nas raças Saanen, Alpina e Angorá (8, 25, 4, 47), ou mesmo 20% a 40% nas raças Creola e Moxotó (37, 17). O fator nutrição igualmente interfere nesse fenômeno (35).
3.5 TAXA DE OVULAÇÃO EM RESPOSTA AO AGENTE SUPEROVULANTE
Com o uso de PMSG, as taxas de ovulação variam de 7,7 a 14 corpos lúteos (33, 3, 4, 50, 42, 28). Resultados superiores, segundo a maioria dos autores, são observados quando do uso de FSH, com uma média de corpos lúteos que varia de 10,6 (42) a 19,8 CL (3, 4, 17, 34, 50, 42, 28). Com o hMG, essa média sobe para 21.8 CL, sem diferença de resposta entre nulíparas e pluríparas ou em múltiplas superovulações em um mesmo animal (47).
Uma acentuada diferença na taxa de ovulação entre cabras das raças Saanen (29,3 CL) e Angorá (5,3 CL) submetidas a 21 mg de FSH (46), demonstra a necessidade de se utilizar e testar diferentes concentrações hormonais de acordo, não apenas com a raça, mas com o peso vivo e a aptidão animal. Em programas de transferência de embriões em caprinos, é importante analisar e considerar as condições de meio-ambiente e a interação de raças importadas (principalmente leiteiras) a ele, pois diferentes condições de fotoperíodo e hemisfério podem modificar a resposta do animal ao hormônio exógeno utilizado na superovulação.
O nível de estimulação ovariana gerado em cabras Saanen e Alpina por 16 mg de FSH-p em doses decrescentes de FSH - LH (8 - 1 - 0,4) não difere significativamente entre a estação de monta e a contra-estação reprodutiva, quanto ao número de corpos lúteos (13,7 x 11,9) e estruturas transferíveis (4,7 x 4,0). Porém, a repetição dos tratamentos em intervalos de sete semanas leva a uma diminuição na resposta superovulatória do 2° ao 5° tratamento (8,6 CL e 1,9 embriões transferíveis) em relação ao primeiro (12,8 CL e 4,3 embriões transferíveis), o que permite aconselhar que uma cabra ainda que de excelente potencial genético, seja submetida a, no maximo, três superovulações e colheitas de embriões (8).
A plena funcionalidade dos corpos lúteos, sinalizada por um nível de P4 superior a 1,0 ng/ml tem início, na maioria das doadoras, no 3° dia após findas as superovulações (44, 47)
3.6 REGRESSÃO PREMATURA DOS CORPOS LÚTEOS
A regressão prematura dos corpos lúteos, fenômeno típico de pequenos ruminantes superovulados, pode ocorrer desde a primeira superovulação, possivelmente em resposta à quantidade e/ou características do hormônio superovulante (2, 3, 4, 45, 44, 13, 8, 31, 35, 47).
Essa alteração sobreviria independentemente da estação do ano e do método de superovulação, não foi observada após a superovulação com extrato hipofisário de origem ovina (31).
Inibidores da prostaglandina-sintetase como o Flunixin-meglumine auxiliam no bloqueio desse processo, permitindo otimizar a recuperação de embriões viáveis e possibilitando o desenvolvimento de programas de transferência de embriões em caprinos (13, 23, 47). A regressão dos corpos lúteos, evidenciada pela redução na concentração de P4, tem início entre o 4° e 5° dia após a detecção dos estros e coberturas, o que permite recomendar que a administração de um inibidor da prostaglandina sintetase tenha início entre o 3° e 4° dias pós- acasalamentos.
4. COLHEITA DE EMBRIÕES
A colheita dos embriões é feita através de lavagem dos cornos uterinos entre o 6° e o 8° dias após o início do estro (dia 0) através de laparotomia, endoscopia ou via cervical (5). Essa colheita pode ser igualmente efetuada entre o 4° e o 5° dias, com imediata transferência a receptoras sincronizadas às doadoras, a fim de reduzir a perda de embriões devido à luteólise prematura dos corpos lúteos (3).
A taxa de recuperação de embriões varia com o método de colheita e o hormônio utilizado (35, 37), atingindo índices médios superiores a 60% e inferiores a 90% (33, 17, 8, 23, 28, 38, 1, 47).
Um índice médio de 12 embriões colhidos / doadora pode ser atingido em superovulações com FSH-p e hMG, embora algumas estruturas possam ser ovócitos não fecundados e embriões em diferentes estágios de desenvolvimento, variando de morulas não compactadas a blastocistos expandidos, em uma mesma doadora (46, 31, 50, 42, 20, 47).
O percentual de estruturas viáveis sofre uma ação direta do hormônio utilizado e da resposta individual dos animais à estimulação ovariana e, indiretamente, da eficácia da metodologia e do número de colheitas, variando de 92% quando da recuperação dos embriões antes do 5° dia do ciclo (4) a 60 - 80% nos dias subsequentes (46, 17, 8, 31, 50, 38, 19, 1), resultando em uma média de 7 estruturas viáveis / doadora (8, 31, 50, 1, 47).
Mesmo com a otimização de cada uma das etapas de produção, a eficácia do método é ainda relativamente baixa, levando ao nascimento de duas a cinco crias por cabra colhida, rendimento este semelhante ao de bovinos (7).
5. TRANSFERÊNCIA ÀS RECEPTORAS
O método mais utilizado é o cirúrgico, com exposição dos cornos para transferências dos embriões no ovário ipsi-lateral ao corpo-lúteo. O semi cirúrgico é igualmente utilisado, porém inicialmente é feito uma observação através de endoscopia, para verificar se a receptora realmente ovulou e em qual ovário, ou se apresenta regressão dos corpos lúteos, pois nesse caso, a receptora é descartada do programa; neste método, uma pequena abertura é feita na linha média e apenas o corno uterino é exposto, para que seja feita a inovulação dos embriões. A transferência pode ainda ser feita exclusivamente via endoscópica, com a inconveniência do custo do aparelho e da habilidade manual para faze-lo.
6. CRIOPRESERVAÇÃO DOS EMBRIÕES 6.1 Congelação lenta
Diferentes crioprotetores como o Glicerol ( 0.7 e 1.4M), DMSO e Etileno-glicol
(ET) são utilizados na congelação de embriões de caprinos, porém os melhores resultados são atribuídos ao ET (7). O estágio de desenvolvimento dos embriões é fundamental no sucesso da criopreservação, uma vez que os melhores resultados de sobrevivência embrionária pós-descongelação ocorre com blastocistos jovens a eclodidos.
Os embriões devem ser mantidos a temperatura ambiente e submetidos ao crioprotetor dentro de, no máximo, 3h após a colheita. Quando da congelação em ET, os embriões são submetidos a concentrações crescentes do crioprotetor – 0.5M, 1.0M e 1.5M. Após o envase em palhetas de 0.25ml, os embriões são resfriados a uma velocidade de 1 a 3°
C / min até atingir a temperatura de – 7° C, quando se induz a cristalização. O resfriamento continua a 0.3° C/min até atingir – 30° a – 35° C, sendo então imersas as palhetas em Nitrogênio líquido (N2). A descongelação é feita em banho- maria a 37° C e a retirada do crioprotetor feita em PBS com sacarose ou em banhos de soluções decrescentes do crioprotetor (7).
Taxas de gestação e de sobrevivência embrionária (traduzida pelo número de cabritos nascidos em relação ao número de embriões transferidos) de 60% e 45%, respectivamente, são índices esperados em um programa de transferência de embriões bem conduzidos, na espécie caprina, com seleção dos embriões no momento da descongelação e transferência à receptoras. Taxas inferiores poderão ser encontradas quando da transferência do conteúdo total da palheta, sem prévia avaliação pré- transferência.
6.2 VITRIFICAÇÃO
O método da vitrificação permite a criopreservação de embriões a baixo custo, além de outras vantagens, como a não formação de cristais intra e extra- celulares e da facilidade de manipulação da palheta e dos embriões no momento da descongelação e transferência a receptoras, o que é particularmente interessante em programas de transferência de embriões de pequenos ruminantes. Em adição, não é necessário aparelho específico de congelação, o que diminui a mão de obra e o custo final de produção.
Uma vez submetidos a soluções de equilíbrio e à solução de vitrificação, de alta osmolaridade (5 a 8M), os embriões são rapidamente aspirados em palheta fina (0.25ml) e imediatamente imersos em N2 , onde as palhetas permanecem até o momento de utilização. A descongelação se faz em duas passagens: 5 Seg no ar e 15 Seg em banho maria a 19-20° C, não necessitando de diluição do crioprotetor após a descongelação, como ocorre com a congelação tradicional (32).
Quando da não seleção de embriões pós-descongelação (metodologia de rotina com embriões criopreservados por congelação lenta), pode- se obter uma taxa de parição das receptoras de 55% e uma taxa de sobrevivência embrionária de 40%, o que se assemelha aos resultados relatados na literatura mundial com a congelação lenta, com diferentes crioprotetores (49).
Vale salientar que, apesar do pequeno número de relatos dessa técnica de criopreservação de embriões produzidos in vivo (através de superovulações), ela já apresenta resultados excelentes em embriões in vitro (48), o que permite aconselha-la na criopreservação de embriões de caprinos e, principalmente, sua utilização a campo, com baixos custos em todos os momentos de sua utilização.
7. PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN VITRO
Diferentes técnicas de maturação in vitro de oócitos imaturos (MIV), sua fertilização por espermatozóides igualmente capacitados in vitro (FIV) e cultivo (DIV) em meio celular (monocamadas) ou sintético (SOF, TCM 199) evoluíram na última década (18). A principal barreira da espécie caprina é a capacitação in vitro, o que resulta numa menor taxa de clivagem dos oócitos (média de 50%), quando comparados aos outros ruminantes. Outra particularidade da espécie caprina é a seleção dos oócitos no momento de sua aspiração intra-folicular, pois eles apresentam uma menor quantidade de células do cúmulos (COC), tornando particularmente delicada a seleção dos oócitos que serão submetidos a maturação e FIV.
Ao final de 9 dias de cultivo (D.0 = dia da FIV) em mSOF adicionado de 10% de soro fetal bovino , um total de 30% de blastocistos pode ser obtido, em relação ao número total de oócitos clivados.
Embora mais sensíveis a criopreservação por congelação, os embriões in vitro de caprinos suportam de forma razoável a vitrificação, permitindo atingir uma taxa de parição de receptoras de 45% e uma sobrevivência embrionária de 30%, resultados raramente obtidos com embriões in vitro de outras espécies domésticas.
8. CONCLUSÃO
A espécie caprina, que acompanha o homem desde os primórdios da domesticação animal, atrai pesquisadores e profissionais de campo, na busca de descobertas de suas
particularidades e otimização de técnicas que difundam o potencial genético de animais produtivos e que se faz de forma acelerada quando da obtenção e transferência de embriões, o que permite que o valor animal e social dos caprinos seja difundido ao redor do mundo.
Mas, de encontro ao novo milênio, desponta a cabra como o animal prático e adequado na produção de biofármacos, acompanhando mais uma vez, de perto, a evolução do homem, não mais apenas na alimentação do homem primitivo há 10000 anos, mas no desenvolvimento de novas biotécnologias que trarão ao homem melhores condições de vida, o que demostra a perfeita simbiose entre homem e animal, entre os caprinos e o ser humano.
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9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1- AKINLOSOTU, B.A.; WILDER, C.D. Fertility and blood progesterone levels following LHRH-induced superovulation in FSH treated anestrous goat. Theriogenology, v.40, p.895-904, 1993.
2- ARMSTRONG, D.T.; PFITZNER, A.P.; PORTER, K.J.; WARNES, G.M.; JANSON, P.O.; SEAMARK, R.F. Ovarian responses of anoestrus goats to stimulation with pregnant mare serum gonadotrophin. Animal Reproduction Science., v.5,p.15-23, 1982.
3- ARMSTRONG, A.T.; PFITZNER, A.P.; WARNES, G.M. Endocrine response of goats after induction of superovulation with PMSG and FSH. Journal of Reproduction and Fertility, v.67, p.395-401, 1983a.
4- ARMSTRONG, D.T.; PFTZNER, A.P.; WARNES, G.M.; SEAMARK, R.F. Superovulation treatments and embryo transfer in Angora goats. Journal of Reproduction and Fertility, v.67, p.403-10, 1983b.
5- ARMSTRONG, D.T.; EVANS, G. Hormonal regulation of reproduction: induction of ovulation in sheep and goats with FSH preparations. In: INTERNATIONAL CONGRESS ON ANIMAL REPRODUCTION AND ARTIFICIAL INSEMINATION, 10, Illinois, 1984. Proceedings. Illinois, 1984, p.8.
6- ARMSTRONG, D.T.; OPAVSKY, M.A. Biological characterization of pituitary FSH preparation with reduced LH activity. Theriogenology, v.25, p.135, 1986.
7- BARIL, G. Possibilidades atuais da transferência de embriões em caprinos. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 11, Belo Horizonte, 1995, Anais. Belo Horizonte, 1992, p.110-20.
8- BARIL, G.; CASAMITJANA, P.; PERRIN, J.; VALLET, J.C. Embryo production, freezing and transfer in Angora, Alpine and Saanen goats. Zuchthygiene, v.24, p.101-15, 1989.
9- BARIL, G.; CHOUVET, C.; DUFOUR, R.; REMY, B.; VALLET, J.C.; CHUPIN, D.; SAUMANDE, J.; BECKERS, J.F. Are decreased superovulatory response in goats related to porcine follicle stimulation hormone antibodies? In: RÉUNION A.E.T.E., 6, 1990. Proceedings. Lyon, 1990, p.122.
10- BARIL, G.; VALLET, J.C. Time of ovulations in dairy goats induced to superovutate with procine follicle stimulating hormone during and out of the breeding season. Theriogenology, v.34, p.303-10, 1990.
11- BARIL, G.; REMY, B.; VALLET, J.C.; BECKERS, J.F. Observations sur l'utilisation repetée du traitment FGA - PMSG chez la chèvre laitière. In: RÉUNION FRANCO-BRITANIQUE, Tours, 1991.
12- BARIL, G.; BREBION, P.; CHESNÉ, P. Manuel de formation pratique pour la transplantation embryonnaire chez la brebis et la chèvre. Roma, FAO, 1993.
13- BATTYE, K.M.; FAIRCLOUGH,A.J.; CAMERON, A.W.N. Evidence for prostaglandin involvement in early luteal regression of the superovulated nanny goat (Capra hircus). Journal of Reproduction and Fertility, v.84, p.425-30, 1988.
14- BORQUE, C.; PINTADO, B.; PEREZ, B.; GUTIERREZ, A.; MUÑOZ, I. MATEOS, E. Progesterone levels in superovulated Murciana goats with or without sucessfull embryo collection. Theriogenology, v.39, p.192, 1993. 15- CAMERON, A.W.N.; BATTYE, K.M.; TROUNSON, A.O. Time of ovulation in goats (Capra hircus) induced to
superovulate with PMSG. Journal of Reproduction and Fertility, v.83, p.747-52, 1988.
16- CAIROLI, F.; TAMANINI, C.; BONO, G.L; CHIESA, F.; PRANDI, A. Reproductive performance of female goats fiven progestagen associated with PMSG and / or hMG in deep anestrus. Reproduction, Fertility and Development, v.27, p.13-19, 1987.
17- CHEMINEAU, P.; PROCUREUR, R.; COGNIÉ, Y.; LEFÈVRE, P.C.; LOCATELLI, A.; CHUPIN, D. Production, freezing and transfer of embryos from a bluetongue-infect goat herd without bluetongue transmission. Theriogenology, v.26, p.279-90, 1986.
18- COGNIÉ, Y. State of the art in sheep-goat embryo transfer. Theriogenology, v.51, p.105-116, 1999.
19- CORDOVA, A.S.; JIMENEZ, F.K.; HERNANDEZ, J.J.L. Serum progesterone concentration in goats superovulated with FSH or PMSG outside the breeding season. Técnica Pecuária em México, v.30, p.232-39, 1992a.
20- CORDOVA, A.S.; JIMENEZ, F.K.; HERNANDEZ, J.J.L. Superovulación con hormona folículo estimulante (FSH) o gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) y antícuerpos monoclonales contra PMSG en cabras fuera de la época reproductiva. Veterinária México, v.23, p.319-24, 1992b.
21- DONALDSON, K.H.; WARD, D.N.; GLENN, S.D. Use of porcine follicle stimulating hormone after chromatographic purification in superovulation in cattle. Theriogenology, v.25, p.747-57, 1986.
22- FLORES - FOXWORTH, G.; McBRIDE, B.M.; KRAEMER, D.C.; NUTI, L.C. A comparison between laparoscopic and transcervical embryo collection and transfer in goats. Theriogenology, v.37, p.213, 1992.
23- GILBERT, D.E.; CONROD, S.A.; WHITTING, C.J. Comparision of a progesterone intravaginal device (CIDR) with flunixine meglumine (Finadyne) for reducing the effects of corpora lutea regression in the goat. Theriogenology, v.33, n.1, p.230, 1990.
24- HENDERSON, K.M.; SAVAGE, L.E.; ELLEN, R.L.; McNATTY, K.P. Consequences of increasing or decreasing plasma FSH concentrations during the preovulatory period in Romney ewes. Journal of Reproduction and Fertility, v.84, p.187-96, 1988.
25- JACKES, P.; St. PIERRE, H.; PICARD, L.; KING, W.A.; CHARTRAIN, I.; BARONET, D. La récolte et le transfert d'embryons chez la chèvre Angora. Canadian Veterinary Journal, v.30, p.581-84, 1989.
26- KIESSLING, A.A.; HUGHES, W.H.; BLANKEVOORT, M.R. Superovulation and embryro transfer in the dairy goat. Journal of American Veterinary Medical Association, v.88, p.829, 1986.
27- KRISCHER, R.L.; GWAZDAUDAS, F.C.; PAGE, R.L.; RUSSEL, C.G.; CANSECO, R.S.; SPARKS, A.E.T.; VELANDER, W.L.; JOHNSON, J.L.; PEARSON, R.E. Ovulation rate, Zygote recovery and follicular populations in FSH-superovulated goats with PGF2α and/or GnRH. Theriogenology, v.41, p.491-98, 1994.
28- MAHMOOD, S.; KOUL, K.G.; BISWAS, J.C. Comparative efficacy of FSH-p and PMSG on superovulation in Pashmina goats. Theriogenology, v.35, p.1191, 1991.
29- MARTEMUCCI, G.; ALESSANDRO, A.D.; GAMBACORTA, M.; TOTEDA, F.; BELLITTI, E. Superovulation response of FSH-p to differente treatments in donor gots. In: RECENT ADVANCES IN GOAT PRODUCTION. Proceedings and papers. New Delhi, 1992. p. 1328-35.
30- McGOWAN, M.R.; BRAITHWAITE, M.; JOCHLE, W.; MAPLETOFT, R.J. Superovulation of beef heifers with Pergonal (hMG): a dose response trial. Theriogenology, v.24, p.173-84, 1985.
31- McNATTY, K.P.; HUDSON, N.L.; BARLL, K.; MASON, A.; SIMMONS, M.H. Superovulation and embryo recovery in goats treated with Ovagem and Folltropin. New Zealand Veterinary Journal, v.37, p.27-9, 1989.
32- MERMILLOD, P.; TRALDI, A.S.; GUERIN, Y.; POULIN, N.; MASSIP, A.; COGNIÉ, Y. Sucessful vitrification of in vitro
produced ovine embryos. A.E.T.E., 13, Lyon, 1997. p. 182.
33- MOORE, N.W.; EPLESTON, J. Embryo transfer in the Angora goat. Australian Journal of Agricultural Research, v.30, p.973-81, 1979.
34- NUTI, L.C.; MINHAS, B.S.; BAKE, W.C. Superovulation and recovery of zygotes from Nubian and Alpine dairy goat. Theriogenology, v.28, p.481, 1987.
35- OLIVEIRA, V.S. Efeitos do hormônio folículo estimulante (FSH) e da gonadotrofina da menopausa humana (hMG) como agentes superovulantes em cabras (Capra hircus LINNAEUS, 1758) utilizadas em transferência de embriões. São Paulo, 1992. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.
36- PANDEY, A.; SINHA, S.K.; MISHRA, O.P.; PANDEY, J.N. Superovulatory response in Black Bengal goats following administration of PGF2α and gonadotropins. Indian Veterinary Journal, v.69, p.1009-10, 1992.
37- PINHEIRO, A.A. Métodos de colheita e de inovulação de embriões caprinos (Capra hircus, Linnaeu, 1758) e os efeitos de repetidas colheitas na vida reprodutiva de doadoras. São Paulo, 1993. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.
38- PLUS-KLEINGELD, M.; YUSWIATTI, E.; NOWSHARI, M.A.; BECKERS, J.F.; WOLTZ, W. Effect of FSH-LH ratio and treatment schedule en superovulatory response in Boer goats. Journal of Reproduction and Fertility, Suppl. 43, p.308, 1991.
39- REMY, B.; BARIL, G.; VALLET, J.C.; DUFOUR, R.; CHOUVET, C.; SAUMANDE, J.; CHUPIN, D.; BECKERS, J.F. Are antibodies responsible for a decreased superovulatory response in goats which have been treated repeatedly with porcine follicle stimulating hormone? Theriogenology, v.36, p.389-99, 1991.
40- SCHIEWE, M.C.; HOWARD, J.G.; GOODROWE, K.L.; STUART, L.D. Human menopausal gonadotropin induces ovulation in sheep, but embryo recovery after prostaglandin F2α synchronization is compromised by premature luteal regression. Theriogenology, v.34, p.469, 1990.
41- SCHIEWE, M.C.; HOWARD, J.G.; STUART, L.S.; GOODROWE, K.L.; WILDT, D.E. Human menopausal gonadotropin (hMG) for superovulation of sheep. Theriogenology, v.23, p.227, 1985.
42- SELGRATH, J.P.; MEMON, M.A.; SMITH, T.E.; EBERT, K.M. Collection and transfer of microinjetable embryos from dairy goats. Theriogenology, v.34, p.1195-1205, 1990.
43- STEFANI, J.S.; PALHA, M.D.C.; RODRIGUES, J.L. Ovine superovulation response to hMG. In: RÉUNION A.E.T.E., 7, 1991. Proceedings. Cambridge, 1991, p.210.
44- STUBBINGS, R.B.; BOSU, W.T.R.; BAKER, C.A.V.; KING, G.J. Serum progesterone concentration associated with superovulation and premature corpus luteum failure in dairy goats. Canadian Journal of Veterinary Research, v.50, p.369-73, 1986.
45- TERVIT, H.R.; GOOLD, P.G.; McKENZIE, R.A.; CLARKSON, D.T. Techniques and sucess of embryo transfer in Angora goats. New Zealand Veterinary Journal, v.31, p.67-70, 1983.
46- TERVIT, H.R.; GOOLD, P.G.; Mc KENZIE, R.D.; CLARKSON, D.J.; DRUMMOND, J. Embryo transfer in Angora and Saanen goats. New Zealand Veterinary Journal, v.33, p.78-80, 1985.
47- TRALDI, A.S.; LEBOEUF, B.; BARIL, G.; COGNIE, Y.; POULIN, N.; EVANS, G.; MERMILLOD, P. Comparative results after transfer of vitrified in vitro produced Goat and Sheep embryos. IN: SCIENTIFIC MEETING OF THE EUROPEAN EMBRYO TRANSFER ASSOCIATION, 14., Venice, 1997. Proceedings.p. 258.
48- TRALDI, A.S. Superovulação com gonadotrofina da menopausa humana (hMG) e prevenção da regressão prematura dos corpos lúteos em caprinos. São Paulo, 1995. Tese de Doutorado – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. 154 p.
49- TRALDI, A.S.; LEBOEUF, B.; BARIL, G.; COGNIE, Y.; POUGNARD, J.L.; MERMILLOD, P. Vitrificação: um bom método alternativo para a criopreservação de embriões de caprinos e ovinos. Arq. Fac. Vet. UFRGS, Supl., 1999 [no prelo].
50- TSUNODA, Y.L; SUGIE, T. Superovulation in nonseasonal Japanese native goats, with special reference to the development progression of embryos. Theriogenology, v.31, p.991-96, 1989.
